Nghiên cứu phân lập hợp chất từ ethyl acetat cây ngải cứu và tác dụng ức chế TNF alfa định hướng điều trị bệnh viêm khớp

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
-----

-----

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ
ETHYL ACETAT CÂY NGẢI CỨU VÀ TÁC
DỤNG ỨC CHẾ TNF-ALFA ĐỊNH HƯỚNG
ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM KHỚP

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS.TRẦN NGUYỄN MINH ÂN
PGS.TS.LÊ TIẾN DŨNG
Sinh viên thực hiện :

HỒ THỊ LAN

Lớp: DHHC14B
MSSV:18085361
Khóa:2018-2022
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2022


BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
-----

-----

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ
ETHYL ACETAT CÂY NGẢI CỨU VÀ TÁC
DỤNG ỨC CHẾ TNF-ALFA ĐỊNH HƯỚNG
ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM KHỚP

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS.TRẦN NGUYỄN MINH ÂN
PGS.TS.LÊ TIẾN DŨNG
Sinh viên thực hiện :HỒ THỊ LAN
Lớp:DHHC14B
MSSV:18085361
Khóa:2018-2022

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2022


i
TRƯỜNG ĐH CƠNG NGHIỆP TP.HCM

CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC

Độc lập – Tự do - Hạnh phúc

----- // -----

----- // -----

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: HỒ THỊ LAN
MSSV: 18085361
Chuyên ngành: Cơng nghệ Hóa học
Lớp: DHHC14B
1.

Tên đề tài đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu phân lập hợp chất từ ethyl acetat cây ngải
cứu và tác dụng ức chế TNF-alfa định hướng điều trị bệnh viêm khớp.

2.

Nhiệm vụ:
-

Tìm hiểu về cây ngải cứu, bệnh viêm khớp.

-

Tìm hiểu về quá trình tách chiết các hợp chất ,các kỹ thuật sắc ký (SKC, SKLM,
SK gel, nhựa trao đổi ion) để phân lập chất tinh khiết.

-

Đánh giá hoạt tính sinh học kháng viêm trên mơ hình tế bào gây viêm, và đại
lượng theo dõi ở dây là TNF-alfa.

-

Tìm hiểu các kỹ thuật phổ để xác định cấu trúc NMR,MS.

-

Tìm hiểu về phương pháp molecular docking model và pharmacokinetic.

3.

Ngày giao nhiệm vụ đồ án tốt nghiệp: 9/2021

4.

Ngày hoàn thành đồ án tốt nghiệp: 7/2022.

5.

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS. TRẦN NGUYỄN MINH ÂN
PGS.TS. LÊ TIẾN DŨNG
Tp. Hồ Chí Minh, ngày… tháng… năm 2022
Chủ nhiệm bộ mơn
chun ngành

Giáo viên hướng dẫn


ii

LỜI CẢM ƠN
Trong cuộc sống chúng ta đã trải qua mn vàng những khó khăn trở ngại: vấp ngã có ,thành
cơng có,thất bại có… Và trên thực tế khơng có sự thành công nào là không gắn liền với
những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong

suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập tại trường đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan
tâm, giúp đỡ của q thầy cơ, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi
đến quý thầy cơ ở Khoa Cơng nghệ Hóa học – Trường Đại học Cơng nghiệp Thành Phố Hồ
Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu
cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Và đặc biệt, trong học kỳ này nếu khơng có
những lời hướng dẫn, dạy bảo của các thầy cơ thì em nghĩ bài khóa luận này của em rất khó
có thể hồn thiện được.
Qua đây em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy PGS.TS.TRẦN NGUYỄN MINH
ÂN, PGS.TS.LÊ TIẾN DŨNG đã tận tâm chỉ dạy và hướng dẫn cũng như hỗ trợ cho em
rất nhiều trong thời gian làm đồ án. Những kiến thức, những kinh nghiệm quý báu mà thầy
truyền đạt đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình tiến hành thực nghiệm đồ án và cũng như
trong công việc sau này. Giúp bản thân em có thể thích nghi và một phần nào đó đỡ bỡ ngỡ
hơn với cơng việc trong tương lai.
Trong quá trình thực hiện đồ án, cũng như là trong q trình làm bài báo cáo khóa luận, khó
tránh khỏi sai sót, rất mong các thầy (cơ) bỏ qua. Đồng thời do trình độ lý luận cũng như
kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo khơng thể tránh khỏi những thiếu sót,
em rất mong nhận được ý kiến đóng góp thầy (cơ) để em học hỏi thêm được nhiều kinh
nghiệm hơn và có thể hồn thành một cách tốt nhất bài luận của mình.
Em xin chân thành cảm ơn!Và kính chúc q thầy (cơ) sức khỏe và bình an!

TP. Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2022
Sinh viên thực hiện
(Ghi họ và tên)


iii

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................

