Ôn tập thực tập sinh học phân tử

Bài 1: Một số thiết bị và thao tác cơ bản
Khối lượng (m): g,mg,ug,ng
Thể tích (V): L. mL, uL
Hoạt độ enzyme: U ( unit)
Nồng độ mol ( CM): M, mM, uM, nM, pM
Nồng độ % ( C%): % (W/v), % (v/v)


Một số công thức thông dụng:
- Venzyme=1/10 v tổng
- C% (w/v)= (m(g) *100)/v(mL) : khối lượng trên thể tích ( hóa chất
gốc là bột)
- C%(v/v)=(V(mL)*100)/V(mL) : Thể tích trên thể tích ( hóa chất
gốc ở dạng lỏng)
- C1V1=C2V2 ( pha hóa chất từ 1 dung dịch mẹ ( vế đầu) , xuống 1
dung dịch có nồng độ thấp hơn)-→ đổi đơn vị sao cho trái phải đều
đồng đơn vị
Vd: Trình bày cách pha 200ml sodium acetate 1% ( w/v)
C%= (m*100)/v -→ tìm m
+ Từ dd mẹ Tris 1M pha 1ml dd Tris 0.1M
C1V1=C2V2-→ 1V1=0.1*1
+ Trình bày cách pha 1ml ( V2) dd TE gồm Tris 10mM (C2), EDTA
1mM
Tris là 1M (C1), EDTA là 0.5 M (
1M=1000mM)(0.5M=500mM)
-→ C1V1=C2V2-→ 10*1/1000=0.01 ( Tris) ml
-→ C1V1=C2V2-→ 1/500= 0.002 ( EDTA) ml
Lưu ý: Thay vì pha dd mẹ riêng thì ta pha chung vs stock cao hơn,
đậm đặc hơn so với bản chất , X là số lần đậm đặc hơn bao nhiêu
lần so với dung dịch ban đầu cần dung, vd 10X sẽ đậm đặc hơn dd
mẹ ban đầu gấp 10 lần, 10mM thành 100mM, có 2 cách tiếp cận, 1

là pha dd mẹ riêng của từng thành phần, 2 là pha dd mẹ chung với
sự đậm đặc hơn dd con bao nhiêu lần.
1. Mơ tả các bộ phận chính của micropipette và cho biết chức năng của
từng bộ phận ( xem kĩ trong giáo trình và prelab)
2. Mơ tả các bước để lấy một thể tích hóa chất nhất định: ví dụ , mô tả
các bước thực hành để láy 500 ul nước ( xem kĩ trong giáo trình và
prelab)


3. Cho biết các bước để chuẩn bị 1 bảng gel agarose 1% ( W/v) cho
điện di: ( xem kĩ them trong giáo trình và prelab):
-Cho agarose vào TAE ( sử dụng TAE vì TAE là dung dịch đệm để hịa
tan agarose vì gel này để chạy điện di , để DNA di chuyển thì nó cần nằm
trong 1 cái dung dịch đệm để tạo ra 1 điện trường để lôi kéo DNA, thống
nhất trong 1 môi trường)
-Cho vào chai nuran, dung micropipet để lấy thể tích dung dịch cần dung,
khơng dung vạch định mức trên các bình định mức vì tính chính xác khơng
cao chỉ mang tính tương đối, pha gel khơng cần nồng độ chính xác, sai số
khơng ảnh hưởng nên khơng cần dung micropipet để đo chính xác.
-Đun nóng gel agarose, lắp khn và lược gel ( mục đích của lược là lược
có cái rang lược, sau khi rút ra thì tạo thành lỗ( giếng) tạo cái giếng để
DNA chạy điện di 1 cách ổn định và phân tách các DNA khác)
-Để nguội gel khoảng 50 tới 55*c ( sỡ dĩ phải làm nguội gel vì bước sau
cho ethidium bromine ( chất nhuộm DNA) dễ bị phân hủy bởi nhiệt)
Ethidium bromine là chất phát ra tín hiệu để phát hiện DNA, nhạy cảm
với nhiệt và ánh sáng., gắn với mạch đơi DNA

-Các cơng đoạn chính của q trình tách chiết nucleic acid, các điểm cần
lưu ý trong tách chiết RNA, so với DNA là? ( xem kĩ trong giáo trình và
prelab)

Cách sử dụng micropipet





Bài 2: Tách chiết Nucleic Acid
I.

