Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của phytohormon đến sự phát sinh cơ quan của loài lan ý thảo

i

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ HIÊN

BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA PHYTOHORMON
ĐẾN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN CỦA LỒI LAN Ý THẢO
(Dendrobium gratiosissimum)

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành : Sƣ phạm Sinh học

Phú Thọ, 2017


i

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ HIÊN

BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA PHYTOHORMON
ĐẾN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN CỦA LỒI LAN Ý THẢO
(Dendrobium gratiosissimum)

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành : Sƣ phạm Sinh học

GIẢNG VIÊN HƢỚNG DẪN: TS. CAO PHI BẰNG

Phú Thọ, 2017


i

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, tơi xin gửi lời cảm ơn
chân thành nhất tới giảng viên hƣớng dẫn thầy giáo TS. Cao Phi Bằng đã hƣớng tận
tình, quan tâm hƣớng dẫn và động viên tơi hồn thành khóa luận. Và tơi cũng xin
chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong Trung tâm nghiên cứu Công nghệ Sinh
h c – Trƣờng Đ i h c H ng Vƣơng – Th xã Ph Th – T nh Ph Th đã t o điều
kiện và gi p đỡ tôi sử dụng các trang thiết b , hóa chất...trong q trình tiến hành thí
nghiệm. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đ o trƣờng Đ i h c Hùng
Vƣơng, c ng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa Khoa h c Tự nhiên đã t o điều
kiện gi p đỡ để tơi nghiên cứu và thực hiện khóa luận này.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, b n bè, những ngƣời đã luôn
bên c nh động viên, gi p đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện và hồn thành khóa
luận này.
Rất mong nhận đƣợc sự ch bảo, góp ý từ phía q Thầy (Cơ) để khóa luận
của tôi đƣợc đầy đủ hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Phú Thọ, tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Thị Hiên


ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AC

: Than ho t tính

BAP

: Benzylamino purine

CTTN : Cơng thức thí nghiệm
ĐC

: Đối chứng

GA3

: Axít giberellic

IAA

: Indole acetic acid

KC

: Knudson C

MS

: Murashige & Skoog

NAA : Naphthaleneacetic acid
PLSs : Protocorm
TDZ

: Thidiazuzon


iii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát sinh chồi in vitro sau 8 tuần của loài Ý
thảo (D. gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là protocorm. ...........................22
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của BAP đến hệ số nhân chồi in vitro của loài Ý thảo (D.
gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là chồi ....................................................23
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của BAP đến số lá của chồi in vitro của loài Ý thảo (D.
gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là chồi ....................................................25
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của BAP đến chiều cao chồi in vitro của loài Ý thảo (D.
gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là chồi ....................................................25
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của NAA đến sự phát sinh chồi in vitro sau 8 tuần của loài Ý
thảo (D. gratiosissimum) ..........................................................................................27
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của Kinetin đến sự phát sinh chồi in vitro sau 8 tuần của loài
Ý thảo (D. gratiosissimum) ......................................................................................28
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của Kinetin đến hệ số nhân chồi in vitro của loài Ý thảo (D.
gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là chồi ....................................................29
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của Kinetin đến số lá chồi in vitro của loài Ý thảo (D.
gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là chồi ....................................................30
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của Kinetin đến chiều cao chồi in vitro của loài Ý thảo (D.
gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là chồi ....................................................30

Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và NAA đến sự phát sinh chồi in
vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) sau 8 tuần nuôi cấy .................................31
Bảng 3.11. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa Kinetin và NAA đến sự phát sinh chồi
in vitro của lồi Ý thảo (D. gratiosissimum) sau 8 tuần ni cấy .............................32
Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi in
vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) ................................................................33
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến số lá của chồi in
vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) ................................................................34
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến chiều cao của chồi
in vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) ............................................................35
Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng kéo dài chồi in vitro loài lan Ý thảo
(D. gratiosissimum) . .................................................................................................36
Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của BAP đến hệ số nhân chồi in vitro loài lan Ý thảo (D.
gratiosissimum) . .......................................................................................................37


iv

DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát sinh chồi in vitro của loài Ý thảo (D.
gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là protocorm. .........................................23
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của BAP đến hệ số nhân chồi in vitro của loài Ý thảo (D.
gratiosissimum) với lo i vật liệu khởi đầu là chồi ....................................................24
Hình 3.3. Chồi cây in vitro trên cơng thức B1K0 và B0K0 ......................................24
Hình 3.4. Chồi cây in vitro trên công thức B0K0 và B1K0 ......................................26
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của NAA đến sự phát sinh chồi in vitro sau 8 tuần của loài Ý
thảo (D. gratiosissimum) ...........................................................................................27
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của Kinetin đến sự phát sinh chồi in vitro sau 8 tuần của loài
Ý thảo (D. gratiosissimum) .......................................................................................28
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi in

vitro của lồi Ý thảo (D. gratiosissimum) .................................................................34
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến số lá của chồi in
vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) .................................................................34
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến chiều cao của chồi in
vitro của loài Ý thảo (D. gratiosissimum) .................................................................35
Hình 3.10. Chồi in vitro trên các công thức B0, B2, B15 và B25 ............................37


v

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài ..........................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài .........................................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa h c và thực tiễn.................................................................................2
3.1. Ý nghĩa khoa h c ................................................................................................2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................................2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .............................................3
1.1. Giới thiệu chung về chi Hoàng thảo (Dendrobium) ..........................................3
1.1.1. V trí phân lo i và phân bố ................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................3
1.1.3. Lan Ý thảo (D. gratiosissimum) .......................................................................5
1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật........................................6
1.2.1. Giới thiệu chung ................................................................................................6
1.2.2. L ch sử phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................................6
1.2.3. Cơ sở khoa h c của kỹ thuật ni cấy mơ, tế bào thực vật ..............................7
1.2.3.1. Tính tồn năng của tế bào ..............................................................................7
1.2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào ....................................................7
1.2.3.3. Sự trẻ hóa .......................................................................................................8

1.2.4. Các giai đo n trong kỹ thuật nhân giống in vitro ..............................................8
1.2.5. Môi trƣờng nuôi cấy ..........................................................................................9
1.2.5.1. Thành phần của mơi trường ...........................................................................9
1.2.5.2. pH của mơi trường .......................................................................................11
1.2.5.3. Tính thẩm thấu của môi trường ...................................................................12
1.2.6. Tầm quan tr ng của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .....................12
1.3. Tình hình nghiên cứu lan Hồng thảo ................................................................13
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................................13
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ....................................................................14
CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..17
2.1. Đối tƣợng và ph m vi nghiên cứu ......................................................................17
2.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................17
2.3.1. Phƣơng pháp luận............................................................................................17
2.3.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm........................................................................17


vi

2.3.3. Phƣơng pháp thu thập số liệu .......................................................................21
2.3.4. Phƣơng pháp phân t ch và xử l số liệu ..........................................................21
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................22
3.1. Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát sinh chồi cây in vitro của loài lan Ý thảo (D.
gratiosissimum) . .......................................................................................................22
3.2. Ảnh hƣởng của NAA đến sự phát sinh chồi cây in vitro của loài lan Ý thảo (D.
gratiosissimum) . .......................................................................................................26
3.3. Ảnh hƣởng của Kinetin đến sự phát sinh chồi cây in vitro của loài lan Ý thảo
(D. gratiosissimum) . .................................................................................................27
3.4. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa Kinetin và NAA đến sự phát sinh chồi cây in
vitro của loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum) . .........................................................31