......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
Phần đánh giá: (thang điểm 10)





Thái độ thực hiện:
Nội dung thực hiện:
Kỹ năng trình bày:
Tổng hợp kết quả:

Điểm bằng số: ................................ Điểm bằng chữ: ....................................................

Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng 09 năm 2022
Giáo viên hướng dẫn


iv

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢNBIỆN

......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
Phần đánh giá:





Ý thức thực hiện:
Nội dung thực hiện:
Hình thức trình bày:
Tổng hợp kết quả:

Điểm bằng số: ............................... Điểm bằng chữ: .....................................................

Tp. Hồ Chí Minh, ngày….tháng….năm 2022
Giáo viên phản biện


v

MỤC LỤC
CHƯƠNG I : TỔNG QUAN ..............................................................................................1
I. Tổng quan về cây ngải cứu .........................................................................................1
1. Đặc tính sinh thái ...................................................................................................1
1.1. Về tên gọi ...........................................................................................................1
1.2. Về phân loại khoa học ........................................................................................1
2. Đặc điểm thực vật học ...........................................................................................1
3. Nguồn gốc ...............................................................................................................2
4. Công dụng của cây ngải cứu .................................................................................2
4.1. Trong y học dân gian ........................................................................................2
4.2. Dược tính của ngải cứu ......................................................................................3
4.3. Một số chế phẩm có chiết xuất từ ngải cứu ........................................................3
4.4. Một số món ăn được chế biến từ lá ngải cứu .....................................................4
5. Về thành phần hóa học và thành phần dinh dưỡng ...........................................5
5.1. Về thành phần hóa học .......................................................................................5
5.2. Về thành phần dinh dưỡng trong cây ngải cứu ..................................................6
II. Tổng quan về viêm xương khớp ...............................................................................6
1. Định nghĩa viêm khớp ...........................................................................................6
1.1. Nguyên nhân gây bệnh: ......................................................................................7
1.2. Triệu chứng bệnh Viêm khớp.............................................................................7
1.3. Đối tượng nguy cơ bệnh Viêm khớp ..................................................................7
2. Viêm khớp dạng thấp ............................................................................................7
2.1. Điều trị................................................................................................................8
3. Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm..............................................9
III. Tổng quan về q trình tách chiết các hợp chất ...................................................9
1. Lịch sử hình thành và khái niệm quá trình tách chiết .......................................9
2. Ưu và nhược điểm của quá trình tách chiết ......................................................10
2.1. Các phương pháp tách chiết .............................................................................10
2.1.1. Phương pháp chiết lỏng – rắn ....................................................................10

2.1.2. Phương pháp chiết lỏng – lỏng. .................................................................12
IV. Tổng quan về các phương pháp sắc ký để phân lập hợp chất tinh khiết ..........12


vi
1. Sắc ký lớp mỏng ...................................................................................................12
2. Sắc ký cột ..............................................................................................................13
3. Sắc ký Gel .............................................................................................................14
4. Sắc ký trao đổi ion ...............................................................................................14
V. Tổng quan về phương pháp Docking phân tử ......................................................14
CHƯƠNG II : THỰC NGHIỆM .....................................................................................16
I. Thực nghiệm ..............................................................................................................16
1. Đối tượng nguyên cứu .........................................................................................16
2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ..............................................................................16
2.1. Hóa chất, thiết bị ..............................................................................................16
2.2. Dụng cụ ............................................................................................................17
3. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................18
4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................18
5. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................18
5.1. Phương pháp điều chế các loại cao chiết và phân lập các chất từ cây ngải cứu
.................................................................................................................................18
6. Quy trình điều chế các loại cao chiết .................................................................19
6.1. Thuyết minh quy trình ......................................................................................21
7. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm ...................................................24
7.1. Thử độc tính của cao chiết và các chất phân lập từ ngải cứu trên tế bào Raw
264.7 ........................................................................................................................24
7.2. Thử hoạt tính kháng viêm ................................................................................26
7.2.1. Thử hoạt tính kháng viêm bằng phương pháp ức chế sản sinh NO ..........26
7.2.2. Thử hoạt tính kháng viêm bằng phương pháp xác định cytokine TNF-α .26
8. Phương pháp docking phân tử trên phần mềm Autodock ..............................27