Nguyên tắc: 3 gia đoạn chính
(1). Phá màng tế bào và màng nhân-→(2) loại protein( bổ sung
nhiều hoạt chất ức chế)-→(3) thu nhận nucleic acid ( enzyme
phân hủy).
- Mục tiêu chính là tách gDNA ( DNA nhân) và tách RNA tổng
số

-Cofactor ( ion 2+ gồm Mg2+ và Ca2+) gắn vào enzyme thì khi đó
enzyme mới có hoạt tính.
-DNA được bảo vệ bởi EDTA

Những chất và tác dụng của nó
+ guanidine thiocyanate: ( hỗ trợ sự gắn, bất hoạt enzyme), chất gây biến
tính protein, Rnase nội bào khi màng tế bào bị phá.
+ Phenol: Gây biến tính protein , có 2 dạng dung dịch bão hịa là pH= 9
và pH = 4, phonol có pH = 4 có khả năng hấp thu nuclic acid có trọng
lượng phân tử lớn về pha phenol cho nên thường được dung trong tách
chiết RNA để tranh nhiễm DNA.
+Chloroform: yếu hơn phenol( thường dung chung với phenol), chất gây
biến tính protein

+EDTA có khả năng bắt giữ các ion như MG2+ và Ca2+ ức chế hoạt động
của Dnase
+DEPC: Chất biến tính protein , ức chế Rnase
+Trizol ( phenol pH4.0 và guanidine thiocyanase), biến tính mạnh protein,
ức chế Rnase.
+DVC : Biến tính protein


+ Dung dịch L6: ( guanidine, Tris- X 100, Tris-HCl pH6.4, EDTA pH 8,
Triton X-100): Phá màng, Giúp gắn nu vào silica, bất hoạt enzyme nucleas
+Dung dịch L2: ( guanidine, Tris-HCl ph6.4): Rửa nucleic acid, giúp biến
tính protein, ức chế enzyme Rnase, hỗ trợ gắn silica
+TEIX: ổn định pH và EDTA, bất hoạt ion Mg2+,bất hoạt Dnase
+ Etanol 70 % : Giúp loại bỏ muối, biến tính protein, thu tủa và loại dịch
nổi
+Silica: gắn nu
+Axetol: Bay hơi etanol ( rửa etanol)
+KTL1( Trix, EDTA, Triton 100X, guanidine) : phá màng
+ KTL2: ( TE pha rời từ bài 1): gắn và giải
+KTL4: Phân hủy protein
+ KTC3 ( Trix, guanidine, etanol): Rửa
+ KTC4 ( etanol, NaH2PO4 với pH = 8): Rửa
+ SDS: Phá màng tế bào



Bài 3: Phân Tích Nucleic Acid Bằng Kĩ Thuật Điện Di
Và Đo Mật Độ Quang
Điện di là định tính
Đo OD là định lượng( xác định nồng độ…)

I: Phương Pháp Điện Di ( định tính)
-Xác định Có Nu mục tiêu của mình hay khơng
-DNA và RNA tích điện âm nhờ nhóm phosphate, kích thước phân tử lớn
sẽ chạy điện di chậm hơn kích thước nhỏ.
- Nếu 2 phân tử có cùng khối lượng, phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ
di chuyển về điện cực trái dấu nhanh hơn.
- Có 2 yếu tố của phân tử Nu khi điện di mà ảnh hưởng tới tốc độ di chuyển
của DNA và khác biệt về sự phân tách đó là
1) Kích thước
2) Cấu hình: phức tạp để bắt ethidium bromine
- Điện thế càng cao thì tốc độ di chuyển DNA sẽ càng nhanh
- Gel agarose với lỗ có đường kính trung bình cho phép nhân tách các
phân tử DNA sợi đơi, kích thước 300- 10.000 cắp nucleotide
-Gel polyacrylamide cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những
đoạn DNA có kích thước dưới 500bp
- Đối với gel agrose thì người ta nhuộm bằng ethidium bromide, chất này
sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA. Dưới ánh sáng kích thích
UV , ethidium bromide phát ánh sáng huỳnh quang màu đỏ cam. Điều này
cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel.
- Đối với gel polyacrylamide, các phân tử DNA thường được dánh dấu
bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kĩ thuật
phóng xạ tự ghi.