3.5. Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến sự phát sinh chồi cây in
vitro của loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum) . .........................................................33
3.6. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng kéo dài chồi in vitro loài lan Ý thảo (D.
gratiosissimum) ........................................................................................................35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................38
1. Kết luận .................................................................................................................38
2. Kiến ngh ...............................................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................39


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay với nền kinh tế ngày càng phát triển, thì nhu cầu vật chất của con ngƣời
ngày càng đƣợc cải thiện và nâng cao. Và đặc biệt nhu cầu tinh thần của ngƣời dân là
không thể thiếu. Một trong những cách mà con ngƣời đã ch n để làm đẹp cho cuộc
sống của mình là trồng hoa và cây cảnh. Việc lựa ch n từng lo i hoa trồng tùy theo sở
thích, vẻ đẹp của hoa và điều kiện nuôi trồng. Trong đó, hoa lan là một trong những
giống hoa đƣợc nhiều ngƣời ƣa th ch bởi không ch về màu sắc, kiểu dáng mà còn
mang một nét đẹp sang tr ng và trang nhã. Hoa lan là loài hoa vƣơng giả, với vẻ đẹp
kiêu kì huyền bí, có vai trị quan tr ng trong đời sống tinh thần và kinh tế. Ngồi ra
chúng có hình dáng, màu sắc, k ch thƣớc phong ph và đa d ng, rất phù hợp với điều
kiện khí hậu Việt Nam nên ch ng đƣợc sản xuất khá phổ biến [1].
T nh đến hiện nay có hơn 25.000 lồi lan khác nhau, ở Việt Nam có 137 đến
140 chi gồm trên 800 loài lan rừng [5]. Trong số đó, Dendrobium là giống khá
phong phú từ màu sắc, d ng hoa cho đến giống, loài. Mặt khác, Dendrobium cũng
rất dễ trồng, siêng hoa và lâu tàn. Do đó, nó đƣợc ƣa chuộng và đƣợc trồng phổ biến
ở nƣớc ta hiện nay nhằm phục vụ cho nhu cầu cuộc sống. Lan Ý thảo hay lan Hoàng
thảo Ý thảo, Ý thảo ba màu (Dendrobium gratiosissimum) là một trong những lồi

lan thuộc nhóm Dendrobium, hoa thƣờng nở vào m a xuân thƣờng nở vào khoảng
từ tháng 3 đến tháng 5, cánh có màu trắng với chóp có màu tím nh t ở giữa có một
đốm màu vàng. Đây là lồi lan đƣợc m i ngƣời ch n lựa trên th trƣờng bởi vẻ đẹp
và giá tr của nó [12].
Ở Việt Nam phần lớn lan đƣợc trồng hiện nay là đƣợc đem từ rừng về hoặc
nhân giống bằng các phƣơng pháp truyền thống nhƣ tách nhánh, gieo h t… Nhƣng
hiệu quả khơng cao, chất lƣợng cây giống khơng đảm bảo, khó đáp ứng đủ nhu cầu
cho ngƣời tiêu d ng trong nƣớc cũng nhƣ xuất khẩu. Mặt khác, Ý thảo là loài lan
đơn thân nên việc nhân giống bằng phƣơng pháp truyền thống cho hệ số nhân
không cao, không đáp ứng đƣợc nhu cầu của ngƣời dùng. Trong khi đó, nhân giống
bằng phƣơng pháp in vitro khắc phục đƣợc những h n chế của các phƣơng pháp
nhân giống truyền thống và có nhiều ƣu điểm nhƣ hệ số nhân giống cao, t o ra cây


2

giống s ch bệnh, cây con t o ra đồng đều về mặt di truyền, có chất lƣợng tốt, có sức
kháng bệnh rất cao, giảm chi ph sản xuất [1, 26].
Trong quá trình nhân giống in vitro, các điều kiện mơi trƣờng dinh dƣỡng, các
chất điều hồ sinh trƣởng đƣợc bổ sung vào mơi trƣờng ni cấy có ảnh hƣởng
khơng nhỏ đến hệ số nhân của chồi, quá trình t o các cơ quan hình thái của cây
cũng nhƣ sự sinh trƣởng phát triển và chất lƣợng của cây [3]. Vì vậy, tơi đã lựa
ch n đề tài: "Bƣớc đầu nghiên cứu ảnh hƣởng của phytohormon đến sự phát
sinh cơ quan của loài lan Ý thảo (Dendrobium gratiosissimum) ”.
. M c ti u đề tài
Bƣớc đầu đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của nồng độ và sự phối hợp các chất
điều hoà sinh trƣởng đến sự phát sinh cơ quan của loài lan Ý thảo (D.
gratiosissimum).
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa h c làm cơ sở
đánh giá những tác động của chất điều hòa sinh trƣởng đến hệ số nhân và chất
lƣợng chồi cây in vitro loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum).
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu đƣợc ứng dụng trong ni cấy mơ lồi lan Ý thảo (D.
gratiosissimum), góp phần sản xuất giống có hiệu quả cao, chất lƣợng tốt, ứng dụng
vào sản xuất, nâng cao hiệu quả kinh tế trên đ a bàn t nh Phú Th .


3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu chung về chi Hồng thảo (Dendrobium)
1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố
Giới: Plantae
Bộ: Asparagales
H : Orchidaceae
Phân h : Epidendroideae
Chi: Dendrobium
Giống lan Dendrobium đƣợc đặt tên vào năm 1799, chữ Dendrobium có nguồn
gốc từ Hy L p, Dendro có nghĩa là cây gỗ, cây lớn; bio là sự sống. Dendrobium rất
phong phú về chủng với khoảng 1600 loài phân bố trên các vùng thuộc Châu Á, tập
trung nhiều ở Đông Nam Á và Châu Úc [6].
Trên thế giới chi lan Hồng thảo có khoảng 1400 lồi, chủ yếu phân bố ở
Đông Nam Á và các đảo thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia, Papua New Guinea,
Đơng Bắc Australia. Ở Việt Nam có 107 loài và 1 thứ, phân bố ở các v ng n i từ Bắc
vào Nam và một số đảo ven biển [15]. Các đ i diện của chi Hoàng thảo chủ yếu sống
phụ sinh trên thân hoặc các cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc m n trên đá,
ch ng thƣờng m c ở nơi ẩm, với độ cao 500 – 1500m so với mực nƣớc biển, cũng có
khi gặp chi lan này m c ở độ cao 200m hoặc tới 2000m so với mực nƣớc biển.

