Bài thuyết trình môn kỹ thuật gen

Bài thuyết trình kỹ thuật gen:
Cắt nối chọn lọc tiền mRNA của gen
sterol 27-hydroxylase (CYP 27) gây ra bởi
đột biến G thành A ở nucleotide cuối cùng
của exon 6 trong bệnh nhân mắc bệnh
cerebrotendinous xanthomatosis (CTX).
Nhóm 6 _ Lớp 10-03
Viện Đại học Mở Hà Nội
Khoa Công Nghệ Sinh Học
Tìm hiểu về bệnh cerebrotendinous
xanthomatosis (CTX)
    
         !
"  #$ % & ! ' ( ) *
+ ,- ./ 0 & !  12 '
3456)*&70$%.8$7($4)
* 9:;14;'+
7<37=>?&@6
5+
7<37=4707'7'?
AB(CD542
"1=2
E
5%7.F%G;.;+
Các biểu hiện khác của CTX bao gồm tiêu chảy mãn tính ở trẻ
sơ sinh, làm đục ống kính của mắt (đục thủy tinh thể), phát triển
chậm ở trẻ nhỏ, xương dần dần giòn dễ gãy, có các vấn đề về thần
kinh ở tuổi trưởng thành, chẳng hạn như mất trí nhớ, co giật, ảo
giác, trầm cảm, và khó khăn với các phản ứng phối hợp (mất điều
hòa) và nói.
Các triệu chứng thần kinh gây ra bởi sự tích tụ các chất béo và

ngày càng tăng số lượng của xanthoma trong não. Xanthoma cũng
có thể tích tụ trong dây thần kinh (myelin), làm gián đoạn các tín
hiệu thần kinh trong não. Thoái hóa (teo cơ) của mô não gây ra bởi
dư thừa tiền lipid cũng góp phần tăng các vấn đề về thần kinh.
Xanthoma dây chằng (thường gặp nhất ở gân Achilles, gân kết
nối gót chân của bàn chân cơ bắp chân) bắt đầu hình thành ở đầu
tuổi trưởng thành. Xanthoma gân có thể gây khó chịu và can thiệp
tới sự linh hoạt gân.
CTX cũng tăng nguy cơ phát triển bệnh tim mạch, sớm xơ vữa động
mạch.
HD =   IJKL  " % % 
+MIJKLN)OKLB$O7(
D5PQ5?R?./
 ; '+ SO  ! 7D 3% A  7.F T
9  Q4 ? " ( ) *+HD =   KLB
  N 1N U A  < 7' 34 56
+V=QN$3%T$.;>.
 9=@1$5+
WR12U4$.(U:4
2141X3;'+Y> 95
$ %$ 5 4 2 14 %  4 )  5  R A
+
Z;[\7D=%77.F470:IJKL+Z@=
-7D=7]DA3
4OKLB+HD=3]=)7]^
:50 _`K3+"R$G?
'57D==M^:50 _`K+
Gen sterol 27-hydroxylase (CYP27)
Tóm tắt nghiên cứu
," R 4 70 7.F a 7D = M  ^  !

 & b A  ` A    KLB
IJ KL   % X  
c7=>X&d,^A+
4 7D = ! 50   Be M A 7@ & [f .; R 5g
&bAD.;7&=5<"N
.:A-7D=7=Q4?X&d,^ 7.F
Q%7'h7=+445 97@"A>
=M^!&bA`"IJKL
c7=X&Ad,^$i_!jkQ
 `$1 !D5b(. l !7@&[f5 &
 4d,^7D=M^+,"R
7 =  3%   4N3m3"  A7D=
;'51n70>)./QG?X
&d,^+
43.;
343$1o<A
"R
H1o<7.Fb7'3%457'
!47!3%T354";
: 1  .gp1& .F$ 7   5 ) ? A
G+
 " R $./  T 9  A
 5 3 7' 3%   4 1= QN  
+
Kỹ thuật điện di
I. Kỹ thuật lai Northern blot
J%   d,^ 2 5Q  A" R 5
3%T$5?((')325>'A
 ; '&+ J.;343 7.F T9a 34

 1  .g 5 ? > ) 70 A 3% T d,^7# .
DqF3d,^3*3./"1=4R7D'
 d,^ 5g 4   ) ? 4 5  h A ; ' &+
a4d,^a4cPr,^d,^!"43%T
d,^Br,^d,^Bd,^+
J.;RXi83% Y>";
:1NU]A4F7;7'!4
3%T+
Các bước thực tế

_\s^d,]&7.F4=8=Ae./1k
! 5e  %  7( 7.F = 0 : 7  e+`t
u"+

'cD(7 .;+

Y13O(i7D7YrY:[\v
Kw$g37.F!:[\vwx5g4r,^
UP!1*3ABKL#yBU
P$ 74 ) a BeeBzJ: 3.; 343 i
c"+

  J4  7.F >  5g & T 34   8
W+

J% 70.F7.F>a4?./
(4 7'3% %yBA^d,T9
3@,{Z{$e+`e+
Kết quả

Khi đột biến xảy ra tại
nucleotide cuối cùng của
exon 6, hiệu quả của nó trên
phiên mã mRNA được phân
tích trong in vivo. Phân tích
Northern blot RNA của bệnh
nhân cho thấy một vạch
rộng hơn so với mẫu bình
thường (2.2 kb), chỉ ra rằng
có thể tồn tại loại nối mRNA
khác ở bệnh nhân. Không
giảm rõ ràng hiệu quả phiên
mã, ở bệnh nhân (0,90) so
với mẫu bình thường (0,97)
được xác định bằng cách
phân tích định lượng của
các tín hiệu.
II. Kỹ thuật PCR đảo ngược
RT-PCR (inverse PCR)
JN R dBJd  3N R 1= 7! D 7!
12 c d,^  " h A Jd+ r  >
"D&5(d,^"&1=
7!D7!A(?./3Nb1o<
dBJd
MiK7!j
−
JN R = 7] d,^    F r,^ R )
3N / 7= D O 3"  .F 5
3  5<  7!  7.F   3" 
.Fd+Y7(Q4?]F3Fr,^R!/

DO14r,^3{+
−
V7(r,^F72812cd,^?3NR=3
|1=7!/1o<Jd7.F>5g
R7D3bF3:q1}$7'%7!r,^$
!"&.FNr,^@=+
Kỹ thuật chung
Quá trình khuếch đại cDNA mạch
kép của gen sterol 27-hydroxylase
•
esd,^]&7.F3".Fr,^K\sq
F3 3N R ( R [  WK$ e  Jd 7 {{$ e  A q
,J$ez)R=d,$es5[z3"
.F+
•
 ~ 3N R 7.FA :wKv `\ 3G *3 51* $ 
:•[v[3G)!3".F5= d,^B
r,^$7(%:[v[3GD?+
•
V=7!Jd7.F>3NRda4
"x\sJdWW(Re$K[WK$eJd7{{$
\$K[s$7!i![f€•3jK\Bw\$
[f^MMMMMMMMM_f57!i!_f€•
e`_•Be`ex$[f^M^^MMMM^M^^M_f$ee+ws
rWY‚5K+[zQr,^3+
•
JNR1=7!7.F>_\1}.g47
17%je+[3G:•\v= $_\%:`xvXi$
5K3GUw%q1}1==3!LKv1*+
•

H7.F>"DKt+J% 70.F
7.F>a4Q*$<7DA45!77.F3%
 T93@,{Z{$e+`e+yB7.F1=7!.
D71'53% 70.F+
Kết quả
Trong sản phẩm RT-PCR
của bệnh nhân, tìm thấy hai
mạch nhỏ hơn ngoài đoạn
có kích thước bình thường
so với mẫu bình thường. Tỷ
lệ của ba loại là 1 : 0,84 :
0,16 (kích thước bình
thường: kích thước ở giữa:
kích thước nhỏ nhất) bằng
cách phân tích định lượng.
Số lượng kích thước
bình thường ở bệnh nhân
chiếm 54,1% RNA so với
RNA của người khỏa mạnh
được xác định bằng cách
phân tích định lượng.
III. Phân tích trình tự gen
Phân tích trình tự gen là kỹ thuật xác định trình tự theo cấu
trúc bậc một của chuỗi các nucleotide trong một phân tử
nucleic acid, xác đinh vị trí, sắp xếp các nucleotide trong phân
tử DNA. Trong những năm gần đây, một số phương pháp xác
định trình tự mới nhờ sự hỗ trợ của máy tính_ Giải trình tự
gen trên máy tự động.
Các bước thực tế
?>3% r,^7.F>a4T9^{Jd{YWƒ_e\

M^O+
•
YN 3m Jd#  3 7.F 74)a Q1= G ? >
3NRD?$.g-71j•`ve\
%$[\v[%$5`\vw3G]DK[1}+
•
Y1!k4F3)%&1=G.8T9DBY3
Y3$ 4 N 3m 7.F 74 ) 3N 7.F ) 12$ ; T  K[ s
3NRY333$57=•KvK3G=
 +
•
Y7($4c77.F!35D^{Jd{YWƒ_e\M^O
7'3% ?>T94&T}Q+)N4c7.F
X3=3?>:NK7@7'4<47D=77.F470+
H!iT9?>j
„€•3jK\…w\$[f^MMMMMMMMM_f
„J_[L_xK…w\K$[fM^MMM^^^M^^M^MM_f
„J_[•jL_L…L[x$[fM^M^^MMM_f
„J_LKjee[•…eexe$[fM^^MMM^^_f
„€•je`_•…e`ex$[f^M^^MMMM^M^^M_f
† '  3 5+ Phân tử DNA mạch
kép có mang các tín hiệu cần thiết (promoter, terminator và vùng
liên kết ribosome) cho sự biểu hiện của một khung đọc mở (gen)
sẽ được nhân dòng và sản xuất protein tương ứng trong tế bào
vật chủ. Là vector có thể mang các gen ngoại lai mong muốn cho
phép thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và
sự dịch mã các mRNA của chúng trong tế bào vật chủ. Để biểu
hiện các gen ngoại lai trong tế bào bắt đầu bằng việc gắn nó vào
trong vector biểu hiện (thường là plasmid).

IV. Xây dựng vecter biểu hiện gen
H'Q41'&14%:>7D=M^
:  & b A  `$   ) !$ ( 5
12(7D=$77.F!57.F'!354=
‚Y+
?>8[•AIJKL8%
5D7&.F1k!7.F1=7!a4T9
iYJ3[fM^^M^^MM^MM^^_fjx•eB•ee
5 YJ [f^M^MM^MM^^ _f j e[•`B
e`eL+
JNR1=7!Jd7.F>_\1}
71je3G:•[v= 5w3G:`xvXi
51*+J@7@[f7!iY33RDX7@
^M550 .;7&B_A^MDM7.F7NN0
QN+J@&_f7!iYJR1=GM^+
Y14<1=7!27!Keee3a
7   $ ‡ > =3 5 5 '  
3^dMSƒ7((RW†7@15>p
3$D1N'R7D‡$54 
 Y†w\ 3 : &+ J A 4 ) G
 a ˆSY^d 3 V+ Z  ( ) G
.;>$!87D=MB^:&bA`$
(4<:3% ?>+
V. Gây đột biến điểm định hướng
(site-directed mutagenesis)
M% 7D = 7' 70 .g B 
Q4?!D=7]470"r,^a4
T9D]F33(D=7]
?>+
Để phân tích biểu hiện đột biến của cDNA chuỗi kép mang đột biến

G thành A được tái tạo trong một cDNA thể mã hóa sterol 27-
hydroxylase người. Đột biến định hướng của cDNA được thực hiện
bằng cách sử dụng pKF18k vector và kit của Takara. Sau đó, cDNA
bình thường và cDNA đột biến của sterol 27 hydroxylase được chèn
vào vecter biểu hiện gen pTARGET ™ bởi vùng Eco RI. Các trình tự
nucleotide của cDNA bình thường và đột biến cDNA được xác nhận bởi
phân tích trình tự. Plasmid cho chuyển nhiễm đã được chuẩn bị bằng
cách sử dụng JETSTAR plasmid Kit.
VI. Kỹ thuật chuyển nhiễm
'‰ là quá trình cố tình chuyển các axit nucleic
vào các tế bào. Thuật ngữ này được sử dụng đặc biệt là cho
các phương pháp không virus trong tế bào nhân chuẩn. Vật
chất di truyền (như DNA plasmid supercoiled hay siRNA xây
dựng), hoặc thậm chí protein như các kháng thể, có thể được
chuyển nhiễm. Chuyển nhiễm của tế bào động vật thường liên
quan đến việc mở các "lỗ hổng" trong màng tế bào , cho phép
sự hấp thu của vật liệu. Chuyển nhiễm có thể dẫn đến hình thái
bất ngờ và bất thường trong các tế bào mục tiêu.
‚YBe=7.F8,%=ˆd77.F
?rWSW(Re\t="57.FT9
7''‰+
K\s 3 A 4 ) G  ? ./ 5
7D=5D57&R77.F'!3
 @ 5 e  e\Š` =  ‚Y a 3.; 343 D A
33+
wx1'‰$d,^]&77.F=):
 B3 u 5 7.F T 9  dBJd
3% 4<41'&+H7.F>"D
[t+
H' 4 70  QN A 7D = M  ^  KLB

 ! 7D$ K\ s 3  r,^ ? ./
# r,^ 7D = .; > 7.F ' !3  @ 5 e 
e\Š`=+
Ywx$4=77.F!'54'
02<3'3@k7.FT91NKLB
+
Các bước thực tế
Phân tích trình tự xác nhận vạch ở 726
bp quan sát trong minigen bình thường
tương ứng với loại RNA có cách cắt nối
chính xác. Mặt khác, vạch đậm được
quan sát thấy trong các minigen đột biến
thiếu exon 5 và exon 6, và một vạch mờ
là minigen thiếu exon 6, vạch mờ còn lại
mất 1 đoạn 88 bp (tính ngược từ đầu 3’
của exon) và sử dụng một mối nối chưa
rõ nào đó ở đầu 5’. (Hình A)
Xác định các mạch cDNA bất thường
được tạo ra bởi cắt nối chọn lọc tiền
mRNA do đột biến, minigen cấu trúc
gồm trình tự gen từ exon 5 đến exon 9
của gen CYP27, có hoặc không có đột
biến, được chuyển nạp vào các tế bào
COS. RT-PCR phân tích của RNA tổng số
được chiết xuất từ các tế bào chuyển
nạp sử dụng mồi SPup và SPd, cho thấy
một vạch duy nhất ở 726 bp ở minigen
bình thường. Trong khi ở minigen đột
biến, có 1 vạch đậm ở 412 bp và 2 vạch
mở 560 và 638 bp. (Hình B)