pcr (polymerase chain reaction)

Trờng đại học quốc gia
đại học khoa học tự nhiên
khoa sinh học
PCR
(Polymerase chain reaction)
(Tiểu luận Sinh học phân tử)
Sinh viên: Nguyễn Đức Nhự
Lớp K6-CNTNSH
Giảng viên hớc dẫn:
PGS.TS
Đỗ Ngọc Liên
1
Hµ néi, N¨m 2004
2
PCR
(Polymerase chain reaction)
I. Những kiến thức cơ bản về PCR.

PCR là từ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction trong tiếng Anh.
Có nhiều cách dịch cho cụm từ này. Có sách dịch là phản ứng tổng hợp dây
chuyền nhờ Polymerase, có tài liệu dịch là phản ứng chuỗi trùng hợp, hay đơn
giản là kỹ thuật PCR. ở đây chúng ta sẽ dùng đơn giản là kỹ thuật PCR.
Kỹ thuật này do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào giữa thập niên 80
của thế kỷ hai mơi đã đa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Từ
đó đến nay, nó đã đợc sử dụng rộng rãi và trở thành phần không thể thiếu trong
các hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử.
Kary Mullis nhận giải thởng Nobel năm 1993 về phát minh PCR
Kary Mullis đã viết trong tạp chí khoa học Mỹ: Bắt đầu bằng một phân tử
riêng lẻ có chứa chất liệu di truyền ADN, PCR có thể tạo ra 100 triệu phân tử t-
ơng tự trong một buổi chiều. Phản ứng dễ dàng thực hiện. Nó đòi hỏi không
nhiều hơn một ống nghiệm, một vài hoá chất đơn giản và một nguồn nhiệt. Mẫu

ADN cần để nhân bản có thể tinh sạch, hoặc là một phần rất nhỏ trong một hỗn
hợp chất sinh học cực kỳ phức tạp. ADN có thể từ mẫu bệnh phẩm của bệnh
viện, một sợi tóc ngời, một giọt máu rơi ở hiện trờng phạm tội, hoặc từ mô não
3
xác ớp, hay từ một wooly không lồ 40.000 năm tuổi đóng băng ở sông băng
(Kary Mullis website.htm).
II. Mục đích và ý nghĩa:
Đối tợng nghiên cứu của Sinh học phân tử thờng là những vật chất di
truyền có hàm lợng tơng đối nhỏ trong mẫu, hoặc là những gen đơn lẻ, rất nhỏ
trong một hệ gen phức tạp, khổng lồ ví dụ nh hệ gen của động vật bậc cao chứa
tới 100.000 gen. Có nhiều kỹ thuật trong di truyền học phân tử đợc hoàn thiện để
vợt qua khó khăn này, nhng chúng đòi hỏi nhiều thời gian, cồng kềnh và rất khó
khăn trong việc tìm kiếm những đoạn and đặc hiệu. Kỹ thuật PCR cho phép
khuếch đại một lợng ADN trong mẫu một cách nhanh chóng và rẻ tiền. Còn đối
với những gen đơn lẻ, việc tạo ra nhiều bản sao của đoạn ADN cần lựa chọn đợc
thực hiện mà không cần tách và nhân dòng.
ADN đợc khuếch đại có thể xuất phát từ các nguồn rất khác nhau, từ các
tác nhân gây bệnh ở ngời (HIV hay là bệnh mụn giộp -herpes) đến tinh dịch
trong một vụ án tội ác nào đó hay ADN của một chú mối sống từ 40 triệu năm tr-
ớc (Powledge 1998). Trình tự đích có thể rất nhỏ (nh đã nói ở trên) hay cũng có
thể rất lớn (đến 10
4
cặp bazơ) (Stryer 1995). Yếu tố mấu chốt của ADN khiến
PCR có thể đợc sử dụng trong mọi trờng hợp là vật liệu di truyền.
Do những u điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật
PCR đợc nhanh chóng áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và cho kết
quả chính xác. Mặt khác sự phân tích thành phần và trật tự nucleotide trên phân
tử ADN trong hệ gen có giá trị rất lơn trong phân loại các loài sinh vật. Chính
nhờ tính thực tiễn to lớn đó mà tác giả của PCR, Kary Mullis đã đợc tặng giải th-
ởng Nobel năm 1993.

III. Cơ sở khoa học (nguyên lý) của kỹ thuật PCR:

PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của
quá trình sao chép AND với sự tham gia của một loại enzyme AND polymerase
chịu nhiệt, có hai đoạn ngắn AND, một sợi làm mồi (primers) và dùng các đoạn
AND mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó. Vì vậy khởi
đầu quá trình tổng hợp AND cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotide (có độ dài
4
từ 3-60 nucleotide). Đoạn này gắn kết với and khuôn tại điểm khởi đầu sao
chép. Đó là đặc điểm quan trọng đầu tiên của PCR vì ADN polymerase đợc điều
khiển để tổng hợp một đoạn ADN đặc thù. Quá trình này đợc enzyme adn
polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi ADNđặc thù. Các sợi ADN mạch
đơn làm khuôn đợc tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên 90 độ C
mà thờng là 94 độ C cho chuỗi xoắn kép ADN bung ra.
Cả hai sợi ADN đều đợc dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các
đoạn mồi (primer) đợc cung cấp để bám vào vị trí tơng ứng cho cả hai sợi. Trong
kỹ thuật PCR, các đoạn mồi đợc chọn nằm ở hai đầu đoạn ADN cần nhân lên sao
cho các sợi ADN tổng hợp mới đợc bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía
đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa hai đoạn mồi này.
Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục
ngàn cặp nucleotide. Nh vậy, sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại
xuất hiện cho mỗi ADN mới đợc tổng hợp . Hỗn hợp phản ứng lại đợc nâng nhiệt
độ lên thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này
sau đó đợc dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bớc: gắn mồi,
tổng hợp ADN và tách rời các đoạn.
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính
theo lý thuyết ta sẽ có 2
n
bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đoạn
mồi. Đó là đặc điểm quan trọng thứ hai của kỹ thuật PCR. Nh vậy kết quả là một

đoạn ADN định trớc đợc nhân lên với một lợng rất lớn, ví dụ sau 32 chu kỳ số l-
ợng bản sao ADN của PCR sẽ là 1.073.741.824.
5
IV. Cách tiến hành phản ứng PCR
PCR là một kỹ thuật phòng thí nghiệm tơng đối dễ làm, mặc dù đó là một
kỹ thuật rất đa năng và ứng dụng hết sức rộng rãi. Vật liệu khởi đầu cho PCR là
ADN có chứa đoạn cần nhân lên, gọi là khuôn ADN. Không phải lúc nào cũng
cần thiết tách chiết đoạn cần nhân lên vì việc đó đã đợc các đoạn mồi dùng trong
phản ứng xác định. Tuy nhiên nếu ADN làm khuôn tinh khiết thì phản ứng PCR
sẽ rất nhạy và đặc hiệu. Hàm lợng ADN khuôn cần cho phản ứng PCR rất nhỏ.
Trong các thí nghiệm bình thờng ở phòng thí nghiệm chỉ cần 1-100 nanogam
(ng) tổng số của hệ gen là đủ. Tuy nhiên ngày nay trong nhiều trờng hợp, phản
ứng PCR có thể nhân các đoạn ADN chỉ từ một phân tử ADN riêng lẻ.
Nguyên liệu cần thiết để tiến hành phản ứng invitro cũng giống nh nguyên
liệu cần thiết để tổng hợp ADN trong tế bào. Có 4 thành phần cần thiết là:
1. ADN làm khuôn (mạch kép) cần khuếch đại
2. Hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN.
3. Enzyme chịu nhiệt ADN-polymerase (hiện nay đợc dùng phổ biến
nhất là Tap, đợc chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus
aquaticus)
4. Tất cả 4 loại deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs): dATP,
dTTP, dCTP, dDTP.
Ngoài ra môi trờng đệm cung cấp ion Mg
++
và nớc tinh khiết rất cần thiết
để tiến hành kỹ thuật PCR.
Dung tích cho một phản ứng PCR thông thờng là 50 à hoặc 20 à .
Chu trình thực hiện
Để thực hiện phản ứng, chúng ta không chỉ đơn giản là cho tất cả nguyên liệu
vào ống nghiệm rồi đun nóng. Đây là một chu trình khép kín, gồm ba bớc cơ bản:

(3 bớc điều chỉnh nhiệt độ ) cho một chu kỳ:
1. Bung liên kết của ADN (denuteration):
Mục đích của việc này là làm biến tính ADN, khiến hai sợi ADN tách nhau
ra. Do đó, các đoạn mồi có thể gắn vào phần bổ sung trên ADN ở bớc sau. Cũng
trong bớc này, các phản ứng enzym đều ngừng lại (ví dụ nh sự mở rộng của chu
trình trớc).
6
Đợc thực hiện ở nhiệt độ khoảng 94
0
trong vài giây đến vài phút. Tại nhiệt độ
này, các phân tử ADN mạch kép sẽ bị tách ra hoàn toàn tạo nên các sợi đơn dùng
để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzyme polymerase xúc tác tổng
hợp.
2. Mồi bám ( hay còn gọi là ủ với mồi) (annealing):
Ngay lập tức nhiệt độ đợc hạ xuống 54
0
C để các đoạn mồi gắn với các trình
tự bổ xung tơng ứng trên các phân tử ADN làm khuôn.
Các đoạn mồi dịch chuyển lộn xộn dới chuyển động Brao (Brown). Liên kết
ion giữa các đoạn mồi đơn và các sợi khuôn đơn liên tục đợc tạo ra rồi lại đứt
gãy. Các liên kết bền vững hơn (do những mồi gắn đúng vào vị trí) kéo dài lâu
hơn. Trên những đoạn ngắn ADN mạch kép bao gồm khuôn và mồi này, ADN
polymerase có thể gắn vào và bắt đầu kéo dài chuỗi. Sau khi đã có một vài bazơ
đợc gắn vào, liên kết hyđro giữa mạch khuôn và mồi trở nên đủ mạnh để nó
không bị đứt vỡ nữa.
Nhiệt độ gắn kết này góp phần quyết định tính đặc hiệu của phản ứng PCR.
Nhiệt độ và khoảng thời gian dùng ở đay thay đổi tuỳ thuộc vào chiều dài của
ADN cần nhân lên.
3. Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài)(extension):
Các đoạn mồi nào đã đợc kéo dài một vài bazơ thì có lực liên kết với

khuôn mạnh hơn lực phá vỡ chúng. Còn các mồi gắn không chính xác trở nên
lỏng lẻo (do nhiệt độ đã cao hơn) và không có sự kéo dài mạch xảy ra.
Nhiệt độ ngay lập tức đợc nâng lên 72
0
C, sự tổng hợp ADN diễn ra tối u
dới nhiệt độ này.
Nhiệt độ 72
0
C đợc duy trì trong 5 phút để các sợi ADN vừa đợc tổng hợp
xoắn vào nhau tạo nên ADN sợi kép.
Vào cuối giai đoạn này, nhiệt độ một lần nữa đợc nâng lên 94
0
C , nhng lần
này chỉ trong vòng 20 giây để cho các mẫu ngắn của ADN mạch kép (cả sợi ban
đầu và sợi mới đợc tổng hợp) tách nhau ra. Nh vậy một chu kỳ gồm: đun nóng để
tách các sợi ADN kép thành sợi đơn để làm khuôn, gắn kết các đoạn mồi vào sợi
khuôn và tổng hợp ADN bằng ADN polymerase, đợc lặp đi lặp lại khoảng từ 30
đến 60 lần.
7
Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ đợc duy trì ở 72
0
C trong 5-10 phút cho tất cả
các sợi đơn ADN có trong phản ứng xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR. Cuối cùng
nhiệt độ đợc hạ xuống 4
0
C để bảo quản sản phẩm.
Hình ảnh minh hoạ các bớc của phản ứng PCR nh sau:
Sản phẩm của phản ứng PCR là đoạn ADN mà ta cần nhân lên. Sản phẩm đ-
ợc kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch Agarose nồng độ 0,8%-2%, và
8