1.1.2. Đặc điểm hình thái
Lan Dendrobium có thể chia thành hai nhóm theo d ng thân của chúng:
- D ng thòng (Nobile) là d ng thân mền thƣờng ở vùng có khí hậu mát mẻ, hoa
đƣợc t o ra từ chồi sơ khởi của giả hành đã trƣởng thành, gồm: Giả h c, H c vĩ, Long
tu, Phi điệp vàng…
- D ng đứng (Phalaenopsis) là d ng thân cứng thƣờng sống ở vùng khí hậu nóng
hơn, hoa đƣợc m c ở giả hành cú lẫn giả hành mới. Ở giả hành mới, chồi non nhất ở
ng n là chồi đầu tiên phát triển thành vòi hoa, gồm: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hồng,
Báo h , Ý thảo, Thủy tiên…
Chi Hồng thảo có một số đặc điểm sau:
- Thân: Chi lan Hoàng thảo là cây thân thảo m c cụm, thẳng đứng hoặc rủ
thõng, phân đốt, sống phụ sinh trên các cây gỗ hoặc số t các loài sống bám trên đá,


4

trong rừng ẩm. Chi này thuộc nhóm đa thân với nhiều giả hành, vừa có thân thật
vừa có giả hành. Giả hành tuy là thân nhƣng l i chứa diệp lục, dự trữ nƣớc và nhiều
chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự phát triển giả hành mới. Đa số các củ giả hành có
màu xanh nên nó đã c ng với lá làm nhiệm vụ quang hợp [6].
Thân của các đ i diện chi Hồng thảo đều phân đốt, hình trụ, hình con suốt,
hình ch y, ... có chiều dài từ 2-3cm đến 120cm. Lát cắt ngang thân có thể là hình
trịn, bầu dục, đơi khi hình 4 c nh thay đổi từ 0,3-1,5cm. Phần gốc, nơi xuất phát
của rễ thƣởng nhỏ mảnh nhƣng cũng có thể phình to [7].
- Rễ: Rễ của các đ i diện chi Hoàng thảo là rễ kh sinh, mảnh, hình trụ, màu
xanh và chuyển thành nâu khi già, ch ng thƣờng ôm lấy giá thể hoặc bng thõng
xuống. Ở một số lồi đƣợc bao b c bởi lớp mô h t ẩm dày bao gồm cả những lớp tế
bào chết chứa đầy không kh do đó có ánh lên màu xám b c. Chiều dài rễ từ 0,10,3cm; rễ thƣờng m c từ phần gốc của thân hoặc có thể ở mấu thân một vài loài.
- Lá: Lá m c thành hai dãy so le, khơng có cuống mà ch có bẹ ơm lấy thân.
Lá thƣờng cứng, d ng đa bóng, bề mặt thƣờng nhẵn, đôi khi bề mặt và bẹ lá

(thƣờng khi lá non) có phủ lơng cứng ngắn màu đen sớm rụng [7].
- Cụm hoa: Cụm hoa ch m thƣờng nhiều hoa hoặc t hoa. Cụm hoa dài thƣờng
rũ thõng xuống, nhiều lồi hoa có giá tr làm cảnh [7].
- Hoa: Hoa lƣỡng t nh, đối xứng hai bên. Màu sắc hoa đa d ng, sặc sỡ. Hoa đa
số có lồi có hƣơng thơm. Bao hoa chia hai vịng. Vịng ngồi gồm một lá đài giữa
và hai lá đài bên. Vòng trong gồm có hai cánh hoa và một cánh mơi [7].
- Cằm: Là một bộ phận đƣợc hình thành nhờ mép phần gốc hai lá đài bên d nh
nhau và d nh với chân cột. Cằm có các hình bán cầu, hình t i đến hình cựa, hình trụ
cong t nhiều [7].
- Cánh môi: Cánh môi khác nhiều so với các thành phần còn l i của bao hoa cả
về màu sắc, k ch thƣớc và trang tr . Trang tr đa d ng trên cánh môi nhƣ đốm, v ch,
diềm tua, u lồi, đƣờng sống, lông phủ chiếm v tr khá quan tr ng trong phân lo i.
Nhiều lồi có gốc cánh mơi dính với chân cột t o thành cựa [7].
- Quả: Quả nang thƣờng hình ch y hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều h t nằm
xen lẫn những sợi lông mảnh. H t rất nhỏ, hầu nhƣ không tr ng lƣợng, bao quanh
h t là lớp màng d ng mắt võng, trong suốt chứa đầy không kh dễ dàng bay cùng
h t trong khơng kh nhờ gió [7].


5

- H t: Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 h t, đôi khi đến 3 triệu h t nên h t lan
có k ch thƣớc rất nhỏ, phơi h t chƣa phân hóa. Sau 12 - 18 tháng h t chín phát tán nhờ
gió. Khi gặp nấm cộng sinh tƣơng th ch trong điều kiện phù hợp h t sẽ nảy mầm [7].
1.1.3. Lan Ý thảo (D. gratiosissimum)
Lan Ý thảo là cây thân thảo, m c thành cụm, với thân trịn có đốt đƣợc bao
quanh bằng bao vỏ lâu rụng và chặt, sống chủ yếu là lâu năm, biểu sinh trên thân và
cành cây thân gỗ chứa nhiều m n, có quan hệ cộng sinh với nấm. Thân dài 25 – 40
cm, đƣờng k nh 0,5 - 0,7 cm, thịng xuống, gióng dài 2,5 - 2,7 cm. Lá trơng giống
nhƣ da, mép lá nhẵn, hình mác, xếp hai dãy, dài 8 – 10 cm, rộng 1,2 -1,8 cm, ở đầu

