Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn từ rong biển có khả năng sinh enzyme chuyển hóa alginate từ rong nâu việt nam

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Nguyễn Xuân Viễn

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG
VI KHUẨN TỪ RONG BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME
CHUYỂN HÓA ALGINATE TỪ RONG NÂU
VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2021


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Nguyễn Xuân Viễn

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG
VI KHUẨN TỪ RONG BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME
CHUYỂN HÓA ALGINATE TỪ RONG NÂU
VIỆT NAM
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hướng dẫn 1: TS. Cao Thị Thúy Hằng
Hướng dẫn 2: PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân

Hà Nội - 2021


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới
sự hướng dẫn của TS. Cao Thị Thúy Hằng và PGS.TS Trần Thị Thanh Vân.
Các số liệu nêu trong luận văn là kết quả làm việc của tơi trong suốt
q trình thực nghiệm tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha
Trang.
Nha Trang, ngày 14 tháng 12 năm 2021
Tác giả luận văn

Nguyễn Xuân Viễn


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Cao Thị Thúy
Hằng và PGS.TS Trần Thị Thanh Vân, những người đã tận tình hướng dẫn
khoa học, giúp đỡ tôi và định hướng nghiên cứu cho tơi trong suốt q trình

thực hiện và hồn thành luận văn.
Và tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh, chị phịng Hóa phân tích
và Triển khai cơng nghệ, phịng Cơng nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu
và Ứng dụng Cơng nghệ Nha Trang đã giúp tơi hồn thành tốt phần thực
nghiệm của mình và tạo điều kiện thuận lợi trong q trình thực hiện luận
văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Cơng
nghệ, Phịng Đào tạo, Khoa Cơng nghệ sinh học và Quý Thầy Cô giáo đã
giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn cũng như
hồn thành các thủ tục cần thiết.
Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng
dụng Công nghệ Nha Trang tạo nhiều điều kiện thuận lợi, hỗ trợ hướng dẫn
tơi trong q trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn
sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và
giúp đỡ tôi trong suốt q trình học tập và hồn thành luận văn.
Nha Trang, ngày 14 tháng 12 năm 2021
Tác giả luận văn

Nguyễn Xuân Viễn


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Thông tin đầy đủ

Å

Angstrom

AOS

Alginate oligosaccharide

CPC

Cetyl pyridinium clorua

DNS

Dinitrosalicylic acid

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

Endolytic

Enzyme nội bào

Exolytic

Enzyme ngoại bào

G

Acid α-L-guluronic

KI

Kali iodide

KLPT

Khối lượng phân tử

M

Acid β-D-mannuronic

MB

Marine broth

MBA

Marine broth alginate

mM

mmol

Olygo

oligosaccharide

Poly M

β-D-mannuronate

Poly G

α-L-guluronate G

Poly MG

heteropolymer

S. mcc A

Alginate chiết xuất từ rong Sargassum mcclurei

T. o A

Alginate chiết xất từ rong Turbinaria ornata


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Hàm lượng acid alginic (% Rong khơ tuyệt đối) ở vùng biển
Khánh Hịa ...................................................................................... 11
Bảng 1.2. Nguồn phân lập một số vi khuẩn biển sinh alginate lyase ............. 22
Bảng 1.3. Đặc tính xúc tác của một số alginate lyase từ vi khuẩn biển.......... 24
Bảng 3.1. Kết quả thí nghiệm phân lập các chủng vi khuẩn biển................... 43
Bảng 3.2. Hoạt tính alginate lyase của chủng vi khuẩn biển phân lập từ
các mẫu rong nâu thu thập tại vùng biển Khánh Hịa ................... 52
Bảng 3.3. Trình tự tương đồng của các chủng vi khuẩn biển ......................... 56
Bảng 3.4. Kết quả sơ bộ thu nhận alginate lyase ............................................ 61


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Nguồn gốc alginate ........................................................................... 8
Hình 1.2. Cấu trúc của β-D-mannuronic acid (M), α-L-guluronic acid (G)
của phân tử alginate .......................................................................... 9
Hình 1.3. Cấu trúc của các block và liên kết (1- 4) glycoside giữa các
uronic của phân tử alginate.. ........................................................... 10
Hình 2.1. Các mẫu rong thu được ở vùng biển Khánh Hịa............................ 30
Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát của đề tài ............................................ 33
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn biển từ rong biển...................... 35
Hình 2.4. Đường chuẩn albumin ..................................................................... 38
Hình 3.1. Hình ảnh các khuẩn lạc phân lập từ mẫu rong S. oligocystum
mọc trên đĩa mơi trường MBA ....................................................... 41
Hình 3.2. Đĩa môi trường MBA sau khi nhuộm bởi thuốc nhuộm
Gram’s iodine ................................................................................. 41
Hình 3.3. Số lượng chủng vi khuẩn biển phân lập được từ các nguồn
rong nâu........................................................................................... 42
Hình 3.4. Thống kê các nhóm kích thước khuẩn lạc của chủng vi khuẩn
biển được phân lập từ các mẫu rong nâu thu tại vùng biển
Khánh Hịa ..................................................................................... 48
Hình 3.5. Thống kê các nhóm màu sắc khuẩn lạc của chủng vi khuẩn
được phân lập theo tỷ lệ %............................................................. 49
Hình 3.6. Thống kê về tỷ lệ độ đục, độ cao khuẩn lạc của chủng vi khuẩn
biển được phân lập ......................................................................... 50
Hình 3.7. Thống kê về tỷ lệ các dạng bề mặt khuẩn lạc chủng vi khuẩn
biển được phân lập .......................................................................... 50
Hình 3.8. Hoạt tính alginate lyase của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
trên đĩa thạch MBA trong quá trình nhuộm (A) và sau khi
nhuộm bằng thuốc nhuộm Gram’s iodine (B). ............................... 52
Hình 3.9. Số lượng và tỷ lệ các chủng vi khuẩn sinh hoạt tính alginate
lyase phân lập được từ các mẫu rong ở vùng biển Khánh Hòa. ..... 54