ADN của PCR sẽ đợc nhìn thấy rõ hơn dới tác dụng của tia cực tím (ultra-violet)
sau khi đực nhuộm bằng Ethidium Bromide, một loại hoá chất có khả năng bám
và làm hiển thị ADN. Độ dài của ADN sản phẩm đợc tính bằng cách so sánh với
chỉ thị ADN (ADN marker), sử dụng thông dụng nhất là ADN của thực khuẩn
thể Lamda cắt bằng enzyme giới hạn Hindlll.
V- Phản ứng RT-PCR (PCR ngợc)
* Nguyên lý:
Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của
khuôn ARN theo nguyên lý của phản ứng PCR, bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn
thứ nhất là chuyển đổi một sợi ARN làm khuôn thành ADN hai sợi, sau đó qua
giai đoạn thứ hai, dùng ADN hai sợi này tiếp tục làm khuôn để thực hiện phản
ứng PCR nh đã giới thiệu.
ARN là một sợi bao gồm 4 nucleotide liên kết vơi nhau, trong đó có
Adenin, Guanin, Cystosin và Uracin. Chuỗi nucleotide này phải đợc chuyển đổi
thành AND 2 sợi mà thành phần Uracin đợc thay thế bằng Thymin. Phản ứng làm
biến đổi ARN hệ gen thành AND phải nhờ đến vai trò của một loại enzyme gọi
là enzyme sao chép ngợc (Reverse Transcriptase), do vậy giai đoạn này đợc gọi
là chuyển ngợc (RT), đợc thực hiện ở nhiệt độ 50-55 độ C trong 30 phút. Khi đã
có ADN 2 sợi làm khuôn chuyển đổi từ ARN ban đầu, phản ứng tiếp theo là PCR
nh đã giới thiệu và đợc thực hiện theo 3 bớc thay đổi nhiệt độ cho phù hợp ở mỗi
chu kỳ. Toàn bộ phản ứng nhân một đoạn ADN từ khuôn ARN qua hai giai đoạn
nói trên đợc gọi là phản ứng RT-PCR hay phản ứng PCR ngợc.
Do một số virus có hệ gen là ARN cho nên muốn nhân một đoạn gen của
nó thì ngời ta phải dùng phản ứng RT-PVR. Một số nghiên cứu về ARN thông
tin cũng cần đến phản ứng RT-PCR để chuyển đổi sợi ARN thành ADN cho quá
trình đồng hoá để giải trình tự hoặc tái tổ hợp trong nghiên cứu biểu thị protein.
Trớc khi tiến hành phản ứng PCR phải thực hiện giai đoạn chuyển ngợc
RT, sau đó thành phần ADN đợc chuyển đổi này làm khuôn tiếp tục mới đợc
nhân lên bằng phản ứng PCR. Quá trình này gồm hai giai đoạn:
- Phản ứng RT: Đó là giai đoạn chuyển ARN hệ gen thành ADN nhờ

enzyme sao chép ngợc biến ARN ở dạng sợi đơn sang dạng sợi kép ADN bằng
cách thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 55 độ C trong vòng 30 phút.
9
- Phản ứng PCR: là giai đoạn gồm 3 bớc nh đã nới ở trên.
* Cách tiến hành:
- Giai đoạn 1 (RT): 1 chu kỳ. Thực hiện sao chép ngợc từ ARN sợi đơn
sang AND sợi kép ở nhiệt độ 55 độ C trong vòng 30 phút.
- Giai đoạn 2 (PCR):
+ Bớc khởi đầu: 1 chu kỳ. Bung liên kết: Bung chuỗi xoắn kép ADN 2 sợi
thành khuôn 1 sợi làm khuôn và cho primer bám vào: 94-95 độ C/ 1 phút.
+ Bớc 1: Bung liên kết: Bung chuỗi xoắn kép ADN 2 sợi thành khuôn 1 sợi
làm khuôn và cho primer bám vào: 94-95 độ C/ 1 phút
+ Bớc 2: Bám mồi
+ Bớc 3: Tổng hợp ADN kéo dài
(Các bớc 1,2,3 đợc thực hiện lặp đi lặp lại trong 35-40 chu kỳ).
+ Bớc kết thúc: (1 chu kỳ), hoàn chỉnh gen ADN cho sản phẩm; 72 độ
trong 1 phút.
Cuối cùng nhiệt độ đợc hạ xuống 4
0
C để bảo quản sản phẩm.
VI- Kiểm tra kết quả PCR:
Trớc khi sản phẩm PCR đợc đem sử dụng, ngời ta cần phải kiểm tra:
1. Sản phẩm có đợc hình thành hay không:
Cho dù hoá sinh có là ngành khoa học chính xác đến đâu đi nữa, ngời ta
cũng không thể chắc chắn rằng mọi phản ứng PCR đều thành công. Chất lợng
của ADN có thể quá tồi, do đó một trong các đoạn mồi có thể không phù hợp,
hoặc cũng có thể có quá nhiều điểm bắt đầu.
2. Kích thớc của sản phẩm có đúng không:
Có khả năng sản phẩm chỉ dài 500 bazơ, mà trên thực tế gen cần khuếch đại
lại dài 1800 bazơ. Khi đó, một trong hai mồi có thể đã gắn (phù hợp) với phần

nào đó trên gen mà gần với mồi còn lại hơn. Cũng có thể cả hai mồi đã gắn vào
một gen hoàn toàn khác.
Kết quả của PCR đợc kiểm tra thông qua băng điện di. Ngời ta thờng sử
dụng phơng pháp điện di trên gel agarose. Nếu không có sản phẩm nào đợc tạo
ra, trên băng điện di sẽ không có vạch nào. Nếu có các sản phẩm khuếch đại
không mong muốn, chúng ta sẽ thu đợc băng điện di có nhiều vạch.
10
Xem trên băng điện di:
Cột ở bên trái là hỗn hợp các đoạn đã biết kích thớc để so sánh. Chú ý rằng
khoảng cách giữa các đoạn trên cột là cấp số mũ.
Cột 1: đoạn PCR dài khoảng 1850 bazơ.
Cột 2 và 4: các đoạn dài khoảng 800 bazơ.
Cột 3: không có sản phẩm nào đợc tạo thành, cho thấy PCR đã thất bại.
Cột 5: nhiều vạch đợc tạo ra do một trong những đoạn mồi đã gắn sai chỗ.
Kết quả cuối cùng có thể đợc kiểm tra bằng điện di trên gel
polyacrolamide, các đoạn gen có độ dài khác nhau hiện rõ có thể đọc đợc
bằng mắt thờng nhờ so sánh với thang chuẩn.
11
VII. Các chỉ tiêu ảnh hởng đến phản ứng PCR
Một phản ứng PCR đòi hỏi nhiều thành phần tham gia: 1. AND mẫu làm
khuôn; 2. Enzyme ADN polymerase; 3. Mồi và nhiệt độ lai; 4. Dung dịch đệm
(Nồng độ ion Magiê); 5. Thành phần dNDPs; 6. Thời gian, số lợng chu kỳ phản
ứng; 7. Yếu tố chu trình nhiệt; 8. Nớc; 9. Thiết bị và dụng cụ nhiệt.
1. AND mẫu làm khuôn:
Phản ứng PCR tối u xảy ra trên ADN thật tinh sạch, nhng nhiều kỹ thuật
chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tối u với ADN thu nhận trực tiếp từ dịch
chiết tế bào. Lợng ADN mẫu sử dụng cũng có có khuynh hớng giảm (1
microgam xuống còn 100 nanogam) với việc sử dụng các polymerase cho hiệu
quả cao. Hơn nữa việc giảm lợng mẫu ban đầu còn có hạn chế đợc các khuếch
đại ký sinh (các nhân bản giả) tạo nên các sản phẩm phụ không mong muốn. Một

u điểm khác của phản ứng PCR là cho phép khuếch đại cả những mẫu ADN
không đợc bảo quản tốt, đã bị phân huỷ từng phần nh trong các vết máu để lâu
ngày, tinh dịch đã khô, hoá thạch tóc, móng tay của ngời đã chết, da, niêm mạc
miệng
12
2. Enzyme
Enzyme đợc sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của ADN polymerase I. Vì
đây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phải
thêm enzyme mới vào mỗi phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị
nhiệt phân huỷ, nhiệt độ lai thấp khiến sự nhân bản giả tăng cao). Phơng pháp
ADN chuyển sang một bớc ngoặt mới cùng với sự phát hiện một loại ADN
polymerase chịu nhiệt đợc tách chiết từ một vi khuẩn sống trong suói nớc nóng
có tên gọi là Thermus aquaticus. Enzyme này có tên gọi là Taq polymerase
không bị phá huỷ ở nhiệt độ biến tính và xúc tác từ đầu đến cuối quá trình phản
ứng.
Điều này cho phép có thể tự động hoá tất cả các bớc của chu trình nhân
ADN nhờ tạo ra một bộ máy tự động có khả năng điều khiển đợc các công đoạn
cả về nhiệt độ và thời gian. Từ đó máy chu trình nhiệt PCR (Thermal Cycler) ra
đời và hiện nay có hàng chục loại do rất nhiều hãng khác nhau trên thế giới sản
xuất nh hãng Perkin Elmer, Eppendorf vv
Taq ADN polymerase không đặc hiệu cho bất kỳ một loại phân tử ADN
riêng biệt nào, chính vì vậy tất cả các phản ứng PCR sử dụng mồi và khuôn khác
nhau đều sử dụng Taq ADN polymerase. Mặt khác một số điểm quan trọng của
Taq- ADN polymerase là có khả năng gắn thêm vào đầu 3 một base là Adenine
(A). Đây là một điểm quan trọng để trong quá trình đồng hóa ngời ta lợi dụng
đặc tính này để gắn sản phẩm của PCR vào plasmide trong quá trình đồng hoá.
Một nhợc điểm của Taq- ADN polymerase là: loại enzyme này chỉ có khả
năng tổng hợp các loại ADN có độ dài dới 3kb (dới 3000 nucleotide), do vậy
muốn nhân bản ADN có độ dài hơn 3-20 kb phải cần những đoạn enzyme khác.
Một nhợc điểm khác của Taq- ADN polymerase là không có khả năng sửa

chữa những sai sót xảy ra trong quá trình sao chép ( trong quá trình sao chép các
base nitơ ở trên mạch đơn đợc tổng hợp, có thể xảy ra sự thay đổi một vài base
nitơ, Taq- ADN polymerase không có khả năng sửa chữa sự nhầm lẫn trong trờng
hợp này).
Ngày nay nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã đực đa ra thị trờng với
nhiều chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Tth polymerase, một enzyme
13
tách chiết từ vi khuẩn Thermus thermophilus có khả năng hoạt động nh một
enzyme phiên mã ngợc khi có mặt ARN khuôn và ion Mg
++
; nhng với sự hiện
diện của ADN khuôn và ion Mg
++
, Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại
ADN. Enyme này cho phép khuếch đại bản mẫu là ARN thông qua sự hình thành
cADN.
3. Mồi và nhiệt độ lai
3.1. Chiều dài mồi
Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đợc một sự nhân bản đặc trng và hiệu
quả cao nhằm thu nhận sản phẩm PCR chất lợng cao trên khuôn ADN biết trớc.
Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phơng pháp PCR và tuân thủ một
số nguyên tắc sau:
- Trình tự của mồi đợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ xung giữa mồi
xuôi và mồi ngợc, và cũng không có cấu trúc kẹp tóc (hair loop forming) do sự
bắt cặp bổ xung giữa các phần khác nhau trong chuỗi nucleotide của một mồi.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi xuôi và mồi ngợc không cách biệt quá xa
(thông thờng trong khoảng 4-5 độ C). Thành phần nucleotide của các mồi cân
bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần.
- Các mồi phải chọn đặc trng cho trình tự ADN cần nhân bản, không trùng với
các trình tự lặp lại trên gen.