2 th y lệch. Cụm hoa chứa 1-3 hoa d ng bên, m c gần các đốt ở phần trên của thân
khơng cịn lá, hoa lộn ngƣợc. Tái sinh bằng h t và chồi [12].
Lá bắc nhỏ, hình mác, dài 0,5 cm, đầu t . Hoa nở vào m a xuân, đƣờng k nh
3–7 cm, cánh hoa và lá đài màu trắng với chóp màu t m nh t. Các lá đài gần đều,
hình mác, dài 2,3-2,5 cm, rộng 0,6-0,8 cm, đầu hơi nh n. Lá đài ở lƣng tự do, các lá
đài bên hơi chếch t i đế. Cằm dài 0,5 cm, có đầu t . Cánh hoa gần giống nhƣ lá đài
ở lƣng, hình mác, dài 2,4-2,5 cm, rộng 1-1,2 cm, đầu t [6].
Cánh mơi gần trịn, dài 2,5-2,7 cm, rộng 2,1-2,3 cm, gốc hơi thót và có các
v ch chéo màu t m ở chóp, ở giữa có một đốm màu vàng. Trụ màu trắng, cao 0,30,4 cm. Nắp hình mũ cao, màu trắng, bề mặt phủ nh m n. Bầu dài 2,8-3,5 cm. Quả
nang hình trứng thuôn dài [6].
Phân bố chủ yếu trong các rừng cây lá sớm rụng và khô cũng nhƣ các rừng
thƣờng xanh mƣa ẩm v ng đất thấp hay miền n i t i Hải Nam (Trung Quốc),
Assam (Ấn Độ), Lào, Thái Lan, Việt Nam và Myanma t i cao độ trong khoảng 0 tới
1.600 m. T i Việt Nam, lan Ý thảo sống trong tự nhiên có t i các t nh Quảng Tr
(huyện Hƣớng Hóa: Lao Bảo), Kon Tum (huyện Đắk Tô: rừng cấm Đắk Uy), Gia
Lai (huyện Chƣ Păh: Gia Lu), Lâm Đồng (Đà L t, Bảo Lộc) [6].
Lan Ý thảo phát triển trong mơi trƣờng có kh hậu từ mát tới nóng với lƣợng
ánh sáng trung bình. Cần duy trì cho cây ẩm ƣớt và bón phân trong m a sinh
trƣởng. Trong m a đông nên giảm tƣới nƣớc cho tới khi các chồi mới xuất hiện.
Trồng trong hỗn hợp của rêu nƣớc (Sphagnum spp.) khô hay môi trƣờng là vỏ linh
sam (Abies spp.) có khả năng thốt nƣớc tốt [6].


6

1. . Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Giới thiệu chung
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là phƣơng pháp nuôi cấy các bộ phận
thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa mơi trƣờng dinh
dƣỡng thích hợp nhƣ muối khống, vitamin, đƣờng và các chất điều hịa sinh trƣởng

trong điều kiện vô trùng.
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ
các mô nhƣ lá, thân, rễ, củ hoặc đ nh sinh trƣởng. Hiện nay các nhà khoa h c sử
dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề có liên quan tới
thực vật nhƣ sinh l h c, sinh hóa h c, di truyền h c và cấu trúc thực vật. Đồng thời
mở rộng tiềm năng nhân giống vô t nh đối với những lồi cây trồng quan tr ng, có
giá tr về mặt kinh tế và thƣơng m i trong đời sống hàng ngày của con ngƣời [11].
1.2.2. Lịch sử phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm ni cấy mô cây một lá mầm
nhƣng không thành công [16].
Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác đ nh đƣợc vai trò của IAA, hormon thực vật
thuộc nhóm Auxin có khả năng k ch th ch sự tăng trƣởng và phân chia tế bào thực
vật [16].
Năm 1939, ba nhà khoa h c Gautheret, Nobecourt và White đồng thời nuôi
cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thƣợng tầng (cambium) ở trên các
đối tƣợng cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trƣởng liên tục [16].
Năm 1960 – 1964, từ những nghiên cứu của mình, Morel đƣa ra kết luận có
thể nhân giống vơ t nh đ a lan bằng nuôi cấy đ nh sinh trƣởng. Từ đó, lan là cây
ni cấy mơ đầu tiên đƣợc đem vào nhân giống với quy mô công nghiệp [16].
Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong t o đƣợc cây
đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt [16].
Năm 1971, Takebe và cộng sự đã thành công trong tái sinh đƣợc cây từ tế bào
trần mô th t lá ở thuốc lá [16].
Năm 1978, Melcher và cộng sự thực hiện thí nghiệm trên cà chua và thuốc lá
và t o đƣợc cây lai soma cà chua – thuốc lá bằng kĩ thuật dung hợp tế bào trần [16].


7

Từ năm 1980 đến nay, ngƣời ta chuyển gen vào tế bào thông qua việc nuôi cấy

mô tế bào và vi khuẩn Agrobacterium đƣợc triển khai rộng rãi, sau đó đƣa vào môi
trƣờng nuôi [16].
Tháng 6 năm 2006, S. Aktar & cộng sự t i Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh
h c USDA, Sở Công nghệ sinh h c, Đ i h c Nông nghiệp Bangladesh,
Mymensingh đã nghiên cứu khả năng hình thành rễ lan Dendrobium trong mơi
trƣờng có chứa nồng độ khác nhau của IBA (0, 0,5, 1,0, 1,5 và 2,0 mg/l) và 1% than
ho t tính. Kết quả ra rễ tốt nhất thu đƣợc từ môi trƣờng chứa 1,0 mg/l IBA [17].
1.2.3. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy mơ tế bào nói chung và kỹ thuật nhân giống vơ tính nói
riêng đều dựa vào cơ sở khoa h c là t nh tồn năng, sự phân hóa và phản phân hóa.
1.2.3.1. Tính tồn năng của tế bào
T nh toàn năng của tế bào: Theo quan niệm sinh h c hiện đ i thì tính tồn
năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang tồn bộ lƣợng thơng
tin di truyền tƣơng đƣơng với lƣợng thơng tin di truyền của cơ thể hồn ch nh. Khi
gặp điều kiện mơi trƣờng thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá
thể hồn ch nh thơng qua q trình phân hóa và phản phân hóa [11].
1.2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào
Mỗi cơ thể là một ch nh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan thực hiện chức
năng khác nhau, mỗi cơ quan do nhiều tế bào cùng thực hiện một chức năng t o
nên. Tuy nhiên, các lo i tế bào đó đều có nguồn gốc một từ tế bào đầu tiên là hợp
tử. Hợp tử phân chia tiếp tục t o thành nhiều tế bào phơi sinh chƣa mang chức năng
riêng biệt (chun hóa) . Sau đó từ các tế bào phơi sinh này đƣợc biệt hóa thực hiện
các chức năng khác nhau t o nên các mơ, cơ quan có chức năng khác nhau.
Q trình phân hố tế bào có thể biểu th :
Tế bào phơi sinh

Tế bào dãn

Tế bào phân hố có chức năng riêng biệt

Tuy nhiên, các tế bào đã chuyên hóa cũng có khả năng phân hóa khi gặp điều
kiện thuận lợi, trong trƣờng hợp cần thiết các tế bào này l i quay trở về d ng phôi
sinh và phân chia liên tiếp. Đó g i là q trình phản phân hóa tế bào.