Hình 3.10. Cây phát sinh lồi dựa vào trình tự đoạn gen 16S rRNA của
các chủng vi khuẩn biển. ................................................................ 58
Hình 3.11. Hoạt tính dịch chiết nội bào và ngoại bào của chủng vi khuẩn
B. velezensis R8BF10 trên môi trường đĩa thạch alginate chiết
từ rong S. mcclurei, đối chứng âm là môi trường MB không
chứa vi khuẩn, đối chứng dương là alginate lyase ngoại bào
của chủng B. velezensis AlgSm1 và alginate lyase của Sigma ....... 60
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của BalyA ........................ 62
Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của BalyA .............................. 63
Hình 3.14. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của BalyA .................. 64
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính của BalyA ............... 64
Hình 3.16. Kết quả điện di C-PAGE của alginate chiết từ rong S. mcclurei,
T. ornata và phản ứng giữa alginate và alginate lyase sau 24h
phản ứng. ......................................................................................... 65


1

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỤC LỤC ......................................................................................................................1
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................5
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................8
1.1. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE ..........................................................................8
1.1.1. Giới thiệu chung alginate ................................................................... 8

1.1.1.1. Nguồn gốc và cấu trúc của alginate ............................................... 8
1.1.1.2. Đặc điểm về alginate của rong nâu Việt Nam .............................. 11
1.1.1.3. Hoạt tính sinh học của alginate và alginate KLPT thấp .............. 12
1.1.1.4. Các ứng dụng của alginate và alginate KLPT thấp ..................... 13
1.1.2. Các phương pháp điều chế alginate KLPT thấp .............................. 15
1.1.2.1. Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp hóa học .......... 15
1.1.2.2. Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp vật lý .............. 15
1.1.2.3. Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp enzyme ........... 16
1.2. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE LYASE .........................................................17
1.2.1. Định nghĩa về alginate lyase ............................................................ 17
1.2.2. Phân loại alginate lyase ................................................................... 17
1.2.3. Nguồn thu nhận alginate lyase ......................................................... 18
1.2.4. Các phương pháp xác định hoạt tính alginate lyase ........................ 19


2
1.2.4.1. Phương pháp đĩa thạch................................................................. 19
1.2.4.2. Phương pháp đo độ đục ................................................................ 20
1.2.4.3. phương pháp đo độ nhớt ............................................................... 20
1.2.3.4. Phương pháp đường khử .............................................................. 21
1.2.3.5. Phương pháp đo độ hấp thụ bước sóng ........................................ 21
1.3. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE LYASE TỪ VI KHUẨN BIỂN ................22
1.3.1. Nguồn phân lập vi khuẩn biển sinh alginate lyase .......................... 22
1.3.2. Đặc tính xúc tác của một số alginate lyase từ vi khuẩn biển ........... 23
1.3.3. Tình hình nghiên cứu alginate lyase từ vi khuẩn biển ở Việt Nam . 28
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...30
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ................................................30
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU .........................................................................................30
2.2.1 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................... 30
2.2.1.1. Nguồn cơ chất ............................................................................... 30

2.2.1.2 Nguồn phân lập vi khuẩn biển ....................................................... 30
2.2.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm ............................................................ 31
2.2.3. Mơi trường ni cấy ........................................................................ 31
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................................33
2.3.1. Xử lý mẫu ........................................................................................ 33
2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn biển từ rong biển .......................... 34
2.3.3. Phương pháp sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh
alginate lyase. ............................................................................................. 35
2.3.4. Phương pháp định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn....................... 36
2.3.5. Phương pháp xác định khả năng bẻ mạch alginate của enzyme
thu được từ chủng vi khuẩn tuyển chọn trên cơ chất alginate ................... 36


