thu nhận trứng bò, heo để cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TP.HCM




BÁO CÁO NGHIỆM THU


THU NHẬN TRỨNG BÒ, HEO ĐỂ CẢI THIỆN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TRỨNG
TRONG ĐIỀU KIỆN VIỆT NAM
Mã số: cs.2008.19.

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:
ThS. NGUYỄN THỊ THƢƠNG HUYỀN





THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 05/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TP.HCM



BÁO CÁO NGHIỆM THU

THU NHẬN TRỨNG BÒ, HEO ĐẺ CẢI THIỆN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TRỨNG
TRONG ĐIỀU KIỆN VIỆT NAM
Mã số:CS.2008.19.


CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:
ThS. NGUYỄN THỊ THƢƠNG HUYỀN



THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 05/2009

i

NHỮNG NGƢỜI THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
STT
Tên ngƣời tham gia
Tên cơ quan
1
ThS. Phạm Văn Phúc
Trƣờng ĐH KHTN TPHCM
2
CN. Đô Ngọc Hân
Trƣờng ĐH KHTN TPHCM
3

CN. Trƣơng Văn Trí
Trƣờng ĐHSP TPHCM
CÁC ĐƠN VỊ PHỐI HỢP
• Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM
• Viện Sinh học Nhiệt đới Tp. HCM
ii

MỤC LỤC
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC BIỂU ĐỒ viii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix
TÓM TẮT x
PHẦN MỞ ĐẦU 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1
2.Mục tiêu đề tài 2
3. Cách tiếp cận đề tài 2
4. Phƣơng phảp nghiên cứu 3
5. Phạm vi nghiên cứu 3
6. Nội dung nghiên cứu 3
7. Sản phẩm đề tài 3
CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. Tình hình nghiên cứu về đông lạnh trứng 5
1.1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc 5
1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 7
1.2. Sinh lý buồng trứng 8
1.2.1. Quá trình hình thành và phát triển nang trứng 8
1.2.2. Sự hình thành và phát triển của trứng 9
1.2.3. Cấu tạo của trứng 12

1.3. Cơ sở khoa học của đông lạnh trứng 13
1.3.1. Các phƣơng pháp đông lạnh 13
1.3.2. Chất bảo quản lạnh (Cryoprotective Additive_CPA) 15
1.3.2. 1. Các chất bảo quản thƣờng sử dụng cho phƣơng pháp thủy tinh hóa 15
1.3.2.2. Dung dịch đệm và các đại phân tử 16
iii

1.3.3. Các yếu tổ ảnh hƣởng đến chất lƣợng trứng sau khi bảo quản bằng phƣơng pháp
thủy tinh hóa 18
1.3.3.1. Biến đổi trong tế bào đông lạnh 19
1.3.3.2. Tính an toàn khi đông lạnh trứng trƣởng thành 21
1.4. Ứng dụng của đông lạnh trứng 23
1.4.1. Ở ngƣời 23
1.4.2. Ở động vật 24
CHƢƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Nội dung 1: Đông lạnh trứng heo trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa 25
2.1.1. Thu nhận mẫu buồng trứng 25
2.1.2. Thu nhận và nuôi trứng Chuẩn bị 26
2.1.3. Đánh giá trứng và lựa chọn trứng chín để đông lạnh 28
2.1.4. Đông lạnh trứng bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (PP1) 29
2.1.5. Phƣơng pháp giải đông các vi giọt đƣợc đông lạnh 31
2.1.6. Đông lạnh trứng bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (PP2) 33
2.1.7. Đánh giá tỷ lệ sống chết của trứng 35
2.2. Nội dung 2: Đông lạnh trứng bò trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa
trong cọng rạ (PP2) 35
2. 2.1. Thu nhận mẫu buồng trứng 35
2.6.2.2. Thu nhận và nuôi trứng 35
2. 2.3. Đông lạnh trứng theo phƣơng pháp 2 37
2.3. Nội dung 3: Đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành bằng phƣơng pháp
thủy tinh hóa 38

2.3.1.Thu nhận buồng trứng 38
2.3.2.Thu nhận trứng 38
2.3.3.Đông lạnh trứng 38
2.3.4. Phƣơng pháp giải đông 39
2.4. Xử lý số liệu 39
CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40
3.1. Kết quả nội dung 1 40
3.1.1. Kết quả thu nhận trứng 40
iv

3.1.2. Kết quả nuôi trứng trong ống nghiệm (IVM) 41
3.1.3. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP1 44
3.1.4. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP2 48
3.1.5. Kết quả so sánh giữa 2 phƣơng pháp thủy tinh hóa trứng heo 50
3.2. Kết quả nội dung 2 51
3.2.1. Kết quả thu nhận trứng 51
3.2.2. Kết quả nuôi trứng bò 53
3.2.3. Kết quả đông lạnh trứng bò 55
3.3. Kết quả nội dung 3 57
3.3.1. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP1 57
3.3.2. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP2 59
3.3.3. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành theo 2 phƣơng pháp thủy
tinh hóa 61
3.4. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn bằng phƣơng pháp thủy tinh
hóa trong cọng rạ 63
3.5. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò và heo đã trƣởng thành bằng PP2 64
CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65
4.1. Kết luận 65
4.2. Kiến nghị 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