9. Phương pháp xác định dược động học pharmacokinetic (hay còn gọi là
ADMET) ...................................................................................................................29
CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................................................30
I. Kết quả .......................................................................................................................30
1. Kết quả điều chế các loại cao chiết và phân lập các chất từ cây ngải cứu ......30
2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm.............................................................31
2.1. Thử độc tính của cao chiết và các chất phân lập từ ngải cứu trên tế bào Raw
264.7 ........................................................................................................................31


vii
2.2. Thử hoạt tính kháng viêm bằng phương pháp ức chế sản sinh NO .................32
2.3. Thử hoạt tính kháng viêm bằng phương pháp xác định cytokine TNF-α ........32
3. Định danh cấu trúc hai hợp chất phân được từ ngải cứu ................................33
3.1. Hợp chất AV8 ..................................................................................................33
3.1.1. Về hình thái ...............................................................................................34
3.1.2. Về dữ liệu phổ ...........................................................................................34
3.1.3. Biện luận ...................................................................................................34
3.2. Hợp chất AV9 ..................................................................................................37
3.2.1. Về hình thái ...............................................................................................37
3.2.2. Dữ liệu phổ ................................................................................................37
3.2.3. Biện luận ...................................................................................................38
4. Kết quả doking phân tử của hai hợp chất AV8 (medioresinol) và AV9
(Syringaresinol) của dược liệu ngải cứu ................................................................39
4.1. Kết quả docking của cấu dạng của ligand AV9 ..............................................40
4.2. Kết quả docking của Ligand AV9 với chuỗi C của phân tử protein 4WCU ....42
4.3. Kết quả docking của Ligand AV8 với chuỗi C của phân tử protein 4WCU ....43
5. Kết quả phương pháp Pharmacokinetic (ADMET) .........................................46
5.1. Đặc tính hóa lý .................................................................................................46
5.2. Hóa dược ..........................................................................................................47

5.3. Sự hấp thụ .........................................................................................................49
5.4. Phân bổ .............................................................................................................50
5.5. Sự trao đổi chất.................................................................................................51
5.6. Sự bài tiết..........................................................................................................52
5.7. Độc tính ............................................................................................................52
5.8. Quy tắc độc tính trong điều chế .......................................................................54
CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................55
I. Kết luận ......................................................................................................................55
1. Điều chế các loại cao chiết và phân lập các chất ...............................................55
2. Về đánh giá hoạt tính kháng viêm khớp của cao chiết và các hợp chất phân
lập từ dược liệu ngải cứu .........................................................................................55
2.1. Thử độc tính của cao chiết và các chất phân lập từ ngải cứu trên tế bào Raw
264.7 ........................................................................................................................55


viii
2.2. Thử hoạt tính kháng viêm bằng phương pháp ức chế sản sinh NO .................55
2.3. Thử Hoạt tính kháng viêm bằng phương pháp xác định cytokine TNF-α .......56
II. Đề nghị ......................................................................................................................56


ix

PHỤ LỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. 1: Thành phần dinh dưỡng trong ngải cứu .........................................................6

Bảng 2. 1: Tên hóa chất ....................................................................................................16
Bảng 2. 2: Tên thiết bị .......................................................................................................17
Bảng 2. 3: Tên dụng cụ .....................................................................................................17

Bảng 3. 1: Kết quả điều chế cao chiết và phân lập hợp chất từ dược liệu ngải cứu....30
Bảng 3. 2: Kết quả khảo sát độc tính với nồng độ khác nhau trên tế báo Raw 264.7
của cao tổng và các cao chiết phân đoạn của dược liệu ngải cứu .................................31
Bảng 3. 3: Kết quả khảo sát sản sinh NO với nồng độ khác nhau trên tế báo Raw
264.7 của cao tổng và các cao chiết phân đoạn của dược liệu ngải cứu .......................32
Bảng 3. 4: Đánh giá mức độ tiết TNF-α của các phân đoạn cao chiết ..........................33
Bảng 3. 5: Dữ liệu phổ và (+)-medioresinol ....................................................................37
Bảng 3. 6: Dữ liệu phổ và (+)-syringaresinol ..................................................................39
Bảng 3. 7: Các giá trị quan trọng tính tốn từ mơ hình mơ phỏng, in silico docking
model giữa ligand cấu dạng bền nhất và cấu trúc tinh thể của enzyme đích, 4CWU:
PDB .....................................................................................................................................40
Bảng 3. 8: Đặc tính hóa lý của AV8 và AV9 ...................................................................47
Bảng 3. 9: Dược tính của AV8 và AV9 ............................................................................48
Bảng 3. 10: Sự hấp thụ của AV8 và AV9 ........................................................................49
Bảng 3. 11: Sự phân bổ của AV8 và AV9 ........................................................................50
Bảng 3. 12: Sự trao đổi chất của AV8 và AV9 ................................................................51
Bảng 3. 13: Sự bài tiết của AV8 và AV9 ..........................................................................52
Bảng 3. 14: Độc tính của AV8 và AV9.............................................................................53
Bảng 3. 15: Các quy tắc về độc tính của AV8 và AV9 ...................................................54


x

PHỤ LỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. 1: Các bộ phận cây ngải cứu .................................................................................1
Hình 1. 2: Một số hình ảnh về cây ngải cứu ......................................................................2
Hình 1. 3: Hoa và lá cây ngải cứu ......................................................................................2
Hình 1. 4: Mặt nạ làm từ cây ngải cứu ..............................................................................3
Hình 1. 5: Dược phẩm hỗ trợ bổ huyết,điều kinh và nhang làm từ ngải cứu. ...............4
Hình 1. 6: Gà hầm ngải cứu................................................................................................4