8

Phân hóa tế bào

Tế bào phơi sinh

Tế bào dãn

Tế bào chun hố

Phản phân hố tế bào
Q trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là
kết quả của q trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kỹ thuật ni cấy mơ, tế
bào xét đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật
một cách có đ nh hƣớng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ
sở t nh tồn năng của tế bào thực vật [11].
1.2.3.3. Sự trẻ hóa
Trong nuôi cấy in vitro, khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác nhau là
rất khác nhau. Vì vậy để ch n mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào tr ng thái sinh lý
hay tuổi mẫu: các mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trƣờng nuôi
cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong ni cấy mơ sẹo, phơi. Ngồi ra mơ non trẻ
mới đƣợc hình thành, sinh trƣởng m nh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn. Vì vậy
việc trẻ hố là một biện pháp quan tr ng nhất trong nhân giống sinh dƣỡng [11].
1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro
Bước 1: Ch n l c và chuẩn b mẫu cấy: Mẫu cấy là các cây s ch bệnh, khỏe

m nh. Cần lƣu

đến độ tuổi sinh lý của cơ quan d ng làm mẫu, vụ mùa lấy mẫu,

k ch thƣớc và v trí lấy mẫu.
Bước 2: T o vật liệu khởi đầu: Là giai đo n khử trùng mẫu vào nuôi cấy in
vitro. Giai đo n này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô
tồn t i và sinh trƣởng tốt. Khi lấy mẫu cần ch n đ ng mô, đ ng giai đo n phát triển
của cây, quan tr ng nhất là đ nh chồi ng n, đ nh chồi nách sau đó đến đ nh chồi hoa
và cuối c ng là đo n thân, mảnh lá.
Bước 3: Nhân nhanh là giai đo n kích thích mơ ni cấy pháp sinh hình thái
và tăng nhanh số lƣợng. Điều kiện ni cấy thích hợp gi p cho q trình tăng sinh


9

diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở tr ng thái trẻ hóa và đƣợc duy trì trong
thời gian dài.
Bước 4: T o cây in vitro hoàn ch nh là giai đo n t o cây con hoàn ch nh có
đầy đủ thân, lá và rễ. Các chất có tác dụng t o chồi đƣợc lo i bỏ. Để t o rễ cho chồi,
ngƣời ta chuyển chồi từ môi trƣờng nhân nhanh sang môi trƣờng t o rễ. Môi trƣờng
t o rễ bổ sung lƣợng nhỏ auxin giúp kích thích sự ra rễ nhanh.
Bước 5: Chuyển cây con ra ngoài vƣờn ƣơm: Cây con ra rễ đƣợc lấy ra ngồi
ống nghiệm, cây đƣợc đặt trong chậu nơi có độ ẩm cao, cƣờng độ chiếu sáng thấp…
Sau khoảng 2 tuần, cây thích nghi với điều kiện bên ngồi và đƣợc đem đi trồng.
Đây là giai đo n quan tr ng trong quy trình nhân giống vơ tính vì cây con dễ b chết
do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro
Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể s ch, tơi xốp, thoát nƣớc.
Phải chủ động điều ch nh đƣợc độ ẩm, sự chiếu sáng của vƣờm ƣơm, cũng nhƣ có
chế độ dinh dƣỡng phù hợp [11].

1.2.5. Môi trường nuôi cấy
1.2.5.1. Thành phần của môi trường
Thành phần của môi trƣờng nuôi cấy mơ tế bào thay đổi tùy theo lồi thực vật, lo i
tế bào, mô và cơ quan đƣợc nuôi cấy. Mặc dù có sự đa d ng về thành phần và nồng độ
các chất, nhƣng tất cả các lo i môi trƣờng nuôi cấy đều gồm các thành phần sau:

 Thành phần hữu cơ
- Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor
của các phản ứng sinh hóa.
+ Thiamin cần cho trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp một số aminoaxit,
hàm lƣợng sử dụng 0,1 – 5 mg/l.
+ Axít nicotinic tham gia t o coenzyme của chuỗi hô hấp, sử dụng 0,1 – 5 mg/l.
+ Pyridoxin là một coenzyme quan tr ng trong nhiều phản ứng trao đổi chất,
sử dụng 0,1 – 1 mg/l.
- Myo – inositol: tham gia vào dinh dƣỡng khoáng, vận chuyển đƣờng và trao
đổi hydratcacbon.
- Các aminoaxit amit: có vai trị quan tr ng trong việc phát sinh hình thái.
- Các thành phần hữu cơ phức t p: Cazein thủy phân, d ch chiết nấm men, nƣớc
ép hoa quả… cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin và các khoáng chất [16].


10

 Thành phần vơ cơ
Gồm các muối khống, các ngun tố cần phải cung cấp là nitơ, phospho,
kali và sắt.
- Nitơ đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở 2 d ng: nitrat và amôn với hàm lƣợng
nitrat là 25mM.
- Phospho đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở d ng muối phosphate và 2 lo i muỗi
đƣợc sử dụng nhiều nhất là NaH2PO4 và KH2PO4.

- Kali đƣợc cung cấp dƣới d ng KNO3, KCl và KH2PO4. Hàm lƣợng kali trong
môi trƣờng nuôi cấy thay đổi từ 2 – 25mM.
- Sắt là nguyên tố vi lƣợng đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở d ng muối
FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3... nhƣng cây rất khó hấp thụ, phải cho vào môi trƣờng
Na2EDTA để t o ra muối phức NaFeEDTA để cây dễ dàng hấp thụ [16].
 Nguồn cacbon
Lo i hydratcacbon đƣợc sử dụng để đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy phổ biến là
đƣờng saccarozơ với hàm lƣợng 6% (W/v). Những lo i đƣờng khác nhƣ: fructozơ,
glucozơ, maltozơ, lactozơ,... ch dùng trong những trƣờng hợp cá biệt. Hàm lƣợng
đƣờng thấp đƣợc sử dụng trong nuôi cấy tế bào trần, ngƣợc l i các hàm lƣợng
đƣờng cao hơn có thể dùng cho nuôi cấy h t phấn, phôi [16].
 Chất điều hòa sinh trưởng
Các chất điều hòa sinh trƣởng là thành phần khơng thể thiếu trong mơi trƣờng ni
cấy, có vai trị quan tr ng trong q trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu quả
tác động của chất điều hòa sinh trƣởng phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng, ho t tính vốn có
của chất điều hịa sinh trƣởng, mẫu ni cấy [9]. Các chất điều hồ sinh trƣởng thực vật
đƣợc chia thành các nhóm ch nh sau đây: Auxin, Cytokinin, Gibberellin,..
- Nhóm Auxin: Đƣợc đƣa vào mơi trƣờng nuôi cấy nhằm th c đẩy sự sinh
trƣởng và giãn nở tế bào, tăng cƣờng các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất,
kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vô tính ...
(Epstein&cs, 1989) . Các lo i Auxin thƣờng sử dụng cho nuôi cấy:
+ IAA (Indole acetic acid)
+ IBA (Indole butyric acid)
+ NOA (Naphthoxy acetic acid)
+ α- NAA (α- Naphthaleneacetic acid)


11

+ 2,4 D (2.4 diclorophenolxy acetic acid) ...

IAA ít sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, nếu dùng thì ở hàm lƣợng
cao 1,0-3,0 mg/l (Dodds & Robert, 1999). Các Auxin khác có hàm lƣợng sử dụng từ
0,1-2,0 mg/l.
- Nhóm Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trƣởng
của chồi in vitro (Miller, 1962). Các Cytokinin có biểu hiện ức chế sự t o rễ và sinh
trƣởng của mơ sẹo nhƣng có ảnh hƣởng dƣơng t nh rõ rệt đến sự phát sinh phơi vơ tính
của mẫu ni cấy. Các lo i Cytokinin thƣờng dùng trong nuôi cấy mô là:
+ Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine).
+ Kinetin (6-furfurylamino purine).
+ BAP (Bezylamino purine).
+ TDZ (Thidiazuzon).
+ 2-ip (isopentenyi adenine).
Hàm lƣợng sử dụng của các Cytokinin dao động từ 0,1-2,0 mg/l. Ở những
nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi nách, đồng
thời ức chế m nh sự t o rễ của chồi ni cấy. Trong các lo i Cytokinin nói trên,
Kinetin và BAP là hai lo i đƣợc sử dụng rộng rãi hơn cả.
Đa số các trƣờng hợp phải sử dụng phối hợp cả Auxin và Cytokinin ở những
tỷ lệ khác nhau [16].
- Nhóm Gibberellin: Ngồi hai nhóm chính là Auxin và Cytokinin, trong ni
cấy mơ ngƣời ta cịn sử dụng thêm Gibberellin để kích thích kéo dài tế bào, qua đó
làm tăng k ch thƣớc của chồi ni cấy... GA3 là lo i Gibberellin đƣợc sử dụng
thƣờng xuyên nhất. Tuy nhiên do mẫn cảm với nhiệt độ nên phải l c qua màng l c
vô trùng rồi mới đƣa vào môi trƣờng [16].

 Các thành phần khác
- Tác nhân t o gel: quyết đ nh tr ng thái vật lý của môi trƣờng nuôi cấy. Chất t o
gel đƣợc sử dụng phổ biến là agar; Hàm lƣợng sử dụng của agar 0,5 – 10% (W/v) .
- Than ho t t nh: đƣợc dụng để hấp thụ các chất màu các hợp chất phenol, các
sản phẩm trao đổi chất thứ cấp [16].
1.2.5.2. pH của môi trường

pH của đa số các lo i môi trƣờng nuôi cấy đều đƣợc điều ch nh trong ph m vi
5,5 – 6. pH dƣới 5,5 làm agar khó chuyển sang tr ng thái gel, cịn pH lớn hơn 6,0


12

agar có thể rất cứng. Nếu trong mơi trƣờng có GA3 thì phải điều ch nh giá tr pH
trong ph m vi nói trên vì ở pH kiềm hoặc q axit thì GA3 sẽ chuyển sang d ng
khơng có ho t tính. Trong q trình ni cấy, pH của mơi trƣờng có thể giảm xuống
do một số mẫu thực vật sản sinh ra các axit hữu cơ [16].
1.2.5.3.. Tính thẩm thấu của môi trường:
Hấp thụ nƣớc của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy b chi phối bởi thế
năng của nƣớc trong d ch bào và trong môi trƣờng dinh dƣỡng.
Các thành phần chính có ảnh hƣởng đến thế năng của nƣớc trong môi trƣờng
bao gồm: hàm lƣợng đƣờng, hàm lƣợng agar, một số thành phần muối khoáng.
Đƣờng vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy đồng thời còn tham
gia vào điều ch nh khả năng thẩm thấu của môi trƣờng. Hàm lƣợng đƣờng cao, mô
nuôi cấy khó h t đƣợc nƣớc. Hàm lƣợng đƣờng thấp là một trong những nguyên
nhân gây ra hiện tƣợng thuỷ tinh hố ở mẫu ni cấy, đây là trở ng i chính cho việc
chuyển cây từ ống nghiệm ra vƣờn ƣơm hoặc đồng ruộng [16].
1.2.6. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Về mặt lý luận sinh h c:
Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của
sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho biết mối tƣơng quan giữa các
bộ phận trong cây. Tách và nuôi cấy mô phân sinh từ đó cho ra nhóm tế bào khơng
chun hóa g i là mơ sẹo, từ mơ sẹo có thể k ch th ch để tái sinh cây hoàn ch nh.
Phƣơng pháp ni cấy mơ có thể biết đƣợc từng giai đo n và chu kỳ phát triển
của từng cá thể. T o thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các quy luật sinh trƣởng,
phát triển cùng mối quan hệ giữ chúng với bên ngồi. Từ đó tìm ra quy luật thúc
đẩy sự phát triển của cây trồng theo ý muốn [9].

- Về mặt thực tiễn:
Với phƣơng pháp nhân giống này, đảm bảo t o ra cây con mang đặc tính
giống hồn tồn với cây cha mẹ (cây con ổn đ nh về mặt di truyền), cây con không
b nhiễm bệnh và t o đƣợc một số lƣợng cây con trong thời gian ngắn Phƣơng pháp
nuôi cấy mô đƣợc sử d ng để bảo quản, nhân nhanh các giống cây quý, có giá tr
kinh tế. Hiện nay, phƣơng pháp này ngày càng đƣợc sử dụng phổ biến trong công
tác giống cây trồng. Bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô, ch sau một thời gian ngắn có
thể t o đƣợc một sinh khối lớn có ho t chất: sinh khối đƣợc t o ra vẫn giữ nguyên


13

đƣợc thuộc tính, tức là vẫn giữ đƣợc khả năng tổ hợp các chất thứ cấp nhƣ glycosid,
các steroid dùng trong y h c, chất dính dùng trong cơng nghiệp thực phẩm, những
chất kìm hãm sinh trƣởng của vi sinh vật trong nông nghiệp [9].
1.3. T nh h nh nghi n cứu lan Hồng thảo
1.3.1. Tình hình nghi n c u tr n thế giới
Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên th trƣờng thế giới rất lớn, ngày càng tăng
nên việc nghiên cứu nhân giống lan Dendrobium rất đƣợc quan tâm và phát triển
m nh mẽ nhƣ:
Tháng 4 năm 2013, M. Musharof Hossain, Ravi Kant, Pham Thanh Van, Budi
Winarto, Songjun Zeng & Jaime A. Teixeira da Silva đã tiến hành nghiên cứu nhân
nhanh chồi giống lan Dendrobium nobile var. Emma từ chồi nách sử dụng mơi trƣờng
có bổ sung benzylaminopurine (BAP) ở các nồng độ 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 và 3,0 mg/l
và Kinetin (Kin) cũng nhƣ nƣớc dừa (CW) với các thể tích khác nhau 50, 100, 150,
200, 250 và 300 ml. Qua nghiên cứu h nhận thấy ở mơi trƣờng có chứa 1,5 mg/l BAP
kết hợp với Kin cho kết quả nhân chồi cao nhất. T o cây hồn ch nh tốt nhất trên mơi
trƣờng chứa 2 mg/l IBA với tỷ lệ phần trăm rễ (97,5%) số lƣợng rễ (4,70) và chiều dài
cây (3,47 cm) hiệu quả hơn so với NAA. Nồng độ cao hơn của IBA và NAA (3,0 mg/l)
cho thấy khả năng hình thành rễ kém [23].

