VI SINH DUOC

ĐẠI HỌC DUY TÂN
KHOA DƯỢC
BỘ MÔN Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ

TẬP BÀI GIẢNG

Môn học : THỰC HÀNH CĂN BẢN VI SINH HỌC
Số tín chỉ: 01
Dành cho sinh viên ngành: Dược sỹ Đại học
Khoa

:

Dược

Bậc đào tạo: Đại học – Cao đẳng
Học kỳ : II

Đà nẵng, tháng 01 năm 2017

Mã môn học: MIB 251


MỤC LỤC

Sử dụng kính hiển vi, các loại hình thể của vi khuẩn

3

Kỹ thuật vô khuẩn, tiệt khuẩn, khử khuẩn trong phịng thí nghiệm vi sinh vât

8

Kỹ thuật làm tiêu bản và các phương pháp nhuộm vi sinh vật

17

Cách lấy, bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm trong chẩn đoán vi sinh vật

23

Các phương pháp phân lập và xác định vi khuẩn

28

Phản ứng sinh hoá

34

Kháng sinh đồ

38

TÀI LIỆU THAM KHẢO

42


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược

SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI

CÁC LOẠI HÌNH THỂ CỦA VI KHUẨN
Mục tiêu:
1. Trình bày được đặc điểm cấu tạo của kính hiển vi quang học nền sáng.
2. Nắm được cách sử dụng và bảo quản khi sử dụng vật kính x100.
3. Nắm được các loại hình thể của vi sinh vật.

I.GIỚI THIỆU VỀ KÍNH HIỂN VI
1. Sơ lƣợc lịch sử và các loại kính hiển vi
1.1. Sự phát minh ra kính hiển vi
Anton van Leeuwenhoek (1632 – 1723), người Hà Lan, là người đầu tiên ở thế
kỷ 17 nhìn thấy vi sinh vật nhờ những kính hiển vi độ phóng đại 270 – 300 lần mà
ông đã chế tạo (1676). Ông đã chế tạo những kính hiển vi bằng cách xếp nhiều thấu
kính ở những khoảng cách khác nhau trên cùng một trục quang học, kết quả đã làm
phóng đại hình ảnh của các vật thể lên nhiều lần, ơng đã dùng để quan sát hồng cầu,
phấn hoa, mao mạch phổi và sau đó với chiếc kính hiển vi có độ phóng đại khoảng
300 lần ơng đã phát hiện các vi sinh vật trong nước.
1.2. Các loại kính hiển vi
Kính hiển vi quang học thƣờng: thường được sử dụng tại các phịng thí
nghiệm để xét nghiệm với mục đích quan sát hình thể, tính chất bắt màu của vi
khuẩn.
Kính hiển vi nền đen: là loại kính hiển vi quang học, nhưng bộ phận tụ quang
được thay thế bằng một cấu trúc khác để tạo nền tối, hay sử dụng để quan sát sự di
động của vi khuẩn.
Kính hiển vi đổi pha: cũng là kính hiển vi quang học nhưng có pha đảo
ngược, thường được dùng.
Kính hiển vi huỳnh quang: kính hiển vi quang học nhưng có nguồn sáng là
đèn huỳnh quang, thường được dùng để quan sát các tiêu bản sử dụng thuốc nhuộm
huỳnh quang.
Kính hiển vi điện tử: ra đời từ năm 1940, hoạt động theo nguyên lý là các bộ
phận được đặt trong một trụ kính và tạo chân không bằng một bơm hút. Trong chân

không, hoạt động của điện tử không bị cản trở. Các điện tử bắn xuyên qua mẫu vật,
3


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
được các vật kính và thị kính bằng từ trường làm tản rộng ra (phân kỳ), sau cùng
hiện lên màn huỳnh quang có bộ máy chụp ảnh để chụp khi cần.
2. Cấu tạo cơ bản của kính hiển vi quang học
Gồm có giá kính, hệ thống điều chỉnh nhanh, tinh và hệ thống quang học.
2.1. Giá kính
Gồm có đế kính, thân kính, ống kính, bàn xoay, bàn kính.
- Đế kính khá nặng có lỗ để cắm đèn chiếu hoặc cắm gương phản chiếu.
- Thân kính có hình cong để cầm và di chuyển dễ dàng kính hiển vi.
- Ống kính mang thị kính, có thể cố định hoặc quay lúc nới lỏng con ốc nhỏ ở
bên dưới ống kính.
- Bàn xoay có nhiều lỗ để lắp các vật kính.
- Bàn kính dùng để mang tiêu bản, có 2 ốc để di chuyển tiêu bản theo những
chiều thẳng góc với nhau, có kẹp cố định tiêu bản, có thước đo và du xích để ghi toạ
độ.
2.2. Hệ thống điều chỉnh nhanh và tinh
Cần thiết để điều chỉnh tiêu bản. Hệ thống gồm có 2 ốc đặt trên cùng một trục.
Ốc lớn (ốc vĩ cấp) điều chỉnh nhanh làm cho ảnh hiện ra, ốc nhỏ (ốc vi cấp) điều
chỉnh chậm và tinh nhằm điều chỉnh ảnh cho thật rõ. Chỉ khi nào ảnh hiện ra khi
điều chỉnh ốc lớn rồi mới vặn ốc nhỏ để làm rõ ảnh.
2.3. Hệ thống quang học
Gồm có vật kính, thị kính, kính tụ quang. Đèn chiếu và gương phản chiếu.
- Thị kính gồm một hệ thống 2 thấu kính, một hướng về mắt, một hướng về vật
quan sát.
- Vật kính là một hệ thống quang học phức tạp trực tiếp phóng đại mẫu vật
quan sát. Nó gồm một số thấu kính, thấu kính ngồi cùng hướng vào vật quan sát

gọi là thấu kính trực diện.
- Có 2 loại vật kính:
+ Vật kính thơ: Vật kính thơ có độ phóng đại nhỏ, đường kính thấu kính
tương đối lớn như vật kính 10, vật kính 40.
+ Vật kính dầu: có độ phóng đại lớn, hay dùng là vật kính 100, thấu kính có
đường kính nhỏ. Do đó chỉ có một phần của chùm tia sáng chiếu lọt vào vật
kính, một phần ánh sáng bị khúc xạ ra ngồi nên ảnh khơng rõ. Muốn có ảnh rõ
phải đặt giữa mẫu vật và vật kính một giọt dầu có chiết xuất n = 1,515 gần bằng
chiết xuất của thuỷ tinh n =1,52 để tạo nên một môi trường đồng nhất để ánh
sáng không bị khúc xạ mà đi thẳng vào vật kính.
4


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
Muốn biết độ phóng đại của thấu kính hiển vi người ta nhân độ phóng đại của
thị kính với độ phóng đại của vật kính.
- Kính tụ quang gồm có một hệ thống thấu kính tập trung ánh sáng và một hệ
thống chắn sáng có nhiệm vụ giảm bớt góc của hình nón ánh sáng thế nào để sau
khi qua mẫu vật và đến vật kính thì nó khơng vượt qua đường kính của thấu kính
trực diện.
- Đèn chiếu đặt ngay dưới tụ quang cung cấp một nguồn sáng thích hợp.
- Gương phản chiếu: lúc khơng có điện thì sử dụng ánh sáng mặt trời bằng
gương phản chiếu, gương có một mặt phẳng và mặt lõm. Mặt phẳng được sử dụng
để phản chiếu ánh sáng mặt trời còn mặt lõm được sử dụng để phản chiếu ánh sáng
nhân tạo như ánh đèn neon.