Hình 1. 7: Nước nấu ngải cứu ............................................................................................4
Hình 1. 8: Cá hấp ngải cứu .................................................................................................4
Hình 1. 9: Cháo gà ác hầm ngải cứu ..................................................................................5
Hình 1. 10: Cấu trúc phân tử hợp chất flavonoid ............................................................5
Hình 1. 11: Hợp chất của cumarine ...................................................................................5
Hình 1. 12: Một số hợp chất trong tinh dầu cây ngải cứu ...............................................6
Hình 1. 13: So sánh khớp thường và VKDT .....................................................................8
Hình 1. 14: Cơ chế bệnh sinh của VKDT ..........................................................................8
Hình 1. 15: Sự phân bố của một chất tan giữa hai pha lỏng ...........................................9
Hình 1. 16: Sự phân bố của một chất tan giữa hai pha lỏng .........................................11
Hình 1. 17: Sơ đồ mơ tả q trình chiết bằng lơi cuốn hơi nước ..................................12

Hình 2. 1: Quy trình phân lập các hợp chất ...................................................................19
Hình 2. 2: Sơ đồ tổng quát quy trình phân lập hợp chất mới .......................................20
Hình 2. 3: Sơ đồ quy trình phân lập hợp chất mới ........................................................21
Hình 2. 4: Các cao phân đoạn sau khi chạy SKC ...........................................................22
Hình 2. 5: Chấm TLC phân đoạn AVEA1,2,3,4,5 ..........................................................22
Hình 2. 6: Chấm TLC phân đoạn AVEA3.1,3.2,3.3 so với mẫu AVEA3 .....................22
Hình 2. 7: Chấm TLC phân đoạn AVEA3.3.1 ................................................................22
Hình 2. 8: Chấm TLC phân đoạn AVEA 3.3.1so với mẫu ............................................23
Hình 2. 9: Chấm TLC phân đoạn AVEA3.3.1 trên bản đảo .........................................23
Hình 2. 10: Chạy SKC đảo ...............................................................................................23
Hình 2. 11: Hiện hình phân đoạn AVEA3.3.1.1 trong acid và cạo bản ........................24
Hình 2. 12: Chấm TLC phân đoạn AVEA3.2.3 ..............................................................24


xi
Hình 2. 13: Sơ đồ thử độc tính trên tế bào Raw 264.7 ...................................................25
Hình 2. 14: Sơ đồ quy trình thử hoạt tính kháng viêm bằng phương pháp ức chế NO
.............................................................................................................................................26

Hình 2. 15: Sơ đồ quy trình thử hoạt tính kháng viêm bằng phương pháp xác định
cytokine TNF-α ..................................................................................................................27
Hình 2. 16: Sơ đồ qui trình docking của thuốc (ligand) đến DNA của tế bào kháng
viêm .....................................................................................................................................28

Hình 3. 1: Cấu trúc của hợp chất AV8 ............................................................................30
Hình 3. 2: Cấu trúc của hợp chất AV9 ............................................................................30
Hình 3. 3: Đồ thị biểu diễn khả năng gây độc trên tế bào Raw 264.7 của cao chiết từ
dược liệu ngải cứu so với Neg ...........................................................................................32
Hình 3. 4: Đồ thị biễu diễn khảo sát sản sinh NO với nồng độ khác nhau trên tế báo
Raw 264.7 của cao tổng và các cao chiết phân đoạn của dược liệu ngải cứu...............32
Hình 3. 5: Đồ thị biễu diễn mức tiết TNF-α trên tế bào Raw 264.7 của cao chiết từ
dược liệu ngải cứu .............................................................................................................33
Hình 3. 6: Cấu trúc hóa học của Medioresinol ...............................................................33
Hình 3. 7: Cấu trúc 7,9′:7′,9 diepoxylignan ....................................................................34
Hình 3. 8: Cấu trúc hóa học của hợp chất COGE6: (+)-medioresinol .........................35
Hình 3. 9: Cấu trúc hóa học của hợp chất AV9: (+)-Syringaresinol ............................37
Hình 3. 10: Cấu dạng của Hydrogen hình thành xung quanh ligand AV9 ..................40
Hình 3. 11: Trình bày các tương tác quan trọng giữa pose 312 của Ligand AV9 và
enzyme ,4WCU ..................................................................................................................41
Hình 3. 12: Bản đồ Ligand trình bày các tương tác bậc hai giữa các amino acid của
protein và pose 312 của Ligand AV9 ...............................................................................41
Hình 3. 13: Cấu dạng Hydrogen của Ligand AV9 với chuỗi C của 4WCU .................42
Hình 3. 14: Trình bày các tương tác quan trọng giữa pose 420 của Ligand AV9 và
enzyme trên chuỗi C của 4WCU ......................................................................................42
Hình 3. 15: Trình bày các tương tác quan trọng giữa pose 420 của Ligand AV9 và
enzyme trên chuỗi C của 4WCU ......................................................................................43
Hình 3. 16: Biểu diễn lực tương tác trên cấu trúc của AV9 ..........................................43
Hình 3. 17: Cấu dạng Hydrogen của Ligand AV8 với chuỗi C của 4WCU .................44
Hình 3. 18: Trình bày các tương tác quan trọng giữa pose 237 của Ligand AV8 và