Tháng 8 năm 2010, M. Maridass & cộng sự đã tiến hành nhân giống in vitro
phong lan Dendrobium nanum từ nguồn vật liệu ban đầu là thân rễ. Vật liệu thân rễ
đƣợc rửa bằng nƣớc cất, rửa qua ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theo khử trùng với
hypoch natri 3% (bổ sung 23 gi t Tween 80 EAC ml) trong 20 ph t và sau đó rửa
s ch cho 45 lần bằng nƣớc cất vô trùng. Thân rễ đƣợc trẻ ra cắt miếng nhỏ (5 mm)
và các mảnh rễ đƣợc cấy trên mơi trƣờng cơ bản của MS có bổ sung các kích thích
tố nhƣ NAA, BAP và Kinetin. Các mẫu hình thành protocorm tốt trên mơi trƣờng
có chứa 2,0μM / l NAA và 1,2 μM / l Kinetin. Sau đó protocorm phát sinh chồi tốt
nhất trên mơi trƣờng MS + 0,5μM / l BAP [20].
Năm 2011, trên t p chí của trƣờng đ i h c Khoa h c & Công nghệ Assam S.
Dutta1, A. Chowdhuryl và cộng sự đã đăng cơng trình nghiên cứu của mình về việc
phát triển và nhân nhanh giống lan Dendrobium aphyllum. Vật liệu đƣợc sử dụng
trong nghiên cứu này là các h t lan Dendrobium aphyllum đƣợc nuôi cấy trên môi


14

trƣờng MS cơ bản. Sau năm tuần tỷ lệ nảy mầm và hình thành protocorm của h t
đ t 90,6%. Các protocorm tiếp tục đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng mới là mơi
trƣờng MS cơ bản có bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng IAA và Kinetin riêng rẽ
và kết hợp với các nồng độ khác nhau. Kết quả các protocorm (PLBs) có sự phát
triển rễ và chồi. Kết quả này có sự khác biệt đáng kể giữa các mơi trƣờng. Từ chiều
dài trung bình của rễ và chồi đƣợc ghi l i cho thấy sự phát triển tốt nhất trên mơi
trƣờng kết hợp MS + 0,05ml (50µg/100ml) IAA+0,1,5mL (50µg/100ml) Kinetin
với thơng số chiều dài rễ và chồi là (0,50 cm và 0,78 cm) [18].
Bijaya Pant and Deepa Thapa (5/2012) khi nghiên cứu để phát triển một giao
thức nhân nhanh một giống Dendrobium primulinum. Nuôi cấy trên môi trƣờng MS
cơ bản và mơi trƣờng MS có bổ sung với sự kết hợp của các nồng độ khác nhau của
các chất điều hịa tăng trƣởng NAA, BAP các protocorm hình thành đã sản xuất
chồi và rễ. Sau 5 tuần nuôi cấy số lƣợng chồi tăng nhanh nhất trên môi trƣờng MS

với BAP (1,5 mg/l) và NAA (0,5 mg/l). Trong thí nghiệm t o rễ, rễ đƣợc quan sát
sau 3 tuần cấy thấy trên môi trƣờng MS với nguồn cung cấp ngo i sinh của IAA 0,5
mg/l cây lan ra rễ tốt nhất. Khi ra cây trên giá thể đất s ch và rêu (dớn) tỷ lệ 2:1.
Gần 70% của cây con sống sót [24].
Năm 2001, Murthy và Pyati đã nghiên cứu đề tài: Nhân nhanh Aerides
maculosum”. Môi trƣờng th ch hợp nhân nhanh protocom đƣợc phát triển từ phân
đo n lá non cấy trên môi trƣờng MS bổ sung thêm 2 mg/l BA. Khi nuôi cấy trên
môi trƣờng này, các protocom biệt hố thành cây con trong vịng 6 – 8 tuần. Có
84

cây con sống sót sau 3 tháng [21].
Năm 2014, J. Hongthongkham, S. Bunnag đã nghiên cứu đề tài

Nhân giống in

vitro và bảo quản l nh lan Quế Lan Hƣơng (Aerides odorata) , trong đó vật liệu sử dụng
là phân đo n lá cấy trên môi trƣờng New Dogashima bổ sung thêm BA với nồng độ 0 –
5 mg/l và NAA với nồng độ 0 – 2 mg/l. Tỷ lệ hình thành chồi đ t: 76 – 96 % [19].
1.3.2. Tình hình nghi n c u trong nước
Năm 1974, các nhà khoa h c đã nuôi cấy mô thành cơng hầu hết các lồi lan
thuộc nhóm đơn thân khác và cũng nhờ có phƣơng pháp ni cấy tế bào các cây lan
đã ch n l c từ phƣơng pháp lai hữu t nh. Mơi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp cho việc
nuôi cấy mô hoa lan là môi trƣờng MS (Murashige – Shoog, 1962), V.W (Vacine –
Went, 1949), KC (Knudsone) ...[10].


15

Năm 2005, tác giả Trần Quang Hoàng đã tiến hành nghiên cứu đề tài: Ảnh
hƣởng của các chất điều hoà sinh trƣởng đến q trình ni cấy in vitro của hai

giống lan Dendrobium và Cymbidium . Kết quả nghiên cứu ch ra mơi trƣờng ni
cấy có bổ sung 1 mg/l TDZ và 0,5 mg/l NAA cho thấy khả năng nhân giống chồi
cao nhất trên cả 2 giống lan. Số chồi/mẫu cấy là 7,22 [3].
Năm 2006, Tr nh Cẩm Tú và cộng sự đã có cơng trình Sử dụng kỹ thuật nuôi
cấy in vitro để nghiên cứu về sự phát triển của phát hoa Dendrobium sonia . Cơng
trình này cho ta thấy đƣợc sự ra hoa của Dendrobium sp. liên quan đến sự chuyển
tiếp mô phân sinh dinh dƣỡng t o lá và thân sang mô phân sinh sinh dục t o hoa.
Bên c nh đó vai trị của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật ảnh hƣởng đến số
lƣợng hoa cũng đƣợc thảo luận [13].
Năm 2009, Nguyễn Th Mỹ Duyên nghiên cứu đề tài: Nhân giống lan
Dendrobium anosmum, Dendrobium mini bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô. Nghiên
cứu các lo i giá thể trồng lan Dendrobium mini th ch hợp và cho hiệu quả cao .
Trên loài lan Dendrobium anosmum môi trƣờng nhân chồi th ch hợp nhất là MS bổ
sung với 1 mg/l BA và MS bổ sung với 2 mg/l BA và trên loài lan Dendrobium
mini: MS bổ sung với 1 mg/l BA và