Cấu tạo kính hiển vi quang học
(1.Thị kính, 2.Giá điều chỉnh vật kính, 3.Vật kính, 4.Ốc vĩ cấp, 5.Ốc vi cấp, 6.Bàn
kính, 7.Nguồn sáng, 8.Tụ quang, 9.Vi chỉnh)

5


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
II. CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI
1. Các bƣớc để soi kính bằng vật kính dầu
- Nhỏ một giọt dầu xét lên chổ quan sát ở tiêu bản di chuyển tiêu bản để giọt
dầu nằm giữa vòng tròn của bàn kính.
- Đặt vật kính 100 vào trục quang học.
- Mắt nhìn vào vật kính, vặn ốc vĩ cấp để nâng tiêu bản từ từ sát với vật kính.
- Bật đèn điều chỉnh tụ quang để có ánh sáng thích hợp.
- Mắt nhìn vào thị kính, vặn ốc vĩ cấp để hạ bàn kính từ từ xuống cho đến khi
nhìn thấy ảnh. Dùng ốc vi cấp để điều chỉnh ảnh cho thật rõ.
Nếu khơng nhìn thấy ảnh thì tiếp tục nâng bàn kính lên rồi hạ bàn kính xuống.
- Mắt nhìn vào thị kính, một tay vặn ốc vi cấp để điều chỉnh khi cần, tay kia
vặn ốc của bàn kính để quan sát toàn tiêu bản.
2. Ghi toạ độ của một điểm ở trên tiêu bản
Để có thể tìm trở lại một điểm cần quan sát ở trên tiêu bản thì phải ghi toạ độ
của điểm đó, muốn thế đọc hoành độ và tung độ ở trên thước cia mm di động đồng
thời với tiêu bản và 2 du xích cố định, 2 thước di động cũng như 2 du xích cố định
thẳng góc với nhau.
III. CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI
Sau khi sử dụng, kính hiển vi phải được bảo quản tốt để sử dụng lâu dài, cần
thực hiền đầy đủ các bước sau:
- Lúc sử dụng xong, phải hạ bàn kính rồi mới tiêu bản khỏi bàn kính.
- Xoay vật kính dầu ở vị trí dễ lau nhất.
- Dùng khan mềm bằng vải mịn hoặc khan giấy để lau vật kính, nhúng một góc
khăn với rất ít xylen rồi lau vật kính dầu. Xong lau khơ với một góc kia của khăn.
- Đặt vật kính độ phóng đại nhỏ nhất ở trên trục quang học.
- Điều chỉnh xe tiêu bản, tụ quang, bàn kính,… đến các vị trí mà đường trượt

tiếp xúc ít nhất với bụi ở phía trên.
- Lúc di chuyển: đỡ đế kính bằng một tay, cầm thân kính ở tay kia để giữ kính
ở vị trí thẳng đứng như lúc đặt kính ở trên bàn.
IV. CÁC LOẠI HÌNH THỂ CỦA VI KHUẨN
Theo hình thái bề ngồi vi khuẩn thường được chia thành 3 loại hình thể chính:
cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn.

6


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
1. Cầu khuẩn
Là những vi khuẩn có hình cầu kích thước khoảng 0,5 x 1,2 µm, tuỳ theo vị trí
của mặt phẳng phân cắt và đặc tính rời nhau ra hoặc dính với nhau sau khi phân cắt
mà cầu khuẩn được chia thành:
- Đơn cầu: Thường đứng riêng ra từng tế bào một, đa số là những tạp khuẩn
gặp trong nước, trong đất và trong khơng khí.
- Song cầu: Là những cầu khuẩn đứng thành từng đơi một. Có một số lồi song
cầu có khả năng gây bệnh cho người như: Streptococcus pyogenes …
- Tetracoccus: Là những cầu khuẩn xếp thành cụm 4 con.
- Sarcina: Xếp thành cụm 8-16 tế bào. Một số gây bệnh cho người và động vật.
- Tụ cầu: phân cắt theo các mặt phẳng bất kỳ và sau đó tụ lại với nhau thành
từng đám như hình chùm nho. Một số lồi có thể gây bệnh ở người. Ví dụ như: tụ
cầu vàng (Staphylococcus aureus).
Cầu khuẩn nói chung khơng có lơng và khơng có khả năng di động..
2. Trực khuẩn
Là những vi khuẩn có hình que, kích thước khoảng 0,5 – 1,0 x 1 – 4 µm, các
loại trực khuẩn thường gặp là:
- Trực khuẩn không sinh nha bào. Ví dụ: E.coli, Shigella, Salmonella, bạch
hầu, lao…

- Trực khuẩn hiếu khí sinh nha bào (Bacillus)
- Trực khuẩn kỵ khí sinh nha bào (Clostridium) Ví dụ trực khuẩn uốn ván, trực
khuẩn gây hoại thư sinh hơi…
3. Vi khuẩn hình xoắn
Gồm có 3 dạng sau:
- Phẩy khuẩn (Vibrio): Là loại vi khuẩn xoắn nửa vịng nên có hình giống như
dấy phẩy. Ví dụ: Phẩy khuẩn tả (Vibrio cholera).
- Spirillum: Gồm các vi khuẩn có 2 đến 3 vịng xoắn nên có hình chữ S.
- Xoắn khuẩn (Spirochetes): Gồm có các vi khuẩn dài mảnh, có nhiều vịng
xoắn. Một số có khả năng gây bệnh cho người như xoắn khuẩn giang mai
(Treponema pallidum), xoắn khuẩn Leptospira, xoắn khuẩn sốt hồi quy (Borrelia).
CÂU HỎI LƢỢNG GIÁ:
1. Mô tả cấu tạo của kính hiển vi quang học nền sáng.
2. Trình bày cách sử dụng kính hiển vi quang học nền sáng khi sử dụng vật
kính x100.
3. Nêu các dạng hình thể của vi khuẩn.
7


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược

KỸ THUẬT VƠ KHUẨN, TIỆT KHUẨN, KHỬ KHUẨN TRONG
PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT
Mục tiêu:
1. Nắm được các thao tác kỹ thuật vô khuẩn trong thực hành vi sinh vật.
2. Trình bày được các phương pháp tiệt khuẩn trong phịng thí nghiệm vi sinh
vật.
3. Trình bày được một số hố chất dùng để khử khuẩn trong phịng thí nghiệm
vi sinh vật.
4. Biết cách xử lý các dụng cụ thuỷ tinh trong phịng thí nghiệm vi sinh vật.

I. KHÁI NIỆM
Khử khuẩn là công việc cần thiết và được thực hiện hằng ngày trong phịng thí
nghiệm vi sinh, một số thuật ngữ thường dùng hằng ngày để chỉ công việc này được
định nghĩa dưới đây:
Vơ khuẩn (Aseptic) là một q trình thao tác nhằm ngăn chặn hay dự phòng sự
xâm nhập của vi sinh vật đến các dụng cụ chuyên môn, tới phòng mổ, buồng tiêm,
buồng thay băng, buồng pha chế thuốc hoặc vết thương, vết mổ…
Tiệt khuẩn (Sterilization) là các biện pháp vật lý, hố học nhằm loại bỏ hồn
tồn hoặc tiêu diệt hết vi sinh vật sống trên các dụng cụ, phương tiện, dịch
truyền,…
Khử khuẩn (Disinfection) là dùng các biện pháp vật lý, hoá học để giết chết
hầu hết các vi sinh vật. Khử khuẩn có thể khơng giết chết toàn bộ các dạng đề
kháng của vi sinh vật như nha bào, vi khuẩn Mycobacteria, các virut và nấm. Người
ta chia các chất khử khuẩn ra các mức độ khác nhau mức độ thấp, mức độ trung
gian và mức độ cao.
Sát khuẩn (Antiseptic) là việc dùng hoá chất để giết chết, làm giảm số lượng vi
sinh vật trên bề mặt da. Các hoá chất dùng để sát khuẩn được chọn lọc kỹ để đảm
bảo tính an tồn khơng làm tổn thương tổ chức cơ thể vật chủ và phải có hiệu lực.
Trong chẩn đoán vi sinh vật gây bệnh yêu cầu cơ bản cho người làm kỹ thuật
là phải đảm bảo vô khuẩn, làm tốt các công tác tiệt khuẩn.
II. THAO TÁC VÃ KỸ THUẬT VÔ KHUẨN
1. Ý nghĩa của thao tác và kỹ thuật trong thực hành vi sinh vật
- Tránh sự tạp nhiễm cho mẫu nghiệm và đem lại kết quả chẩn đốn chính xác.
8


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
- Tránh được lây nhiễm cho người tiếp xúc và lây lan cho môi trường xung
quanh.
2. Các thao tác và kỹ thuật vô khuẩn

Trong thực hành vi sinh vật, để đảm bảo vô khuẩn, yêu cầu người làm kỹ thuật
phải thực hiện các thao tác kỹ thuật sau:
2.1. Sử dụng que cấy
- Cầm que cấy như cầm bút, “ mềm” cổ tay để dễ làm thao tác.
- Khử khuẩn đầu kim loại que cấy trên ngọn lửa đèn cồn: vừa đốt vừa xoay
que cấy. Phải khử khuẩn đầu kim loại que cấy trước và sau khi lấy bệnh phẩm.
2.2. Sử dụng ống nghiệm
- Cách cầm ống nghiệm: có 2 cách
+ Cầm bằng 3 ngón tay 1,2,3. Thân ống nghiệm lót giữa 3 ngón tay. Đáy
ống nghiệm đặt giữa lịng bàn tay.
+ Cầm 2 ngón tay 1,2. Thân ống nghiệm kẹp giữa 2 ngón tay. Thường dùng
tay trái cầm ống nghiệm. Tay phải cầm que cấy.
- Mở nút ống nghiệm: dùng mô út của bàn tay phải mở nút ống nghiệm. Tay
trái xoay và kéo ống nghiệm ra khỏi nút.
- Đóng nút ống nghiệm: làm như mở nút nhưng đẩy ống nghiệm vào nút theo
hướng ngược lại khi mở nút.
- Khử khuẩn ống nghiệm:
+ Sau khi mở nút ống nghiệm, phải hơ nóng miệng ống nghiệm trên ngọn
lửa đèn cồn trước khi lấy bệnh phẩm (vừa hơ vừa xoay tròn miệng ống
nghiệm).
+ Phải khử khuẩn lại trước khi đậy ống nghiệm.
2.3.Sử dụng hộp Petri (hộp lồng)
- Cách cầm hộp Petri: (có 2 cách) thường dùng tay trái để cầm hộp Petri.
+ Dùng cả bàn tay để đỡ đáy hộp và dụng một ngón tay cố định lên bờ nắp
hộp.
+ Dùng ngón tay 3,4,5 đỡ đáy hộp, hai ngón 1 và 2 vịng theo chu vi nắp
hộp.
- Mở và đóng nắp hộp Petri: dùng ngón 1 để mở và đóng nắp hộp.
* Chú ý: Ít khi mở tồn bộ nắp hộp, thường mở một phần để hạn chế vi khuẩn từ
khơng khí rơi vào trong hộp Petri.

2.4. Sử dụng ống hút
- Có 2 loại ống hút: ống hút khắc độ và ống hút Pasteur.
- Các ống hút đều có bơng nút ở đầu, được bọc giấy và được khử khuẩn ở
0
170 C/30 phút trước khi sử dụng. khi dùng, các ống hút khơng phải khử khuẩn lại.
- Dùng quả bóp cao su để hút dung dịch.
- Cắm ống hút đã dùng vào bình chứa dung dịch khử khuẩn.
9


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
III. CÁC KỸ THUẬT TIỆT KHUẨN BẰNG NHIỆT
1. Tiệt khuẩn bằng nhiệt khơ
1.1. Phương pháp đốt:
Dùng lị đốt nhỏ để đốt xác động vật thí nghiệm, bơng gạc bẩn. Dùng cồn đốt
các dụng cụ tiểu phẫu thuật hoặc dùng đèn cồn, đèn gaz khử khuẩn miệng ống
nghiệm, đầu kim loại que cấy.
1.2. Sấy khơ bằng khơng khí nóng (dùng tủ sấy khơ):
a. Ngun lý: dùng tủ kín bằng kim loại có nguồn nhiệt nâng nhiệt độ khơng khí
trong tủ lên tới 170-1800C. Ở 1700C /60 phút hoặc 1600C /120 phút tất cả các vi
khuẩn và nha bào đều bị diệt do quá trình mất nước của tế bào vi sinh vật.
b. Cấu trúc của tủ sấy:
- Bộ phận điều chỉnh dòng điện
- Nhiệt kế
- Bộ phận ngắt tự động (phòng khi nhiệt độ lên quá mức yêu cầu)
- Các đèn hiệu (để báo cho dịng điện có hoạt động hay không).
c. Cách sử dụng:
- Cho các đồ vật cần sấy vào tủ (ống nghiệm, ống hút, hộp lồng Petri,…), các
dụng cụ này sau khi được rửa sạch, phơi khô, phải được gói thành từng gói bằng
giấy. Để đồ vật trên giá lưới thép, tránh chạm vào thành tủ vì nhiệt độ ở thành tủ

cao có thể làm cháy giấy bọc hoặc làm vỡ đồ thủy tinh.
- Đóng mạch điện (mở nguồn nhiệt) chờ khi nhiệt kế chỉ đủ nhiệt độ u cầu
thì duy trì ở nhiệt độ đó trong 30 phút. Tắt nguồn nhiệt.
- Chờ nhiệt độ hạ xuống khoảng 50-600C (mùa hè) và 30-400C (mùa đông)
mới được mở tủ lấy dụng cụ ra.
* Lưu ý:
+ Tủ sấy chỉ dùng để sấy dụng cụ thủy tinh, không sấy đồ nhựa, cao su. Dụng
cụ kim loại có thể sấy, nhưng nếu sấy thì sẽ bị gỉ, giịn và dể gãy.
+ Cửa tủ sấy và lổ thơng hơi phải được đậy kín khi bắt đầu sấy. Chú ý theo dõi
các đèn hiệu và nhiệt kế. khi nhiệt độ nâng cao không được mở tủ. Muốn mở tủ sấy
phải mở lỗ thông hơi trước.
+ Sau khi sấy, đồ vật được lấy ra nên để trên giấy, vãi, gỗ vì để trực tiếp xuống
nền đá lạnh thì làm đồ vật dễ vỡ. Có thể kiểm tra nhiệt độ sấy có đủ đảm bảo khử
khuẩn khơng bằng cách xem các nút bơng: nếu có màu nâu là vừa, nếu nút bơng cịn
màu trắng là nhiệt độ thấp (<1400C) chưa đạt yêu cầu; nút bông cháy đen là nhiệt độ
quá cao.
10


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
+ Dụng cụ sấy vơ khuẩn có thể dùng trong 7 ngày. Khi để quá thời gian này thì
phải sấy lại.
2. Tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm
2.1. Phương pháp luộc sôi dụng cụ:
Đun sơi và duy trì nhiệt độ 1000C trong thời gian 30 phút. Muốn làm nhiệt độ tăng
thì cho thêm 1-2% Na2CO3.
Ứng dụng: thường dùng để tiệt khuẩn bơm kim tiêm, dụng cụ tiểu phẫu thuật.
2.2. Tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm dưới áp lực (dùng nồi hấp Autoclave):
a. Nguyên lý:
Trong một nồi kín khơng có khơng khí, chỉ có hơi nước, khi áp lực hơi nước tăng

thì nhiệt độ cũng tăng theo một tương quan nhất định. Trong nồi kín khi nhiệt độ
duy trì ở 110-1210C /30 phút tương ứng với áp lực 1-1,2 at thì các vi khuẩn và nha
bào đều bị tiêu diệt.
b. Cấu trúc nồi hấp:
- Nồi hấp là một loại thùng có 2 lớp vỏ:
+ Lớp vỏ ngồi rất dày, có thể chịu được áp suất tới 5-6 at.
+ Lớp vỏ trong dùng để đựng đồ cần hấp.
- Nắp nồi hấp bằng thép dày, chắc, có các ốc để vặn giữ cho nắp khơng bị bật
khi áp suất trong nồi lên cao.
- Đồng hồ đo áp lực và nhiệt độ.
- 1 van xả hơi.
- 1 van an toàn.
- 1 van ở nơi đổ nước vào.

11


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược

Nồi hấp tiệt trùng áp suất cao
c. Cách sử dụng:
- Đổ nước cất vào nồi với số lượng quy định (quan sát vạch mức nước). Mỗi
lần hấp nên thay nước.
- Mở nắp nồi, xếp các đồ vật cần hấp vào (môi trường, sinh phẩm, đồ vải, đồ
nhựa…). Giữa các vật thuỷ tinh bên trong có chứa chất lỏng thì nên chèn vải để khi
sôi không chạm vào nhau, đồ vật hấp không nên để sát với nhau và sát thành quá.
Đậy nắp, vặn ốc từng cặp đối diện nhau để tránh kênh nồi hấp.
- Điều chỉnh kim đồng hồ áp kế (1at).
- Đóng mạch điện. Khi nước sơi thì mở van xả hơi, lúc đầu hơi trắng và chưa
đều, khi hơi ra đều và trong xanh thì mới đóng van lại. Làm như vậy để khơng khí

trong nồi hấp ra hết nhằm tránh sai lệch về nhiệt độ, áp suất (có thể kiểm tra khơng
khí trong nồi cịn hay hết bằng cách dùng 1 ống cao su, một đầu lắp vào khố thốt
khí, đầu kia nhúng vào một chậu nước lạnh. Khi không thấy sủi bọt trong chậu nước
là chứng tỏ khơng khí trong nồi đã ra hết). Đóng van xả hơi và van an tồn.
- Tiếp tục đun nóng đến khi kim áp kế chỉ 1at, nhiệt độ 1210C thì duy trì trong
30 phút. Với các mơi trường dinh dưỡng chỉ cần duy trì 1210C trong 15-20 phút.
Ngắt điện khi đủ thời gian cần thiết.
- Chờ kim áp kế chỉ về số 0 mới mở nắp nồi cho thoát hơi ra từ từ và lấy dụng
cụ hoá chất đã khử khuẩn (phải vặn ốc nắp nồi ngay vì nếu chờ nguội hẳn thì nắp sẽ
dính chặt vào nồi rất khó mở).

12


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
* Lưu ý:
+ Phải kiểm tra van an tồn, vì nếu van hỏng có thể gây nổ rất nguy hiểm.
+ Phải có mặt thường xuyên bên cạnh chỗ hấp suốt thời gian vận hành.
+ Không để nhiệt độ tăng quá cao làm vỡ dụng cụ hoặc hỏng môi trường.
+ Không tháo hơi ra quá nhanh làm thuỷ tinh có thể bị nứt và các nút bình mơi
trường có thể bị bật ra ngoài.
+ Dụng cụ hấp ướt chỉ dùng trong 3 ngày. Mơi trường trong bình kín hoặc ống
nghiệm có thể giữ được 1 tuần.
* Ứng dụng: Đây là phương pháp tiệt khuẩn rất tốt và thường được dùng tại các
bệnh viện, các phịng thí nghiệm và các cơ sở y tế để khử khuẩn dụng cụ kim loại,
cao su, nhựa, băng gạc, mơi trường, hố chất…
2.3. Phương pháp Tyndall:
a. Nguyên lý: ở nhiệt độ 60-800C trong một giờ, protein của vi khuẩn bị đơng
vón lại. Khi nhiệt độ này trở về bình thường, nha bào phát triển thành thể sinh
dưỡng. Sau 24 giờ lại đun nóng lần 2, làm như vậy 3-4 ngày liền và cuối cùng các

vi khuẩn còn lại sẽ bị tiêu diệt.
b. Ứng dụng: Thường dùng để tiệt khuẩn sinh phẩm, huyết tương, huyết
thanh. Vì một số hoá chất, sinh phẩm sẽ bị huỷ hoại khi khử khuẩn ở nhiệt độ cao.
IV. KHỬ KHUẨN BẰNG HOÁ CHẤT
Nhiều loại hố chất khác nhau dùng cho mục đích này:
1. Các loại cồn:
Cồn etylic và isopropylic 60-850 có tác dụng khử khuẩn, cồn methylic có tác
dụng khử khuẩn kém hơn cồn etylic và isopropylic. Cồn có tính chất giết chết vi
khuẩn, nấm và vi khuẩn lao, khơng có tác dụng diệt nha bào. Cồn etylic có tác dụng
giết nhiều loại virut hơn isopropylic. Cả cồn etylic và isopropylic đều có tác dụng
chống lại HIV.
Sự hiện diện của nhiều chất hữu cơ có thể làm giảm tác dụng của cồn. Trong
phịng thí nghiệm các chất có nhóm acol dùng để làm sạch các bề mặt của dụng cụ.
Cồn bay hơi và dễ cháy nên cần dùng nơi thoáng và cách xa ngọn lửa.

13


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
2. Các hợp chất Phenol:
Phenol không dùng như chất khử khuẩn vì độc tính cao, gây ung thư và làm
tổn thương da. Các dẫn chất phenol trong đó các nhóm hoá học chloro, bromo, alky,
benzyl, phenyl thay thế một nguyên tử hydro ở nhân thơm thường được dùng làm
chất khử khuẩn. Việc thay thế các nhóm hố học này làm giảm độc tính, giảm tính
chất ăn mịn và giảm khả năng gây ung thư của phenol. Tuy nhiên nó vẫn cịn tính
chất gây kích thích và có thể hấp thụ qua da, do vậy khi dùng cần chú ý.
Các dẫn chất phenol thường làm chất khử khuẩn là ortho-phenyl phenol, ortho
benzyl-parachlorphenol. Khi thêm chất có tác dụng tẩy vào cơng thức cơ bản tạo
nên chất có tác dụng tẩy rửa và khử khuẩn. Các dẫn chất phenol khơng có tác dụng
diệt nha bào, nhưng khi dùng với nồng độ thích hợp và cho tác dụng ở thời gian

thích hợp chúng có tác dụng diệt vi khuẩn, diệt nấm, vi khuẩn lao và virut. HIV bị
bất hoạt ở nồng độ 0,5%, nồng độ bất hoạt nấm là 2%. Dung dịch khử khuẩn
thường sử dụng có nồng độ từ 2-5%. Khi sử dụng với nồng độ thấp thì cần để thời
gian lâu hơn.
3. Các hợp chất ammonium bậc 4:
Các ammonium bậc 4 là các chất tẩy có tác dụng bề mặt, chúng có tác dụng
kìm khuẩn, kháng nấm ở nồng độ khá thấp. Khi ở nồng độ trung bình và nồng độ
cao chúng có tác dụng diệt vi khuẩn, nhưng khơng có tác dụng diệt nha bào, vi
khuẩn Mycobacteria và nhiều loại virut ngay với nồng độ cao. Vi khuẩn
Pseudomonas có thể phát triển trong các hợp chất ammonium bậc 4, và nhiều vụ
dịch bệnh do nhiễm trùng các vi khuẩn Gram âm được báo cáo do các vi khuẩn này
nhiễm bẩn các dung dịch ammonium bậc 4. Tác dụng giết chết vi khuẩn của các
ammonium bậc 4 do làm phá vỡ màng tế bào, bất hoạt enzyme, làm biến tính
protein.
Các ammonium bậc 4 khơng có màu, khơng có tính chất nhuộm màu, khơng
có tác dụng ăn mịn, khơng độc và rẻ. Tác dụng của các chất ammonium bậc 4 giảm
khi có mặt các chất hữu cơ, các chất tẩy xà phòng, những chất vải, băng gạc.
4. Các hợp chất halogen:
Các nhóm chất halogen như bromine, chlorine, fluorine và iodine. Tuy nhiên
chỉ có chlorine và iodine thường dùng để khử khuẩn trong phịng thí nghiệm.
Những chất thuần khiết của chlorine hoặc iodine khơng ổn định, có tính chất ăn
mịn và độc. Do vậy các halogen này được phối hợp với các hoá chất khác như
chlorine kết hợp với p-toluen-sulfonamide gọi là chloramine-T chất thường dùng để
khử khuẩn và tẩy uế nền phòng thí nghiệm. Iodine kết hợp với các chất mang như
polyvinylpyrrolidone. Chlorine là một chất khử khuẩn thường dùng, chlorine dạng
14


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
vô cơ như natri hypochlorite (NaOCl) dùng để khử khuẩn nước và tẩy trắng ở nồng

độ 1-5%. Chlorine bị bất hoạt bởi máu, huyết thanh và các chất có chứa protein.
5. Muối kim loại:
Thường dùng các hợp chất muối kim loại như muối thuỷ ngân, dung dịch
HgCl2 1/1000 đã từng được sử dụng như chất khử khuẩn trong phịng thí nghiệm.
Các hợp chất thuỷ ngân hữu cơ ít độc hơn và có tác dụng cản khuẩn nên được dùng
là chất sát khuẩn như merthiolate…Một số muối kim loại khác được dùng làm chất
sát khuẩn như nitrate bạc dùng làm dung dịch nhỏ mắt (1%)…
Hiện nay những hợp chất muối kim loại không được dùng làm chất khử khuẩn
và tẩy uế phịng thí nghiệm vì độc tính cao và gây ơ nhiễm môi trường.
IV. CHỌN LỰA CÁC CHẤT KHỬ KHUẨN ĐỂ SỬ DỤNG
Khơng có một chất khử khuẩn nào là chất lý tưởng. Do vậy khi sử dụng trong
phịng thí nghiệm cần chọn lựa các chất khử khuẩn cẩn thận dựa vào các yếu tố sau:
- Loại và số vi khuẩn cần loại bỏ.
- Loại và lượng chất hữu cơ hiện diện.
-Thời gian tác dụng.
- Kiểu bề mặt diện tích cần khử khuẩn, khả năng bị ăn mòn và hỏng.
- Loại nước dùng để hồ lỗng, vì nước cứng làm giảm khả năng giết vi khuẩn
của một số chất khử khuẩn.
- An tồn khi sử dụng và khơng gây ơ nhiễm môi trường.
- Dễ pha chế và sử dụng.
- Giá cả phải chăng.
- Khả năng nhà sản xuất ghi đúng tác dụng của chất khử khuẩn.
V. RỬA CÁC DỤNG CỤ THUỶ TINH TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM
1. Xử lý dụng cụ thuỷ tinh mới
Các đồ dùng bằng thuỷ tinh pyrex hoặc các dụng cụ thuỷ tinh đã được nhà sản
xuất rửa bằng soda khơng cần xử lý trước khi dùng, ngồi rửa nước bình thường.
Tuy nhiên các đồ thuỷ tinh khơng được rửa soda phải ngâm trong dung dịch acid
chlohydric 2% qua đêm để trung hồ bớt tính kiềm chứa trong thuỷ tinh.

15

Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
2. Xử lý các dụng cụ thuỷ tinh đã dùng
Tất cả dụng cụ thuỷ tinh có mơi trường cấy vi khuẩn hoặc bị nhiễm bẩn vi
khuẩn cần phải hấp tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút, hấp tiệt trùng cũng cho phép
làm cho môi trường trở nên lỏng ra để dễ lấy. Đồ thuỷ tinh đã tiệt trùng phải rửa
dưới vòi nước chảy, sau khi đã ngâm trong dung dịch xà phòng và cuối cùng dùng
bàn chải để rửa sạch. Trong phịng thí nghiệm vi sinh nên dùng loại xà phịng đặc
dụng đảm bảo một số tính chất sau:
- Phải rửa sạch các chất cặn dính như protein, mỡ…
- Xà phịng và các chất cặn phải trơi đi khi rửa dưới vịi nước.
- Khơng làm hỏng dụng cụ thuỷ tinh và không hại da.
Khi rửa cần phải lấy các nút cao su, các vòng kim loại khỏi dụng cụ thuỷ tinh,
các nắp vặn có rãnh cao su phải lấy ra để cho tất cả bề mặt của dụng cụ được rửa
sạch.
Sau khi rửa bằng xà phòng, rửa các dụng cụ dưới vòi nước máy ấm 5 lần, rửa
lại 3 lần với nước cất, để ráo trước khi sấy trong tủ sấy.
Những dụng cụ làm với thuốc thử, hoá chất sau khi làm xong cần phải rửa
bằng xà phòng, dùng chổi lơng để rửa bên trong, và rửa kỹ dưới vịi nước chảy, sau
đó rửa lại với nước cất, rồi làm ráo nước trên giá.
Pipette và hộp lồng thuỷ tinh sau khi rửa và để ráo nước nên xếp vào hộp đựng
bằng kim loại hoặc gói riêng vào trong các gói giấy trước khi đem sấy.
3. Xử lý các dụng cụ thải:
Các dụng cụ lấy bệnh phẩm và lam kính để nhuộm vi khuẩn nên sử dụng một
lần. Dĩa petri bằng plastic, pipette và chai lọ dùng một lần nên hấp tiệt trùng ở
1210C /20 phút trước khi thải, các lam kính và lamelle cho vào một bình đựng thuốc
khử khuẩn rồi loại không cần tiệt trùng.