enzyme trên chuỗi C của 4WCU ......................................................................................44


xii
Hình 3. 19: Bản đồ Ligand trình bày các tương tác bậc hai giữa các amino acid của
protein và pose 237 của Ligand AV8 ...............................................................................45
Hình 3. 20: Biểu diễn lực tương tác trên cấu trúc của AV8 ..........................................45

Phụ lục
Hình S. 1: Phổ 1H-NMR của L-AV-8 ..............................................................................60
Hình S. 2: Phổ 13C-NMR của L-AV-8 ............................................................................61
Hình S. 3: Phổ DEPT-NMR của L-AV-8 ........................................................................61
Hình S. 4: Phổ HMBC – NMR của L-AV-8 ....................................................................63
Hình S. 5: Phổ HSQC-NMR của L-AV-8 ........................................................................64
Hình S. 6: Phổ 1H-NMRcủa L-AV-9 ...............................................................................65
Hình S. 7: Phổ C13 –NMR của L-AV-9 ..........................................................................66
Hình S. 8: Phổ DEPT –NMR của L-AV-9 .......................................................................67
Hình S. 9: Phổ HMBC- NMR của L-AV-9......................................................................68
Hình S. 10: Phổ HSQC- NMR của L-AV-9 .....................................................................69


xiii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Tiếng anh

VKDT

Diễn giải
Viêm khớp dạng thấp

EtOH

Ethanol

NO3-

Nitrate

NO2-

Nitrite

NO

nitric oxide

MTT

(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium
bromide)

NADH

Hydrogenperoxideoxidoreductase

Cồn

Sulfanilamide và Nalphanaphthylethylenediamine trong
môi trường axit

Griess

LPS

lipopolysaccharide

DMSO

Dimethyl sulfoxide

Tác nhân gây viêm

Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử

ASS
ppm

Part per million

kg

kilogram

g

gram

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Carbon (13) Nuclear

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon
(13)

13

C-NMR
Magnetic Resonance

1

Hydro (1) Nuclear
H-NMR
Magnetic Resonance

Phần triệu

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
(1)


xiv
Heteronuclear Single

HSQC
Quantum Coherence
Heteronuclear
HMBC
Multiple Bond Cohenrence

Phổ tương tác dị hạt nhân qua một
liên kết
Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều
liên kết
Độ dịch chuyển hóa học

δ

Chemical shift

s

Singlet

Mũi đơn

d

Doublet

Mũi đơi

dd

Doublet of doublet

Mũi đôi đôi

AVE

Cao Ethanol

AVEA

Cao Etyl Acetat

AVH

Cao Hexan

AVM

Cao Methanol


xv

LỜI NĨI ĐẦU
Trong thời đại cơng nghệ 4.0, con người khơng chỉ ăn ngon ,mặc đẹp mà việc chăm sóc sức
khỏe và y học ngày càng được quan tâm.Bên cạnh nhiều loại bệnh đã được nghiên cứu và
tìm ra thuốc chữa trị thì ngành hóa học đặc biệt hóa hữu cơ đã và đang có những đóng góp
rất lớn trong việc tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có khả năng chống lại
các căn bệnh gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe và tính mạng con người.
Trong những thống kê gần đây ở Việt Nam nói chung và các nước trên thế giới nói riêng có