- Thang nucleic acid là hỗn hợp của nhiều đoạn nucleic acid ( DNA và
RNA) có kích thước xác định. Điện di thang cùng 1 lúc với mẫu nucleic
acid cần phân tách sẽ cho phép xác định kích thước các đoạn nuleic acid
trong mẫu
- Một số thang DNA thông dụng như: lamda- Hind III, 174-HaeIII, thang
1kb, thang 100bp.

II: Nguyên Tắc Điện Di

III: Phương Pháp Đô Mật Độ Quang
- Mỗi loại phân tử có khả năng hấp thụ cực đại ở một loại ánh sáng
có độ dài song nhất định. Ví dụ, nucleic acid hấp thụ cực đại ở bước
song 260 nm trong vùng tử ngoại. Sự hấp thụ này là do sự tương tác
của các photon với các electron của vịng purine và pyrimidine.
Trong khi đó protein hấp thụ cực đại ở bước song 280nm.
- Tính tỉ lẹ OD260/OD280 để ước lượng độ tinh sạch của dung dịch
nucleic acid. Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng( 1.8-2.0) dung dịch
nucleic acid được xem là sạch. Nếu mẫu nhiễm protein hay phenol,
tỉ lệ này sẽ thấp hơn nhiều và khi đó việc định lượng nucleic acid
bằng đo mật độ quang sẽ không cịn chính xác.


+ Dung dịch TAE ( Tris, EDTA, acetic acid): Hỗ trợ thiết yếu cho
q trình điện di trong đó acetic acid cung cấp ion H+ sẽ giúp lôi
kéo DNA di chuyển, khơng sử dụng nước cất vì ít lượng ion
+ Thành phần dung dịch nạp mẫu:
Glycerol giúp làm tăng tỉ trọng làm cho dd khơng bị hịa tan trong gel
Bromophenol blue: chất màu, giúp nhận diện mẫu, tích điện âm nên nó di
chuyển cùng chiều với DNA từ đó giúp dự đoán DNA di chuyển tới đâu
Xylene cyanol : chất màu giúp nhận biết, nhưng lại di chuyển với những
DNA có kích thước 3000bp
Orange G: chất màu giúp nhận diện mẫu từ 40-80bp

Phân tích 1 kết quả điện di
ADN
1) Có nhận thấy được DNA bộ gen hay khơng-→ có tách chiết được
DNA bộ gen ngun vẹn hay khơng?

2) Tiêu chí độ nguyên vẹn: vệt kéo dài ( đứt gãy 1 phần)
3) Độ tinh sạch
RNA
1) Có vệt hay khơng-→ DNA đứt gãy hay nhiễm protein hay khơng
2) Có 2 vạch rõ rang hay không-→ RNA ribosom nếu 2 vạch
3) Dưới vạch 16s thấy 1 đốm sáng thì RNA cũng bị phân hủy


-

-

-

Phân tích trên mẫu DNA cột C: ( DNA)
M là thang lamda- Hind III ( chứng dương)
Với PP điện di giúp ta phân tách những nu có kích thước khác nhau,
nếu những phân tử có kích thước q lớn hay q nhỏ thì sẽ khơng
phân tách được, vì vậy nếu khơng phân tách được thì các nu sẽ chạy
cùng nhau, không tách nhau ra , thể hiện bằng 1 VẠCH trên thang
( ở đây tập trung nhiều nu đang tập trung hoặc khơng phân tách)
Nhưng đối với những kích thước lớn như DNA bộ gen, thì mang
tính định tính, xem thử xem có cái vạch lớn hay khơng từ đó ta xác
định được DNA bộ gen (> 10k bp)
Khi nhìn thấy vệt phát quang bên dưới thì biểu thị cho sự hiện diện
của DNA có kích thước khác nhau rải rác nhưng bị đứt gãy ( kích
thước khơng ngun vẹn và đứt gãy một cách ngẫu nhiên)-→ có
nhiều kích thước khác nhau trên thang chạy
RNA:
+ RNA tách chiết chủ yếu là RNA tổng số, nhưng trong tổng số thì

RNA ribosome là chiếm nhiều nhất trên 70%, khi điện di chủ yếu là
nhìn thấy RNA ribosome.