3
2.3.5.1. Phương pháp lên men vi khuẩn biển để thu nhận alginate lyase . 36
2.3.5.2. Phương pháp thu nhận alginate lyase từ chủng vi khuẩn tuyển
chọn ............................................................................................................ 37
2.3.5.3. Phương pháp xác định đặc tính xúc tác của enzyme .................... 38
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................... 40
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................41
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN .....................................41
3.2. KẾT QUẢ SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI
KHUẨN THEO ĐỊNH HƯỚNG SINH ALGINATE LYASE ................51
3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN TUYỂN CHỌN.....55
3.3.1. So sánh trình tự 16S rDNA của chủng vi khuẩn biển với các
chủng trên ngân hàng gen (NCBI) ............................................................. 55
3.3.2. Xây dựng cây phát sinh loài. ........................................................... 58
3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH XÚC TÁC CỦA
ALGINATE LYASE TỪ CHỦNG VI KHUẨN BIỂN TUYỂN
CHỌN ................................................................................................................60

3.4.1. Kết quả chiết xuất sơ bộ alginate lyase từ chủng vi khuẩn biển
B. velezensis R8BF10................................................................................. 60
3.4.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của
BalyA ......................................................................................................... 61
3.4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của BalyA ........ 62
3.4.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của
BalyA. ........................................................................................................ 63
3.4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl đến hoạt tính của
enzyme. ...................................................................................................... 64
3.4.6. Kết quả xác định khả năng phân cắt alginate của enzyme thu
nhận được ................................................................................................... 65


4
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..........................................................66
4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................ 66
4.2. KIẾN NGHỊ....................................................................................... 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................68
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Sắc ký đồ, bảng số liệu và các hinh ảnh thực nghiệm nghiên
cứu
Phụ lục 2. Trình tự 16S rDNA của các chủng vi khuẩn biển tuyển chọn.
Phụ lục 3. Các dãy trình tự gen so sánh độ tương đồng 16S rDNA của
03 chủng vi khuẩn biển phân lập được bằng công cụ Blast tương ứng
với các chủng vi khuẩn trên ngân hàng Genbank NCBI.


5
MỞ ĐẦU
Alginate là một anion polysaccharide, phân bố rộng rãi trong thành tế

bào của rong nâu và một số loài vi khuẩn, bao gồm cả Pseudomonas
aeruginosa và Azotobacter vinelandii [1]. Đây là polysaccharide dị trùng hợp
bao gồm hai axit uronic: α-L-guluronic (G) và β-D-mannuronic (M) sắp xếp
với nhau thành các khối β-D-mannuronate (poly M), α-L-guluronate G (poly
G) và heteropolymer (polyMG), các uronic acid này được liên kết với nhau
thông qua liên kết 1,4-glycosidic [1], [2]. Alginate đã và đang được ứng dụng
rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm do
các đặc tính vật lý độc đáo của nó là tạo thành gel. Trong khi đó, rong nâu
được xem là nguồn nguyên liệu chính để điều chế và chiết xuất alginate. Ở
rong nâu hàm lượng alginate chiếm tỷ lệ lên đến 40 % và có khối lượng phân
tử (KLPT) lớn. Ở dạng muối alginate bán trên thị trường có KLPT từ 30.000 400.000 Da, độ nhớt cao nên nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu điều
chế alginate KLPT thấp với mục đích tăng khả năng ứng dụng trong lĩnh vực
y dược cũng như trong việc nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của
chúng[2], [3]. Alginate KLPT thấp (alginate oligosaccharide) được điều chế
bằng các phương pháp hóa học, vật lý hoặc phương pháp sinh học. Trong đó,
việc sử dụng các enzyme cắt mạch alginate được xem là “phương pháp xanh”
do hạn chế sử dụng hóa chất, sản phẩm alginate KLPT thấp khơng có độc tính
sản phẩm tạo ra được kiểm sốt bởi đặc tính xúc tác của enzyme.
Alginate lyase là enzyme có khả năng xúc tác cắt mạch alginate bằng
sự khử liên kết glucoside để tạo ra các oligo alginate. Vi khuẩn biển là nguồn
chính để thu nhận enzyme vì có nhiều ưu điểm vượt trội về chất lượng cũng
như khả năng sản xuất alginate lyase [4]. Một số chủng vi khuẩn có thể kể
đến: gram dương là Bacillus circulans và gram âm là Azotobacter vinelandii,
Klebsiella aerogens, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas maltophilia,
Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa đã được nghiên cứu cho sản
xuất alginate lyase [5]. Vi khuẩn là sinh vật có khả năng sinh sản nhanh, phát
triển mạnh, thích ứng tốt với điều kiện cơng nghiệp. Môi trường dinh dưỡng