thể nói bệnh xương khớp là một trong những loại bệnh phổ biến nhất hiện nay và đang có
xu hướng trẻ hóa.
Theo các chuyên gia xương khớp, các bệnh về cơ xương khớp nếu không được chữa trị kịp
thời sẽ gây biến chứng nguy hiểm, ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe. Người bệnh có thể bị
giảm khả năng vận động, tăng nguy cơ mắc bệnh về tim, thận, biến dạng khớp, teo cơ…
nghiêm trọng hơn là bại liệt suốt đời. Hiểu được tính cấp bách và tầm nghiêm trọng của
nó ,chúng tôi đã quyết định chọn cây ngải cứu (Artemisia VulgarisL )có nguồn gốc từ thiên
nhiên với nhiều tính năng ,công dụng đa dạng cùng với phương pháp kỹ thuật sắc ký trong
hóa hoc để phân lập các hợp chất có khả năng kháng viêm trên mơ tế bào gây viêm. Theo
như các nghiên cứu từ các tài liệu nước ngồi cho thấy lá ngải cứu có chứa một số hợp chất
có hoạt tính sinh học như: Aesculetine(6,7-dihydroxycoumarin), Scopoletine (7-hydroxy-6methoxycoumarin), Jaceosidine (4,5,7-trihydroxy-3,6-dimethoxyflavone), Eupafoline (6methoxy-5,7,3’,4’-tetrahydroxyflavone),
Leuteolin(3’,4’,5,7-tetrahydroxyflavone),
Apigenin(4’,5,7trihydroxyflavone), Tricine(5,7,4’-trioxy-3’,5’-dimethoxylflavone),… Các
chất này có khả năng ức chế rất tốt sự tăng trưởng của các tế bào ung thư vú và ung thư cổ
tử cung, kháng khuẩn, kháng viêm. Ngoài ra các thành phần trong cây ngải cứu cịn có rất
nhiều cơng dụng hữu ích cho sức khỏe con người .Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu phân lập
hợp chất từ ethyl acetat cây ngải cứu và tác dụng ức chế TNF-alfa định hướng điều trị
bệnh viêm khớp” hi vọng sẽ giải quyết được một phần nào đó những vấn đề cấp thiết về
căn bệnh này ,bên cạnh đó giảm giá thành sản xuất và góp phần đưa quy trình nghiên cứu
áp dụng vào thực tiễn nhằm phục vụ cho ngành y tế và đời sống con người.


1

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN

I. Tổng quan về cây ngải cứu
1. Đặc tính sinh thái [1]
1.1. Về tên gọi
-

Tên khoa học: Artemisia VulgarisL.

-

Tên thường gọi: ngải diệp, nhả ngải, quá sú, cỏ linh ti …

-

Tên gọi khác: Mugwort
commune (Pháp),...

(Anh),

sagebrush,

Wormwood,

AbsinthArmoise

1.2. Về phân loại khoa học
Giới : Plantae
Ngành : Angiospermae
Lớp : Asterids
Bộ : Asterales
Họ : Asteraceae
Chi : Artemisia
Loài : A. vulgaris
2. Đặc điểm thực vật học [1], [2]
Đây là một loại cỏ sống lâu năm, có chiều cao khoảng từ 30cm đến 1.5m (thậm chí

có thể cao trên 2m) với:
Thân:Ngải cứu là cây thân thảo, to có rãnh dọc,thân thẳng đứng thường có màu đỏ tía.
Lá:dài từ 5-20cm, mọc so le, rộng, xẻ thùy long chim, khơng có cuống (nhưng lá phía
dưới thường có cuống), mặt trên lá có màu lục sẫm, mặt dưới màu trắng xám do có nhiều
lơng nhỏ. Lá có mùi thơm nồng và có vị đắng
Hoa. Mọc thành cụm ,bơng hoa nhỏ (dài ~ 5 mm), hoa có màu vàng hoặc màu hồng.
hoa trổ từ tháng 7 – tháng 10 .

Hình 1. 1: Các bộ phận cây ngải cứu


2

Hình 1. 2: Một số hình ảnh về cây ngải cứu

Hình 1. 3: Hoa và lá cây ngải cứu
3. Nguồn gốc [1]
Ngải cứu có nguồn gốc từ các vùng ơn đới ấm ở Bắc Mỹ, Châu Âu, Châu Á; Vùng
nhiệt đới Bắc Phi và vùng hàn đới Alaska.Ở nước ta, cây ngải cứu được trồng trên khắp các
vùng miền từ Nam ra Bắc và mọc hoang ở nhiều nơi như như đồng ruộng,bề mương,lề
đường....
Loài cây này được trồng trên các loại đất khơng chứa nhiều đạm.Hầu hết các hộ gia
đình trồng ngải cứu xung quanh nhà với quy mô nhỏ, chủ yếu làm rau ăn, chưa thấy trồng
và thu hoạch ở quy mô lớn.
4. Công dụng của cây ngải cứu
4.1. Trong y học dân gian
Loại cây này được biết đến khơng chỉ như một loại thực vật mà cịn dùng làm thực
phẩm (hầu hết là gia vị) ,dùng để làm rau ăn tốt cho cơ thể ,giúp giải nhiệt và thanh mát
Còn là nguồn dược liệu. Cây ngải cứu được ví như một vị thuốc chữa được rất nhiều
bệnh như: trị mụn, trị mẩn ngứa,trị cảm cúm ,ho,đau họng,đau xương khớp,giảm đau đầu

và cầm máu tốt do trong ngải cứu có tính kháng viêm…Khơng những thế cịn dùng phổ biến
trong ngành châm cứu có tác dụng lưu thơng mạch máu, khơi phục sức khỏe.
Có tác dụng rất tốt đối với phụ nữa mang thai : giúp an thai, trị các bệnh đau bụng ra
máu.Ngoài ra khi uống ngải cứu với nước ấm giúp điều hịa kinh nguyệt,khơng gây đau
bung hay mệt mỏi.