+ Thuốc nhộm bắt vào vùng mạch đôi của cấu trúc thứ cấp của RNA,
RNA ribosome thì có 2 tiểu phần lớn và nhỏ đều có sự hiện diện
RNA, khi tách chiết ta sẽ thấy được ít nhất RNA của tiểu phần lớn
và nhỏ nên ta thấy rõ rang 2 vạch.( 500-2000 bp)
+ Ta quan sát được rằng đa số các nhóm đều phân tách nguyên vẹn
RNA, riêng nhóm 9 thì hiện ra một đốm sáng chứng tỏ RNA khơng
cịn nguyện vẹn ( đã bị phân cắt, phân hủy), kích thước nhỏ hơn so
với RNA nguyên vẹn.
+ Mỗi vạch tương ứng với con số bao nhiêu tương ứng với thang
( Dự đốn kết quả)
+Xuất hiện vệt sáng chứng tỏ có nhiễm DNA bộ gen
• Lưu ý: với phương pháp điện di giúp
chúng ta nhận diện được phân tử mục
tiêu của mình có được DNA hay RNA
hay khơng,ngồi ra dựa vào kích
thước ta có thể đánh giá được độ
ngun vẹn, nếu ngun vẹn thì sẽ
hiện diện tại kích thước dự đốn,
khơng nguyên vẹn thì hiện vêt và
đốm, so sánh thang để nhận được kích
thước.


• Để đánh giá chất lượng của một mẫu nucleic Acid sau khi tách
chiết thì ta xét trên các tiêu chí sau:
1) Có tách chiết được DNA và RNA hay không ( dựa vào kết quả

điện di)
2) Chất lượng của nó như thế nào
- Phân tử có cịn ngun vẹn hay khơng ( dựa vào kết quả điện di)
- Có tinh sạch hay không ( dựa vào kết quả đo OD)
+ Có nhiễm protein hay khơng
+ Có DNA hay RNA khác loại hay không ( dựa vào kết quả điện
di): DNA có kích thước trên 2000bp, RNA nhỏ hơn
-Nồng độ có là bao nhiêu ( dựa vào kết quả đo OD)



Bài 4: Phản Ứng PCR ( Polymerase Chain Reaction)
I: Lý thuyết
( Sao chép DNA/ nhân bản số lượng lớn DNA mục tiêu).
-PCR có bản chất là một phản ứng sao chép và khuếch đại
-Mồi được cung cấp cho phản ứng PCR là những trình tự DNA ngắn
có khả năng bắt cặp bổ sung với trình tự DNA mục tiêu, cung cấp
đầu 3’OH tự do cho DNA polymerase tổng hợp kéo dài mạch
-Phản ứng PCR được thực hiện dựa trên sự lặp lại nhiều ( 20-40)
chu kì luân nhiệt gồm 3 bước:
1) Biến tính ( 94-98*c): DNA mạch đơi được tách rời thành hai
mạch đơn
2) Bắt cặp ( 50-65*c) Mồi bắt cặp với bản mẫu
3) Tổng hợp ( 72* c) : Mạch mới được nối dài từ mồi
- Thành phần cơ bản của phản ứng PCR gồm có: DNA bản mẫu,
mồi xuôi và mồi ngược , dNTP ( dATP, dCTP. dGTP, dTTP), dung
dịch đệm cho phản ứng PCR, MgCl2 và Tag DNA polymerase.
- Chứng âm: là mẫu chứng không chứa đoạn DNA/RNA bản mẫu
mục tiêu để kiểm sốt q trình nhiễm chéo khi thực hiện phản ứng
PCR ( nếu như có sự xâm nhập của DNA bản mẫu ngồi mơi trường