CÂU HỎI LƢỢNG GIÁ:

1. Nêu ý nghĩa của thao tác kỹ thuật vô khuẩn trong thực hành vi sinh vật.
2. Trình bày quy trình sử dụng tủ sấy để tiệt khuẩn các dụng cụ.
3. Trình bày quy trình sử dụng nồi hấp để tiệt khuẩn.
4. Kể tên các hoá chất dùng để khử khuẩn trong phịng thí nghiệm.
5. Trình bày cách xử lý các dụng cụ thuỷ tinh bị nhiễm bẩn.
16


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược

KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN VÀ
CÁC PHƢƠNG PHÁP NHUỘM VI SINH VẬT
Mục tiêu:
1. Nắm được khái niệm và các loại kỹ thuật nhuộm vi khuẩn.
2. Trình bày được cách làm tiêu bản vi sinh vật.
3. Nắm được thao tác kỹ thuật của phương pháp nhuộm đơn.
I. ĐẠI CƢƠNG VỀ NHUỘM VI KHUẨN
1. Khái niệm về nhuộm vi khuẩn
Người ta có thể soi tươi vi khuẩn, do tính chất chiết quang của vi khuẩn người
ta có thể nhận biết hình thể của chúng nhưng khó quan sát. Những nhà vi khuẩn học
đầu tiên như Pasteur đã quan sát trực tiếp vi khuẩn không nhuộm. Hiện nay soi tươi
chỉ sử dụng để quan sát sự di động của vi khuẩn và người ta thường khảo sát các
tiêu bản vi khuẩn đã giết chết và nhuộm màu. Nhuộm vi khuẩn lần đầu tiên do
Weigert áp dụng năm 1877, tiếp theo do Koch, Gram, Unna…
Phương pháp nhuộm giúp cho chúng ta quan sát vi khuẩn, phát hiện những đặc
điểm hình thái cũng như một số cấu trúc dễ dàng hơn, rõ hơn.
2. Các loại thuốc nhuộm vi khuẩn
Các thuốc nhuộm vi khuẩn thường là các muối. Căn cứ vào thành phần mang
màu của thuốc nhuộm mà người ta chia các thuốc nhuộm làm 2 loại:
- Thuốc nhuộm bazơ gồm các cation có màu và một anion khơng màu. Ví dụ:

Xanh Methylen. Tế bào vi khuẩn giàu protein và acid nucleic chứa những nhóm
PO4 có điện tích âm, những nhóm này kết hợp với các cation của thuốc nhuộm bazơ
làm cho dễ dàng nhuộm màu các thành phần của tế bào vi khuẩn. Vì acid nucleic
tập trung dày đặc ở trong nguyên tương, cũng như trong nhân nên thuốc nhuộm
bazơ nhuộm đều tế bào vi khuẩn.
- Thuốc nhuộm acid thì ngược lại, các anion có màu và một cation khơng màu,
ví dụ sodium, eosinat. Thuốc nhuộm acid không nhuộm tế bào vi khuẩn mà thường
được sử dụng để nhuộm nền tiêu bản tạo nên một màu tương phản, đó là nhuộm âm.
Nhuộm âm thường được áp dụng đối với những tế bào hoặc cấu trúc khó nhuộm
trực tiếp.
3. Giới thiệu sơ lƣợc các loại kỹ thuật nhuộm vi khuẩn
Người ta chỉ sử dụng một loại thuốc nhuộm trong phương pháp nhuộm đơn,
trong phương pháp nhuộm kép, 2 hoặc nhiều thuốc nhuộm được sử dụng trên cùng
một tiêu bản.
Trong các phương pháp nhuộm kép trong đó quan trọng nhất là phương pháp
nhuộm Gram và phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen có thể giúp phân biệt các nhóm
vi khuẩn nên đây là các phương pháp nhuộm phân biệt.
17


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
Người ta còn sử dụng những phương pháp nhuộm đặc biệt để nhận biết những
cấu trúc bên trong riêng biệt của tế bào vi khuẩn như vỏ, vách, màng tế bào, nhân,
bào tử, những hạt dị nhiễm sắc…
II. CÁCH LÀM TIÊU BẢN
Làm tiêu bản để nhuộm gồm 3 bước:
1. Dàn mỏng vết bôi: vết bôi phải được dàn đều và đủ mỏng.
Muốn thế phải chọn phiến kính thật sạch và khô không dây dầu mỡ, không bị
mốc. Khử trùng que cấy, lấy một quai canh khuẩn hoặc một quai vi khuẩn ở mơi
trường đặc hồ trong một giọt nước cất vơ trùng đã đặt trước ở trên phiến kính.

Dùng que cấy từ từ dàn mỏng bằng động tác nhẹ nhàng theo đường xoắn ốc từ
trong ra ngoài tạo nên một diện tích khoảng 1 cm2 hình vng hoặc hình trịn.
2. Làm khô:
Làm khô là một động tác đơn giản nhưng cần tách rời cố định thành một bước.
Tốt nhất là để khơ tự nhiên ở nhiệt độ trong phịng hoặc để vào tủ ấm 370C. Cũng
có thể đưa tiêu bản gần ngọn lửa.
Trường hợp cố định bằng cồn nếu vết bơi chưa khơ mà cố định thì vi khuẩn sẽ
trơi mất. Trường hợp cố định bằng nhiệt nếu vết bôi chưa khơ mà cố định thì vi
khuẩn sẽ khơng chết hoặc biến dạng.
3. Cố định: Cố định có 3 mục đích:
- Giết chết vi khuẩn
- Làm cho vi khuẩn gắn chặt vào phiến kính
- Làm cho vi khuẩn bắt màu tốt hơn (protein chết bắt màu tốt hơn protein
sống).
Có nhiều phương pháp cố định tiêu bản:
- Cố định bằng nhiệt: Đưa phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần, lâu
chừng vài giây. Hơ mặt dưới, không hơ đến nóng bỏng.
- Cố định bằng rượu etylic 96% trong 5-20 phút.
- Cố định bằng rượu metylic trong 5 phút.
III. PHƢƠNG PHÁP NHUỘM ĐƠN
Nhuộm đơn rất đơn giản chỉ dùng một loại thuốc nhuộm duy nhất, phương
pháp nhuộm nhanh chóng cho phép khảo sát hình thể và kích thước của vi khuẩn.
Phương pháp nhuộm đơn bằng Xanh Methylen kiềm còn có thể phát hiện những hạt
dị nhiễm sắc của vi khuẩn bạch hầu.
1. Thuốc nhuộm: Người ta có thể dùng một trong các dung dịch thuốc nhuộm như
sau: xanh methylene, tím gentian, safranin …
2. Kỹ thuật nhuộm:
- Phủ lên tiêu bản đã cố định 1 giọt thuốc nhuộm cho tác dụng trong 3 đến 5
phút.
- Rửa nước, thấm khô.

18


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
3. Kết quả soi kính: Tế bào vi khuẩn bắt màu xanh biển nhạt, các hạt biến sắc bắt
màu tím đen.
IV. PHƢƠNG PHÁP NHUỘM GRAM
1. Nguyên lý:
Khi nghiên cứu để kiểm tra tế bào vi khuẩn trong tổ chức động vật nhà khoa
học Đan Mạch Christian Gram và cộng sự (1884) đã phát minh một phương pháp
nhuộm đặc biệt được gọi là phương pháp nhuộm gram.
Trong phương pháp nhuộm này tiêu bản vi khuẩn được nhuộm với dung dịch
tím gentian, cắm màu bằng dung dịch lugol rồi tẩy màu bằng cồn và cuối cùng
nhuộm tương phản bằng dung dịch safranin. Người ta nhận thấy vi khuẩn được
phân loại thành 2 nhóm, vi khuẩn bắt màu tím được gọi là vi khuẩn gram dương, vi
khuẩn bị tẩy mất màu tím là vi khuẩn gram âm, loại vi khuẩn này sẽ bắt màu hồng
nhạt ở bước nhuộm tương phản.
Sự sai biệt trong bắt màu gram liên hệ đến các đặc tính sinh vật học và di
truyền học của vi khuẩn. những nghiên cứu cho thấy giữa 2 nhóm vi khuẩn gram
dương và vi khuẩn gram âm có những sai khác về cấu trúc của vách tế bào, vì thế có
sự khách nhau về tính thấm đối với cồn, các vi khuẩn gram dương có vách dày, khó
thấm đói với cồn nên khơng bị tẩy màu sau bước tẩy cồn, vì vậy vi khuẩn giử
ngun màu tím của gentian, cịn các vi khuẩn gram âm do vách mỏng hơn, dễ thấm
đối với cồn nên bị tẩy mất màu tím ở bước nhuộm đầu tiên, sau đó sẽ bắt màu hồng
của safranin khi nhuộm tương phản. vì thế bước tẩy màu bằng cồn trong nhuộm
gram rất quan trọng. nếu ch cồn tác dụng cồn lâu quá thì vi khuẩn gram dương cũng
bị tẩy màu và trở thành bắt màu của vi khuẩn gram âm và ngược lại.
Nhuộm gram là phương pháp nhuộm phân biệt, nó cho phép phân loại vi
khuẩn thành 2 nhóm là vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm, điều này có ý
nghĩa giúp cho chuẩn đốn và sơ bộ giúp cho người thầy thuốc có hướng chnj

kháng sinh diều trị bệnh.
2. Thuốc nhuộm
- Dung dịch tím gentian hoặc tím tinh thể:
+ Tím tinh thể
2g
+ Cồn ethylic 95%
20ml
+ Ammonium oxalat
0,8g
+ Nước cất
80ml
- Dung dịch lugol:
+ Iốt tinh thể
1g
+ KI
2g
+ Nước cất
300ml
19


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
- Dung dịch Safranin 0,25%:
+ Iốt tinh thể
+ Rượu eetylic 95%
+ Nước cất

1g
10ml
90ml

3. Kỹ thuật nhuộm
- Nhỏ dung dịch tím gentian lên tiêu bản đã cố định cho tác dụng môt phút.
Nghiêng tiêu bản và đổ thuốc nhuộm, rửa nước nhẹ.
- Nhỏ dung dịch lugol lên tiêu bản cho tác dụng một phút. Nghiêng tiêu bản và
đổ dung dịch lugol, rửa nước nhẹ.
- Nhỏ vài giọt cồn lên tiêu bản, nghiêng phiến kính quay lại để cồn chảy từ
phiến kính bên này sang cạnh bên kia, mắt quan sát màu tím, khi nào vết bơi hết tím
thì rửa nước ngay. Thời gian tẩy màu từ 10 đến 30 giây tùy theo bề dày của vết bôi.
- Nhỏ dung dịch safranin lên tiêu bản cho tác dụng trong một phút. Nghiêng
tiêu bản đổ thuốc nhuộm, rửa nước nhẹ. Thấm khô soi kính.

Các bước tiến hành nhuộm Gram
20


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
4. Kết quả soi kính: cho thấy vi khuẩn gram dương bắt màu tím, gram âm bắt màu
hồng hay màu đỏ Fuchsin.
V. PHƢƠNG PHÁP NHUỘM ZIEHL-NEELSEN
1. Nguyên lý
Ehrlich là người đầu tiên phát minh phương pháp nhuộm vi khuẩn kháng axit
(1882), ơng nhuộm vi khuẩn lao bằng dung dịch tím gentian. Sau đó ơng phát hiện
nếu tẩy màu bằng HCL ( axit chlohydric) thì vi khuẩn lao khơng bị mất màu trong
khi những vi khuẩn khác và tổ chức động vật đều bị mất màu. Sau đó Ziehl (1882)
và Neelsen (1883) đã cải tiến phương pháp nhuộm và xây dựng một quy trình
nhuộm thường được gọi là phương pháp nhuộm Ziehl Neelsen.
Nguyên lý của phương pháp nhuộm là dùng một loại thuốc nhuộm mạnh, dung
dịch fuchsin có phenol của Ziehl cho tác dụng một thời gian dài hoặc dùng nhiệt độ,
hóa chất giúp cho thuốc nhuộm thấm ngấm qua vách tế bào vi khuẩn. sau khi rửa

sạch nước người ta tẩy màu bẳng hổn hợp axit vô cơ mạnh và cồn, vi khuẩn không
bị tẩy màu (vi khuẩn vẫn bắt màu đỏ) được gọi là vi khuẩn kháng axit- cồn.
2. Thuốc nhuộm
- Dung dịch Fuchsin có phenol
+ Fuchsin
+ Ethanol
+ Phenol
+ Nước cất
- Dung dịch HCL, cồn 95%

0,3g
10ml
5g
100ml

Cho từ từ 3ml HCL đậm đặc vào 97ml cồn 95% để được 100ml.
- Dung dịch xanh meetylen kiềm
+ Xanh mêtylen
+ Nước cất
3. Kỹ thuật nhuộm
3.1. Kỹ thuật nhuôm cổ điển bằng nhiệt:

0,3g
100ml

- Phủ lên tiêu bản đã cố định một lớp Fuchsin có phenol, hơ nóng dưới ngọn
lửa đèn cồn cho đến khi bốc khói trắng. Để 5 phút. Rửa nước.
Chú ý: khơng để dung dịch thuốc nhuộm sôi hoặc khô.
- Ngâm vào dung dịch axit, cồn trong 3 phút cho đến khi các tiêu bản khơng
cịn màu đỏ. Rửa nước.

21


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
- Phủ dung dịch xanh metylen kiềm, cho tác dụng trong 30s, rửa nước, thấm
khơ, soi kính.
3.2. Kỹ thuật nhuộm lạnh:
- Phủ lên tiêu bản đã cố định một lớp Fuchsin, thêm một giọt viso 1%, cho tác
dụng trong 2 phút, rửa nước.
- Ngâm vào dung dịch axit, cồn trong 3-5 phút cho đến khi tiêu bản khơng có
màu đỏ, rửa nước.
- Phủ dung dịch xanh metylen, cho tác dụng trong 3 phút, rửa nước, khơ soi
kính.
4. Kết quả soi kính: Vi khuẩn kháng axit-cồn như vi khuẩn lao, BCG, vi khuẩn
bệnh phong bắt màu đỏ tươi. Những vi khuẩn thơng thường tìm thấy trong đàm và
các tế bào của tổ chức động vật bạch cầu, tế bào thượng bì bắt màu xanh, tất cả
trên một màu xanh nhạt.
CÂU HỎI LƢỢNG GIÁ:
1. Trình bày mục đích của nhuộm vi sinh vật.
2. Kể tên các kỹ thuật nhuộm vi sinh vật.
3. Trình bày cách làm tiêu bản vi sinh vật.
4. Trình bày nguyên tắc của phương pháp nhuộm Gram.
5. Trình bày nguyên tắc của phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen.

22


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược

CÁCH LẤY, BẢO QUẢN VÀ VẬN CHUYỂN
BỆNH PHẨM TRONG CHẨN ĐOÁN VI SINH VẬT
Mục tiêu:
1. Nắm được các nguyên tắc lấy, bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm.
2. Biết được cách lấy các bệnh phẩm để làm xét nghiệm vi sinh vật.
I. KHÁI NIỆM VỀ BỆNH PHẨM VÀ NGUYÊN TẮC LẤY BỆNH PHẨM
1. Khái niệm về bệnh phẩm
Bệnh phẩm là những phẩm vật lấy từ bệnh nhân như phân, nước tiểu, máu, mủ,
các loại dịch chọc hay mẫu sinh thiết…dùng để xét nghiệm với mục đích xác định
mầm bệnh (tìm ngun nhân) giúp cho việc chẩn đốn, điều trị chính xác, triệt để.
Nếu các bệnh phẩm lấy từ môi trường, thực phẩm… thì được gọi là mẫu
nghiệm.
2. Một số nguyên tắc cơ bản
Việc tuân thủ các nguyên tắc và phương pháp lấy, bảo quản và vận chuyển
bệnh phẩm sẽ quyết định đến chất lượng xét nghiệm. Cần tuân thủ tuyệt đối 4
nguyên tắc cơ bản sau đây:
(1) Bảo đảm tuyệt đối vô trùng cả dụng cụ đựng bệnh phẩm và thao tác kỹ
thuật lấy bệnh phẩm nhằm:
- Tránh gây tạp nhiễm cho bệnh phẩm làm mất chính xác kết quả thí
nghiệm.
- Tránh gây nhiễm bẩn và nhiễm khuẩn cho bệnh nhân.
- Bảo đảm an tồn cho người làm và mơi trường xung quanh.
(2) Lấy đúng nơi, đúng lúc, đúng thời gian theo tính chất của bệnh và theo yêu
cầu xét nghiệm.
Ví dụ: ở bệnh nhân nghi thương hàn: tuần thứ nhất lấy máu ở bệnh nhân đang
sốt để cấy máu, tuần thứ hai lấy máu để chẩn đoán huyết thanh, tuần thứ ba lấy phân
để phân lập mầm bệnh. Lấy máu để cấy máu phải lấy 5-10 ml, để làm phản ứng
huyết thanh chỉ cần lấy 3 ml, lấy phân phải lấy ở chỗ nghi ngờ bằng dụng cụ vô
trùng và không chạm vào thành bô, bô khử trùng bằng nước sơi, khơng có hố chất
sát trùng.

(3) Bệnh phẩm và vật phẩm gửi đi xét nghiệm phải bảo quản đúng quy định:
(3.1)Bệnh phẩm và vật phẩm thường:
- Để chẩn đoán vi khuẩn không nhất thiết phải bảo quản lạnh, nhưng phải
để trong lọ vơ trùng nút kín, gửi đi xét nghiệm càng sớm càng tốt, không để lâu
quá 2 giờ. Nếu thời gian vận chuyển lâu phải cho vào môi trường vận chuyển.
23


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
- Để chẩn đoán virus và Rickettsia cần bảo quản lạnh.
(3.2) Bệnh phẩm và vật phẩm nguy hiểm, có khả năng lây lan mạnh (than,
tả, dịch hạch, virut Arbo…)
Bệnh phẩm lấy xong cho vào lọ vơ trùng nút kín, đặt cả lọ vào một ống kim
loại hoặc gỗ có chèn lót bơng tẩm thuốc sát trùng, sau đó lại cho tất cả vào một
hộp kim loại hoặc gỗ có chèn lót bơng như trên, dán nhãn, niêm phong cẩn thận,
cử người mang đến tận nơi xét nghiệm.
(4) Tất cả bệnh phẩm, vật phẩm phải có phiếu yêu cầu xét nghiệm kèm theo và
ghi rõ:
- Họ tên bệnh nhân
- Tên bệnh phẩm, vật phẩm
- Người lấy bệnh phẩm
- Ngày, giờ lấy.
- Nơi lấy
- Chẩn đoán sơ bộ.
- Yêu cầu xét nghiệm.
- Người viết phiếu xét nghiệm.
II. CÁC LOẠI BỆNH PHẨM, MẪU NGHIỆM THƢỜNG LẤY
1. Máu
- Cấy máu tìm vi khuẩn cần lấy lúc bệnh nhân đang sốt, dùng bơm và kim tiêm
vơ trùng, lấy 5-10 ml bơm ngay vào bình mơi trường ni cấy.

- Để chẩn đốn huyết thanh lây 3-5 ml máu, chiết huyết thanh.
2. Các bệnh phẩm đƣờng hô hấp
2.1. Dịch họng:
- Tốt nhất lấy lúc sáng sớm, bệnh nhân chưa ăn uống gì (hoặc sau khi ăn 2
giờ). Dùng que tăm bông vô trùng quệt ở ngã ba mũi, hầu, họng, hai trụ trước
amidan, hoặc màng giả trong bệnh bạch hầu, đặt tăm bông vào ống nghiệm vô trùng
hoặc môi trường bảo quản (nếu vận chuyển xa).
- Dịch họng dùng để chẩn đốn nhiễm khuẩn hơ hấp ở trẻ em và nhiễm virut
đường hô hấp cả trẻ em và người lớn.
2.2. Dịch tỵ hầu:
Dùng tăm bông cán mềm, đàn hồi đưa qua lỗ mũi vào đến thành sau họng
(vùng tỵ hầu) để lấy dịch. Dịch này có giá trị chẩn đốn tốt hơn dịch họng vì ít lẫn
tạp khuẩn.
24


Bài giảng Thực hành Vi sinh căn bản – Khoa Dược
2.3. Đàm:
Lấy lúc sáng sớm, khi bệnh nhân chưa ăn uống,… vỗ nhẹ ngực và lung trước
khi lấy. Bệnh nhân khạc vào lọ rộng miệng có nắp, vơ trùng. Bệnh phẩm không
được lẫn nước bọt.
2.4. Dịch màng phổi:
Khi bệnh nhân có tràn dịch màng phổi thì dùng bơm kim tiêm vô trùng chọc
hút dịch qua khe liên sườn (phối hợp với bác sỹ lâm sàng) cho vào ống nghiệm.
2.5. Dịch hút qua sụn nhẫn giáp:
Dùng kim chọc vào sụn nhẫn giáp để hút dịch chẩn đoán trong trường hợp
bệnh nhân có thơng khí phổi nhân tạo hoặc viêm phổi-phế quản tắc nghẽn mãn
tính…
2.6. Dịch hút qua nội khí quản:
Trong trường hợp bệnh nhân có đặt nội khí quản và viêm đường hô hấp.

Lưu ý: Các bệnh phẩm đường hô hấp sau khi lấy phải chuyển đến phịng xét
nghiệm khơng q 2 giờ, nếu lâu hơn có thể dùng mơi trường Amies để vận chuyển
nhưng cũng không quá 24 giờ.
3. Các bệnh phẩm đƣờng tiêu hoá
3.1. Dịch dạ dày:
Lấy lúc sáng sớm khi bệnh nhân chưa ăn, dùng ống thông dạ dày lấy dịch cho
vào lọ vô trùng.
3.2. Chất nôn:
Lấy 5-10 ml cho vào lọ vơ trùng đậy kín, gửi ngay đến phòng xét nghiệm.
3.3. Thức ăn:
Lấy chỗ thức ăn nghi ngờ xét nghiệm tìm vi khuẩn hoặc độc tố.
3.4. Phân:
- Phân rắn: dùng que vô trùng lấy khoảng 1 đến 2 gam cho vào lọ vô trùng (lấy
chỗ nghi ngờ).
- Phân lỏng: dùng tăm bơng vơ trùng lấy chỗ có nhầy, máu cho vào ống
nghiệm. Có thể dùng tăm bơng lấy trực tiếp ở hậu môn, người lớn đưa tăm bông sâu
7cm, trẻ nhỏ khoảng 5cm.
25