CA 2 NHÓM 18 báo cáo THỰC HÀNH bài ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD (1)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO THỰC HÀNH

ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

SINH HÓA HỌC

KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngày 01 tháng 04 năm 2022

ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD
I. THÔNG TIN SINH VIÊN:
Ca: 2

Nhóm: 18

Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Huỳnh Như

MSSV: 20180341

Họ tên sinh viên: Nguyễn Việt Kiều Oanh

MSSV: 20180346

Họ tên sinh viên: Trần Xuân Phú

MSSV: 20180350

II. CÂU HỎI LÝ THUYẾT:

Hãy nêu ưu và nhược điểm của phương pháp Bradford trong định lượng protein ?
 Ưu điểm:
- Độ nhạy cao, có thể xác định ít nhất từ 1 µg đến 20 μg protein.
- Hợp chất đơn giản.
- Ít tốn thời gian. Tổng thời gian cần thiết để thiết lập và hoàn thành xét nghiệm là dưới 30 phút.
- Ít bị cản trở bởi các hợp chất sử dụng trong nghiên cứu protein, nhất là ammonium sulfate.
- Thuốc nhuộm Coomassie Blue G250 tạo ra các mối liên kết không lưu trú mạnh mẽ với các
protein, thông qua các tương tác tĩnh điện với các nhóm amino và carboxyl, cũng như các tương
tác Van der Waals. Từ đó, loại bỏ khả năng các phân tử khơng liên kết của thuốc nhuộm có thể
đóng góp vào q trình thực nghiệm.
- Ít tốn kém, dễ sử dụng và có độ nhạy cao của thuốc nhuộm cho protein.
- Tồn bộ thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phịng.
- Biểu đồ tuyến tính có được từ xét nghiệm (độ hấp thụ so với nồng độ protein trong μg/ml) có thể
dễ dàng xác định nồng độ protein bằng cách sử dụng độ dốc của dòng.
 Nhược điểm:
- Phương pháp Bradford là tuyến tính trong phạm vi ngắn, thường từ 0 µg/mL đến 2000 µg/mL nên
thường phải pha lỗng trước khi phân tích mẫu.
- Các lỗi trong q trình pha lỗng có thể dẫn đến mối quan hệ tuyến tính của các số liệu khơng
được chính xác.
- Phụ thuộc vào chuỗi protein. Nếu protein không chứa một phần dư các amino acid thơm thì thuốc
nhuộm sẽ khơng thể liên kết với protein một cách hiệu quả.

1


-

Phụ thuộc vào việc so sánh độ hấp thụ của protein với protein tiêu chuẩn. Nếu protein không phản
ứng với thuốc nhuộm theo cách tương tự như protein tiêu chuẩn, có thể nồng độ đo sẽ khơng chính
xác.

- Thuốc thử có xu hướng nhuộm các ống nghiệm, các vết bẩn sẽ ảnh hưởng đến việc đọc độ hấp thụ.
- Nhạy cảm với thời gian nên cần đảm bảo mẫu được ủ trong cùng một lượng thời gian để so sánh
chính xác.
- Bị ức chế bởi sự hiện diện của chất tẩy rửa.
- Thuốc nhuộm Coomassie Blue G250 ban đầu dễ dàng liên kết với các nhóm protein arginine và
lysine. Sự ưu tiên của thuốc nhuộm với các axit amin này có thể dẫn đến các phản ứng khác nhau
của xét nghiệm giữa các protein khác nhau.
III. KẾT QUẢ THỰC HÀNH:
Đo giá trị hấp thu (OD) ở bước sóng 595 nm:
Dung môi tủa protein

(NH4)2SO4

OD595nm đối chứng

0,440

OD595nm mẫu tủa protein

0,555

OD595nm mẫu thô

0,728

ΔOD595nm mẫu tủa protein

0,115

ΔOD595nm mẫu thơ

0,288

Đường chuẩn:
Protein chuẩn (µg)

0

10

20

30

40

50

ΔOD595nm

0

0.033

0.069

0.107

0.142

0.176

Sử dụng phần mềm excel để xây dựng đường chuẩn:
Trình bày0.2
cách tính nồng độ protein trong các mẫu:
0.18

ΔOD595nm 0.16
mẫu tủa protein = OD595nm mẫu tủa protein - OD595nm đối chứng = 0,555 – 0,440 = 0,115
0.14

ΔOD595nm

ΔOD595nm 0.12
mẫu thô = OD595nm mẫu thô - OD595nm đối chứng = 0,728 – 0,440 = 0,288

y = 0,0036x – 0,0011

0.1
Dựa vào đường
chuẩn tuyến tính y = 0,0036x – 0,0011 đã dựng, ta suy ra được x =

Với

0.08
x: 0.06
giá trị
0.04
y: 0.02
giá trị

0
0

nồng độ µg/ml protein trong mẫu
OD595nm đo được từ thực nghiệm

R2 = 0,9997

10
30
40
Vì ban đầu thể tích dung
dịch20mẫu tủa
protein
lấy 0,550ml mà 60
dung dịch mẫu thô lấy 1 ml nên nồng độ mẫu
Protein
chuẩn
(µg)
tủa protein phải nhân 2

Đồ thị đường chuẩn
Kết quả nồng độ protein
2


Nng protein (àg/mL)

Mu ta protein

Mu thụ

x = ì2 = 64,5

x = = 80,3

Hiệu suất tách chiết protein:
H (%) = x100% = x100% = 80,3%
Nhận xét:



Lượng protein trong mẫu thô thu được : 80,3
Lượng protein trong mẫu tủa protein thu được: 64,5
 Lượng protein trong mẫu thô cao gấp 1,2 lần lượng protein trong mẫu tủa protein.



Hiệu xuất kết tủa đạt thấp hơn 100%



Giải thích:
+ Sau khi lấy mẫu ra khỏi máy ly tâm không gạn bỏ phần dung dịch phía trên ra ngay, làm cho lượng
protein kết tủa bị hồ tan một phần.
+ Q trình hồ tan mẫu protein trong ống nghiệm diễn ra khơng hồn tồn, lượng tủa protein còn
nằm dưới đáy ống
+ Bấm giờ và canh thời gian giữa các bước khi thực hành thí nghiệm chưa chính xác nên thuốc thử
khơng liên kết tốt với protein, làm cho protein có trong mẫu khơng hấp thụ tốt các bước sóng từ
ánh sáng.

+ Ống cuvette khi đo máy OD chưa được rửa sạch, bị dính dấu vân tay
+ Các thao tác khi dùng máy OD chưa được chính xác

--- HẾT ---

3