PHỤ LỤC 75
v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Môi trƣờng chuẩn bị thu trứng 27
Bảng 3.1. Kết quả thu nhận trứng heo 40
Bảng 3.2. Kết quả nuôi trứng heo 42
Bảng 3.3. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP1 44
Bảng 3.4. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP2 48
Bảng 3.5. So sánh kết quả đông lạnh trứng heo 50
Bảng 3.6. Kết quả thu nhận trứng bò 51
Bảng 3.7. Kết quả nuôi trứng bò 54
Bảng 3.8. Kết quả đông lạnh trứng bò chín bằng PP2 56
Bảng 3.9. Kết quả đông lạnh trứng bò bằng PP1 57
Bảng 3.10. Kết quả đông lạnh trứng bò bằng PP2 59
Bảng 3.11. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành 61
Bảng 3.12. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn khác nhau 63
Bảng 3.13. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò, heo trƣởng thành bằng PP2 64
vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sự hình thành và phát triển nang trứng 9
Hình 1.2. Cấu trúc của buồng trứng và nang trứng 10
Hình 1.3. Tế bào trứng 12
Hình 1.4. Ảnh hƣởng của tốc độ đông lạnh lên sự hình thành tính thể đá 19
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 1 25
Hình 2.2: Mầu buồng trứng heo 26
Hình 2.3. Thao tác chọc hút trứng từ buồng trứng 28
Hình 2.4. Soi tìm và thu trứng bằng hệ thống kính đảo ngƣợc 28

Hình 2.5. Sơ đồ bổ trí đĩa vi giọt đông lạnh 30
Hình 2.6. Cách tạo vi giọt đông lạnh 30
Hình 2.7. Nhỏ trực tiếp vi giọt vào LN
2
31
Hình 2.8. Chuyển vì giọt vào cryotube 31
Hình 2.9. Thao tác đổ vị giọt ra khỏi cryotube 32
Hình 2.10. Sơ đồ bố trí đĩa vi giọt rã đông 32
Hình 2.11. Cọng rạ chứa trứng 33
Hình2.12. Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng 34
Hình 2.13. Giải đông cọng rạ trong nƣớc ấm 34
Hình 2.14. Cắt cọng rạ chứa trứng 34
Hình 2.15. Chuyển trứng vào môi trƣờng RĐ 34
Hình 2.16. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 2 35
Hình 2.17. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 3 38
Hình 3.1. Trứng heo đƣợc thu nhận từ buồng trứng (X100) 40
Hình 3.2. Trứng heo với sự xuất hiện thể cực thứ nhất 42
Hình 3.3. Trứng sống 46
Hình 3.4. Trứng có tế bào chất phân mảnh 46
Hình 3.5. Trứng chết do tế bào chất co lại 46
vii


Hình 3.6. Trứng bò thu nhận từ dịch nang trứng theo phƣơng pháp chọc hút (X40) 51
Hình 3.7. Trứng bò sau khi IVM có lớp cumulus giãn nở (X100) 54
Hình 3.8. Trứng bò sau khi IVM xuất hiện thể cực I (X400) 54
Hình 3.9. Trứng sống sau giải đông (X100) 55
Hình 3.10. Trứng chết sau giải đông 55
viii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Kết quả thu nhận trứng heo từ buồng trứng 41
Biểu đồ 3.2. Kết quả nuôi trứng heo 42
Biểu đồ 3.3. Kết quả thu hồi trứng heo từ đông lạnh theo PP1 45
Biểu đồ 3. 4. Tỷ lệ sổng, chết của trứng heo so với tổng số trứng thu hồi đƣợc bảo quản theo
PP1 46
Biểu đồ 3.5. Kết quả thu hồi trứng từ đông lạnh theo PP2 49
Biểu đồ 3. 6. Tỷ lệ sống, chết của trứng heo so vói tổng số trứng thu hồi đƣợc bảo quản theo
PP2 49
Biểu đồ 3.7. Kết quả so sánh bảo quản trứng heo theo 2 phƣơng pháp 50
Biểu đồ 3.8. Kết quả thu nhận trứng bò từ mẫu buồng trứng 52
Biểu đồ 3.9. Kết quả nuôi trứng bò 54
Biểu đồ 3.10. Kết quả thu hồi trứng bò chín sau giải đông 56
Biểu đồ 3.11. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tồng số trứng thu hồi đƣợc bảo quản theo PP2 57
Biểu đồ 3.12. Kết quả thu hồi trứng chƣa chín đƣợc bảo quản theo PP1 58
Biểu đồ 3.13. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tồng số trứng thu hồi đƣợc bảo quản theo PP1 59
Biểu đồ 3.14. Kết quả thu hồi trứng chƣa chín đƣợc bảo quản theo PP2 60
Biểu đồ 3.15. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tồng số trứng thu hồi đƣợc bảo quản theo PP2 61
Biểu đồ 3.16. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành 62
Biểu đồ 3.17. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn khác nhau 63
Biểu đồ 3.18. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò, heo trƣởng thành bằng PP2 64
ix