thì nó sẽ hiện lên kết quả tại vì chứng âm khơng có DNA bản mẫu
thì theo ngun tắc sẽ khơng hiện vạch, nếu hiện trên vạch chứng tỏ
đã bị ngoại nhiễm-→ Dương tính giả) xem xét xem có nhiễm DNA
ngoại lai hay khơng.
- Chứng dương: Là mẫu chứng có chứa đoạn DNA/RNA khuôn mục
tiêu đã được biết trước-→ so sánh và đánh giá mẫu thử ( nếu quy
trình kĩ thuật bình thường thì chứng dương lên vạch).
- Trong phản ứng PCR có 2 hiện tượng:
+ Xuất hiện Primer dimer: 2 mồi bắt cặp với nhau, có kích thước
nhỏ, có thể phân biệt với sản phẩm mục tiêu ( 60-70bp)
+ Sản phẩm kí sinh: Mồi thiết kế khơng tốt, bắt vào những vùng
trình tự khác từ đó nhân bản những vùng trình tự này--→ Ngồi


những sản phẩm mục tiêu sẽ xuất hiện thêm những sản phẩm khơng
mong muốn.( khơng có đặc hiệu).
-D1S80: Nằm trên NST số 1, là trình tự khơng mã hóa, lặp lại 16bp,
khác về số lần lặp lại.

Bài 5: Các Enzyme thơng dụng trong sinh học phân
tử

Nuclease là các enzyme có hoạt tính thủy giải liên kết
phosphodiester giữa các nucleotide trong phân tử DNA hay DNA
Trong SHPT một số enzyme nuclease được sử dụng phổ biến như:
+ Dnase
+ Rnase
+ Enzyme cắt giới hạn ( Restriction enzyme- RE): nhận diện một
trình tự và phân cắt phân tử nucleic acid tại vị trí chuyên biệt.

Hầu hết các enzyme cắt giới hạn trong sinh học phân tử đều là nhóm
II có khả năng nhận diện và cắt ngay tại vị trí chun biệt. Cơng
dụng của enzyme cắt giới hạn là thủy giải một đoạn DNA dài thành
những đoạn DNA ngắn hơn, có kích thước phù hợp để dễ dàng phân
tích trong các thí nghiệm RFLP….

Polymerase: là những enzyme tham gia vào sinh tổng hợp chuỗi
DNA và RNA . một số polymerase thông dụng:
+ Enzyme phiên mã ngược có khả nange tổng hợp c DNA từ khn
RNA
+ DNA polymerase có khả năng sinh tổng hợp DNA . Hoạt động
khơi mào bởi đầu 3’OH tự do, được cung cấp bởi đoạn mồi(
primer) đã bắt cắp trên khuôn để bắt đầu tổng hợp.
+ Các RNA polymerase như SP^, T7, T3 cho phép tổng hợp RNA
từ mạch khuôn DNA.


Ligase: có khả năng hình thành liên kết phosphodiester giữa đầu
3’OH của một nu này và ddaauf5’P của một nu kế cận. DNA ligase
nối 2 trình tự DNA, cịn các RNA ligase nối hai trình tự RNA



+ vạch đầu là chạy nhanh nhất là dạng siêu xoắn,
+ vạch 2 là dạng thẳng
+ Vạch 3 là dạng vịng lơi: Khó di chuyển
Phân tích Plasmit

-SaiI cắt tại 1 vị trí ( 6096): plasmit tạo thành dạng thẳng, kích thước của

vịng chính là kích thước plasmid ( 6279bp).
- Cắt bằng HindIII cắt tại 2 vị trí ( 6102 và 5704): thì sản phẩm tạo thành
2 đoạn, vịng lớn cịn lại, và đoạn được cắt bởi HindIII, với kích thước
đoạn nhỏ là (6102-5074), kích thước đoạn lớn ( 6279-(6102-574)).
Chốt lại: Khi đã có sơ đồ plasmid, xác định xem làm việc với enzyme nào,
enzyme đó có bao nhiêu vị trí cắt trên plasmid, như vậy cắt thành công sẽ
tạo ra bao nhiêu sản phảm với kucsh thước bao nhiêu và trên ddienj di sẽ
tạo ra những vạch với kích thước nào.
Ví dụ:




Ví dụ phân tích của 1 bài báo cáo: