Báo cáo thực tập kỹ thuật gen

Nhóm: 2 – Ca 2
Họ và tên: Lê Hồng Trung Hiếu
MSSV: 19180252
BÁO CÁO THỰC TẬP KỸ THUẬT GEN

I. Tách chiết plasmid
1. Mục tiêu thí nghiệm
Mục tiêu của thí nghiệm là nhằm phân tách plasmidp Bluescript (+) từ tế
bào E.Coli DH5α và tinh sạch plasmid. Chuẩn bị cho q trình dịng hố.
2. Ngun tắc
Sử dụng chất tẩy rửa có tính kiềm hóa như SDS – NaOH để phá màng tế
bào, giải phóng DNA tổng số. Trong điều kiện mơi trường kiềm, DNA bị phân
cắt liên kết hydro giữa các nucletotide dẫn đến bị biến tính. Sau đó, kali axetat
(KOAc) được bổ sung làm giảm độ kiềm của hỗn hợp và liên kết hydro của các
DNA có thể được thiết lập lại. DNA plasmid ở dạng siêu xoắn dễ dàng hồi tính
trở về hình dạng ban đầu, DNA genome kích thước lớn sẽ bị tủa. Trong khi các
DNA plasmid có thể hịa tan dễ dàng trong dung dịch, DNA genome và các
protein biến tính sẽ bị kết tủa và được giữ lại trong phức hợp SDS-Kali. Kết tủa
có thể tách ra khỏi dung dịch DNA plasmid bằng cách ly tâm.
Các hạt resin silica (SiOH) trong cột tinh sạch tạo liên kết hydro với các
gốc PO43- của DNA trong nồng độ muối cao Guanidium HCl giúp DNA bám
chặt vào cột. Các tạp như protein, muối, RNA sẽ được rửa giải trước bằng dung
dịch rửa giải và DNA còn lại trong cột sẽ được ly giải bởi H2O sau để thu nhận.
3. Quy trình
B1: Ly tâm thu nhận sinh khối.
B2: Cho các dung dịch phá màng tế bào và tạo tủa để tách DNA.
B3: Cho qua cột tinh chế, rửa giải và ly giải để thu nhận DNA plasmid.
B4: Định tính plasmid bằng chạy điện di và định lượng bằng đo mật độ quang.
Sau đó phân tích kết quả
4. Kết quả - biện luận
- Khi cho dung dịch I vào và vortex dung dịch sẽ đục dần do sinh khối hồ

tan vào mơi trường.


- Khi cho dung dịch II vào thấy dung dịch trong dần và nhớt do SDS đã phá
tế bào và NaOH làm biến tính các DNA.
- Dung dịch III cho vào thấy kết tủa trắng do KOAc đã hồi tính DNA khiến
các DNA genome dính vào nhau tạo kết tủa.
Kết quả đo mật độ quang
A260/280

A260/230

Nồng độ( ng/μl)

2,1>2

1,9 ∈ [1,8 ; 2,2]

256,0

- Kết quả định lượng A260/280=2,108 >2 cho thấy có khả năng nhiễm
RNA. RNA nhiễm này có thể là từ bước thêm dung dịch II, III và
dùng dung dịch rửa cột.
- A260/230 nằm trong khoảng tin cậy sạch  các hóa tất tan trong H2O ở
q trình ly giải được lọc sạch.
Kết quả định tính:
Thang chuẩn

Nhóm 2

- Kết quả định tính cho thấy có plasmid pBluesript(+). So sánh 2 vạch trên
bảng điện di với thang chuẩn thì đó là 2 cấu hình plasmid. Vạch xa nhất có
thể là plasmid siêu xoắn và gần nhất là plasmid dạng thẳng hoặc dạng
nicked. Do các gel aragose sẽ giữ lại các phân tử có kích thước lớn nên
plasmid dạng vịng hoặc dạng nick kích thước cồng kềnh nên đi chậm và
gần, dạng siêu xoắn có kích thước nhỏ gọn nên đi nhanh và xa hơn.


- Có vệt mờ ở sau 2 vạch nên có khả năng nhiễm RNA với lượng nhỏ.
5. Kết luận – kiến nghị
Kết luận:
- Plasmid đã được tách chiết và tinh sạch tốt. Tuy nhiên còn nhiễm
lượng nhỏ RNA.
- Cần kiểm tra thêm bằng giải trình tự để khẳng định.
Kiến nghị:
- Dùng RNase để loại bỏ bớt RNA.
- Làm lại bước tinh sạch DNA plasmid: dùng phenol, chloroform để thu được
hỗn hợp: DNA plasmid, phần tan H2O và thu riêng plasmid bằng phương pháp
tủa ethanol lạnh.

II. Cắt plasmid
1. Mục tiêu thí nghiệm
Mở vòng plasmid để chuẩn bị cho phản ứng nối và tạo dòng gen ở các
bước sau.
2. Nguyên tắc
Dùng enzyme cắt giới hạn BamHI để cắt mở vòng tại vùng MCS chứa vị
trí cắt enzyme BamHI có trên plasmid pBluescript.
3. Quy trình
B1: Tính tốn các thể tích hố chất cần cho phản ứng cắt.
Thành phần

Thể tích lấy cuối cùng

dH2O

13 µl

Plasmid

4 µl

Buffer

2 µl

BamHI

1 µl

Tổng:

20µl

B2: Cho nước, buffer và enzyme BamHI vào mẫu plasmid đã được tinh
sạch.
B3: Chạy điện di sản phẩm cắt. Và phân tích kết quả
4. Kết quả - Biện luận


Kết quả: Ở cột điện di số 2 thấy một vạch đậm và một vạch mờ.

Nhóm 2

Đối chứng p

Biện luận: So với đối chứng p (plasmid chưa cắt) thì cột 2 cũng có vạch đậm và
một vạch mờ giống vậy, chứng tỏ plasmid đã khơng được cắt hồn tồn hoặc
khơng cắt được. Có thể là do lượng enzyme, thời gian ủ, điều kiện ủ không đủ
hoặc thao tác kỹ thuật hút sai, thiếu các hoá chất.
5. Kết luận – kiến nghị:
Kết luận: Phản ứng cắt đã không được thực hiện tốt nên plasmid chỉ được cắt
một phần hoặc còn nguyên.
Kiến nghị: Cần tăng lượng enzyme BamHI, tăng thời gian ủ, giảm nồng độ
plasmid.

III. Biến nạp plasmid
1. Mục tiêu thí nghiệm
Mục tiêu của thí nghiệm là đưa plasmid đã được nối gen mục tiêu vào
trong tế bào E. coli.
2. Nguyên tắc
Tế bào E. coli được xử lý với CaCl2: Ca2+ mang điện tích dương hình
thành liên kết ion với PO43- trên plasmid và lớp phospholipid của màng tế bào.
Giúp đưa plasmid lại gần màng tế bào hơn. Sau đó tế bào sẽ được sốc nhiệt để
màng mở ra ngẫu nhiên, lúc này plasmid sẽ chui vào bên trong tế bào.


3. Quy trình
B1: Chuẩn bị 1 eppendorf chứa tế bào khả nạp và sản phẩm nối (+), 1
eppendorf ống chỉ chứa tế bào khả nạp (-).
B2: Làm lạnh để plasmid tiếp cận gần màng tế bào và sốc nhiệt ở 45 oC
trong 90 giây.

B3: Thêm môi trường LB vào 2 eppendorf và lắc trong 30 phút để tế bào
tăng sinh và tiếp nhận plasmid. Hút bớt 1ml môi trường LB.
B4: Trải dung dịch trong eppendorf (+) và (-) 2 đĩa mơi trường LB có
ampicillin-Xgal-IPTG ủ ở 37oC trong 24-40 giờ.
4. Kết quả - biện luận
Kết quả:
- Ở môi trường chỉ chứa tế bào khả nạp (-) xuất hiện nhiều hơn 30 khuẩn
lạc trắng.
- Ở môi trường chứa hỗn hợp tế bào khả nạp và sản phẩm nối (+) xuất
nhiều hơn 30 khuẩn lạc trắng và xanh.


Khuẩn lạc xanh

Khuẩn lạc trắng

Biện luận:
- Ở đĩa môi trường (-) xuất hiện nhiều khuẩn lạc trắng chứng tỏ đã nhiễm
các vi khuẩn mang gen kháng ampicillin, có thể là từ môi trường hoặc
nhiễm chéo giữa các mẫu khi thao tác kỹ thuật. Lúc hút mẫu trong
eppendorf (+) và có thể quên thay đầu hút khi hút mẫu trong eppendorf
(-) hoặc khi trải đĩa (+) mà khử trùng không sạch que trải lại tiếp tục trải
trên đĩa (-).
- Ở đĩa môi trường (+) xuất hiện cả khuẩn lạc trắng và xanh nên có thể đã
biến nạp thành cơng plasmid mang gen mục tiêu vào tế bào.
- Khuẩn lạc xanh là do gen mục tiêu không gắn chèn vào gene lacZ, vi
khuẩn tạo được enzyme β-galactosidase hoàn chỉnh và phân giải Xgal
tạo màu xanh.
- Khuẩn lạc trắng xuất hiện do gene lacZ bị gen mục tiêu gắn chèn làm bất
Khuẩn lạc trắng

hoạt khơng tạo được enzyme β-galactosidase hồn chỉnh nên khơng
thể
phân huỷ Xgal. Hoặc do gene lacZ đã bị đột biến trong quá tình cắt


plasmid khiến enzyme β-Galactosidase không được tổng hợp, tạo nên
khuẩn lạc trắng, vì vậy cần PCR khuẩn lạc để kiểm tra thêm.
5. Kết luận – kiến nghị:
Kết luận:
Quá trình biến nạp plasmid được nối gen mục tiêu vào E. coli có thể
thành cơng. Cần kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc và giải trình tự để khẳng định
thêm.
Kiến nghị:
Nên thực hiện lại thao tác kỹ thuật (hút mẫu và trải đĩa) một cách cẩn
thận tránh để nhiễm từ môi trường hoặc nhiễm chéo giữa các mẫu với nhau.

IV.

Sàng lọc

1. Mục tiêu thí nghiệm
Kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu bằng cặp mồi đặc hiệu.
2. Nguyên tắc
Kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu bằng phản ứng PCR. Gen mục
tiêu được nhận diện và giới hạn kích thước bằng cặp mồi đặc hiệu. Sau đó được
khuếch đại bằng chu trình nhiệt, Taq polymerase và chạy điện di để phân tích
kết quả.
Trong chu kỳ nhiệt PCR gồm 3 giai đoạn: tăng nhiệt độ cao làm DNA bị
biến tính tách mạch đôi thành 2 mạch đơn, hạ nhiệt độ giúp đoạn mồi bắt cặp
đặc hiệu với trình tự nucloetide, tăng lên nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của

enzyme DNA polymerase kéo dài mạch. Quá trình này được lặp lại để thu đủ
lượng gene mục tiêu.
3. Quy trình
B1: Chuẩn bị hỗn hợp dung dịch cho 5 phản ứng PCR và chia vào 4
eppendorf.
Thành phần
dH2O

Thể tích 1 phản ứng
PCR (µl)

Thể tích 5 phản ứng
PCR (µl)

17,5

87,5

Buffer (5X): Đệm, Mg2+,
dNTPs

5

25

Mồi EPN-F

1

5

Mồi EPN-R
MyTaq
polymerase
Tổng

1

5

0,5

2,5

25

125

B2: Bổ sung khuôn DNA vào eppendorf chứng dương, chọn 2 khuẩn lạc
trắng từ đĩa (+) có khuẩn lạc mang có thể mang plasmid tái tổ hợp cho vào 2
eppendorf cịn lại, 1 eppendorf cuối cùng khơng bổ sung khuôn DNA.
B3: Thực hiện phản ứng PCR
B4: Điện di trên gel agarose và phân tích kết quả
4. Kết quả - biện luận
Kết quả
- Ở cột điệnNhóm
di 1,2,3
và 4 cho thấy chứng âm không xuất hiện vạch, chứng
2

dương
eppendorf 1 và 2 khơng có vạch
(-) có
(+)vạch,
KL1 KL2

Biện luận:


- Ở chứng âm và chứng dương có vạch chứng tỏ hố chất hoạt động hiệu
quả, q trình thiết lập PCR tốt.
- Ở cột KL1 và KL2 khơng có vạch có thể do các nguyên nhân sau:
+ Mẫu khuẩn lạc không chứa gen mục tiêu.
+ Lượng mẫu khuẩn lạc quá lớn làm ức chế quá trình PCR hoặc quá nhỏ PCR
không khuếch đại được.
+ Do khuẩn lạc trắng đem đi PCR có thể mang plasmid đã bị đột biến vùng gen
lacZ, gen mục tiêu không được gắn chèn vào plasmid.
5. Kết luận – kiến nghị:
Kết luận:
- Hoá chất đảm bảo và q trình PCR được thiết lập tốt.
- Khơng sàng lọc được dịng mang plasmid tái tổ hợp có gen mục tiêu.
Kiến nghị:
- Thực hiện lại quy trình nối gen mục tiêu vào plasmid và biến nạp plasmid
tái tổ hợp vào tế bào.
- Sử dụng khuẩn lạc khác với lượng vừa đủ và điện di lại.