- Độ dài cần chọn cho một mồi đặc hiệu thông thờng là 18-30 nucleotide.
Nếu quá ngắn (dới 10 nucleotide), mồi sẽ bám không đặc hiệu; nếu quá dài (trên
30 nucleotide), chu kỳ nhiệt ở giai đoạn thứ 3 (giai đoạn tỏng hợp hay kéo dài) sẽ
ảnh hởng đến cơ chế bám của mồi. Nhiệt độ nóng chảy của mồi không đợc vợt
quá chu kỳ nhiệt ở giai đoạn thứ 3.
Chiều dài tối u của một đoạn mồi phụ thuộc vào lợng (A+T) của nó. Một
điều cần lu ý về mồi là các đoạn mồi phải đủ phức tạp để khả năng xảy ra việc
gắn mồi vào các trình tự khác mà không phải là trình tự đích đợc chọn trớc rất
thấp.
Ví dụ, khả năng bắt gặp A, G, C hay T trong một trình tự ADN cho trớc
bất kỳ là 1/4; khả năng bắt gặp một trình tự dinucleotide bất kỳ (ví dụ AG) là
14
1/16; còn khả năng bắt gặp một trình tự 4 bazơ cho trớc là 1/256. Do đó, một
trình tự 16 bazơ xét về mặt thống kê sẽ có xác suất có mặt là 1 trên 4
16
(= 4 294
967 296, hay là khoảng hơn 4 tỉ). 4
16
bazơ tơng đơng với kích thớc hệ gen ngời
hay ngô, và lớn gấp 1000 lần so với kích thớc hệ gen của E.coli. Do đó việc kết
hợp một oligonucleotide dài hơn 17 bazơ với trình tự đích của nó là một quá trình
thực sự đặc hiệu, đặc hiệu hơn cả sự đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên.
Vì vậy một đoạn mồi dài 17 bazơ hay hơn thờng đợc dùng để khuếch đại từ ADN
thuộc hệ gen của thực vật và động vật. Mồi quá dài có thể đồng nghĩa với việc
ngay cả nhiệt độ gắn mồi cao cũng không ngăn ngừa đợc sự bắt cặp sai và gắn
mồi không đặc hiệu.
3.2. Một số nguyên tắc thiết kế trình tự mồi (theo Innis và GelfDNA, 1991).
i. Mồi nên dài 17 - 28 bazơ.
ii. Thành phần của các bazơ nên có 50 - 60% (G+C).
iii. Mồi nên có đầu 3 ở G hay C hay CG hay GC; điều này ngăn ngừa việc

thở (breathing) của các đầu và tăng hiệu suất gắn mồi.
iv. Nhiệt độ Tm tốt nhất là nằm trong khoảng 55 - 80
o
C.
v .Việc sử dụng mồi có nhiều hơn 3 G hay C ở đầu 3 có thể làm tăng khả năng
bắt cặp sai ở những trình tự giàu G hay C (do sự ổn định của việc gắn mồi), nên
tránh điều này.
vi . Các đầu 3 của các mồi không nên bổ sung cho nhau (cụ thể hơn là không
nên bắt cặp bazơ với nhau), nếu không thì các dimer mồi sẽ đợc tổng hợp nhiều
hơn là các sản phẩm khác.
vii. Nên tránh dùng các mồi có thể tự bổ sung cho nhau (nghĩa là khả năng hình
thành cấu trúc 2
o
nh cái thòng lọng).
6.5 Dung dịch đệm cho phản ứng.
Dung dịch đệm thờng chứa:
+ Tris-HCl pH 8,3 10-50mM.
+ KCl không quá 50 mM; MgCl
2
1,5 mM hay cao hơn.
+ Mồi 0.2 - 1àM đối với mỗi mồi.
+ 50 - 200à đối với mỗi dNTP.
+ Gelatin hay BSA đến 100àg/ml.
15
+ Và/hoặc thuốc tẩy không mang tính ion ví dụ Tween-20 hay Nonidet
P40 hay Triton x-100 (0,05 - 0.1% nếu dùng một loại nào đó). (Innis và
Gelfan, 1990).
Các công thức hiện đại có thể khác một cách đáng kể, nhng chúng thờng có
tỷ lệ tơng đơng.
Ngời ta cho rằng PCR làm việc tốt nhất trong dung dịch đệm phiên mã ngợc

(Krawet và cộng sự, 19xx; Fuqua và ngời khác, 1990).
Nồng độ KCl hay NaCl cao hơn 50mM sẽ ức chế Taq, nhng với nồng độ
thấp, nó sẽ cần để giúp mồi gắn dễ dàng hơn.
Nồng độ ion Mg
2+
ảnh hởng đến việc gắn mồi, nhiệt độ Tm của khuôn, sự
liên kết giữa mồi và khuôn; tính đặc hiệu của sản phẩm, hoạt động và sự chính
xác của enzyme. Taq cần Mg
2+
tự do, do đó, cần phải tạo ra lợng khấu hao cho
dNTPs, mồi và khuôn, tất cả chúng đều cô lập cation, và trong số đó thì dNTPs
có nồng độ cao nhất, do đó, nồng độ Mg
2+
nên cao hơn nồng độ dNTP 0,5 -
2,5mM. Đối với mỗi tổ hợp khuôn-mồi mới, nồng độ Mg
2+
thay đổi nên cần phải
định lợng lại, vì nhu cầu của chúng sẽ khác nhau đáng kể thậm chí dới cùng điều
kiện nồng độ và thời gian hay nhiệt độ của chu trình.
Nồng độ ion Mg
++
là thành phần không thể thiếu đợc của phản ứng PCR.
Tuy nhiên không có một qui luật chung cho vấn đề này. Nồng độ tối u phải đợc
xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm.
Một số enzyme không cần protein bổ sung, trong khi số khác lại phụ thuộc
vào chúng. Một vài enzyme hoạt động tốt hơn rõ rệt khi có mặt chất tẩy
(detergent), có thể bởi vì chất tẩy ngăn cản xu hớng tự nhiên là co cụm lại của
enzyme.
Nồng độ mồi không nên vợt quá 1àM trừ phi mức độ thoái hoá cao; 0,2àM
là đủ đối với các mồi tơng đồng.