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BSA
Bovine Serum Albumin

DMSO
Dimethylsulphoxide

CPA
Cryoprotective Additive
Chất bảo quản lạnh
Cs.
cộng sự

EG
Ethylene glycol

EGF
Epiderman Growth factor
Nhân tố tăng trƣởng biểu mô
FBS
Fetal Bovine Serum

FCS
Fetal Calf Serum

GV
Germinal Vesicle
Giai đoạn túi mầm
GVBD
Germinal Vesicle Breakdovvn
Giai đoạn phá vỡ túi mầm
IIF
Intracellular Ice Formation
Sự hình thành đá nội bào

LH
Luteinizing hormone
Hormone hoàng thể hóa
MU
Metaphase II
Kì giữa giảm phân II
IVM
In vitro Maturaration
Nuôi trƣởng thành trong ống nghiệm
IVF
In Vitro Fertilỉzation
Thụ tinh trong ống nghiệm
PCR
Polymerase Chain Reaction

PEG
Polyethylene glycol

PTN
Phòng thí nghiệm

PP1
Thủy tinh hóa trong vi giọt

PP2
Thủy tinh hoa trong cọng rạ

PVP
Polyvinylpirrolidone

x

TÓM TẮT

Tên đề tài: "Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện cải thiện quy trình đông lạnh trứng
trong điều kiện Việt Nam "
Mã số: CS.2008.19.
Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Thị Thƣơng Huyền Tel.: 0918605081
Email: thuonghuyen78@,yahoo.com; huyenntth@,hcmup.edu.vn
Cơ quan chủ trì: Trƣờng Đại học Sƣ phạm Tp. HCM
Cơ quan phối hợp thực hiện
• Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM
• Viện Sinh học nhiệt đới Tp. HCM
Cá nhân phối họp thực hiện
STT
Tên ngƣời tham gia
Tên cơ quan
1
ThS. Phạm Văn Phúc
Trƣờng ĐH KHTN TPHCM
2
CN. Đỗ Ngọc Hân
Trƣờng ĐH KHTN TPHCM
3
CN. Trƣơng Văn Trí
Trƣờng ĐHSP TPHCM
Thời gian thực hiện: tháng 04 - 2008 đến 04 - 2009
1. Mục tiêu
Sự phát triển của Công nghệ hỗ trợ sinh sản nói chung và kỹ thuật đông lạnh nói riêng

đã đem lại nhiều tiềm năng ứng dụng có ý nghĩa không chỉ về kinh tế mà còn có ý nghĩa về
khoa học. Đề tài tiến hành nhằm mục tiêu thu nhận nguồn giao tử cái (trứng) bò và heo phục
vụ cho quá trình bảo quản trứng bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa; đồng thời làm cơ sở cho
các nghiên cứu sâu hơn trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản.
2. Nội dung chính
Nội dung 1: Buồng trứng heo đƣợc thu nhận tại lò mổ và chuyển nhanh về phòng thí
nghiệm trong nƣớc muối sinh lý, dùng kim tiêm 18G và xi lanh 5ml thu nhận trứng bằng
phƣơng pháp chọc hút. Trứng đƣợc nuôi trong môi trƣờng IVM
1
ở 38,5
0
C, 5%CO
2
, hơi nƣớc
bão hòa sau 22 - 24 giờ nuôi, chuyển trứng sang môi trƣờng IVM
2
nuôi tiếp cho tới 42 - 44
giờ. Các trứng chín sau khi nuôi đƣợc bảo quản bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong vi giọt
và trong cọng rạ theo 2 bƣớc: trứng đƣợc cho vào dung dịch thủy tinh hóa chứa 10% DMSO
+ 10% EG để trong 45 giây, tiếp theo cho vào dung dịch thủy tinh hóa chứa 20% DMSO +
20% EG + 1M sucrose để trong 25 giây, sau đó cho vào vi giọt hoặc cọng rạ (0,25ml) và
nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng (khoảng 25 - 40 giây kể từ khi trứng tiếp xúc với dung dịch bảo
quản). Giải đông trứng theo 3 bƣớc. Nôi dung 2: Buồng trứng bò đƣợc thu nhận tại lò mổ và
chuyển nhanh về phòng thí nghiệm trong nƣớc muối sinh lý. Trứng đƣợc thu nhận bằng
phƣơng pháp chọc hút, chọn những trứng có ít nhất 3 lớp cumulus cho vào nuôi trong môi
trƣờng C
3
(TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG + EGF). Sau 22 - 24 giờ, chọn những
trứng chín đem bảo quản bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ. Nội dung 3: Trứng
bò sau khi đƣợc thi nhận từ buồng trứng bằng phƣơng pháp chọc hút, tiến hành bảo quản