6

để ni vi khuẩn đơn giản, dễ kiếm. Do đó, enzyme thu được từ việc nuôi vi
khuẩn sẽ nhanh hơn, giá thành rẻ hơn.
Các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh alginate lyase chủ yếu được
phân lập từ bộ phận tiêu hóa của động vật biển như cầu gai, san hơ mềm,
những lồi động vật hai mảnh vỏ, nước biển và hải miên [6]. Sở dĩ được tìm
kiếm ở những vật chủ như vậy vì đây là những lồi sử dụng rong tảo làm thức
ăn, hệ vi sinh vật đường ruột những lồi này ln có một hoặc một hệ vi
khuẩn sinh alginate lyase để hỗ trợ chuyển hóa thức ăn. Một nguồn phân lập
vi khuẩn biển sinh alginate lyase khác chính là vi khuẩn cộng sinh với rong
nâu bởi vì alginate là thành phần chủ yếu trong cấu tạo thành tế bào rong nâu.
Đã có những cơng bố về các chủng vi khuẩn biển cộng sinh với rong nâu có
khả năng sinh alginate lyase như Pseudoalteromonas elyakoii IAM 14594
phân lập từ rong Laminaria japonica [7], Pseudoalteromonas sp. SM0524
phân lập tảo bẹ trong giai đoạn phân hủy [8]. Do đó, nguồn rong nâu là nguồn
tiềm năng để tìm kiếm vi khuẩn biển sinh alginate lyase.
Ở Việt Nam, rong nâu với khả năng có thể tự tái tạo trong tự nhiên và
sản lượng có thể khai thác lên tới 10.000 tấn khô/năm nên rong nâu là nguồn
lợi rong biển tự nhiên lớn nhất [9]. Các nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy
trong các loài rong nâu ở vùng biển Việt Nam, hàm lượng alginate lên đến
35% và có cấu trúc phức tạp theo 3 dạng cấu trúc block gồm: block M, block
G và block MG sắp xếp khác nhau tùy vào từng lồi rong [9]. Trong khi đó,
alginate lyase thương mại giá thành cao và xúc tác không hiệu quả lên
alginate của rong nâu Việt Nam. Vì vậy, khả năng ứng dụng enzyme thương
mại vào việc điều chế alginate KLPT thấp ở Việt Nam là khó khăn nên việc
nghiên cứu enzyme chuyển hóa alginate từ rong nâu Việt Nam vẫn là cần
thiết.
Do vậy, đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các
chủng vi khuẩn từ rong biển có khả năng sinh enzyme chuyển hóa
alginate từ rong nâu Việt Nam” được tiến hành nhằm tìm ra được chủng vi
khuẩn biển tiềm năng có khả năng sinh alginate lyase có hoạt tính trên cơ chất

alginate chiết xuất từ rong nâu vùng biển Việt Nam.


7
Mục tiêu của đề tài:
Tìm và định danh được chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ rong biển, có
khả năng sinh alginate lyase.
Xác định khả năng bẻ ngắn mạch alginate của enzyme thu nhận được
trên cơ chất alginate chiết xuất từ rong nâu Việt Nam.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh alginate
lyase được phân lập từ rong nâu thu nhận ở vùng biển Khánh Hòa
- Phạm vi nghiên cứu: Khả năng sinh alginate lyase trên cơ chất
alginate chiết xuất từ rong nâu Việt Nam như các loài rong thuộc chi
Sargassum và Turbinaria.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
Tìm kiếm các chủng vi khuẩn biển sinh alginate lyase có hoạt tính cao
nhằm điều chế alginate KLPT thấp là cách tiếp cận mới có ý nghĩa khoa học
cao bên cạnh các phương pháp hóa lý điều chế alginate KLPT thấp.
Alginate lyase từ vi khuẩn biển cắt mạch alginate theo đặc hiệu cơ chất,
từ đó định hướng tạo ra các sản phẩm alginate KLPT thấp có hoạt tính sinh
học ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, y tế.
Các nội dung nghiên cứu chính:
Để thực hiện được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu của luận
văn bao gồm:
- Phân lập các chủng vi khuẩn từ các loài rong nâu thu thập được ở
vùng biển Khánh Hòa.
- Sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ các loài rong nâu thu
thập được ở vùng biển Khánh Hòa theo định hướng sinh alginate lyase.
- Định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn.

- Xác định khả năng bẻ ngắn mạch alginate của enzyme thu nhận từ
chủng vi khuẩn tuyển chọn.


8
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE
1.1.1. Giới thiệu chung alginate
1.1.1.1. Nguồn gốc và cấu trúc của alginate
Alginate là thuật ngữ chung để nói đến alginic acid, muối và dẫn xuất
của nó. Trong tự nhiên alginate tồn tại chủ yếu ở rong nâu, là thành phần cấu
trúc của thành tế bào rong nâu (phaeophyceae), ngồi ra cịn có ở vi khuẩn
như Pseodomonas, Azotobacter,… (Hình 1.1). Ở vi khuẩn, alginate là polyme
duy trì sự ổn định của màng sinh học và thành tế bào nhằm chống lại sự bất
lợi của mơi trường như độc tính của kim loại nặng. Sản xuất và sử dụng
alginate trên thị trường chủ yếu được chiết xuất từ rong nâu vì sinh khối
alginate chiếm tỷ lệ cao lên đến 40% trọng lượng khô của rong nâu và thường
tồn tại dạng muối natri alginate, KLPT alginate từ 30.000 Da đến 400.000 Da.
Năm 1883, Stanford đã khám phá ra alginate từ tảo bẹ, ông đã phát triển quy
trình chiết xuất kiềm từ vật liệu có độ nhớt gọi là “Algin” [10].

Alginate

Vi khuẩn

Rong nâu

Macrocystis

Sagassum

Laminaria

Azotobacter

Pseodomonas

Hình 1.1. Nguồn gốc alginate
Alginate được tạo thành bởi các monosaccharide β-D-mannuronic acid
(M) và α-L-guluronic acid (G) thông qua liên kết thành từ liên kết (1→4)


9

glycoside (hình 1.2). Trong phân tử alginate tỷ lệ, trình tự và sự phân bố của
hai monomer thay đổi rất rộng tùy theo nguồn gốc của alginate. Sự sắp xếp
ngẫu nhiên của 2 monomer M và G trong mạch alginate theo 3 dạng cấu trúc
block: Block homopolymeric guluronic (Poly-G) gồm các gốc acid guluronic
nối tiếp nhau; Block homopolymeric mannuronic (Poly-M) gồm các gốc acid
mannuronic nối tiếp nhau; Block heteropolymeric ngẫu nhiên (Poly-MG) hai
gốc acid guluronic và acid mannuronic luân phiên nối tiếp nhau (hình 1.3)
[11, [12], [13], [14], [15]. Độ dài trung bình của các khối, trình tự của chúng
trong mạch phân tử cũng thay đổi tùy theo nguồn gốc của alginate. Do cấu
trúc của các gốc monomer G và M khác nhau nên hình dạng của các khối
cũng khác nhau: Poly M có cấu tạo ít gấp khúc và tạo nên sự mềm mại của
mạch phân tử, trong khi poly G gấp khúc mạnh hơn và có độ bền chặt hơn.
Chính sự khác nhau của mạch cấu trúc này nên hai loại uronic thể hiện các
tính chất hóa học, sinh học khác nhau [16].

Hình 1.2. Cấu trúc các β-D-mannuronic acid (M), α-L-guluronic acid

(G) của phân tử alginate [16]


10

Hình 1.3. Cấu trúc của các block và liên kết (1→4) glycoside giữa các
uronic của phân tử alginate [16]
Hiện tại alginate được sử dụng trên thị trường có độ đồng nhất về mặt
lý hóa thấp, điều này làm ảnh hưởng đến chất lượng và hạn chế khả năng ứng
dụng của chúng trong các lĩnh vực của sự sống. Tùy vào cấu trúc, thành phần
của alginate mà chúng có những đặc tính lý hóa khác nhau như KLPT, độ
nhớt, độ hịa tan. Alginate có nguồn gốc khác nhau thì tỷ lệ block G và M
khác nhau. Khi alginate có chứa nhiều block G hơn, KLPT cao hơn thì khả
năng tạo gel mạnh hơn và giòn hơn [19].


11
Acid alginic không tan trong nước và dung môi hữu cơ, trong khi muối
đơn chất của alginate và ester alginate tan trong nước tạo thành các dung dịch
nhớt, ổn định [20]. Độ tan của alginate còn phụ thuộc vào pH (pH giảm thì
alginate sẽ kết tủa), cường độ ion và hàm lượng của ion tạo gel [20], [21].
Alginate có cấu trúc khối MG hòa tan ở pH thấp hơn so với các poly M hoặc
poly G. Ngoài KLPT, khả năng tạo dung dịch nhớt của alginate có thể thay
đổi tùy theo nồng độ, pH dung môi, nhiệt độ và sự hiện diện của các ion hóa
trị II. Chính vì vậy mà mỗi loại alginate được lựa chọn để ứng dụng trong các
lĩnh vực khác nhau.
1.1.1.2. Đặc điểm về alginate của rong nâu Việt Nam
Ở Việt Nam, rong nâu là nhóm rong có kích thước lớn (macroalgae),
chủ yếu gồm 4 chi Sargassum, Turbinaria, Dictyota, Padina sản lượng tự
nhiên cao nhất so với các nhóm rong biển khác. Alginate chiết xuất từ rong

nâu ở nước ta chủ yếu tập trung vào chi Sargassum, Turbinaria do hàm lượng
alginate và độ nhớt cao đạt yêu cầu về chất lượng alginate thương mại.
Bảng 1.1. Hàm lượng acid alginic (% Rong khô tuyệt đối) ở vùng biển
Khánh Hịa [22]
TT

Lồi rong

Địa điểm

Hàm lượng acid
alginic

1

Sargassum mcclurei

Hịn Chồng

35,9

2

Sargassum kjellmanianum

Hịn Chồng

33,9

3

Sargassum polycystum

Hịn Chồng

33,8

4

Sargassum congkinhii

Hịn Chồng

26,6

5

Turbinaria ornata

Hịn Chồng

39,4

Ở một số lồi rong thuộc chi Sargassum và Turbinaria, hàm lượng
alginate cao nhất ở loài T. ornata (39,4%), tiếp theo là S. mcclurei (35,9%) và


12
thấp nhất ở lồi S. congkinhii (26,6%) [22]. Chính vì vậy hai loài rong T.
ornata và S. mcclurei là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất alginate

(bảng 1.1). Như vậy, alginate chiếm tỷ lệ cao trong rong nâu, là nguồn nguyên
liệu dồi dào có thể khai thác, sản xuất ở quy mơ cơng nghiệp.
1.1.1.3. Hoạt tính sinh học của alginate và alginate KLPT thấp
Alginate còn là đối tượng được các nhà khoa học quan tâm chú ý do
hoạt tính sinh học đa dạng, tiềm năng lớn ứng dụng trong lĩnh vực dược
phẩm. Các nghiên cứu về alginate hoặc dạng acid của nó cho thấy alginate có
tính kháng khuẩn [23]. Các nhà nghiên cứu đang tìm kiếm các loại kháng sinh
mới để chống lại tình trạng kháng đa thuốc ở vi khuẩn đang gia tăng trên toàn
thế giới. Sử dụng alginate oligosaccharide G (oligo G) khối lượng 2.600 Da
được điều chế từ loài Laminaria hyperborea alginate làm tăng hiệu quả của
kháng sinh thông thường (lên đến 512 lần) đối với 21 chủng vi khuẩn đa
kháng thuốc khác nhau bao gồm Pseudomonas, Burkholderia sp. và
Acinetobacter spp. [24]. Khi có 10% Oligo G thì màng tế bào vi khuẩn bị tổn
thương, sự phát triển của vi khuẩn kháng thuốc bị suy yếu. Như vậy oligo G
đã liên kết với bề mặt vi khuẩn điều chỉnh điện tích, gây ra sự kết tụ của vi
khuẩn và ức chế khả năng vận động. Alginate cịn có khả năng kháng u [25],
alginate ức chế sự vận chuyển và hấp thụ glucose qua thành ruột vào máu nên
là chất tiềm năng để ứng dụng làm thuốc trị tiểu đường [26]. Nhờ vào muối
natri alginate tăng cường khả năng bài tiết cholesterol vào phân và ngăn chặn
sự gia tăng nồng độ glucose hoặc insulin gây ra bởi khả năng dung nạp
glucose [27].
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu về alginate và alginate
KLPT thấp đều có hoạt tính chống oxy hóa. Các tính chất này tăng khi
alginate bị cắt ngắn thành oligomer [28], [29].
Alginate cịn có khả năng tẩy xạ. Khi cơ thể bị nhiễm chất phóng xạ
strontium bằng con đường tiêu hóa, có thể dùng natri alginate để đưa chất
phóng xạ này ra ngồi cơ thể. Alginate tạo kết tủa bền với strontium do đó nó
ngăn được sự hấp thụ strontium vào trong máu và phức hợp này sẽ được đào
thải ra ngoài [30].

13
Ngồi các hoạt tính sinh học tác dụng có lợi cho sức khỏe đã nêu ở
trên, Alginate oligosaccharide (AOS) cũng ảnh hưởng đến các khía cạnh khác
của hoạt động tế bào bao gồm tác dụng điều hòa tăng trưởng tế bào, tác dụng
bảo vệ thần kinh, ức chế sự tích tụ chất nhầy trong ruột,…[31].
Hoạt tính sinh học của alginate có mối quan hệ chặt chẽ với cấu trúc
của nó, các hoạt tính sinh học tăng khi alginate có độ tinh sạch cao và KLPT
thấp [32]. Do đó, ngồi việc nghiên cứu chiết tách, tinh sạch alginate để đảm
bảo cấu trúc tự nhiên, độ sạch cao, thì việc nghiên cứu bẻ ngắn mạch alginate
để thu nhận các AOS là hết sức cần thiết để tạo nên những sản phẩm có hoạt
tính sinh học có tiềm năng ứng dụng trong y dược.
1.1.1.4. Các ứng dụng của alginate và alginate KLPT thấp
Alginate khơng độc, khơng gây miễn dịch, có khả năng thích ứng và
phân hủy sinh học cao nên được xem là vật liệu mới phục vụ cho các ngành
công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, ngành dệt,...
Trong nông nghiệp alginate có khả năng kích thích tăng trưởng ở cây
trồng, giúp hạt nảy mầm sớm, nâng cao sức đề kháng của cây trồng, tăng
năng suất cây trồng, kéo dài thời gian bảo quản và sử dụng, thúc đẩy sự hình
thành rễ ở cây lúa [23]. Trong ngành chăn nuôi lợn, bổ sung AOS giúp cải
thiện hiệu quả protein thô và khả năng tiêu hóa chất béo do đó kích thích tăng
trưởng lợn [31]. Năm 2015 Wenhui Zhu và cộng sự chứng minh
polymannuronate có khả năng chống oxy hóa, tình trạng miễn dịch ở chăn
nuôi gà thịt [32].
Năm 2000, Iwasaki và cộng sự đã dùng alginate lyase điều chế
Alginate KLPT thấp thành oligomer có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng sự phát
triển của rau diếp (Lettuce) như: Trisaccharide, tetrasaccharide,
pentasaccharide, hexasacharide đều kích thích sinh trưởng rễ cây rau diếp
[33]. Lê Quang Luân và cộng sự [34] dùng chiếu xạ điều chế alginate KLPT
thấp, các oligosaccharide được điều chế có KLPT từ 1 kDa đến 3 kDa, ở nồng

độ 20 ppm là tác nhân kích thích sinh trưởng và phát triển của thực vật.


14
Alginate được ứng dụng rộng rãi và phổ biến trong ngành công nghiệp.
Trong ngành công nghệ dệt, alginate dùng làm hồ vải cho sợi bền và chịu
được cọ sát, giảm bớt tỷ lệ sợi đứt và nâng cao hiệu suất dệt. Ngồi ra cịn
làm vải khơng thấm nước, in vải, alginate tạo cho thuốc nhuộm có độ dính
cao đáng kể, in hoa khơng nhịe và rõ ràng, cơng nghiệp giấy và sơn [35].
Trong công nghệ thực phẩm alginate KLPT lớn được sử dụng chủ yếu
như là chất phụ gia do tính khơng độc hại, khả năng tạo gel và tạo độ nhớt.
Natri alginate được sử dụng làm chất ổn định kem ly, làm cho kem mịn có
mùi thơm, chịu nóng tốt chống tan chảy, ngồi ra cịn được dùng trong quá
trình làm các loại nước sốt mayonnaise. [36].
Dựa vào đặc tính hóa sinh của alginate mà trong cơng nghệ dược phẩm,
alginate thường được dùng làm chất nhũ hóa trong các dạng thuốc có cấu trúc
nhũ tương và hỗn dịch, dùng trong tá dược, bao của viên nén hay tham gia
vào thành phần của vỏ nang [2]. Trong những năm gần đây, các ngành công
nghiệp y khoa và công nghiệp dược đã khơng ngừng nghiên cứu các loại
polymer sinh học nói chung và alginate nói riêng. Điều thú vị là alginate
khơng những được ứng dụng ở KLPT cao trong dược liệu, mà cịn thể hiện rõ
rệt khi chúng có KLPT thấp. Các nhà khoa học đã tìm thấy các sản phẩm thủy
phân alginate có KLPT từ 5 kDa đến 20 kDa có hoạt tính dược lý [37].
Alginate cịn được sử dụng để làm băng y tế, bông y tế, đồ bảo hộ y tế và các
sản phẩm dệt may y tế do nhờ tính chất kháng khuẩn, ức chế sự sinh sản của
vi khuẩn, nấm và khả năng hấp thụ mùi [21].
Như vậy, alginate đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của
cuộc sống từ công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm và y dược. Tuy nhiên, với
nhu cầu ngày càng cao, đặc biệt là nhu cầu alginate KLPT thấp cho lĩnh vực y
dược và thực phẩm chức năng nên việc điều chế alginate KLPT thấp an toàn

sinh học cao và tính đặc hiệu cơ chất đang được nhiều quan tâm chú ý và triển
vọng.


15
1.1.2. Các phương pháp điều chế alginate KLPT thấp
1.1.2.1. Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp hóa học
Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp hóa học là phương
pháp phổ biến. Các phương pháp hóa học bao gồm thủy phân alginate bằng
acid, oxy hóa bằng H2O2, thủy phân bằng kiềm. Các acid được sử dụng để
thủy phân alginate thường là HCl, H2SO4, H3PO4 [38]. Chandia và cộng sự
[39] đã tiến hành thủy phân sodium alginate khi dùng HCl 0.3 M, pH 2,85 sau
nhiều công đoạn gia nhiệt và ly tâm thu được các polymannuronic acid và
polyguluronic acid.
Thủy phân bằng acid là phương pháp đơn giản và hiệu quả, trong môi
trường acid các liên kết glycoside dễ dàng được phân cắt dưới xúc tác H+ để
tạo thành các oligomer không bằng nhau về trùng hợp. Tuy nhiên, phản ứng
cắt của acid là ngẫu nhiên và khơng có tính đặc hiệu. Nhược điểm của phương
pháp này là rất mất thời gian từ 10-12 giờ, dư lượng muối được tạo ra từ trung
hịa acid với kiềm và chất lượng alginate oligosaccharide khơng đảm bảo
[38].
Năm 2020, Soukaina và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu dùng chất xúc
tác là H2O2 để thủy phân alginate thu từ rong nâu Bifurcaria bifurcata và kết
quả là sau 6h đã thu được các alginate oligosaccharide có KLPT nhỏ hơn 5,5
kDa [40].
1.1.2.2. Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp vật lý
Các phương pháp vật lý để điều chế alginate KLPT thấp gồm: Sử dụng
tia gamma chiếu xạ [41], để tăng hiệu quả của quá trình điều chế alginate
KLPT thấp bằng tia gamma thì nhiều cơng trình nghiên cứu đã kết hợp giữa
chiếu xạ gamma và sử dụng H2O2 đã giảm liều lượng chiếu xạ cần thiết xuống

9 lần so với chỉ sử dụng tia gamma để điều chế alginate KLPT thấp [42];
phương pháp cắt mạch alginate bằng tia cực tím (UV) kết hợp với chất xúc
tác titanium dioxide (TiO2) điều chế alginate [43]; ngồi ra cịn có các
phương pháp sử dụng sóng siêu âm, vi sóng và phương pháp thủy nhiệt cũng


16
được nghiên cứu và sử dụng trong việc điều chế alginate nhưng chỉ mang tính
chất thử nghiệm.
Điều chế alginate KLPT thấp bằng các phương pháp vật lý được sử
dụng phổ biến hiện nay, ưu điểm của các phương pháp này là chi phí điều chế
thấp, thời gian nhanh và được thực hiện ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên,
khả năng cắt mạch alginate không theo thứ tự các oligomer, sử dụng nhiều
năng lượng, đòi hỏi về thiết bị và các điều kiện thí nghiệm nghiêm ngặt.
1.1.2.3. Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp enzyme.
Phương pháp pháp enzyme là phương pháp sử dụng xúc tác sinh học
gọi là alginate lyase để cắt mạch alginate bằng phản ứng khử β của liên kết
(1→4) glycoside giữa các monome tạo thành các oligomer. Tùy theo đặc tính
của mỗi loại enzyme khác nhau mà phản ứng khử tạo các sản phẩm AOS có
đặc điểm khác nhau. Quá trình khử β được thực hiện qua 3 bước: bước 1 là
trung hịa điện tích âm của alginate carboxyl, khử proton H-5; bước 2 một
phản ứng được xúc tác bởi chất nền thu hút proton trên vị trí C5 hình thành
chất trung gian carboxylate dianion; bước 3 là tăng proton để hình thành liên
kết đơi giữa C4 và C5 từ đó dẫn đến phản ứng khử β xảy ra ở liên kết (1→4)
glycosidic tạo thành các acid mannuronic không no [31], [44].
Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp enzyme so sánh với
phương pháp vật lý, phương pháp hóa học thì nhược điểm là phải tinh sạch
enzyme nên chi phí cho việc phân tách và tinh sạch cao, enzyme thu nhận từ
động vật thân mềm thì khó tách khỏi đường tiêu hóa của chúng nên q trình
cơng nghiệp hóa gặp khó khăn [4]. Nhưng các enzyme cắt mạch alginate có

tính đặc hiệu, tùy thuộc mỗi loại enzyme khác nhau thì cắt mạch ở những
monome khác nhau và khả năng cắt mạch thực hiện theo trình tự, các vị trí cắt
được thực hiện chính xác. Chính sự đặc hiệu này đã phân ra các loại poly M
lyase, poly G lyase, poly MG lyase và tạo ra các oligo G, oligo M, oligo MG.
Mặt khác trong quá trình thực hiện enzyme khơng sử dụng đến hóa chất nên
sản phẩm khơng tồn dư hóa chất, q trình thực hiện ngồi việc duy trì độ pH
và nhiệt độ thì tiêu thụ ít năng lượng. Công nghệ enzyme trong điều chế


17
alginate KLPT thấp được đánh giá là công nghệ sạch và an toàn sinh học cao
đặc biệt sản phẩm được ứng dụng trong lĩnh vực y dược và thực phẩm [31].
1.2. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE LYASE
1.2.1. Định nghĩa về alginate lyase
Alginate lyase là một nhóm các enzyme xúc tác quá trình khử alginate
thành oligosaccharide. Alginate lyase xúc tác quá trình khử β phá vỡ các liên
kết glycoside giữa các monome và tạo ra liên kết đôi tại C4 và C5 của các
vịng đường cacbon, trong q trình đó liên kết 4 – O – glycoside sẽ bị loại bỏ
và tạo thành các oligosaccharide [4], [31], [45]. Alginate lyase đã được ứng
dụng trong q trình sản xuất oligosaccharide và phân tích cấu trúc
polysaccharide.
Alginate lyase có KLPT dao động từ 24 kDa -110 kDa, là đồng trùng
hợp của α-L-guluronate (G) và C5 epimer β D-mannuronate (M) của nó, được
sắp xếp như các khối G homopolymer, khối M, xen kẽ GM hoặc dị trùng hợp
ngẫu nhiên G / M kéo dài.
1.2.2. Phân loại alginate lyase
Alginate lyase gồm nhiều loại khác nhau được thu nhận từ các nguồn vi
sinh vật, virus, nấm,… nên có nhiều cách phân loại:
Dựa vào đặc hiệu cơ chất, alginate lyase được chia làm 3 loại với tính
đặc hiệu với G-block (EC4.2.2.11), đặc hiệu với M-block (EC4.2.2.3) và một

nhóm enzyme đặc hiệu với poly M và cả poly G là MG-block (EC4.2.2.-) [4].
Dựa vào cơ chế hoạt động, alginate lyase được chia làm 2 nhóm là
alginate lyase endolytic và alginate lyase exolytic. Alginate lyase endolytic
tách các liên kết glycoside bên trong phân tử alginate và giải phóng các
oligoalginate, đó có thể là các disacharide, trisacharide, tetrasacharide…
Trong khi alginate lyase exolytic có thể tách nhỏ phân tử alginate và các đoạn
oligoalginate thành các monosacharide [4].
Dựa vào cấu trúc sơ cấp của enzyme, alginate lyase chia vào 7 họ của
polysaccharide lyase là 5, 6, 7, 14, 15, 17 và 18. Hầu hết, exolytic alginate