3
Trong thành phần ngải cứu có chứa viamin B6 và vitamin C glucose, absinthine,
tannin, axit malic, azulene và cadinene vì vậy giúp tăng cường đề kháng ,giảm đau hạ sốt
…
4.2. Dược tính của ngải cứu [1] [2]
Ngải cứu cịn được biết đến là một loại thuốc thảo dược rất tốt.Đặc biệt là bộ phận lá
cây được sử dụng với nhiều dược tính quan trọng:Giusp giảm thiếu máu, phịng chống bệnh
dạ dày ,chống giun sán chống co thoắt phế quản,hỗ trợ miễn dịch và cân bằng hocmon.
Ngoài ra, nghiên cứu gần đây cho thấy ngải cứu có khả năng giúp điều trị bệnh trĩ và viêm
âm đạo.
Trên thế giới, một nghiên cứu đã phân lập được trong lá ngải cứu hơn hai mươi
flavonoid, nhiều nhất là Jaceosidine, Leuteolin, Quercetin và Eupafoline, Kaempferol. Các
chất này là những flavonoid có hoạt tính mạnh, có tác dụng chống viêm, làm giảm sự tăng
sinh các tế bào gây hại. Chúng có tác dụng điều trị ung thư tiazofurin trên các tế bào ung
thư biểu mô buồng trứng của người và trị ung thư carboxytriazol trên tếbào ung thư biểu mơ
vú.
Mặc khác trong ngải cứu có thành phần tinh dầu (chủ yếu là monoterpenoid) giúp xua
đuổi cơn trùng và khử khuẩn rất tốt. Tuy nhiên, vì tinh dầu chứa hàm lượng thuyone đáng
kể, nên dùng quá liều có thể dẫn tới ngộ độc cấp, gây nên tình trạng ảo giác, hoang tưởng…
Tóm lại ngải cứu có cơng dụng đa năng , có giá trị rất hữu ích cho nền y học cổ truyền
và y học hiện đại.
4.3. Một số chế phẩm có chiết xuất từ ngải cứu

Hình 1. 4: Mặt nạ làm từ cây ngải cứu


4

Hình 1. 5: Dược phẩm hỗ trợ bổ huyết,điều kinh và nhang làm từ ngải cứu.
4.4. Một số món ăn được chế biến từ lá ngải cứu

Hình 1. 6: Gà hầm ngải cứu

Hình 1. 7: Nước nấu ngải cứu

Hình 1. 8: Cá hấp ngải cứu


5

Hình 1. 9: Cháo gà ác hầm ngải cứu
5. Về thành phần hóa học và thành phần dinh dưỡng
5.1. Về thành phần hóa học [1], [2]
Theo một số nghiên cứu về thành phần hóa học đã được cơng bố trong cây ngải cứu,
có thành phần chủ yếu là flavonoid (loại trihydroxyflavone và tetra hydroxyflavone, dẫn xu
ất coumarine....) và tinh dầu với hàm lượng từ 0,20 –0,34%(trong đó chiếm đến 90% là 1,8–
cineole, thujonevà germacrene D (41,46%), -caryophyllene (11,94%) là 2 chất này có thể
đảm bảo mùi đặc trưng của tinh dầu trong một thời gian dài hơn). [1]
Dịch chiết từ thân và rễ ngải cứu chứa lactone sesquiterpen như artevulgarin và
dehydromatricarin,… trong đó artevulgarin là một chất mới chưa được tìm thấy trong tự
nhiên.
Ngồi ra trong ngải cứu cịn có hợp chất của indole, xeton, matricaria este
dehydro, tetradecatrilin, tricosanol, arachyl alcol, chất màu, vulgarin, profilin, các acid

amin như adenin, cholin,....

Hình 1. 10: Cấu trúc phân tử hợp chất flavonoid

Hình 1. 11: Hợp chất của cumarine


6

Hình 1. 12: Một số hợp chất trong tinh dầu cây ngải cứu [1]
5.2. Về thành phần dinh dưỡng trong cây ngải cứu
Trong 100 g lá ngải cứu tươi thì có thành phần dinh dưỡng như sau:
Thành phần

Hàm lượng (g)

Calories

50-60

Protein

5

Chất béo

0

Carbohydrates

8

Chất xơ

3.5

Vitamin B6 và C

0.028

Bảng 1. 1: Thành phần dinh dưỡng trong ngải cứu
II. Tổng quan về viêm xương khớp
1. Định nghĩa viêm khớp
Bệnh viêm khớp – tên khoa học gọi là Arthritis [1], bao gồm các rối loạn có liên quan
đến cấu trúc và hoạt động của khớp. Các tế bào được kích hoạt sản sinh ra một lượng lớn
nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2) và các cytokine tiền viêm như IL-1β, IL-6,
TNF-α để giúp tiêu diệt hoặc gây ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật xâm nhập hoặc mơ
ung thư trong suốt q trình gây viêm.
Vị trí tổn thương chủ yếu là sụn khớp-sụn là mơ bao bọc các đầu xương có vai trị làm
giảm ma sát và đảm bảo các đầu xương có thể dễ dàng trượt lên nhau khi vận động khớp.
Vì vậy khi bị viêm xương khớp làm các khớp khó chuyển động, biến dạng thậm chí các
xương lệch khỏi vị trí bình thường. Các khớp thường bị viêm đó là các khớp bàn tay, cột
sống, đầu gối, hông. Bệnh này thường xuất hiện ở lứa tuổi trung niên, đặc biệt từ 40 tuổi trở
lên. Tuy nhiên viêm xương khớp cũng có thể gặp ở người trẻ đặc biệt là sau các chấn thương
tại khớp.


7
1.1. Nguyên nhân gây bệnh:
Có rất nhiều nguyên nhân nhưng thường gặp nhất là viêm sụn và bào mòn sụn khớp,

thối hóa khớp, nhiễm khuẩn tại khớp, chấn thương khớp do
Ngồi ra cịn có các ngun nhân khác như do các rối loạn chuyển hóa (tăng acid uric
trong bệnh gút), do hệ thống miễn dịch gây tổn thương các thành phần trong khớp ( nguyên
nhân gấy ra bệnh viêm khớp dạng thấp) .
1.2. Triệu chứng bệnh Viêm khớp
Khi vận động mạnh hoặc kể cả khơng vận động thì khớp vẫn sưng tấy gây cứng khớp
và đau khớp dẫn đến việc khó khăn trong di chuyển, đi lại.
Thỉnh thoảng sẽ nghe âm thanh lạo xạo khi cử động và gây đỏ ở vùng da tại khớp.
Các triệu chứng ngồi khớp có thể như: sốt, phát ban hoặc ngứa, khó thở, gầy sút
cân…
1.3. Đối tượng nguy cơ bệnh Viêm khớp
Viêm khớp có thể xảy ra ở hầu hết mọi lứa tuổi kể cả trẻ em nhưng tỷ lệ mắc các bệnh
viêm khớp cao ở độ tuổi trung niên do ảnh hưởng của các rối loạn chuyển hóa và tích tụ các
chấn thương kéo dài. Phụ nữ có tỷ lệ măc cao hơn là nam giới.
Do tính chất cơng việc lao động nặng, tư thế ngồi lâu hoặc sai gây chấn thương tại
khớp ,viêm khớp cấp tính và về lâu gây mãn tính.
Người béo phì ,thừa cân cũng gây ra bệnh viêm khớp vì bị sức ép tác động lên sụn
khớp.
Bị ảnh hưởng bởi các rối loạn trao đổi chất lên quá trình ni dưỡng các thành phần
bình thường và bất thường xuất hiện trong khớp.
Các bệnh hệ thống miễn dịch và một số rối loạn di truyền cũng có thể tăng nguy cơ
bệnh khớp.
 Tìm hiểu sâu hơn và kỹ hơn về loại bệnh này thì có hai loại viêm khớp phổ biến nhất
hiện nay là: thối hóa khớp (Osteoarthritis - OA) và viêm khớp dạng thấp (Rheumatoid
arthritis - RA). Nguyên nhân chính gây tàn phế trong 10 loại bệnh gây tàn phế phổ biến
và chiếm tỷ lệ cao là bênh VKDT.
2. Viêm khớp dạng thấp
VKDT là một bệnh tự miễn do sự hình thành các phức hợp miễn dịch tại màng hoạt
dịch khớp gây viêm tại khớp với sự hoạt hóa hàng loạt tế bào gây tăng sinh màng hoạt dịch
khớp, hoạt hóa hủy cốt bào, gây phá hủy sụn khớp, đầu xương dưới sụn, dẫn đến xơ hố,

dính và biến dạng khớp.
Theo thống kê ở Việt Nam chúng ta, tỉ lệ mắc VKDT chiếm khoảng 0,5 % dân số
trong đó nữ giới trên 40 tuổi chiếm 70 – 80% . [1] [2]


8

Hình 1. 13: So sánh khớp thường và VKDT

Hình 1. 14: Cơ chế bệnh sinh của VKDT
2.1. Điều trị
VKDT [1]rất khó để điều trị dứt điểm. Bệnh nhân phải kiên trì và có một sinh hoạt
lành mạnh thì mới mau khỏi. Hiện nay có hai phương pháp điều trị :