những
xi

trứng tốt (có từ 3 lớp cumulus trở lên) bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong vi giọt và trong
cọng rạ. Các trứng sau giải đông đƣợc đánh giá sống chết bằng quan sát hình thái dƣới kính
hiển vi soi nổi (hoặc kính vi thao tác). Tất cả sổ liệu thu nhận đƣợc xử lý bằng phần mền
Excel ở độ tin cậy 95%.
3. Kết quả chính đạt đƣợc
Kết quả nội dung 1: Đã thu đƣợc 1733 trứng/80 buồng trứng, trung bình 21,66
trứng/buồng; Chọn đƣợc 1189 trứng để nuôi chín, tỷ lệ chín đạt 65,42 ± 0,79% (779 trứng);
Có 305 trứng đƣợc đông lạnh theo vi giọt, tỷ lệ sống đạt 46,15 ± 5,63%; 386 trứng đƣợc đông
lạnh bằng cọng rạ, tỷ lệ sống đạt 47,54 ± 0,60%. Kết quả nội dung 2: Thu đƣợc 909 trứng/50
buồng trứng, trung bình đạt 18,55 trứng/buồng; Chọn đƣợc 684 trứng đem nuôi, tỷ lệ chín đạt
84,92 ± 0,63% (580 trứng); Đông lạnh 197 trứng bằng cọng rạ, tỷ lệ trứng sống sau giải đông
đạt 79,90 ± 2,33%. Kết quả nội dung 3: Đông lạnh 477 trứng bằng vi giọt, tỷ lệ trứng sống
sau giải đông là 71,92 ± 2,20%; 365 trứng đông lạnh bằng cọng rạ, tỷ lệ trứng sống sau giải
đông là 65,31 ± 2,69%.
Từ khóa: nuôi chín trứng, đông lạnh trứng, thủy tinh hóa
xii

SUMMARY

Project Title: "Collected bovine and porcine oocytes to improve oocyte cryopreserved
protocol in Vietnamese condition"
Code number: CS. 2008.19.
Coordinator: MSc. Nguyen Thi Thuong Huyen Tel. 0918605081
Implementing Institution: University of Pedagogy HCMC
• Cooperating Institution(s):
• University of Natural Science HCMC
Intistute of Tropical Biology

Ordinal
number
Full name
Office
1
MSc. Pham Van Phuc
University of Natural Science HCMC
2
BA. Do Ngoc Han
University of Natural Science HCMC
3
BA. Truong Van Tri
University of Pedagogy HCMC
Duration: from 04-2008 to 04 - 2009
1. Objectives
The development of the Assisted reproductive technology and freezing techonology
has brought many potential economical and scientific applications. The goal of this study is
collecting bovine and porcine oocytes which were then preserved by vitrification methods to
be materials for further studies in the field of assisted reproductive technology.
2. Main contens
In the first experiment, porcine ovaries were obtained from shaughter house and
transferred to the laboratory in 0.9% (w/v) saline solution. The cumulus-oocyte complexes
(COCs) were aspirated from 2 to 8 mm follicles with an 18-gauge needle attached to 5ml
syringe. Maturation culture was performed in IVM1 medium under sterile mineral oil at
38.5°C in an humidified atmosphere of 5% (v/v) CO2 in air for 22-24h. The COCs were
subsequently cultured in IVM2 medium under same gas conditions for 20-22h. After 42-44h
incubation, matured oocytes (with visible first body and expanded cumulus) were preserved
by vitrification in microdrops or straws in two steps, (i) oocytes were incubated in the
vitrification solutions containing 10% DMSO + 10% EG in 45 seconds; (ii) oocytes were
then subjected in the solution containing 20% DMSO + 20% EG + 1M sucrose in 25 seconds

and then were loaded into microdrops or straws (0,25ml) by mouth pipette and pipette
Pasteur and the mircrodrops or straws were plunged directly into liquid nitrogen within 25 -
40 seconds after the exposure of eggs to preservation solution.
In the second experiment, bovine ovaries were obtained from shaughter house and
transferred to the laboratory in 0.9% (w/v) saline solution. The cumulus-oocyte complexes
(COCs) were aspirated in the same way of porcine COCs. Maturation culture was performed
in C3 (TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG + EGF ) medium under
xiii

sterile mineral oil at 38.5°C in an humidified atmosphere of 5% (v/v) CO2 in air. After 20-
24h incubation, matured oocytes (with visible first body and expanded cumulus) were
preserved by vitrification in straws.
In the last experiment, the immatures bovine oocytes were preserved by vitrification
in straws. After thrawed, oocytes could be recovered after cryopreservation and were
evaluated by morphological examination under a stereomicroscope (confidence level 95%).
3. Results obtained
In the first experiment, collected 1733 oocytes from 80 ovaries porcine, average 21.66
oocytes/ovary; 1189 oocytes were cultured, the rates of the metaphase II (MII) oocytes after
in vitro maturation (IVM) are 65.42 ± 0.79% (779 oocytes); 305 oocytes were preserved by
vitrification in microdrops, the rates of viability of oocytes are 46.15 ± 5,63%. 386 oocytes
were preserved by vitrification in straws, the rates of viability of oocytes are 47.54 ± 0.60%.
In the second experiment, collected 909 oocytes from 50 ovaries bovine, average 18.55
oocytes/ovary; 684 oocytes were cultured, the rates of the metaphase II (MII) oocytes after
IVM are 84.92 ± 0.63% (580 oocytes); 197 oocytes were preserved by vitrification in straws,
the rates of viability of oocytes are 79.90 ± 2.33%. In the last experiment: 477 oocytes were
preserved by vitrification in microdrops, the rates of viability of oocytes are 71.92 ± 2.20%.
365 oocytes were preserved by vitrification in straws, the rates of viability of oocytes are
65.31 ± 2.69%.
Keywords: in vitro maturation, cryopreservation, vitrification
1 Mở đầu

