tuyển chọn vi khuẩn lactic có tiềm năng probiotics

Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
CHƯƠNG 1 : MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề :
Ngày nay, các vấn đề khoa học công nghệ luôn nhận được sự quan tâm
đặc biệt nhằm phát triển hơn nữa để đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao của con
người. Chính vì lẽ đó, con người càng đòi hỏi khắt khe hơn về chất lượng của tất
cả những sản phẩm mà họ sử dụng trong đời sống hằng ngày, đặc biệt là đối với
sản phẩm có ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của chính bản thân họ. Bởi thế, có
thể nói rằng những nhu cầu này đã tạo nên tiền đề và cũng là tác nhân trực tiếp
thúc đẩy cho khoa học trên thế giới ngày càng phát triển hơn nữa.
Một trong số thành quả của công nghệ sinh học hiện nay có thể kể đến là
Probiotics. Theo tiếng Hy Lạp thì probiotics có nghĩa là “dành cho cuộc sống” và
nó hiện đang được ứng dụng vô cùng rộng rãi trong đời sống hằng ngày của con
người. Vậy probiotics là gì, tại sao nhu cầu sử dụng nó lại trở nên phổ biến ở
khắp nơi trên thế giới như thế? Và hiệu quả mà nó mang lại liệu có giúp ích nhiều
đến việc nâng cao chất lượng sống của con người chúng ta hay không?
Quả thật, probiotics mang rất nhiều lợi ích khác bên cạnh như : hỗ trợ
việc tiêu hóa thức ăn được tốt hơn và giảm sự rối loạn trong hệ đường ruột, đẩy
mạnh sự tổng hợp vitamin B, cải thiện sự dung nạp lactose, cải thiện chức năng
miễn dịch, ngăn chặn các chứng viêm nhiễm, giảm cholesterol, ức chế các vi
khuẩn gây hại trong ruột.
Do các công dụng hữu ích trên mà probiotics đã và đang được xem là một
trong những vấn đề cần quan tâm và nghiên cứu nhiều hơn nữa để ứng dụng vào
cuộc sống của con người. Hiện trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về
probiotics và thu được những kết quả đáng kể.
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 1
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
Hình 1.1 : Những công bố nghiên cứu về probiotics theo các năm [5]
So với những năm 90 thì số nghiên cứu về probiotics đã tăng vọt lên rất
nhiều trong thời gian gần đây (hình 1.1). Các nhà khoa học đã tìm ra hầu hết vi

khuẩn lactic được sử dụng phổ biến trong những sản phẩm lên men thông thường
để tạo ra các chế phẩm probiotic chất lượng phục vụ cho con người hằng ngày
như : sữa chua uống Yakult, men vi sinh sống hỗ trợ điều kiện bệnh rối loạn tiêu
hóa, …. Không những vậy, probiotics còn được chế biến để sử dụng cho các loài
vật nuôi khác để ứng dụng trong nông nghiệp và góp phần tác động cải thiện môi
trường. Điều hiển nhiên là do trên thực tế về mức độ an toàn sinh học và thiết
thực thì probiotics luôn ở vị trí đứng đầu so với các phương cách khác. Bởi lẽ, tác
động của probiotic xuất phát từ cơ chế điều hòa tự nhiên, không gây nên bất cứ
một sản phẩm phụ có hại nào hay một tác động xấu nào đến cơ thể sinh vật chủ.
Đối với vấn đề quan tâm trọn vẹn giữa yếu tố sức khỏe và môi trường hiện này
thì đây có thể nói là một sản phẩm khá hoàn hảo.
Một điều đáng quan tâm nữa đó là việc lạm dụng thái quá kháng sinh
trong nuôi trồng khiến cho nhiều bất cập xảy ra và các nhà khoa học đã phải lên
tiếng cảnh báo. Mặc dù, không ai phủ nhận hiệu quả kinh tế của việc sử dụng
chúng như : tăng năng suất, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, phòng bệnh, nâng cao
chất lượng sản phẩm, và tăng hiệu quả kinh tế cho người sử dụng.
Song, nếu sử dụng kháng sinh quá nhiều sẽ gây ra việc tồn dư trong cơ
thể động vật, sẽ ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của người tiêu dùng. Ngoài ra, nếu
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 2
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
chúng ta phối trộn với một lượng nhỏ không đúng quy cách, sẽ dẫn đến một hậu
quả nghiêm trọng hơn là vô tình làm tăng thêm hiện tượng kháng kháng sinh của
các loài vi khuẩn gây bệnh đối với người và vật nuôi. Và điều này sẽ dẫn đến kết
quả tai hại là sẽ có những dịch bệnh rộng lớn trên toàn cầu không thể nào kiểm
soát được ở trong tương lai.
Ở Việt Nam, các chế phẩm probiotic cũng đang dần trở nên phổ biến, đa
phần là được sử dụng trong chăn nuôi gia cầm và đã bắt đầu sử dụng cho các loài
thủy hải sản. Bên cạnh đó là chế phẩm dược giúp hỗ trợ rối loạn tiêu hóa trong hệ
đường ruột phù hợp cho từng đối tượng khác nhau. Các nghiên cứu về probiotic

cũng đang được quan tâm tìm hiểu dựa trên những thành tựu trong nước và trên
thế giới đã đạt được nhằm phục vụ cho nhu cầu ngày càng cao hiện nay.
Tóm lại, có thể nói rằng, việc nghiên cứu để phát triển và ứng dụng
probiotics vào cuộc sống là một vấn đề rất cần được quan tâm và đầu tư nhiều
hơn nữa để ngày càng nâng cao được hiệu quả, tính an toàn cũng như chất lượng
cuộc sống ngày càng cao của con người chúng ta. Bởi đây được xem là sự tác
động thân hữu của con người vào tự nhiên đã mở ra một chiến lược phát triển bền
vững và an toàn.
Tuy nhiên, để có được một chế phẩm probiotic thỏa mãn tất cả những yêu
cầu được đặt ra với hoạt tính cao cần thiết, nhất định phải kể đến quá trình chọn
lọc các chủng vi khuẩn để làm probiotic. Đây là bước cực kỳ quan trọng, bởi nó
được xem là yếu tố quyết định vai trò, tác dụng của chế phẩm probiotic lên đối
tượng cần quan tâm. Một chủng vi khuẩn có được xem là có khả năng làm
probiotics hay không là phụ thuộc vào kết quả của khâu tuyển chọn này. Do đó
mà tôi đã chọn đề tài đồ án tốt nghiệp nhan đề “Tuyển chọn vi khuẩn lên men
lactic có tiềm năng probiotics”.
1.2 Mục tiêu đồ án tốt nghiệp :
Tuyển chọn các chủng tiềm năng probiotics trong bộ sưu tập vi khuẩn lên
men lactic phân lập từ chế phẩm probiotic dược, thực phẩm lên men truyền thống
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 3
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
(nem, sữa, dưa muối) và hệ vi sinh đường ruột người theo tiêu chuẩn khả năng
kháng vi sinh vật, chịu acid và chịu muối mật.
1.3 Nội dung đồ án tốt nghiệp :
_Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lên men lactic có khả năng chịu acid.
_Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lên men lactic có khả năng chịu muối
mật.
_Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lên men lactic có khả năng kháng vi
sinh vật chỉ thị (Bacillus substilis, Escherichia coli, Salmonella spp.,

Pseudomonas spp.)
_Đề xuất hướng sử dụng các chủng vi khuẩn lên men lactic có các hoạt
tính trên.
1.4 Phương pháp thực hiện đồ án tốt nghiệp :
Qua nhiều tài liệu tham khảo và các bài báo cáo nghiên cứu khoa học về
probiotics, các phương pháp tuyển chọn vi khuẩn probiotic được tiến hành dựa
trên những kết quả kiểm tra của các nhà nghiên cứu một cách khá chi tiết. Cho
nên, từ các nguồn thông tin này bắt đầu tiến hành thí nghiệm trên những chủng đã
được phân lập trong bộ sưu tập vi khuẩn lên men lactic. Cuối cùng là thu nhận số
liệu, dựng đồ thị để phân tích đánh giá các chủng vi khuẩn này và đưa ra kết luận
cuối cùng.
1.5 Phương pháp xử lý số liệu :
Sử dụng phần mềm excel tính toán và vẽ đồ thị biểu diễn.
1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn :
_Tìm hiểu về các phương pháp tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic.
_Góp phần chọn lọc ra những chủng vi khuẩn lên men lactic có tiềm năng
probiotics.
CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về Probiotics :
2.1.1 Giới thiệu chung :
Kể từ khi Alexander Fleming phát hiện ra tính chất kháng vi khuẩn của
nấm Penicillium spp. vào năm 1929 (Fleming, 1929), thế giới đã chứng kiến ưu
thế nhanh chóng của thuốc kháng sinh trong điều trị các bệnh khác nhau. Sự phát
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 4
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
triển một cách rộng rãi và đặc hiệu cao của thuốc kháng sinh đã khiến cho ngành
y học quá tin tưởng vào phương pháp trị liệu kháng sinh như đại diện cho phương
pháp chữa trị chống lại các bệnh khác nhau. Tuy nhiên, tồn tại một số hạn chế
nhất định liên quan với phương pháp trị liệu kháng sinh. Tác động loại bỏ của

thuốc kháng sinh không phân biệt được mầm bệnh thật sự và hệ vi sinh vật có lợi
trong ruột. Vì vậy, phương pháp trị liệu kháng sinh cũng dẫn đến thay đổi hệ cân
bằng của ruột và gây ra một vài ảnh hưởng xấu mà có thể tồn tại lâu dài ngay cả
sau khi ngừng sử dụng cách điều trị này. Bên cạnh đó, sự xuất hiện nhanh của
nhiều chủng vi khuẩn kháng lại kháng sinh chẳng hạn như Enteroccus spp. kháng
vancomycin và Staphylococcus aureus kháng methicillin trong môi trường bệnh
viện cũng là một mối quan tâm ngày càng tăng đối với những người làm việc
trong nghề y. Hơn nữa, một vài bệnh lây nhiễm từng được cho rằng sẵn sàng có
thể xử lý với thuốc kháng sinh bây giờ đang bị công nhận như là mối đe dọa sức
khỏe nghiêm trọng. Ví dụ, bệnh tiêu chảy có thể do Clostridium difficile, một
mầm bệnh cơ hội, hoạt động khi có sự mất cân bằng của hệ vi sinh vật trong ruột
thông thường diễn ra trong suốt quá trình điều trị kháng sinh. Mặc dù bệnh này
nói chung được điều trị thành công với một loại thuốc kháng sinh thứ hai, tuy
nhiên một vài bệnh lây nhiễm vẫn tái diễn mặc cho các phương pháp trị liệu
kháng sinh (Sanders, 1999).
Chính vì những nguyên nhân này, mọi người đều nhận ra rằng ngăn ngừa
hoặc giảm nguy cơ bị bệnh thích hợp hơn là để đến lúc phải điều trị bệnh. Thực
tế, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo trên toàn cầu về giảm việc sử dụng
thuốc kháng sinh trong y học và đề xuất các nỗ lực để ngăn cản bệnh thông qua
sự phát triển của các vắc xin có hiệu quả hơn và an toàn hơn (Stanton et al.,
2001). Một môi trường chung đã được tạo ra mà trong đó cả bác sĩ lẫn bệnh nhân
đang tìm kiếm biện pháp phòng ngừa hơn là chữa bệnh, để hệ vi sinh vật trong
ruột cơ thể người không bị ảnh hưởng xấu. Và một cách tiếp cận nhanh chóng đạt
được sự công nhận là khái niệm probiotics, một khái niệm chung chỉ phần bổ
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 5
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
sung dinh dưỡng chứa một hoặc nhiều chủng vi sinh vật (đặc biệt là vi khuẩn
hoặc nấm men) mà khi đưa vào cơ thể con người có một tác động có lợi bằng việc
cải thiện hệ vi sinh vật nội sinh (Markowitz và Bengmark, 2002). So với các

nhược điểm như đắt, tính hóa học và xâm hại ruột của thuốc kháng sinh, ưu điểm
của probiotics là an toàn, không hề đắt, tự nhiên, và phần lớn không có bất cứ ảnh
hưởng có hại nào.
Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe con người
không phải là mới. Trên hàng nghìn năm về trước, rất lâu trước khi có sự tìm ra
thuốc kháng sinh, con người đã biết tiêu thụ các thực phẩm chứa vi sinh vật sống
có lợi chẳng hạn như các sản phẩm sữa lên men. Các bằng chứng cho thấy quá
trình sản xuất sữa lên men được ghi trong “Book of Genesis”. Theo Ayurveda,
một trong số ngành y học lâu đời nhất là vào khoảng 2500 năm trước công
nguyên, sự tiêu thụ sữa chua (một sản phẩm sữa lên men) đã được ủng hộ để duy
trì sức khỏe tốt (Chopra và Doiphode, 2002). Các nhà khoa học đầu tiên, như
Hippocrates và những người khác cũng chỉ định sữa lên men với tính chất dinh
dưỡng và thuốc của nó, để chữa trị rối loạn ruột và dạ dày (Oberman, 1985).
Một sự giải thích khoa học cho ảnh hưởng có lợi của các vi khuẩn lactic
có trong sữa lên men được cung cấp lần đầu tiên vào năm 1907 bởi người đoạt
Giải Nobel, nhà sinh lý học người Nga, Eli Metchnikoff. Trong bài thảo luận xuất
sắc của ông " Việc kéo dài cuộc sống " (‘The prolongation of life’), Metchnikoff
đã tuyên bố "Sự phụ thuộc của hệ vi sinh vật trong ruột đối với thực phẩm làm
cho nó có khả năng chấp nhận biện pháp thay đổi hệ vi sinh vật trong người của
chúng ta, tức là thay thế vi sinh vật có hại bởi vi sinh vật hữu ích (Metchnikoff,
1907 ". Người ta đề xuất rằng sự tiêu hóa một vài vi khuẩn được chọn lựa có thể
có ích lợi ảnh hưởng đến vùng dạ dày-ruột của con người. Metchnikoff tin vào lý
do chính gây ra quá trình lão hóa của con người là do chất độc tạo thành bởi sự
thối rữa và sự lên men trong ruột (O ' Sullivan et al., 1992 ). Và khi nhận thấy quá
trình lên men lactic của sản phẩm sữa ngăn chặn sự thối rữa, ông ta đã tin rằng sự
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 6
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
tiêu thụ sản phẩm sữa lên men như thế sẽ tương tự với việc ngăn chặn lại quá
trình thối rữa ruột. Metchnikoff đưa ra giả thuyết rằng cuộc sống khoẻ mạnh và

lâu dài của nông dân Bungari là do sự tiêu thụ các sản phẩm sữa lên men. Ông tin
khi được tiêu thụ, các vi khuẩn lên men trong sản phẩm ảnh hưởng tốt đến hệ vi
sinh vật của ruột kết: giảm hoạt động của vi khuẩn độc, bằng cách ấy dẫn đến
cuộc sống thọ. Điều này khiến cho Metchnikoff đã khuyên trong sách của ông
rằng uống đồ uống chẳng hạn như sữa chua chứa vi khuẩn lactic sẽ ngăn cản lão
hóa.
Ngoài ra, cùng một thời gian, Henry Tissier đã phân lập Bifidobacteria,
thành viên của nhóm vi khuẩn lactic, từ phân của trẻ được nuôi bằng sữa mẹ và
nhận thấy chúng là một thành phần nổi bật của hệ vi sinh vật ruột (Ishibashi và
Shimamura, 1993). Tissier tin rằng sự thống trị của Bifidobacteria trong cơ thể trẻ
sẽ chiếm chỗ của các vi khuẩn thối rữa liên quan đến sự xáo trộn dạ dày và sự tự
thành lập của chúng để chiếm chỗ của các vi khuẩn có ích trong ruột. Như vậy
tương tự như Metchnikoff, Tissier tin vào giả thuyết ảnh hưởng lớn của
Bifidobacteria tới số trẻ em này(O ' Sullivan et al., 1992). Lý thuyết của ông được
khẳng định bởi quan sát lâm sàng trẻ nuôi bằng sữa mẹ so với trẻ được nuôi bằng
sữa hộp (Rasic và Kurmann, 1983).
Mặc cho sự diễn ra Thế chiến I và cái chết của Metchnikoff làm giảm nhẹ
lượng tiền đang quan tâm tới liệu pháp diệt khuẩn của ông ấy, nền tảng cho khái
niệm hiện đại về probiotics rõ ràng đã được thành lập. Nghiên cứu về việc sử
dụng vi khuẩn lactic trong chế độ ăn uống đã được tiếp tục suốt cả thế kỷ vừa
qua. Trong khi công việc ở giai đoạn trước của thế kỷ là đề cập đến việc sử dụng
sữa lên men để điều trị bệnh lây nhiễm đường ruột, các nghiên cứu gần đây đã tập
trung vào lợi ích sức khỏe khác của các vi sinh vật này cũng như về bảo đảm sự
sống sót của các vi khuẩn này khi ở trong vùng dạ dày-ruột và các loại thực phẩm
để vận chuyện chúng vào trong cơ thể con người (Lourens - Hattingh và Viljoen,
2001).
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 7
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
Các kiến thức có được về probiotics thông qua những nghiên cứu này đã

thúc đẩy mạnh mẽ ngành công nghiệp các sản phẩm sữa. Từ các quan sát từ sớm
của Eli Metchnikoff và các nhà nghiên cứu khác, lịch sử của probiotics với sản
phẩm sữa lên men đã tiếp tục cho đến tận hiện đại. Điều này hiển nhiên được thấy
rõ qua thực tế ngày hôm nay của thị trường thực phẩm sữa-probiotic khổng lồ
đang tồn tại.
2.1.1.1 Định nghĩa Probiotics là gì :
Từ “probiotics” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “cho cuộc sống”.
Tuy nhiên, định nghĩa về probiotics đã phát triển nhiều theo thời gian. Lily và
Stillwell (1965) đã mô tả trước tiên probiotics như hỗn hợp được tạo thành bởi
một động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác. Phạm vi
của định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm bảy mươi
bao gồm dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển của vi sinh vật (Gomes và Malcata,
1999). Sau đó, Parker (1974) đã áp dụng khái niệm này đối với phần thức ăn gia
súc có một ảnh hưởng tốt đối với cơ thể vật chủ bằng việc góp phần vào cân bằng
hệ vi sinh vật trong ruột của nó. Vì vậy, khái niệm “probiotics” được ứng dụng để
mô tả “cơ quan và chất mà góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật ruột”.
Định nghĩa chung này sau đó được làm cho chính xác hơn bởi Fuller
(1989), ông định nghĩa probiotics như “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật
sống mà có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh
vật ruột của nó”. Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn : “vi sinh vật sống
(vi khuẩn lactic và vi khuẩn khác, hoặc nấm men ở trạng thái khô hay bổ sung
trong thực phẩm lên men) mà thể hiện một ảnh hưởng có lợi đối với sức khỏe của
vật chủ sau khi được tiêu hóa nhờ cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn có của vật
chủ” ( Havenaar và Huis in't Veld, 1992 ).
Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây đã chứng minh vùng ruột thật sự là một
hệ sinh thái vi sinh vật ở người trưởng thành (Tannock, 1990); mặc dù phương
pháp trị liệu kháng sinh, bệnh tật hoặc thay đổi chế độ ăn có thể dẫn đến thay đổi
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 8
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương

hệ sinh thái này, nhưng trạng thái mất cân bằng này dường như có khả năng tự
hiệu chỉnh (annock, 1983). Vi khuẩn probiotic được tiêu thụ với số lượng lớn
cũng không đủ để trở thành chủng chiếm ưu thế trong ruột và có thể hiếm khi
được phát hiện trong mẫu ruột hoặc phân sau một hay hai tuần sau sự tiêu hóa.
Do đó, quan trọng là chúng ta phải hiểu trên thực tế ảnh hưởng của
probiotic có thể được đem lại bởi các sự kết hợp và cơ cấu hoạt động ít thân thiết
hơn và tạm thời hơn so với hệ vi sinh vật của người (Sanders, 1999). Vì vậy, định
nghĩa về probiotics hiện tại chỉ còn là “vi sinh vật sống mà đi ngang qua vùng
ruột và làm lợi cho sức khỏe của người tiêu dùng”. (Tannock et al., 2000) .
2.1.1.2 Hiệu quả sử dụng probiotic :
Do nhiều yếu tố, một phần lớn lượng vi sinh vật có lợi trong đường ruột
bị giảm hay bị tiêu diệt như bị tiêu chảy, sử dụng kháng sinh trong chữa bệnh,
điều này ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng hoạt động của hệ tiêu hóa như thủy
phân đường lactoza trong sữa, giảm khả năng hấp thụ thức ăn và giảm tính đề
kháng của cơ thể. Chính bởi lẽ đó mà cơ thể của chúng ta cần phải bổ sung thêm
một lượng đủ lớn sinh khối vi khuẩn có lợi nhằm cải thiện sức khỏe.
Hình 2.1 : Tác dụng của probiotics
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 9
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
Đã có rất nhiều chế phẩm probiotics dành cho người hay cho vật nuôi
được đăng kí bảo hộ sáng chế. Hầu hết các sản phẩm này chứa Lactobicillus spp.
hoặc Streptococcus spp., một số chứa Bifidobacteria spp., Saccharomyces
boulardii hay Bacillus subtilis. Ảnh hưởng của các chế phẩm probiotics có thể là
trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua sự điều chỉnh hệ vi sinh vật trong đường ruột
(Hình 2.1). Những chế phẩm này có hiệu quả sử dụng được biết tới như sau :
a. Có khả năng kháng ung thư và chống các yếu tố đột biến :
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy vi khuẩn probiotic có thể làm giảm
nguy cơ ung thư ruột kết và ung thư bàng quang. Ngoài ra có tác dụng khử chất
độc gây ung thư có trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bướu.

Cơ chế này đã được nghiên cứu và kết luận rằng :
Nhờ sự gắn kết và phân hủy các chất gây ung thư.
Sản xuất các hợp chất kháng ung thư : sinh ra những acid yếu có lợi
cho đường ruột như acid butyric có vai trò giảm tạo ra những chất gây ung thư
trong đường ruột và kích thích các tế bào niêm mạc ruột bị tổn thương mau lành
và hồi phục chức năng.
Điều hòa những enzyme gây tiền chất ung thư ruột, như các enzyme
phân (nitroreductase, β-glucuronidase) có khả năng chuyển các chất tiền sinh ung
thư thành chất gây ung thư trong trực tràng.
Ức chế khối u bằng một cơ chế đáp ứng miễn dịch.
Tuy nhiên, những vấn đề vẫn còn giới hạn trong mô hình in vitro hay
in vivo, việc mở rộng ra trên người để dự phòng ung thư còn là vấn đề đang tranh
cãi.
b. Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa :
Probiotics kìm hãm sự phát triển của mầm bệnh và cải thiện hệ thống
miễn dịch của dạ dày và giảm nguy cơ nhiễm một số mầm bệnh phổ biến như
Salmonella và Shigella.
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 10
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
Để có thể tác động lên hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột thì điều khá
quan trọng đó là probiotics phải có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh
bằng cách tiết ra các kháng sinh hay là những chất cạnh tranh.
Hình 2.2 : Tác
động đến hệ vi sinh
đường ruột
(Modified after stewart
et al. 1995)
Từ hình 2.2, nhận thấy được tác động của probiotics đến hệ vi sinh vật
đường ruột như sau :

_Cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh.
_Cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính của chúng
vào đường ruột. Vị trí nào được các vi khuẩn probiotics gắn kết thì các độc tố
đường ruột bị ngăn chặn.
_Vi khuẩn probiotics tạo ra các chất đa dạng ức chế cả vi khuẩn Gram
âm và Gram dương. Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những vi
sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi
chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố.
Qua nghiên cứu cho thấy các kháng sinh và chất cạnh tranh thường
thấy ở các chủng probiotics là:
_Bacteriocin.
_Hydrogen peroxide.
_Acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic).
_Diacetyl.
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 11
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua
sự tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và
butyrate, nhất là acid lactic.
c. Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp
được lactose:
Sự không dung nạp đường lactose (có nhiều trong sữa) xảy ra khá
phổ biến ở nhiều người, gây ra sự đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu thực phẩm có
chứa đường lactose. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy một số chủng vi khuẩn lên
men axit lactic trong sản phẩm sữa lên men có thể cải thiện các triệu chứng kháng
đường lactoza của cơ thể bằng cách cung cấp men lactaza cho đường ruột và dạ
dày. Sử dụng các thực phẩm có chứa các chủng vi khuẩn này giúp cải thiện rõ rệt
khả năng tiêu hóa đường lactose.
d. Làm giảm Cholesterol trong huyết thanh :

Probiotic có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh,
làm giảm huyết áp cao. Ngoài ra, giúp nhanh chóng bình phục sau khi mắc các
bệnh tiêu chảy và sử dụng nhiều kháng sinh.
e. Kích thích hệ thống miễn dịch :
Thực phẩm chức năng probiotic có thể góp phần cải thiện hệ thống
miễn dịch của cơ thể, làm tăng hàm lượng globulin. Sự hấp thụ thực phẩm
probiotic đối với người ốm và trẻ nhỏ cải thiện rõ rệt sức đề kháng của cơ thể.
Tăng cường hiệu quả của một số vaccin như vaccin thương hàn.
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 12
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
Hình 2.3 : Cơ chế kích thích hệ thống miễn dịch của probiotics
Những cải thiện hệ miễn dịch bởi probiotics ở hình 2.3 có thể được
trình bày theo 3 cách sau :
_Tăng cường hoạt động của đại thực bào, nâng cao khả năng thực bào
của sinh vật hay hạt carbon.
_Tăng khả năng sản xuất kháng thể thường là loại IgG và IgM và
interferon (nhân tố kháng virus không đặc hiệu).
_Tăng cường khả năng định vị kháng thể trên bề mặt ruột thường là
IgA.
f. Các tác dụng khác :
Probiotics còn có một số tác dụng khác như giảm tác dụng phụ của
kháng sinh, giảm nhiễm trùng đường niệu ở người. Đối với việc sử dụng
probiotics trong chăn nuôi còn mang lại hiệu quả cao nhờ có khả năng tăng trọng
(5%) ở gia cầm, giảm tỉ lệ mắc các bệnh do nhiễm trùng và tiêu chảy ở động vật
non.
Bảng 2.1 : Tác dụng lâm sàng của một số chủng probiotics [8] [13].
Chủng Tác dụng lâm sàn trên người
Lactobacillus rhamrosus GG
(ATCC 53103)

Giảm hoạt tính enzyme phân, giảm tiêu chảy
do kháng sinh ở trẻ em, điều trị và dự phòng
rotavirus và tiêu chảy cấp ở trẻ em, điều trị
tiêu chảy tái phát do Clostridium difficile, kích
thích miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da
không điển hình ở trẻ em.
Lactobacillus johnsonii
(acidophilus) LJ-1 (La1)
Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tăng
cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị Helicobacter
pylori.
Bifidobacterium lactis Bb-12 Dự phòng tiêu chảy du lịch, điều trị tiêu chảy
do virus, kể cả rotavirus, cân bằng hệ vi sinh
vật đường ruột, cải thiện tình trạng táo bón,
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 13
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
kích thích hệ miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng
viêm da không điển hình ở trẻ em.
Lactobacillus reuteri
(BioGaia Biologics)
Rút ngắn thời gian bị tiêu chảy do rotavirus ở
trẻ em, điều trị tiêu chảy cấp ở trẻ em, an toàn
và dung nạp tốt ở bệnh nhân trưởng thành
HIV dương tính.
Lactobacillus casei Shirota Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, giảm hoạt
tính enzyme phân, có tác động tích cực đối
với ung thư mặt bàng quang và ung thư cổ tử
cung, không ảnh hưởng tới hệ miễn dịch của
người khỏe mạnh.

Lactobacillus plantarum
DSM9843 (299v)
Cân bằng hệ vi sinh đường ruột, tăng hàm
lượng acid béo mạch ngắn trong phân.
Saccharomyces bourlardii Dự phòng tiêu chảy do kháng sinh, điều trị
viêm ruột kết do Clostridium difficile, dự
phòng tiêu chảy cho bệnh nhân sử dụng dinh
dưỡng qua ống.
Chủng trong sữa chua
(Streptococcus thermophilus hay
L. Delbrueckii subsp bulgaricus)
Không có tác dụng trên tiêu chảy do rotavirus,
không có hiệu ứng tăng cường miễn dịch khi
bị tiêu chảy do rotavirus, không có tác dụng
lên hoạt tính enzyme phân.
Vào khoảng cuối năm 1940 đã có hai nghiên cứu phát triển về hệ vi sinh
vật đường ruột này. Đầu tiên là việc bổ sung thuốc kháng sinh vào trong thức ăn
đã thúc đẩy sự tăng trưởng của vật nuôi. Do đó mong muốn khám phá cơ chế này
đã ảnh hưởng tới việc tăng cường nghiên cứu về thành phần của hệ vi sinh vật
đường ruột và cách thức nó tác động lên vật chủ là như thế nào. Vấn đề thứ hai, là
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 14
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
vì ngày càng có nhiều vật nuôi bị bệnh đã cung cấp nhiều cho thí nghiệm nhằm
khám phá hệ vi sinh vật trong đường ruột của những vật chủ sẵn có này. Và kết
luận đã nhận định rằng L.acidophilus không là vi khuẩn Lactobacillus duy nhất
có trong ruột non mà còn nhiều vi sinh vật khác cần được nghiên cứu để sử dụng
làm probiotics. Những nghiên cứu tiếp sau đó cho thấy có khoảng 10
14
vi sinh vật

thuộc khoảng 400 loài khác nhau tồn tại ở trong ruột (Moore & Holdemann
1974), chính vì vậy, việc nghiên cứu về những vi sinh vật có thể sử dụng làm
probiotics ngày càng được mở rộng. Đồng thời sau nhiều nghiên cứu ấy, người ta
đã tổng kết lại được rất nhiều vi sinh vật có thể sử dụng làm probiotics (bảng 2.1).
2.1.1.3 Thành phần của Probiotic :
Bảng 2.2 : Những vi sinh vật được xem như là probiotic (Holzapfel et al.
2001)
Lactobacillus Bifidobacteriu
m
Other lactic acid
bacteria
Non-lactic acid
bacteria
L. acidophilus
L. amylovorus
L. casei
L. cripatus
L. delbrueckii
subsp.Bulgaricus
L. gallinarum
L. gasseri
L. johnsonii
L. paracasei
L. plantarum
L. reuteri
L. rhamnosus
B. adolescentis
B. animalis
B. bifidum
B. breve

B. infantis
B. lactis
B. Longum
Enterococcus
faecalis
Enterococcus
faecium
Lactococcus lactis
Leuconostoc
mesenteroides
Pediococcus
acidolactici
Streptococcus
thermophilus
Sporolactobacillu
s inulinus
Bacillus cereus var. Toyoi
Escherichia coli Nissle 1917
Propionibacterium
freudenreichii
Saccharomyces cerevisiae
Saccheromyces boulardii
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 15
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
2.1.1.4 Tiêu chuẩn tuyển chọn chủng Probiotic :
Từ rất nhiều nghiên cứu và thông tin về các vi sinh vật được chọn lựa làm
probiotics phải đáp ứng được hai tiêu chuẩn sau :
+ Tiêu chuẩn về an toàn.
+ Tiêu chuẩn về đặc điểm và chức năng.

Hình 2.4: Các tiêu chuẩn tuyển chọn probiotic cho người (M. Saarela et al. 2000)
a. Khía cạnh an toàn của probiotics bao gồm những điểm cụ thể sau :
_Có định danh chính xác.
_Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người.
_Được phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh.
_Được chứng minh là không có khả năng gây bệnh.
_Không liên quan tới bệnh tật.
_Không gây khử liên hợp muối mật.
_Đặc điểm duy truyền ổn định.
_Không mang các gene đề kháng kháng sinh có thể truyền được.
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 16
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
Lẽ tất nhiên, tính an toàn của các chủng probiotics là điều được quan
tâm hàng đầu. Có một số phương thức giúp tiến hành đánh giá tính an toàn của
probiotics như: nghiên cứu trên các đặc tính của chủng probiotics, nghiên cứu về
dược động học của chủng probiotics, nghiên cứu các tác động qua lại giữa
probiotics và vật chủ. Các probiotics thường thuộc nhóm vi sinh vật GRAS
(Generally Regarded As Safe).
Bảng 2.3 : Vi khuẩn probiotics và tính an toàn của chúng [3] [14]
Giống vi sinh vật Khả năng lây nhiễm
Lactobacillus Không gây bệnh, đôi khi gây nhiễm trùng cơ hội ở
các bệnh nhân suy giảm miễn dịch (AIDS).
Lactococcus Không gây bệnh.
Streptococcus Gây bệnh cơ hội, có S. thermophilus được sử dụng
trong các sản phẩm sữa.
Enterococcus Gây bệnh cơ hội, một vài chủng có khả năng kháng
kháng sinh.
Bacillus Chỉ có Bacillus subtilis được sử dụng làm probiotics.
Bifidobacterium Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở

người.
Probionobacterium Có tiềm năng trong việc sử dụng làm probiotics.
Saccharomyces Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở
người.
Đối với những vi sinh vật được sử dụng làm probiotics (bảng 2.3) cho
người đều bắt buộc phải đạt những yêu cầu trên, song đối với vật nuôi chúng ta
có thể giảm bớt đi một số yêu cầu, chủ yếu là tùy thuộc vào từng loại vật nuôi và
tính an toàn khi sử dụng nó.
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 17
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
b. Để một probiotics có thể mang lại những lợi ích trên sức khỏe
con người chúng phải có những đặc điểm sau :
_Chủng vi sinh phải có những đặc điểm phù hợp với công nghệ để có
thể đưa vào sản xuất, dễ nuôi cấy.
_Có khả năng sống và không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sản
phẩm.
_Không gây các mùi vị khó chịu cho sản phẩm.
_Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác động của chúng, để tồn
tại được chúng phải có hai đặc tính là: có khả năng dung nạp với acid (chịu pH
thấp ở dạ dày) và dịch vị của người; đồng thời chúng phải có khả năng dung nạp
với muối mật (là đặc tính rất quan trọng để probiotics có thể sống sót được khi đi
qua ruột non).
_Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa vật chủ : khả
năng bám vào bề mặt và sau đó là phát triển trong đường tiêu hóa người được
xem là điều kiện tiên quyết quyết định chức năng của probiotics. Những vi khuẩn
có khả năng bám dính vào bề mặt ruột sẽ tồn tại lâu hơn và do đó có điều kiện để
biểu hiện những tác động điều hòa miễn dịch hơn là những chủng không có khả
năng bám dính.
_Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật

chủ có thể sử dụng.
_Có khả năng kích thích miễn dịch nhưng không có tác động gây
viêm.
_Có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên, có hoạt tính đối
kháng với các vi sinh gây bệnh, đặc biệt là vi sinh vật gây bệnh đường ruột.
_Sản xuất các chất kháng vi sinh vật (như bacteriocins, H
2
0
2
, acid hữu
cơ…).
_Có khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư.
2.1.2 Quy trình chọn lọc các chủng Probiotic :
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 18
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
Hình 2.5 : Sơ đồ theo hướng dẫn của FAO và WHO trong tuyển chọn probiotics
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 19
Tuyển chọn và xác định chủng dựa trên kiểu hình và kiểu
gene
Tên chi, loài, ký hiệu chủng.
Đăng ký trong bảo tàng giống quốc tế nào?
Xác định chức năng
In vitro
Trên động vật
Đánh giá độ an toàn
_In vitro trên người và động vật
_Trên người : pha 1
Pha 2: Thử nghiệm mù kép ngẫu nhiên

gồm nhóm thử nghiệm và nhóm đối
chứng uống thuốc vờ (DBPC)* để xác
định tính công hiệu của chủng hoặc sản
phẩm.
Tốt nhất nên thử nghiệm
DBPC độc lập lần 2 để
khẳng định kết quả.
Dán nhãn
Tên chi, loài, ký hiệu chủng
Số lượng tối thiểu vi khuẩn sống
Điều kiện bảo quản thích hợp
Thông tin liên hệ với khách hàng
PROBIOTIC
CCSSSS
Pha 3: Kiểm nghiệm mức độ hiệu quả trên người
So sánh hiệu quả điều trị 1 bệnh đặc trưng bằng
probiotics với phương pháp điều trị thông thường
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
Hình 2.6 : Sơ đồ tuyển chọn các vi sinh vật dùng làm probiotic
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 20
Phân lập các dòng
vi khuẩn
Sàng lọc in
vitro
Sàng lọc in vivo
quy mô nhỏ
Kiểm tra khả năng gây bệnh
đối với vật chủ
Không đạt

OK
?
Đạt
Đạt
Thử nghiệm in vivo
quy mô pilot
OK
?
Khả năng gây bệnh đối với
điều kiện nuôi (nếu cần)
OK
?
OK
?
Loại
bỏ
PROBIOTIC
Đạt
Đạt
Không đạt
Không đạt
Không đạt
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
2.1.3 Các tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật Probiotic :
Các tiêu chuẩn để đánh giá hoạt tính của vi sinh vật probiotic đều dựa
trên cơ sở sự ức chế tăng trưởng vi sinh vật chỉ thị của các chủng probiotic, khái
quát như hình 2.7
Hình 2.7 : Sơ đồ khái quát tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật
2.2 Khả năng chịu acid, chịu muối mật và chịu enzyme tiêu hóa của các
chủng Probiotic :

2.2.1 Khả năng chịu acid :
Nguyên tắc : pH của dạ dày và ruột thường thấp do các acid gây ra như
oxalic acid, butylic acid, folic acid,… Chính vì vậy các vi khuẩn probiotics cần
phải chịu được điều kiện pH thấp, hay là dung nạp được với acid trong dạ dày và
ruột thì mới có thể phát huy được tác dụng probiotics của mình.
Để kiểm tra khả năng này, người ta nuôi cấy các vi khuẩn probiotics trên
môi trường MRS với điều kiện pH là 2, 3, 4, 5 và đối chứng trên môi trường
MRS thông thường. Sau đó tiến hành ly tâm thu sinh khối để đo quang xác định
mật độ của tế bào ở bước sóng là 610 nm khi đã cho chúng phát triển 24h ở 37
0
C
trong tủ ấm.
2.2.2 Khả năng chịu muối mật :
Có 2 loại muối mật là glycochalat natri và taruocholat natri. Muối mật có
chức năng quan trọng trong việc tiêu hóa và hấp thu lipid ở ruột non kéo theo sự
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 21
Probiotics
Sự
bám
dính
Chịu
acid
dạ
dày
Kháng
vi
sinh
vật
Chịu

được
muối
mật
Thử
nghiệm
in vivo
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
hấp thu các vitamin tan trong lipid như A, D, E, K. Khi xuống đến hồi tràng, 95%
muối mật được tái hấp thu rồi theo tĩnh mạch chủ trở về gan và được tái bài tiết,
gọi là chu trình ruột gan. Còn 5% muối mật được đào thải theo phân có tác dụng
giữ nước trong phân và duy trì nhu động ruột già. Chính vì thế mà khả năng chịu
được muối mật cũng là một điều kiện để đánh giá hoạt tính của probiotics, đòi hỏi
các vi khuẩn probiotic không gây ảnh hưởng gì tới lượng muối mật ở trong ruột.
Bảng 2.4 : Thành phần chủ yếu và đặc trưng của dịch mật người (M. Begley
et al. 2005), [1]
Thành phần Nồng độ (mmol/l)
Natri
Kali
Clorua
Muối mật
Cholesterol
Phospholipid
145
4
90
40
3
7
Để kiểm tra khả năng này, tương tự như kiểm tra khả năng chịu pH thấp,
cũng dùng môi trường MRS có bổ sung 0,3% muối mật và đối chứng trên môi

trường MRS thông thường. Tiến hành ủ 24h trong tủ ấm 37
0
C, sau đó ly tâm thu
sinh khối và đem đo quang ở bước sóng 610 nm để khảo sát mật độ tế bào.
2.2.3 Khả năng chịu enzyme tiêu hóa :
Men tiêu hoá trong đường ruột là một loại men sinh học (enzym) do cơ
thể con người sản sinh ra có tác dụng hỗ trợ chuyển hóa các chất đạm, chất béo
trong thức ăn. Men tiêu hoá thực ra là những chất được sản sinh tại các tuyến rồi
đổ vào dạ dày, ruột, giúp biến đổi thức ăn thành nhũ tương để cho mao ruột hấp
thụ vào máu, nuôi dưỡng cơ thể. Mỗi tuyến có vai trò chức năng riêng. Dạ dày
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 22
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
dịch vị và men pepsin giúp tiêu hóa protide và điều này có ảnh hưởng đến việc bổ
sung probiotics về cơ thể của chúng ta.
Để khảo sát, cần bổ sung enzyme tiêu hóa trong đường ruột vào môi
trường MRS nuôi cấy vi khuẩn probiotics, các bước còn lại tiến hành như thử
nghiệm về khả năng chịu acid và muối mật và đo độ đục xác định sinh khối tế bào
so với mẫu đối chứng không bổ sung enzyme.
2.3 Khả năng kháng vi sinh vật :
Có rất nhiều nghiên cứu về các phương pháp trong việc kiểm tra khả
năng kháng vi sinh vật của vi khuẩn probiotics. Tuy nhiên, tất cả đều dựa trên khả
năng sinh kháng sinh hay các chất cạnh tranh để ngăn chặn sự phát triển của các
vi sinh vật gây bệnh.
Ở thí nghiệm này phương pháp được sử dụng là đo độ đục
(Turbidometry). Nguyên tắc là ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn chỉ thị bằng
các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn probiotics. Trong môi trường lỏng là
Pepton Water, cho dịch ly tâm môi trường nuôi cấy probiotics vào cùng với môi
trường phát triển của vi khuẩn chỉ thị. Sau khi đem ủ 21h ở 37
0

C tiến hành đo OD
ở bước sóng 610nm, so sánh phần trăm ức chế với ống đối chứng không sử dụng
dịch ly tâm trên.
2.3.1 Thử nghiệm trên vi khuẩn Gram dương :
Các chủng probiotics là có tác động quan trọng đến ruột kết vì chúng cho
thấy sự đối kháng chống lại các vi khuẩn gây bệnh bằng cách sinh ra chất kháng
khuẩn hoặc cạnh tranh ức chế. Những nỗ lực nghiên cứu lớn tập trung vào nghiên
cứu bacteriocins. Mặc dù các chủng có khả năng sản sinh bacteriocins, vai trò của
chúng trong ức chế mầm bệnh ở điều kiện in vivo là có giới hạn, từ khi
bacteriocins sinh ra có tác động ức chế chống lại các chủng có liên quan mật thiết
như các vi khuẩn Lactobacillus khác hoặc trên bào tử Bacillus và Clostridium
(Holzapfel et al. 1995). L.rhamnosus GG (bảng 2.1) sản sinh ra chất kháng khuẩn
có trọng lượng phân tử thấp, có thể là chuỗi acid béo ngắn nhưng khác lactic và
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 23
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
acid lactic với tác dụng ức chế chống lại vi sinh vật kị khí như Clotridium,
Bacteroides và Bifidobacterium, chống lại các loài Enterobacter, Pseudomonas,
Staphylococcus và Streptococcus nhưng không chống lại các vi khuẩn lactic khác
(Silva et al. 1987). Sự nuôi cấy giống L.acidophilus (bảng 2.1) làm giảm khả
năng sống sót của các vi khuẩn Gram dương như Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Bacillus cereus. trong điều kiện in vitro. Không nhận biết được
chắc chắn chất kháng có trọng lượng phân tử thấp nào đó là độc lập trong quá
trình sinh acid latic. Chủng L.acidophilus (Jonhsonii) LA1 (LJ-1) (bảng 2.1) sản
sinh ra loại chất kháng khuẩn không phải là bacteriocins (không nhận biết được
nhưng không phải từ acid lactic) ở điều kiện in vitro có khả năng ức chế rộng vi
khuẩn gây bệnh Gram dương như là S.aureus, L.monocytogenes, Bacillus cereus,
Clostridium,…. Tuy nhiên, sự ức chế của vi khuẩn lactic và Bifidobacteria là
không thể xóa bỏ.
2.3.2 Thử nghiệm trên vi khuẩn Gram âm :

Đa số các nghiên cứu về hoạt tính đối kháng dựa trên các vi sinh vật gây
bệnh Gram dương như S.aureus, L.monocytogene, Bacillus cereu, Clostridium,…
Song, trên thực tế nhận thấy rằng, các vi sinh vật gây bệnh trong hệ đường ruột
phần lớn là do các vi khuẩn Gram âm. Chất chuyển hóa trọng lượng phân tử thấp
(như H
2
O
2
, lactic và acid lactic và các hợp chất thơm khác) và chất chuyển hóa
thứ yếu có thể là quan trọng hơn từ phổ kháng rộng của chúng để chống lại vi
sinh vật gây bệnh như Salmonella, E.coli, Pseudomonas và Helicobacter (Skytta
et al. 1992; Helander et al. 1997; Niku-Paavola et al. 1999). Sự nuôi cấy giống
L.acidophilus (bảng 2.1) cũng làm giảm khả năng sống sót của một số vi khuẩn
Gram âm như S. typhimurium, Shigella flexneri, E.coli, Klebsiella pneumoniae,
Pseudomonas aeruginosa, và Enterobacter spp. trong điều kiện in vitro. Tác dụng
đối kháng của L.acidophilus (bảng 2.1) hướng về S.typhimurium đã được duy trì
trong điều kiện in vivo lây nhiễm cho chuột (Coconier et al. 1997). Chủng
L.acidophilus (Jonhsonii) LA1 (LJ-1) (bảng 2.1) sản sinh ra loại chất kháng
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 24
Đồ án tốt nghiệp khóa 06-Khoa MT&CNSH GVHD : TS. Nguyễn Hoài Hương
khuẩn không phải là bacteriocins (không nhận biết được nhưng không phải từ
acid lactic) ở điều kiện in vitro có khả năng ức chế rộng vi khuẩn Gram âm như là
S.typhimurium, S.flexneri, K.pneumoniae, P.aeruginosa và Enterobacter spp. Tuy
nhiên, sự ức chế của vi khuẩn lactic và Bifidobacteria là không thể xóa bỏ. Hơn
nữa, L.acidophilus LA1 (bảng 2.1) cho thấy hoạt tính đối kháng chống lại
H.pylori cả trong điều kiện in vitro và trong cơ thể người. Chính vì lẽ đó, nhằm
mở rộng hơn hoạt tính đối kháng của các vi khuẩn lactic, cần thử nghiệm trên
nhiều chủng vi sinh vật chỉ thị Gram âm thường gây bệnh trong đường tiêu hóa
hơn là chỉ sử dụng vi khuẩn E.coli như đề tài trước đó đã tiến hành.

Tương tự như thử nghiệm đối với vi khuẩn Gram dương, sử dụng môi
trường phát triển của lần lượt 3 loại vi khuẩn Gram âm này rồi tiến hành đo quang
để khảo sát sự ức chế của vi khuẩn probiotics đối với chúng.
2.3.3 Khả năng sinh các chất kháng khuẩn :
2.3.3.1 Bacteriocins :
Bacteriocins là những hợp chất có bản chất là protein do vi khuẩn sinh
tổng hợp và có khả năng ức chế sự phát triển của các giống vi khuẩn khác có liên
hệ gần với giống sản xuất. Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp
bacteriocins, trong đó các vi khuẩn lactic (LAB) được quan tâm nhiều nhất do
bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng và có tiềm năng được dùng làm
chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm (bảng 2.5).
Bacteriocins được tổng hợp từ LAB chia thành 4 lớp :
_Lớp I : Lantibiotics (lanthionine có chứa kháng sinh)là nhóm peptide
nhỏ (<5 kDa) có chứa các amino acid hiếm như lanthionine (Lan), α-
methyllanthionine (Melan), dehydroalanine, và dehydrobutyrine. Những
bacteriocins này được cho vào nhóm Class I. Class I tiếp tục chia làm 2 loại
lantibiotics type A và B phân loại theo cấu trúc hóa học và các hoạt động kháng
khuẩn (Moll và những người khác năm 1999; van Kraaij và những người khác
năm 1999; Guder và những người khác 2000).
SVTH : Huỳnh Đặng Hà Uyên
MSSV: 106111040 Trang 25