Nồng độ nucleotide không cần nhiều hơn 50àM đối với mỗi loại; tuy nhiên
các sản phẩm dài có thể cần nồng độ cao hơn.
5. Thành phần dNDP
16
Bốn loại nucleotide trong phản ứng PCR thờng đợc sử dụng ở dạng
deoxynucleotide (dNTPs bao gồm dATP; dGTP; dCTP và dTTP). Thờng đợc sử
dụng ở nồng độ 20-200 àM / mỗi loại nucleotide. Nồng độ cao hơn hay thấp hơn
dễ dẫn đến sự tạo nên sản phẩm PCR giả. Sự mất cân bằng trong thành phần các
nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của enzyme ADN polymerase.
6. Thời gian
17
6.1. Thời gian và nhiệt độ biến tính:
Hai trình tự bổ sung liên kết với nhau bởi liên kết hydro giữa các bazơ bổ
sung của chúng (G với C và A với T hay U), hình thành phân tử mạch kép ổn
định. Phản ứng PCR cần các sợi ADN mạch đơn làm khuôn, do đó nếu ADN
khuôn ban đầu không phải là dạng sợi đơn, nh hầu hết các virus ARN, thì cần
phải làm nóng nó đến trên nhiệt độ nóng chảy (melting temperature) của dạng
sợi kép hoặc nhiệt độ nóng chảy của một phần dạng sợi kép. Rồi sau đó làm
lạnh nhanh nó. Việc làm lạnh nhanh là để chắc chắn các sợi đã đợc làm biến tính,
tức là các sợi đã tách nhau ra, không còn liên kết lại với nhau nữa. Ngoài ra, nếu
acide nucleic đợc đun nóng trong dung dịch đệm chứa các ion có nồng độ thấp
hơn 150mM NaCl thì nhiệt độ nóng chảy thông thờng sẽ thấp hơn 100
o
C. Đây
chính là khoảng nhiệt độ làm việc của PCR, nhiệt độ biến tính nằm trong khoảng
từ 91
o
C đến 97
o
C.

Taq polymerase có thời gian bán huỷ ở 95
o
C là 30 phút. Đây chính là lý do
tại sao không nên thực hiện quá 30 chu trình khuếch đại. Tuy nhiên cũng có thể
giảm nhiệt độ biến tính xuống sau khoảng 10 chu trình, khi mà chiều dài trung
bình của ADN đích đã giảm xuống. Ví dụ, đối với khuôn dài khoảng 300 cặp
bazơ hay ngắn hơn, nhiệt độ biến tính có thể đợc giảm xuống đến 88
o
C cho
khuôn chứa 50% (G+C) (Yap và McGee, 1991). Điều này đồng nghĩa với việc có
thể tiến hành đến 40 chu trình mà không sợ làm giảm hiệu suất của enzyme.

Thời gian tại nhiệt độ là nguyên nhân chính cho sự biến tính hay là bất
hoạt của Taq. Do đó, nếu ta có thể giảm điều này, ta sẽ có thể tăng số chu trình
phản ứng mà bất kể là nhiệt độ có giảm hay không. Thông thờng, thời gian biến
tính là 1 phút ở 94
o
C: đối với những trình tự khuôn ngắn thời gian này có thể đợc
giảm xuống đến 30 giây hay thấp hơn nữa. Ngời ta cũng có thể vừa tăng nhiệt độ
biến tính, vừa giảm thời gian biến tính: Innis và GelfDNA (1990) đã đề xuất thời
gian là 15 giây khi nhiệt độ là 96
o
C.
6.2 Thời gian gắn mồi và việc thiết kế mồi.

18
Chiều dài và trình tự mồi là một tham số có ý nghĩa vô cùng quan trọng đảm
bảo sự thành công của quá trình khuếch đại. Nhiệt độ nóng chảy của một acide
nucleic mạch kép tăng lên theo chiều dài của nó cũng nh là số lợng (G+C). Công
thức đơn giản để tính nhiệt độ nóng chảy (temperature melting-Tm) của một

đoạn DNA kép là:
Tm (
o
C) = 4(G + C) + 2(A + T)
Do đó, nhiệt độ gắn mồi (annealing temperature-Ta) cho một phản ứng PCR
nhất định phụ thuộc trực tiếp vào thành phần và chiều dài mồi. Nhiệt độ Ta nên
chọn thấp hơn khoảng 5
o
C so với nhiệt độ Tm thấp nhất của cặp mồi đợc sử dụng
(Innis và GelfDNA, 1990). Rychlik và nhiều ngời khác (1990) đã chỉ ra cách xử
sự của Ta. Họ cho rằng nếu tăng nhiệt độ Ta lên 1
o
C sau mỗi chu trình thì tính
đặc hiệu của quá trình khuếch đại và số lợng sản phẩm (1kb chiều dài) đều tăng
lên. Một hệ quả của việc sử dụng nhiệt độ Ta quá thấp là một hay cả hai đoạn
mồi lại gắn vào các trình tự khác chứ không phải trình tự đích, do các bắt cặp sai
một bazơ hay sự gắn mồi một phần. Điều này không gây ảnh hởng gì nếu ta chỉ
khuếch đại các trình tự đích thân thuộc hoặc tơng tự nhau. Tuy nhiên, điều này
có thể dẫn đến việc khuếch đại không đặc hiệu và hậu quả là số lợng các sản
phẩm mong muốn bị giảm xuống.
Một hậu quả của việc sử dụng nhiệt độ Ta quá cao là rất ít sản phẩm đợc tạo
ra do khả năng gắn mồi bị giảm xuống. Một điều quan trọng khác cần cân nhắc
là một cặp mồi với nhiệt độ Ta không thích hợp sẽ không bao giờ cho sản phẩm
duy nhất với số lợng đáng kể, và còn có thể dẫn đến sự khuếch đại không đối
xứng có nghĩa là sự khuếch đại sợi đợc gắn mồi hiệu quả hơn.
Sự gắn mồi không thể diễn ra trong thời gian dài: hầu hết các mồi chỉ gắn
hiệu quả đợc trong 30 giây hay ít hơn, trừ trờng hợp nhiệt độ Ta rất gần nhiệt độ
Tm hoặc các mồi dài bất thờng.
19

Hình trên minh hoạ ảnh hởng của nhiệt độ gắn mồi dến tính đặc hiệu và hiệu
suất khuếch đại của papillomavirus ngời type 16 (Human papillomavirus type
16, HPV-16) (Williamson và Rybicki, 1991: J Med Virol 33: 165-171).
Plasmide và khuôn DNA mẫu đợc khuếch đại ở các nhiệt độ gắn mồi khác
nhau nh đã chỉ ra ở trên. Chú ý rằng trong khi plasmide đợc khuếch đại trong
khoảng từ 37
o
C đến 55
o
C thì HPA, ADN chỉ đợc khuếch đại đặc hiệu ở 50
o
C.
6.4 Thời gian và nhiệt độ kéo dài mạch:
Thông thờng ngời ta tiến hành ở 70
o
C - 72
o
C trong 0,5 đến 3 phút. Trong khi
đó, Taq hoạt động thực sự đặc hiệu ở 37
o
C, nhiệt độ rất gần với nhiệt độ hoạt
động của đoạn Klenow của E.coli DNA polymerase I. Đây quả là một nghịch lý,
làm thế nào mà các đoạn mồi chỉ gắn vào mạch khuôn ở nhiệt độ tối u của nó lại
có thể đợc kéo dài ở nhiệt độ cao một cách đáng kể nh vậy. Câu trả lời là sự kéo
dài mạch xảy ra ngay từ khi bắt đầu có sự gắn mồi, thậm chí nếu điều này chỉ
xảy ra trong thời gian rất ngắn ngủi, thì nó cũng dẫn đến sự ổn định đáng kể.
Hoạt động này xảy ra tối u ở khoảng 70
o
C và sự mở rộng mồi diễn ra với tốc độ
tối đa là 100 bazơ/giây. Thời gian khoảng một phút là đủ để sự khuếch đại trình

tự 2kb là đáng tin cậy (Innis và GelfDNA, 1990). Các sản phẩm dài hơn thì cần
thời gian lâu hơn: 3 phút cho sản phẩm 3kb hay dài hơn. Việc kéo dài thời gian là
cần thiết trong những chu trình cuối khi mà nồng độ sản phẩm vợt quá nồng độ
enzyme (>1nM), và khi dNTP và/hoặc sự suy giảm số lợng mồi có thể trở nên
hạn chế.
20
6.6 Số chu trình.
Số lợng chu trình cần thiết để tạo ra băng nhìn thấy đợc trên gel phụ thuộc
phần lớn vào nồng độ ADN đích ban đầu: Innis và GelfDNA (1990) đề xuất
khuếch đại 40 - 45 chu trình đối với 50 phân tử đích, và 25-30 chu trình cho
3x105 phân tử cùng nồng độ. Sự không tơng xứng này do cái gọi là hiệu ứng
bằng (plateau effect) gây nên. Đây là sự giảm tốc độ tăng của sự tích luỹ sản
phẩm theo cấp số mũ ở những giai đoạn cuối của PCR, khi mà nồng độ sản phẩm
đạt đến 0,3 - 1,0 nM. Có thể sự phân rã của các chất phản ứng (dNTPs, enzyme),
sự depletion của chất phản ứng (mồi, dNTPs - cái đầu là trục trặc đối với các sản
phẩm ngắn, cái sau là trục trặc đối với các sản phẩm dài), sự ức chế đầu sản
phẩm (end-product) (sự hình thành Pyrophosphate), sự cạnh tranh của các sản
phẩm không đặc hiệu với chất tham gia phản ứng, sự cạnh tranh của việc tái gắn
mồi của các sản phẩm nồng độ cao (10nM) với việc gắn mồi (Innis và GelfDNA,
1990).
Nếu sản phẩm mong muốn không đợc tạo ra sau 30 chu trình, tốt hơn là lấy
một mẫu nhỏ (1àl) của hỗn hợp đã khuếch đại làm hỗn hợp phản ứng mới, đem
khuếch đại 20-30 lần chứ không nên tiếp tục chạy thêm nhiều chu trình. Trong
một số trờng hợp khi mà nồng độ khuôn hạn chế, điều này có thể tạo ra sản phẩm
tốt trong khi việc tiếp tục chu trình đến 40 lần hay hơn không làm đợc.


21
Một biến số quyết định số lợng chu trình là PCR mồi làm tổ. Sự khuếch đại
PCR đợc thực hiện với một tập hợp các mồi, sau đó sản phẩm nào đó đợc lấy ra -

có hay không có sự bỏ thuốc thử- để khuếch đại lại, vói tập hợp các mồi nằm bên
trong, hay còn gọi là mồi làm tổ. Quá trình này làm tăng mức độ của tính đặc
hiệu, có nghĩa là tất cả các sản phẩm không đặc hiệu đợc khuếch đại trong lần
chạy đầu tiên sẽ không đợc khuếch đại trong lần chạy thứ hai. Điều này đợc minh
hoạ nh sau:
Thời gian cho một chu kỳ khởi đầu mục đích bung liên kết của chuỗi xoắn
kép ADN là không vợt quá 5 phút. Đối với 25-40 chu kỳ tiếp theo, thời gian cho
giai đoạn 1 (bung liên kết ) là 10 giây 2 phút; thời gian cho giai đoạn 2 (mồi
bám) không quá nhanh hoặc quá lâu, thông thờng dới 1 phút; thời gian cho giai
đoạn 3 (tổng hợp) tuỳ thuộc vào độ dài vùng ADN cần nhân lên, nhng nói chung
22
theo qui luật, 1 phút cho 1 kb (1000 nucleotide). Ví dụ cần có sản phẩm là 3 kb,
thời gian thích hợp là 3 phút. Thời gian dài hơn không ảnh hởng lớn đến ADN có
độ dài ngắn hơn.
Trong thực tế, phản ứng đợc thực hiện trong 25-40 chu kỳ, và không vợt
quá 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR. Sở dĩ nh vậy là vì phản ứng PCR diến tiến
qua hai giai đoạn: trong giai đoạn đầu số lợng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ
với lợng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên
nhân sau:
- Sự phân huỷ xảy ra và cạn kiệt các thành phần của phản ứng
- Có sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.
- Các bản sao vừa đợc tổng hợp không kết hợp với các cặp mồi mà bắt cặp
với nhau.
Phản ứng PCR ít khi đợc thực hiện dới 25 chu kỳ, vì nh thế số lợng nhân
bản sẽ ít và lợng ADN thu đợc trong sản phẩm PCR thấp.
Số chu kỳ cho một phản ứng phụ thuộc vào số lợng bản mẫu ban đầu. Ví
dụ, nếu số lợng bản mẫu là 10
5
thì cần 25-30 chu kỳ, nếu số lợng bản mẫu là 10
2

-
10
3
thì số chu kỳ phải là 35-40.
7. Yếu tố chu trình nhiệt
Một yếu tố quan trọng đảm bảo sự thành công của phản ứng PCR là nhiệt
độ của chu trình nhiệt ở giai đoạn thứ 2 khi mồi bám vào khuôn (giai đoạn mồi
bám). Một kinh nghiệm có tính qui luật là nhiệt độ cho mồi bám phải thấp hơn
nhiệt độ nóng chảy của cặp mồi là ít nhất 4
o
C.
8. Nớc
Nớc sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa bất kỳ ion
nào, không chứa enzyme phân huỷ ADN (ADNaza), phân huỷ ARN (ARnaza),
enzyme giới hạn cắt Adn (endonucleaza) và bất kỳ các thành phần nào khác. Ion
khác lạ sẽ ảnh hởng nồng độ dung dịch đệm trong phản ứng, các loại enzyme sẽ
pha huỷ hay cắt bỏ ADN làm khuôn hoặc sản phẩm PCR.
23
9. Thiết bị và dụng cụ
Thực chất một thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng đ-
ợc yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác. các thiết bị hiện nay đã đợc
cải tiến để tránh tối đa sự bốc hơi nớc trong quá trình phản ứng, hay cho phép
tiến hành phản ứng PCR ngay ở trên mô tế bào, Tuy nhiên mỗi kiểu thiết bị có
đặc điểm khuếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần đợc tiến
hành trên cùng một loại thiết bị.
Hơn nữa ống nghiệm dùng cho các phan ứng của cùng một nghiên cứu
phải thuộc cùng một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt của các ống này cúng nh độ
tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị có ảnh hởng lớn đến quá trình
khuếch đại.
VIII . Các hạn chế của phản ứng PCR

Do độ nhạy rất cao của PCR dồng thời với thao tác rất đơn giản, ngời ta có
khuynh hớng sử dụng phơng pháp này để giải quyết nhiều vấn đề. Tuy nhiên ph-
ơng pháp có nhiều mặt hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí
nghiệm cũng nh khi phân tích kết quả. Có 3 vấn đề lớn khi sử dụng kỹ thuật
PCR:
1. Trong thực nghiệm, kích thớc của trình tự cần khuếch đại là giới hạn
đầu tiên.
Trừ vài trờng hợp rất cá biệt, phơng pháp PCR không hoạt động đợc với
những đoạn ADN lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dới 1,5 kb
cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối u cho phản ứng phải đợc
xác định qua thực nghiệm.
2. Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả
năng khuếch đại bản sao của phơng pháp này.
Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán, dự phòng vì
hậu quả có thể rất nghiệm trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thờng là các sản
phẩm khuếch đại của những lần thao tác trớc. Ngời ta chứng minh đợc rằng việc
mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian
kín nh phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã đợc khuếch đại thoát ra
khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tờng, cửa, thiết bị dụng
24
cụ rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó. Có thể khấc phục các vấn đề
này bằng một số biện pháp sau;
- Các công đoạn thao tác khác nhau nh thiết lập phản ứng PCR và phân
tích các sản phẩm khuếch đại phải đợc tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau.
- Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng không sử dụng vào các thao tác khác.
đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette
bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng.
- Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại tr-
ớc.
- Tất cả mọi thành phần phản ứng đều đợc chia thành những lợng nhỏ, tính

toán sao cho đủ với 1 , 2 lần thao tác.
- Ngoài ra các hãng sản xuất còn tung ra thị trờng những hệ thống cho
phép loại bỏ hoàn toàn sự ngoại nhiễm, ví dụ hãng Perkin - Elmer- Cetus đề xuất
việc sử dụng dUTP thay vì dTTP; việc thay thế này không ảnh hởng đến phản
ứng. Trớc mỗi lần phản ứng kế tiếp, ngời ta cho thêm vào dung dịch phản ứng
uracylglycolase; enzyme này sẽ phân huỷ tất cả các ADN có mang dUTP nhiễm
từ lần trớc. Đồng thời, enzyme sẽ bị phân huỷ bởi nhiệt ngay từ lần biến tính đầu
tiên. Bất lợi của các hệ thống này là giá thành cao.
3. Các sai sót gây ra do Taq polymerase.
Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ khá cao (10
4
nghĩa là cứ 10.000
nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này không nghiêm trọng
nếu ta chỉ cần xem xét kích thớc hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại,
nhng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của ADN. Ta
không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt, ví dụ nh đảm
bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng xác định trình tự của
nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trớc khi đi đến
trình tự chính thức.
* Độ tin cậy của kỹ thuật PCR/RT- PCR
Cũng nh tất cả các quá trình sinh học khác, tái bản ADN là một quá trình
không hoàn hảo, đôi khi enzyme ADN polymerase cũng nhân nhầm một
nucleotide không bổ sung vào chuỗi đang kéo dài của mình, tỷ lệ này trong tự
25