Tìm hiểu về sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

TÌM HIỂU VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1. Khái niệm – Phân loại:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) là một kỹ
thuật tách hỗn hợp thành các thành phần riêng biệt dựa trên sự tương tác giữa chất
phân tích với pha động và pha tĩnh.
Phân loại:
Dựa trên cơ chế tách của pha tĩnh, ta có:
- HPLC thuận (NP-HPLC)
- HPLC pha đảo (RP-HPLC)
- HPLC rây phân tử
- HPLC trao đổi ion
2. Cấu tạo:
1. Bình dung mơi (pha động)
Chứa dung mơi dùng để mang chất phân tích đi qua cột sắc ký. Với sắc ký pha
thuận thì pha động là chất không phân cực và ngược lại với pha đảo thì pha động là
chất phân cực.
2. Bơm pha động (bơm cao áp)
Đây là bộ phận đẩy pha động từ bình chứa dung mơi qua cột sắc ký bằng áp suất
cao (250-500 at), đây cũng là nơi điều chỉnh tốc độ dòng của pha tĩnh.
3. Bộ phận hòa trộn dung mơi
Dùng để hịa trộn dung mơi với những tỷ lệ khác nhau.
3. Bộ tiêm mẫu
Có 2 cách để đưa mẫu vào máy:
- Dùng xilanh tiêm mẫu phân tích trực tiếp vào van tiêm để pha động mang mẫu
đến pha tĩnh.
- Bộ đưa mẫu tự động (Autosampler) có thể chứa nhiều mẫu và tiêm lần lượt các
mẫu vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn.
4. Tiền cột
Là một cột ngắn đặt giữa bộ phận tiêm mẫu và đầu vào cột phân tích chính, nhiệm
vụ là hấp phụ và giữ lại tạp/ các tiểu phân nhỏ có trong mẫu phân tích, pha động có
thể gây hư hại cột chính. Tiền cột được nhồi pha tĩnh như cột chính nhưng kích

thước lớn hơn một ít.
5. Cột sắc ký (pha tĩnh)


Thông thường cột sẽ được làm bằng thép không gỉ, dài từ 50-300mm và cso đường
kính trong từ 2 – 5 mm.
Một số loại cột được sử dụng phổ biến hiện nay:
ST Tên cột
Pha tĩnh
Cơng dụng
T
1
Cột
sắc Những chất có khả năng hấp phụ Phân tích những hợp
ký
hấp (SiO2, Al2O3,…)
chất hữu cơ tan trong
phụ
dung mơi, ít tan trong
nước.
2
Cột
sắc Pha thường: Silica xốp chưa qua xử Tách và phân tích
ký phân lý hóa học
những hợp chất có độ
bố
phân cực cao, phân tử
lượng khơng q lớn
Pha đảo: khơng phân cực hoặc ít Phân tích những hợp từ
phân cực (C8, C18,…)

chất ít phân cực đến
phân cực trung bình
3
Cột
sắc Vật liệu trơ có khả năng trao đổi Phân tách các ion
ký ion
ion (cellulose, sephadex, molselect,
…)
4
Cột
sắc Các hạt silica hoặc polysaccharide, Phân tách các phân tử
ký
rây … với các kích thước mắt lưới sinh học
phân tử
khác nhau.
6. Đầu dị (detector)
Có nhiệm vụ phát hiện các chất khi các chất phân tích được rửa giải từ cột sắc ký.
7. Thiết bị nhận dữ liệu
Nhận và biểu diễn dữ liệu dưới dạng các phổ đồ phục vụ cho việc phân tích định
tính hoặc định lượng.
4. Nguyên tắc hoạt động của HPLC
HPLC là một phương pháp sử dụng kỹ thuật chia tách trong đó pha động là chất
lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân
hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến
bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Các thành phần của hỗn hợp
được tách ra khỏi nhau do mức độ tương tác khác nhau của chúng với các hạt hấp
thụ. Chất có ái lực ít với pha tĩnh thì có xu hướng ra khỏi cột trước và ngược lại.
5. Các loại detector

1. Detector UV-Vis
Là đầu dò phổ biến rộng rãi nhất trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
dùng để phát hiện các hợp chất và phân tử. Nó đo độ hấp thụ của các hợp chất
trong dải cực tím ( 190-360nm) hoặc dải nhìn thấy (360-800nm)
Nguyên tắc đo: Dựa trên định luật Lambert-Beer

 Ưu điểm: Sử dụng đơn giản, ứng dụng rộng rãi và tiết kiệm chi phí
 Nhược điểm: Chất phân tích phải chứa mang màu
2. Detector FD
Là đầu dò nhạy cảm nhất trong số các detector hiện đại hiện có trong HPLC
nhạy hơn UV-Vis 10-1000 lần. Có thể phát hiện sự hiện diện của một phân tử
chất phân tích duy nhất trong flow-cell.
 Ưu điểm: Độ nhạy và độ chọn lọc cao
 Nhược điểm: Chất phân tích phải chứa fluorophore hoặc được tạo dẫn xuất
hoặc được dán nhãn huỳnh quang
3. Detector tán xạ bay hơi ( ELSD)
Là detector thích hợp cho việc phát hiện các thành phần mẫu không bay hơi trong
một dung môi dễ bay hơi. ELSD sử dụng ánh sáng phản xạ và tán xạ và một biến
quang có độ nhạy cao để đo nồng độ chất phân tich.


Ưu điểm: dễ sử dụng, độ nhạy cao, độ ổn định đường nền tốt khi chạy gradient.
Nhược điểm: chi phí cao
4. Ứng dụng của HPLC
a) Định tính:
Dựa trên thời gian lưu của mẫu phân tích và thời gian lưu của mẫu chuẩn. Bằng
cách so sánh thời gian lưu của mỗi pic tR với thời gian lưu của chất chuẩn đối
chiếu được tiêm vào trong cùng một pha động và pha tĩnh, máy sắc ký có thể xác
định được từng hợp chất.
b) Định lượng:

- Phương pháp nội chuẩn: Thêm một lượng cố định chất nội chuẩn vào mẫu, dựng
đường chuẩn. Từ dữ kiện diện tích hoặc chiều cao peak và nồng độ của chuẩn,
chuẩn nội và mẫu có thể định lượng chính xác mẫu thử.
- Phương pháp ngoại chuẩn: Cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được sắc ký trong cùng
điều kiện. So sánh diện tích hoặc chiều cao của pic của mẫu và chuẩn sẽ tính được
nồng độ các chất trong mẫu thử.
Xác định hàm lượng vitamin C trong mẫu ớt bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
- Điều kiện phân tích
 Cột sắc ký: cột pha đảo C18
 Pha động: hỗn hợp ( methanol:acid phosphoric pH 3/5:95)
 Tốc độ dịng: 0.7 ml/phút
 Bước sóng cài đặt cho đầu dị: 254nm


- Đảm bảo chất lượng
 Đường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quang hồi quy tuyến
tính R phải lớn hơn hoặc bằng 99.

Cách tính kết quả:
Trong đó:
C: Hàm lượng vitamin C có trong mẫu (mg/Kg)
C0: Hàm lượng vitamin C có trong dịch chiết thơng qua đường chuẩn
f: Hệ số pha lỗng (nếu có)
m: Khối lượng mẫu thử (g)