MS bổ sung với 1 mg/l BA là hai môi trƣờng

th ch hợp nhất cho việc nhân chồi [1].
Nguyễn Thanh Tùng và cộng sự (2010), đã áp dụng phƣơng pháp nuôi cấy lát
mỏng tế bào trong nhân giống in vitro cây Hoàng thảo thân gãy (Dendrobium aduncum).
Trong nghiên cứu của nhóm tác giả này đã d ng vật liệu khởi đầu để cắt lát mỏng theo
chiều ngang TCL là chồi in vitro. Kết quả cho thấy mẫu cảm ứng tốt trên mơi trƣờng ½
MS có bổ sung thêm 0,5 mg/l BA và tái sinh tốt trên mơi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l
Kinetin + 0,3 mg/l NAA. Từ protocorm tỷ lệ chồi đ t đƣợc 5,67 chồi/mẫu [12].
Năm 2013, Vũ Ng c Lan và Nguyễn Th Lý Anh đã nghiên cứu

Nhân giống

in vitro Lan Dendrobium nobile Lindl . Kết quả cho thấy nguyên liệu sử dụng thích

hợp là quả lan 5 tháng tuổi; mơi trƣờng gieo h t là MS + (100 ml ND + 10g
saccharozơ + 6,0g agar) /l t môi trƣờng. Trong nhân in vitro kinh điển, môi trƣờng
nhân nhanh protocorm tối ƣu là KC+ (100 ml ND + 10 g saccharozơ + 6,0g agar)
/lít; nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS+ (100 ml ND + 10 g saccharozơ + 6,0g
agar) /lít. Trong nhân in vitro cải tiến: ni cấy lỏng lắc nút bơng và lỏng lắc màng
thống kh đã tăng hệ số nhân protocorm đ t 1,9 và 2,3 lần so với nhân in vitro kinh


16

điển. Ni cấy đặc thống khí giúp giảm 25

lƣợng saccharozơ bổ sung vào môi

trƣờng và tăng hệ số nhân protocorm lên gấp 1,4 lần so với nuôi cấy kinh điển.
Nhân nhanh cụm chồi bằng kỹ thuật bioreactor giảm ½ thời gian nhân giống. Mơi
trƣờng tối ƣu t o cây hồn ch nh là RE+ (10g saccharozase + 0,5g than ho t tính )
/l t, cƣờng độ ánh sáng 2300lux [8].
Năm 2014, Nguyễn Th Mai H nh và Nguyễn Bảo Toàn đã nghiên cứu đề tài:
Cải tiến giai đo n 2 và 3 trong vi nhân giống lan Aerides sp . Kết quả cho thấy ở
giai đo n 2, hiệu quả nhân chồi lan đ t đƣợc số chồi cao ở mơi trƣờng MS có bổ
sung NAA và BA với t lệ 1:10 [4].
Năm 2016, Vũ Kim Dung, Nguyễn Văn Việt và B i Văn Thắng đã thực hiện
đề tài: Nhân giống lan Hoàng thảo Ý thảo ba màu (D. gratiosissimum reichenb.f)
bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sát khuẩn bề mặt quả
lan bằng etanol 70

trong 2 ph t, khử tr ng bằng dung d ch HgCl2 0,1% trong 10

ph t và nuôi cấy trên môi trƣờng MS bổ sung sucrozơ 30 g/l, cho tỷ lệ mẫu s ch là

96,67 , tỷ lệ phát sinh protocorm 90

với thời gian phát sinh chồi 20 ngày. Cảm

ứng t o đa chồi trên môi trƣờng BAP 0,5 mg/l, NAA 0,3 mg/l, Kinetin 0,3 mg/l,
d ch chiết khoai tây 100 ml/l, nƣớc dừa 100 ml/l, sucrozơ 30 g/l, cho hệ số nhân
chồi và tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất (9,53 và 96,67 ) sau 4 tuần nuôi cấy. Chồi
ra rẽ 93,33

và chiều dài rễ trung bình 3,22 cm khi nuôi cấy trên môi trƣờng bổ

sung IBA 0,2 mg/l, NAA 0,3 mg/l, dich chiết khoai tây 100 mg/l sau 5 tuần nuôi
cấy [2].


17

CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
.1. Đối tƣ ng và phạm vi nghi n cứu
- Đối tƣợng: Cây lan Ý thảo (D. gratiosissimum) in vitro.
- Ph m vi nghiên cứu: ảnh hƣởng của nồng độ một số chất điều hòa sinh
trƣởng và sự phối hợp các chất điều hòa sinh trƣởng đến sự phát sinh chồi cây in
vitro của loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum) in vitro.
- Đ a điểm nghiên cứu: Các th nghiệm đƣợc thực hiện t i Trung tâm nghiên Cứu
công nghệ Sinh h c – Trƣờng Đ i h c H ng Vƣơng – Th xã Ph Th – T nh Ph Th .
. . Nội dung nghi n cứu
- Ảnh hƣởng của BAP, Kinetin, NAA đến sự phát sinh cơ quan của loài lan Ý
thảo (D.gratiosissimum) in vitro.
- Ảnh hƣởng của sự kết hợp giữa BAP với NAA, Kinetin với NAA và BAP
với Kinetin đến sự phát sinh cơ quan của loài lan Ý thảo (D.gratiosissimum) in vitro.

- Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng kéo dài chồi của loài lan Ý thảo
(D.gratiosissimum) in vitro.
.3. Phƣơng ph p nghi n cứu
2.3.1. Phương pháp luận
- Các nhân tố ch tiêu nghiên cứu phải chia thành các công thức khác nhau.
- Các nhân tố không phải ch tiêu nghiên cứu phải đảm bảo t nh đồng nhất giữa các
cơng thức thí nghiệm.
- Số mẫu của mỗi cơng thức thí nghiệm phải đủ lớn (≥20).
2.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Thí nghi m 1: Đánh giá ảnh hƣởng của BAP đến sự phát sinh chồi cây in
vitro loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum).
+ Vật liệu ban đầu:
 Cụm protocorm đƣợc nuôi cấy trên các công thức môi trƣờng:
BSI1: MT nền (ĐC)
BSI2: MT nền + 1 mg/l BAP
BSI3: MT nền + 2 mg/l BAP
BSI4: MT nền + 3 mg/l BAP