PHẦN MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Sự phát triển của Công nghệ sinh sản nói chung và kỹ thuật đông lạnh nói riêng đã
đem lại nhiều tiềm năng ứng dụng có ý nghĩa không chỉ về kinh tế mà còn có ý nghĩa về khoa
học. Đặc biệt, kỹ thuật đông lạnh trứng ngoài việc ứng dụng trong điều trị vô sinh còn là nền
tảng cho những nghiên cứu mới của nhân loại trong nhiều lĩnh vực: y sinh học nhằm thu nhận
tế bào gốc phôi, nhân giống vật nuôi, bảo quản nguồn gen in vỉtro, chuyển gen, sinh sản vô
tính
Ở nƣớc ta trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đƣợc triển khai nhằm nhân
nhanh đàn bò để thực hiện "Chiến lƣợc phát triển chăn nuôi đến năm 2020 do Thủ tƣớng
chính phủ đề ra (16/1/2008). Tuy nhiên, các nghiên cứu này còn gặp khó khăn do nguồn
trứng không đủ để tiến hành các thí nghiệm nuôi chín trứng, thụ tinh trong ống nghiệm (in
vitro ferttilization_IVF) Nguyên nhân của vấn đề này là do hạn chế trong việc vận chuyển và
chi phí. Do đó, cung cấp nguồn trứng có chất lƣợng cao với giá thành thấp đang đƣợc quan
tâm.
Heo là đối tƣợng động vật quan trọng cho việc nghiên cứu sinh lý và bệnh học ở
ngƣời. Kỹ thuât chuyển gen đang đóng vai trò thiết yếu trong việc tạo ra heo có kiểu gen cho
các hƣớng nghiên cứu khác: khai thác tế bào gốc phôi, cắt phôi Xa hơn nữa, công nghệ này
còn có khả năng ứng dụng trong Y sinh: cấy ghép cơ quan, nội tạng Bảo quản lạnh giao tử và
phôi từ heo có thể là một phƣơng pháp thay thế hữu hiệu trong việc duy trì những cá thể sinh
sản nhằm bảo tồn các kiểu gen quý hiếm. Đây là một cuộc cách mạng không chỉ với việc
kiểm soát khả năng sinh sản ở heo mà còn với sự gia tăng sử dụng heo trong các ứng dụng về
công nghệ Y sinh học.
Hiện nay nguồn trứng chủ yếu đƣợc bảo quản bằng phƣơng pháp đông lạnh, song tỷ
lệ trứng sống sau khi rã đông theo tổng kết của các chuyên gia thế giới
2 Mở đầu

chƣa cao (bò 30%, ngƣời 10%,). Chính điều này là làm tốn kém và hạn chế trong công việc

của nhiều nƣớc. Một trong những tác nhân giới hạn thành công của kỹ thuật đông lạnh trứng
là xảy ra tổn thƣơng lạnh trong suốt quá trình đông lạnh. Trứng rất dễ tổn thƣơng khi tiếp xúc
với nhiệt độ thấp của quá trình đông lạnh và để tránh điều này bằng cách sử dụng phƣơng
pháp thủy tinh hóa (Ruffing và cs., 1993; Martino và cs., 1996).
Trên cơ sở đó, chúng tôi mạnh dạn thực hiện đề tài "Thu nhận trứng bò, heo để cải
thiện cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam".
2.Mục tiêu đề tài
- Thu nhận và nuôi trứng bò, heo đến giai đoạn trƣởng thành (In vitro
Maturaration_IVM)
- Thử nghiệm khả năng sống của trứng bò, heo trƣởng thành sau khi đông lạnh bằng
phƣơng pháp thủy tinh hóa.
3. Cách tiếp cận đề tài
• Tiếp cận với nhu cầu đòi hỏi của xã hội và tầm quan trọng của vấn đề này trong
cuộc sống; đồng thời các điều kiện về kiến thức, điều kiện phòng thí nghiệm cho phép ứnng
dụng Công nghệ Sinh học.
• Tiếp cận với các chuyên gia đầu ngành để học tập, trao đổi kỹ thuật, kinh nghiệm:
Tham gia lớp học về các kỹ thuật thu nhận, nuôi, đông lạnh trứng, thụ tinh trong ống nghiệm
trên đối tƣợng bò heo tại Viện Chăn nuôi quốc gia, Hà Nội (tháng 05/2008) do TS. Otoi
(Ngƣời Nhật) và các cán bộ của viện đảm trách
• Tra cứu các tài liệu liên quan trong và ngoài nƣớc
• Tiếp cận với các kỹ thuật hiện đại: hệ thống máy đông lạnh và giải đông trứng, kỹ
thuật vi thao tác, PCR
3 Mở đầu

4. Phƣơng phảp nghiên cứu
• Phƣơng pháp trực quan (nghiên cứu trực tiếp): thu nhận trứng và xử lý trứng, đông
lạnh trứng, giải đông trứng, kiểm tra, đánh giá tỷ lệ trứng sống sau khi rã đông.
• Phƣơng pháp tổng họp
• Phƣơng pháp so sánh
5. Phạm vi nghiên cứu

• Trứng bò từ các nguồn khác nhau: từ viện chăn nuôi quốc gia, lò mổ Vissan Tp.
HCM
• Trứng heo từ lò mổ Vissan Tp. HCM
6. Nội dung nghiên cứu
• NỘI DUNG 1 : Đông lạnh trứng heo trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa
trong vi giọt (PP1) và trong cọng rạ (PP2)
• NỘI DNG 2 : Đông lạnh trứng bò trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa
trong cọng rạ (PP2)
• NỘI DNG 3 : Đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh
hóa trong vi giọt (PP1) và trong cọng rạ (PP2)
7. Sản phẩm đề tài
Kết quả khoa học
Đã tiến hành thu nhận và bảo quản nguồn trứng bò, heo thu nhận từ lò mổ bằng
phƣơng pháp thủy tinh hóa trong vi giọt và trong cọng rạ.
Kết quả sản phẩm
Đã bảo quản đƣợc số lƣợng trứng vƣợt với chỉ tiêu đề ra trong thuyết minh:
• 71 cọng rạ chứa 386 trứng heo đã IVM
• 36 cọng rạ chứa 197 trứng bò đã IVM
4 Mở đầu

• 70 cọng rạ chứa 365 trứng bò chƣa trƣởng thành
• 305 trứng heo đã IVM trong vi giọt
• 477 trứng bò chƣa trƣởng thành trong vi giọt
Kết quả đào tạo
02 cử nhân
• Phan Bá Quy: Thử nghiệm bảo quản trứng bò trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy
tinh hóa trong cọng rạ (vitrification)- 2008
• Nguyễn Quốc: Bảo quản trứng bò bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa (vitrification) -
2009.
01 SV nghiên cứu khoa học đạt giải nhì cấp trƣờng

Đỗ Hoàng Hùng: Thử nghiệm bảo quản trứng bò, heo bằng phƣơng pháp thủy tinh
hóa trong vi giọt (microdrop vitrification) - 2009.
Kết quả bài báo, báo cáo đã công bố
• 01 bài đăng trong Hội nghị Khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM, 2008
(Bảo quản trứng bò bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ)
• 01 bài đăng trong Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 2008 (Bảo quản trứng bò
bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ; đang chờ phản biện)
5 Chƣơng I

CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình nghiên cứu về đông lạnh trứng
1.1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Khái niệm thủy tinh hóa hay toàn bộ vật chất có trạng thái trong suốt giống thủy tinh
đƣợc mô tả đầu tiên vào năm 1890, sau đó đƣợc Luyet mô tả lại vào năm 1937 (Luyet, 1937)
[46].
Vào nửa cuối thập kỷ 1940, Chang đã thực hiện những nghiên cứu đầu tiên về bảo
quản phôi thỏ ở nhiệt độ thấp [3]. Đến năm 1949, Polge và cs. phát hiện ra glycerol có thể giữ
đƣợc sức sống của tinh trùng gia cầm khi nhiệt độ đƣợc hạ xuống -70
0
C [65]. Phát hiện này
mở ra khả năng có thể bảo quản các loại tế bào và mô ở nhiệt độ thấp hơn. Smith (1952) đã
đông lạnh phôi thỏ ở nhiệt độ -79
0
c và -196
0
c nhƣng đạt kết quả không cao. Sau khi rã đông,
chỉ có 1% số phôi đƣợc bảo quản còn giữ đƣợc một phôi bào có khả năng tiếp tục phân chia
[76].
Năm 1976, Parkening và cs. tiến hành đông lạnh trứng chuột ở -30

0
C và -50
0
C có tỉ lệ
sống đạt 51 - 56%; ở -75
0
C chỉ đạt 18% trứng sống [60].
Một loạt nghiên cứu của tác giả Willadsen (1977) [85], Trouson (1977) [77], Massip
(1979) [52], đã cải tiến phƣơng pháp đông lạnh và rã đông theo phƣơng pháp giảm từng bƣớc
một, nhằm pha loãng các chất bảo quản lạnh, tăng nhanh tốc độ đông lạnh và rã đông mà vẫn
bảo tồn sức sống của phôi, thu đƣợc kết quả tốt ở bò và chuột. Những cải tiến này cũng hạn
chế đƣợc sự biến đổi về hình thái học của phôi. Ngày nay, việc đơn giản hóa kĩ thuật đông
lạnh và rã đông theo phƣơng pháp một bƣớc (one - step method) do Leibo (1980) đề xuất đã
thực sự thúc đẩy việc sử dụng phôi cũng nhƣ tinh trùng đông lạnh rộng rãi trong sản xuất.
Hiệu quả cho thấy khi sử dụng tinh đông lạnh thì sức sống của phôi đạt trên 80% và tỉ lệ thụ
thai đạt 50 - 60% [40].
6 Chƣơng I


Đến năm 1985, Rall và Fahy đã công bố phƣơng pháp đông lạnh cực nhanh còn gọi là
phƣơng pháp thủy tinh hóa, bằng cách nhúng trực tiếp phôi chuột 8 tế bào vào nitơ lỏng từ
nhiệt độ trên 0
0
C, do đó chỉ mất vài giây để đông lạnh. Và ông đã thực hiện thành công trong
trữ lạnh phôi gia súc (bò) [66]. Phƣơng pháp này không yêu cầu những dụng cụ làm lạnh đắt
tiền hay kĩ năng đặc biệt mà có thể tiến hành rất nhanh. Mặt khác, phƣơng pháp thủy tinh hóa
đơn giản hơn phƣơng pháp đông lạnh thông thƣờng. Từ đó, phƣơng pháp thủy tinh hóa đƣợc
sử dụng rộng rãi và bây giờ đƣợc xem nhƣ là phƣơng pháp thay thế phƣơng pháp đông lạnh
chậm.
Mặc dù, phƣơng pháp đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa đƣợc Rall và Fahy thực

hiện thành công đầu tiên trên phôi bò vào năm 1985 [66]. Tuy nhiên, quy trình này chỉ đƣợc
Kuleshova và Lopata ứng dụng đầu tiên trên trứng ngƣời vào năm 1999 [37] và sau đó vài
tháng, quy trình này cũng đƣợc thực hiện đầu tiên trên phôi ngƣời đang phát triển ở giai đoạn
phôi nang bởi Lane [38]. Vào ngày 20/6/1999, em bé đầu tiên trên thế giới từ phôi trữ lạnh
bằng kỹ thuật thủy tinh hóa ra đời [90].
Kỹ thuật đông lạnh bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa áp dụng thành công trên trứng bò
(Martino và cs.,1996) [51]. Trên chuột, tỷ lệ hình thái trứng sống sau quy trình đông lạnh và
rã đông bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa là 88% (Nakagata, 1989) [55]; 80% (Shaw, 1991)
[72]; 99% (Lane, 2001) [39]; 90% (Kim, 2007) [36]. Trên bò, tỷ lệ trứng sống sau đông lạnh
và rã đông là 85% (Otoi,1998) [58]; 87% (Asada, 2002) [12]; 88% (Men, 2002) [53]; đặc biệt
Chian (2004) thu đƣợc tỷ lệ trứng bò sống sau rã đông đạt 92% khi dùng chất bảo quản đông
lạnh là 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% dimethyl sulphoside (DMSO), và đạt 98%
khi dùng 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% propylene glycol (PG) [17].
Vào năm 2005, Fujihira thực hiện quy trình đông lạnh và rã đông trứng heo bằng
phƣơng pháp thủy tinh hóa sử dụng Cryotop, với nồng độ EG trong
7 Chƣơng I

dung dịch thủy tinh hóa là 30%, thu đƣợc tỷ lệ sống sau rã đông là 54 - 56% [24]. Trong năm
này Martins R.D. và cs. đã đông lạnh trứng bò chƣa chín bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa, sử
dụng chất bảo quản là EG và sucrose, tỷ lệ trứng sống là 20% so với nhóm đối chứng là
74,6% [50]. Năm 2006, Cetin Yunus và Bastan Ayhan đã bảo quản trứng bò chƣa trƣởng
thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa với các chất bảo quản khác nhau, tỷ lệ sống trên 20%
so với nhóm đối chứng là 79,6% [18].
Somfai và cộng sự (2006) khảo sát ảnh hƣởng của Cytochalasin B trên quá trình thủy
tinh hóa trứng heo sử dụng phƣơng pháp thủy tinh hóa trên bề mặt kim loại. Họ sử dụng quy
trình bổ sung CPA qua 2 bƣớc (trong EG 4% khoảng 10-15 phút ở 37
0
C, sau đó trong dung
dịch thủy tinh hóa cuối cùng EG 35% với 5% PVP và trehalose 0.3M) [75].
Gupta và cộng sự (2007) sử dụng quy trình thủy tinh hóa tƣơng tự với quy trình trên.

Trong thử nghiệm sử dụng trứng giai đoạn túi mầm, kết quả đƣợc cải thiện khi kết hợp sử
dụng EG và DMSO, vì vậy họ sử dụng kết hợp 2 chất này trên đổi tƣợng trứng MII. Tuy
nhiên phƣơng pháp này làm giảm đáng kể khả năng phát triển của trứng (chỉ 3.4% phát triển
đến blastocyst so với lô đối chứng là 20.1%) [28].
Morató và cs. (2008) đã bảo quản trứng bò trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh
hóa bằng cọng rạ và cryoloop cho tỷ lệ trứng sống sau giải đông tƣơng ứng là 88,4% và
94,5% [54].
1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bò đã đƣợc tiến hành vào năm 1984. Phƣơng
pháp đông lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 12
0
C/phút) sau khi khử nƣớc cục bộ ở nhiệt độ phòng
trên phôi bò đã thành công với 63,4% (33/52) phôi phát triển trong ống nghiệm sau 48 giờ và
44,2% (23/52) phôi nang thoát màng và tỷ lệ có thai sau khi cấy phôi đông lạnh - rã đông là
33,3% (7/21) [3].
8 Chƣơng I


Năm 1990, con bê Charolais đầu tiên đƣợc sinh ra từ phôi đông lạnh nhập khẩu [2].
Năm 2003, Lƣu Công Khánh và cs. đã báo cáo thành công việc nghiên cứu ứng dụng
phôi bò đông lạnh bằng glycerol [5].
- Ngày 24/05/2004, trƣờng hợp em bé đầu tiên của Việt Nam ra đời từ trứng trữ lạnh
tại bệnh viện Từ Dũ [90].
- 2008, Nguyễn Thị Thƣơng Huyền và cs. đã bảo quản thành công trứng bò bằng
phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ với tỷ lệ trứng sống so với tổng số trứng đem đông
lạnh sau giải đông 58,83% [4].
- Hiện nay các nhà khoa học đang nghiên cứu về việc bảo quản trứng ở động vật hữu
nhũ, nhằm mục đích tạo ngân hàng bảo quản giao tử cái (trứng) để phục vụ cho các nghiên
cứu sâu hơn: IVF, ICSI, cloning, chuyển gen, thu nhận tế bào gốc phôi
1.2. Sinh lý buồng trứng

1.2.1. Quá trình hình thành và phát triển nang trứng
Hình thành nang trứng là quá trình tiếp nối của các giai đoạn từ nang nguyên thủy
phát triển thành nang sơ cấp và sau đó thành nang thứ cấp, các nang này sẽ phát triển, tích lũy
dịch, phồng lên và di chuyển ra ngoài buồng trứng để chuẩn bị rụng trứng - đó là nang trứng
chín (Hình 1.1). Và quá trình phát triển này ở gia súc từ giai đoạn nguyên thủy đến giai đoạn
trƣớc rụng trứng mất khoảng 180 ngày (Lussier và cs., 1987) [45].
Từ giai đoạn nguyên thủy đến giai đoạn tiền rụng trứng đƣờng kính nang trứng bò
tăng 30 đến 400 lần (từ 50 μm lên 15 đến 20mm). Trong quá trình này trứng hình thành màng
trong suốt, tích lũy một số sản phẩm cần thiết cho sự thụ tinh và các giai đoạn đầu của sự
phát triển phôi. Sau khi rụng nang trứng sẽ hình thành thể vàng.
9 Chƣơng I

Số lƣợng nang trứng dự trữ trong buồng trứng ở các loài có sự khác nhau và thoái hóa
dần trong quá trình phát triển của cá thể, càng lớn thì số nang trứng có hiệu quả càng ít. Ở bò,
bê con lúc mới sinh ra có hơn 100.000 nang trứng và số lƣợng này giảm dần theo độ tuổi.













Hình 1.1. Sự hình thành và phát triển nang trứng
1.2.2. Sự hình thành và phát triển của trứng

Một trứng trƣởng thành và sẵn sàng cho sự thụ tinh khi nó đƣợc phóng thích từ nang
trứng trƣởng thành của buồng trứng. Sự trƣởng thành của trứng liên quan mật thiết với sự
trƣởng thành của các nang trứng (Hình 1.2). Quá trình phát triển của trứng gồm 4 giai đoạn:
Sự di chuyển của các tế bào mầm vào cơ quan sinh dục- Sự gia tăng số lƣợng tế bào mầm
bằng nguyên phân; Sự giảm vật liệu di truyền bằng giảm phân; Sự trƣởng thành về cấu trúc
và chức năng của trứng. Trong quá trình giảm phân của trứng có 2 giai đoạn trứng ở trạng
thái ngừng tăng trƣởng (block):
10 Chƣơng I

• Giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trƣởng lần thứ nhất: khi trứng bƣớc vào giai
đoạn prophase của giảm phân I, cho ra trứng sơ cấp ở giai đoạn túi mầm (Germinal
Vesicle_GV). Các trứng sẽ vƣợt qua giai đoạn này khi có sự xuất hiện của đỉnh LH
(Luteinizing hormone) tức khi cá thể đến tuổi trƣởng thành sinh dục.
• Giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trƣởng lần thứ hai: khi ở giai đoạn
metaphase-M của giảm phân II (MU), cho ra trứng thứ cấp ở giai đoạn MU. Trứng chỉ vƣợt
qua đƣợc giai đoạn MU khi có sự thụ tinh của tinh trùng.












Hình 1.2. Cấu trúc của buồng trứng và nang trứng
Sự trƣởng thành của trứng bao gồm những biến đổi ở mức tế bào để hỗ trợ cho sự thụ

tinh và thời kỳ đầu của sự phát triển phôi thai (Sirard và cs., 1989) [73]. Sự trƣởng thành
trứng bao gồm: