Nghiên cứu sự phát sinh cơ quan của lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) in vitro

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VÀNG THỊ NHƢ

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN CỦA LAN
KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume) IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành : Sƣ phạm Sinh học

Phú Thọ, 2017


TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VÀNG THỊ NHƢ

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN CỦA LAN
KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume) IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành : Sƣ phạm Sinh học

NGƢỜI HƢỚNG DẪN: TS. CAO PHI BẰNG

Phú Thọ, 2017


i

LỜI CẢM ƠN
Trƣớc tiên, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy giáo hƣớng dẫn TS.
Cao Phi Bằng đã tận tình, quan tâm hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt q
trình hồn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn các Thầy cô giáo trong Trung tâm nghi n
cứu C ng ngh sinh học – Trƣờng Đại học H ng Vƣơng – Th xã Phú Thọ –
T nh Phú Thọ, đã tạo điều ki n và giúp đỡ em sử dụng các trang thiết b , hóa
chất... trong q trình tiến hành thí nghi m.
Em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của toàn thể các thầy cô giáo
trong khoa Khoa học Tự nhiên và Ban lãnh đạo trƣờng Đại học H ng Vƣơng
đã tạo điều ki n giúp đỡ để em nghiên cứu và thực hi n khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những ngƣời đã
luôn bên cạnh động vi n, giúp đỡ em trong suốt q trình thực hi n và hồn
thành khóa luận này.
Rất mong nhận đƣợc sự ch bảo, góp ý từ phía q Thầy (C ) để khóa
luận của em đƣợc đầy đủ hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Phú Thọ, tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Vàng Thị Như


ii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
1. Tính cấp thiết của đề tài............................................................................................. 1
2. Mục ti u đề tài ............................................................................................................ 2
3.

ngh a hoa học và thực ti n .................................................................................. 2

NỘI DUNG ..…………………………….….…………………………………4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4
1.1. Giới thi u về lan Kim tuyến................................................................................... 4
121

tr ph n o i ........................................................................................ 4

122

i m sinh họ ................................................................................... 4

1.2.2.1. Phân bố ................................................................................................. 4
1.2.2.2. Hình thái ............................................................................................... 5
123

i m sinh thái .................................................................................. 7

1.2. K thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................................... 7
121

nh nghĩa ............................................................................................... 7

1.2.2. L ch sử phát tri n kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ......................... 8
1 2 3 Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật ................... 9
1.2.3.1. Tính tồn năng của tế bào .................................................................... 9
1.2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào ........................................... 9
1.2.3.3. Sự trẻ hóa ........................................................................................... 11
1 2 4 Cá giai o n trong kỹ thuật nhân giống in vitro................................. 11

1 2 5 Môi trường nuôi cấy.............................................................................. 13
1.2.5.1. Thành phần của m i trƣờng ............................................................... 13
1.2.5.2. pH của m i trƣờng ............................................................................. 16
1.2.5.3. Tính thẩm thấu của m i trƣờng .......................................................... 16
1.2.6. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi ấy mô tế bào thực vật .......... 17
1.3. Tình hình nghi n cứu............................................................................................18
1 3 1 T nh h nh nghi n

u tr n thế gi i ........................................................ 18


iii
1 3 2 T nh h nh nghi n

u trong nư .......................................................... 19

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG,NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
........................................................................................................................................21
2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu .......................................................................21
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................21
231

hương pháp uận ................................................................................. 21

232

hương pháp ố tr th nghi m ............................................................. 21

233

hương pháp thu thập số i u ............................................................... 22

234

hương pháp ph n t h v

ử

số i u ................................................ 23

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...............................24
3.1. Ảnh hƣởng của kinetin tới sự phát sinh cơ quan của lan Kim tuyến ...............24
3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng của than hoạt tính đến ra r ...........................................28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………….33
TÀI LIỆU THAM KHẢO………...……………….…………………………34
PHỤ LỤC


iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của inetin đến sự phát sinh cơ quan của lan Kim tuyến
(thời gian 4 tuần) ..........................................................................................................24
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của inetin đến sự phát sinh cơ quan của lan Kim tuyến
(thời gian 8 tuần) ..........................................................................................................25
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của than hoạt tính đến sự ra r lan Kim tuyến ...............29


v
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cây (A) và hoa (B) lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume .. 5
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của kinetin đến h số nhân chồi.............................................26
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của inetin đến chiều cao chồi...............................................27
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của inetin đến số đốt .............................................................27
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của than hoạt tính đến t l ra r ........................................30
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của than hoạt tính đến h số r ..........................................30
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của than hoạt tính đến chiều dài r ........................................31
Hình 3.7. Chồi cây in vitro tr n các m i trƣờng không bổ sung và bổ sung than
hoạt tính (AC) ...............................................................................................................32


vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AC

:

Than hoạt tính

CT

:

Cơng thức

ĐC

:

Đối chứng

MS

:

Murashige & Skoog

KC

:

Knudson C


1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Xã hội ngày càng phát triển thì chất lƣợng cuộc sống của con ngƣời
đƣợc hồn thi n và nâng cao, và có nhiều các nhu cầu trong đời sống. Một
trong những nhu cầu quan trọng với con ngƣời đó là nhu cầu sức khỏe đƣợc
bảo v tốt hơn. Để bảo v cơ thể tránh các b nh tật con ngƣời có truyền thống
sử dụng các loại thảo mộc làm thuốc chữa b nh. Vi c tìm kiếm, khai thác và
sử dụng các loại thảo dƣợc trong đời sống vẫn rất đƣợc chú trọng.
Vi t nam là một trong những nƣớc có nguồn tài nguyên cây thuốc phong
phú. Theo các số li u thống kê mới nhất thảm thực vật Vi t Nam có trên
12000 lồi, trong số đó có tr n 3200 lồi đƣợc sử dụng làm thuốc trong y học
dân gian [1]. Những cây thuốc dân gian có tác dụng rất tốt trong vi c bảo v
sức khỏe con ngƣời. Một trong những nhóm cây thảo dƣợc quan trọng là các
lồi lan. Bên cạnh giá tr thẩm m do có hoa rất đẹp, một số lồi phong lan cịn

có giá tr dƣợc học cao.
Họ Lan có số lƣợng thành phần lồi khơng những phong phú trong tự nhiên
mà còn đa dạng bởi các loài lan đƣợc lai tạo. Ở Vi t Nam, hi n có 137 đến 140
chi gồm trên 800 lồi lan rừng [2], trong đó Lan Kim tuyến (Anoectochilus
setaceus Blume) (cịn có tên là lan Kim tuyến lơng cứng, Kim tuyến, Kim
tuyến tơ, Giải thủy tơ, lan Gấm, cỏ Nhung, Kim cƣơng) là một lồi thực vật
có giá tr thảo dƣợc, đƣợc sử dụng để chữa tr các b nh ung thƣ, chống tăng
huyết áp, lƣu th ng hí huyết, kháng khuẩn..v.v [3]. Do có giá tr thảo dƣợc
và có giá tr kinh tế cao, Lan Kim tuyến đã b thu hái nhiều đến mức cạn ki t
ngoài tự nhiên [5]. Hơn nữa, Lan Kim tuyến phân bố với số lƣợng cá thể
khơng nhiều, tái sinh chậm và địi hỏi điều ki n sống ngặt nghèo, đã b khai
thác liên tục trong nhiều năm, hi n đã trở nên giảm sút rõ r t, ngày càng hiếm
và có nguy cơ b tuy t chủng [5,8]. Gần đây, vi c nhân giống loài Lan này


2
mang lại hi u quả kinh tế cao cho con ngƣời. Tuy nhi n, phƣơng pháp nhân
giống truyền thống có nhiều hạn chế, chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu ngày càng lớn
của con ngƣời.
Mặt hác, phƣơng pháp nhân giống bằng

thuật nu i cấy m in vitro

có nhiều ƣu điểm vƣợt trội. Nhân giống bằng phƣơng pháp in vitro hắc phục
đƣợc những hạn chế của các phƣơng pháp nhân giống truyền thống, phƣơng
pháp này cho h số nhân giống cao, giúp duy trì các iểu gen quý hiếm và làm
vật li u cho công tác tạo giống, tạo ra cây giống sạch b nh, có sức kháng b nh
cao, giảm chi phí sản xuất. Vi c nghiên cứu sự phát sinh cơ quan loài lan Kim
tuyến (Anoectochilus setaceus) sẽ cung cấp những cơ sở khoa học và thực
ti n, góp phần bảo tồn và phát triển loài lan này.

Xuất phát từ yêu cầu thực ti n trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên
cứu sự phát sinh cơ quan của lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume) in vitro”.
2. Mục tiêu đề tài
- Đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của chất điều tiết sinh trƣởng Kinetin đến sự
phát sinh cơ quan của lan Kim tuyến in vitro.
- Đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của than hoạt tính đến sự ra r của lan Kim
tuyến in vitro.
3

ngh a hoa học và thực ti n
Ý nghĩa khoa học
- Cung cấp dẫn li u khoa học về một số giai đoạn của quá trình nhân

giống in vitro là cơ sở khoa học cho vi c xây dựng quy trình nhân giống in
vitro lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume).
Ý nghĩa thực tiễn


3
- Các kết quả nghiên cứu sẽ bổ sung thêm tài li u khoa học phục vụ cho
nghiên cứu khoa học về loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume),
tại trƣờng Đại học H ng Vƣơng.
- Tạo ra nguồn cây giống với số lƣợng lớn và sạch b nh, đáp ứng nhu
cầu của th trƣờng.


4
NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về lan Kim tuyến
. . . ị

ph n o i

Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) đƣợc Carlvon Blume m tả đầu
ti n năm 1810 thuộc phân họ Orchidoideae. Tr n thế giới đã thống
51 loài thuộc chi này. Ở Vi t Nam hi n thống

đƣợc

đƣợc 12 lồi, trong đó

lồi lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) đƣợc biết đến chủ yếu
với c ng dụng làm thuốc.
Lan Kim tuyến thuộc: Giới (regnum): Plantae, Bộ (ordo): Asparagales,
Họ (familia): Orchidaceae, Chi (genus): Anoectochilus, Loài (species):
A.setaceus, Danh pháp hai phần: Anoectochilus setaceus Blume, Danh pháp
đồng ngh a: Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. (1832) [3].
. . .

i m inh h

1.2.2.1. Phân ố
Trong nƣớc: phân bố rộng ở hầu hết các t nh trong cả nƣớc nhƣ: Lào Cai
(Sapa: Phan Xi Păng, Văn Bàn: Liêm Phú), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái,
V nh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (M Đức: Ch a Hƣơng), Quảng Tr (Đồng
Chè), Hà T nh (Hƣơng Sơn: Rào àn), Kontum (Đắk Glei: núi Ngọc Linh, Sa
Thầy: núi Chƣ Mom Ray), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng), Đắk Lắk (Krông
Bông: núi Chƣ Yang Sinh), Lâm Đồng (Lạc Dƣơng: núi Bì Đúp).

Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đ ng), Mianma, Thái Lan, Lào,
Campuchia, Malaixia, Inđ n xia, Ấn Độ, Nêpan, Butan.
Lan Kim tuyến có thể gặp ở hầu hết các dạng đ a hình, nhƣ chân núi, sƣờn
núi, đ nh núi, dọc theo khe suối, dƣới các tán cây to trong rừng thuộc kiểu
rừng kín lá rộng thƣờng xanh á nhi t đới núi thấp, cấu trúc rừng thƣờng có 2


5
tầng cây gỗ. Đ i hi có thể gặp lan Kim tuyến ở kiểu rừng kín lá rộng thƣờng
xanh mƣa mùa nhi t đới ở độ cao 500 - 1.600 mét. Đặc điểm của cây bụi và
thảm tƣơi ở khu vực lan Kim tuyến phân bố là thƣa thớt, độ che phủ thấp
thƣờng vào khoảng từ 15 - 30%, với độ cao của lớp cây bụi và thảm tƣơi
khoảng từ 0,1 - 0,5m tuỳ từng khu vực. Lan Kim tuyến thƣờng ít phân bố ở
những nơi cây bụi thảm tƣơi dày đặc. Chúng có thể nằm ngay trên lớp thảm
mục của rừng đang b phân huỷ. Lan Kim tuyến chủ yếu phân bố tr n đất,
chúng mọc sát ngay bề mặt đất, nơi đất giàu m n, độ ẩm và độ xốp cao, thống
khí, thậm chí ngay trên lớp thảm mục của rừng đang phân huỷ. Đ i hi chúng
mọc trên các tảng đá ẩm, tr n các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây [8].
1.2.2.2. Hình thái

A
Hình 1.1. Cây (A) và hoa (B) lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume
Lan Kim tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân r mọc dài, thân tr n đất
mọng nƣớc và có nhiều lơng mềm, mang 2 - 4 lá mọc xoè sát đất. Tái sinh bằng
chồi từ thân r và hạt ít, sinh trƣởng rất chậm. Là loại cây ƣa bóng, ỵ ánh sáng
trực tiếp thƣờng mọc dƣới tán rừng nguyên sinh, rừng rậm nhi t đới ở độ cao
500 - 1600m. Mọc rải rác vài ba cây tr n đất ẩm, giàu mùn và lá cây rụng [8].



i m th n rễ


6
Lan Kim tuyến là cây thân r nằm ngang sát mặt đất, đ i

hi hơi

nghi ng, bò dài. Chiều dài thân r từ 5 - 12 cm, trung bình là 7,87 cm. Đƣờng
ính thân r từ 3 - 4 mm, trung bình là 3,17 mm. Số lóng tr n thân r từ 3 - 7
lóng, trung bình là 4,03 lóng. Chiều dài của lóng từ 1 - 6 cm, trung bình là
1,99 cm. Thân r thƣờng có màu xanh trắng, đ i hi có màu nâu đỏ, thƣờng
nhẵn, h ng phủ l ng [8].



i m th n kh sinh
Cây lan Kim tuyến có thân hí sinh thƣờng mọc thẳng đứng tr n mặt đất,

ít hi mọc nghi ng. Chiều dài thân hí sinh từ 4 - 8 cm, trung bình 6 cm.
Đƣờng ính thân hí sinh từ 3 - 5 mm, trung bình là 3,08 cm. Thân khí sinh
mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài hác nhau. Số lóng tr n thân hí sinh
thay đổi từ 2 - 4 lóng, chiều dài mỗi lóng từ 1 - 4 cm. Thân hí sinh thƣờng
mọng nƣớc, nhẵn, h ng phủ l ng, thƣờng có màu xanh trắng, đ i hi có màu
hồng nhạt [8].



i m rễ
R lan Kim tuyến đƣợc mọc ra từ các mấu tr n thân r . Đ i hi r cũng đƣợc

hình thành từ thân hí sinh. R thƣờng đâm thẳng xuống đất. Th ng thƣờng mỗi
mấu ch có một r , đ i hi có vài r c ng đƣợc hình thành từ một mấu tr n thân r .
Số lƣợng và ích thƣớc r cũng thay đổi tuỳ theo cá thể. Số r tr n một cây thƣờng
từ 3 – 10 r . Chiều dài của r thay đổi từ 0,5 - 8 cm [8].



i m á
Lá lan Kim tuyến mọc cách xoắn quanh thân, xoè tr n mặt đất. Lá hình

trái xoan hay hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn,
phiến lá dài từ 3 – 5 cm và rộng từ 2 - 4 cm. Lá có màu nâu thẫm ở mặt tr n
và phủ l ng m n nhƣ nhung. H gân lá mạng lƣới l ng chim, thƣờng có 5 gân
gốc. Lá có v t vàng ở giữa và màu hồng nhạt tr n các gân. Mặt dƣới lá có
màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ. Các gân b n ở phía rìa lá nổi rõ,
gân ở giữa lá ở mặtdƣới h ng rõ. Cuống lá dài 0,6 - 1,2 cm, thƣờng nhẵn và


7
có màu trắng xanh, đ i hi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên
một cây thay đổi từ 2 - 6, th ng thƣờng có 4 lá. Kích thƣớc của lá cũng thay
đổi, các lá trên một cây thƣờng có ích thƣớc hác nhau rõ r t [8].



i m hoa, quả
Hoa lan Kim tuyến dạng cụm, dài 10 - 20 cm ở ngọn thân, mang 4 - 10

hoa mọc thƣa. Lá bắc hình trứng, dài 8 - 10 mm, màu hồng. Các mảnh bao

hoa dài hoảng 6 mm, cánh m i màu trắng, dài đến 1,5 cm, ở mỗi b n gốc
mang 6 - 8 dải hẹp, đầu chẻ đ i thành 2 th y hình thu n trịn. M a hoa tháng
10 - 12. Mùa quả chín tháng 12 - 3 năm sau [8].
. .3.

i m sinh thái

- Nhi t độ: Nhi t độ h ng hí trung bình thấp nhất hoảng 10oC, nhi t
độ h ng hí trung bình cao nhất hoảng 28oC.
- Độ ẩm: Độ ẩm h ng hí trung bình hoảng 80%.
1 2 K thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật
. . . ịnh nghĩa
K thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là phƣơng pháp nu i cấy các bộ
phận thực vật (tế bào đơn, m , cơ quan) trong ống nghi m có chứa mơi
trƣờng dinh dƣỡng thích hợp nhƣ muối hống, vitamin, đƣờng và các chất
điều hòa sinh trƣởng trong điều ki n vô trùng.
K thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ
quan từ các m nhƣ lá, thân, r , củ hoặc đ nh sinh trƣởng. Hi n nay các nhà
khoa học sử dụng h thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn
đề có liên quan tới thực vật nhƣ sinh lý học, sinh hóa học, di truyền học và
cấu trúc thực vật. Đồng thời mở rộng tiềm năng nhân giống v tính đối với
những lồi cây trồng quan trọng, có giá tr về mặt kinh tế và thƣơng mại trong
đời sống hàng ngày của con ngƣời.


8
Công ngh nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những công ngh
quan trọng của Công ngh Sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng
các công ngh

hác trong l nh vực công ngh sinh học thực vật. Trong những

năm gần đây, nu i cấy mô tế bào thực vật đã h ng ngừng phát triển và đem
lại hi u quả thiết thực trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng.
Những thành tựu tr n đã góp phần to lớn vào vi c thúc đẩy sự phát triển nền
nông nghi p công ngh cao mang tính cạnh tranh trong th trƣờng quốc tế.
1.2.2. Lịch sử phát tri n kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghi m nuôi cấy mô cây một lá
mầm nhƣng h ng thành c ng [11].
Năm 1934, Kogl lần đầu ti n xác đ nh đƣợc vai trò của IAA, một
hoocmon thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng ích thích sự tăng
trƣởng và phân chia tế bào [11].
Năm 1939, ba nhà hoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời
nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ m thƣợng tầng (cambium)
ở cà rốt và thuốc lá, mơ sẹo có khả năng sinh trƣởng liên tục [11].
Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của
kinetin - một cyto inin đóng vai trị quan trọng trong phân bào và phân hố
chồi ở mơ ni cấy [11].
Đến năm 1957, S oog và Miller đã hám phá vai trò của tỷ l nồng độ
các chất Auxin: Cyto inin trong m i trƣờng đối với sự phát sinh cơ quan (r
hoặc chồi). Khi tỷ l Auxin/ Cytokinin nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mơ có xu
hƣớng tạo chồi. Ngƣợc lại khi nồng độ Auxin/ nồng độ Cytokinin lớn hơn 1
và càng lớn, m có xu hƣớng tạo r . Tỷ l nồng độ Auxin và Cytokinin thích
hợp sẽ kích thích phân hố cả chồi và r , tạo cây hoàn ch nh [11].


9
Năm 1960, Morel đã thực hi n bƣớc ngoặt cách mạng trong sử dụng k
thuật nuôi cấy đ nh sinh trƣởng trong nhân nhanh các loại đ a lan Cymbidium,
mở đầu công nghi p vi nhân giống thực vật [11].

Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo đƣợc
cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt [11].
Năm 1971 Ta ebe và cộng sự đã tái sinh đƣợc cây từ tế bào trần mô th t
lá ở thuốc lá [11].
Năm 1978, Melcher và cộng sự đã tạo đƣợc cây lai soma cà chua – thuốc
lá bằng dung hợp tế bào trần [11].
Năm 1979, Marton và cộng sự đã xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen
vào tế bào trần bằng đồng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium [11].
Từ năm 1980 đến nay, hƣớng chuyển gen vào tế bào thông qua vi c nuôi
cấy mô tế bào và vi khuẩn Agrobacterium đƣợc triển khai rộng rãi. sau đó đƣa
vào m i trƣờng ni cấy [11].
. .3. Cơ ở khoa h c của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
1.2 3 1 T nh to n năng ủa tế

o

Cuối thế k XIX đầu thế k XX, nhà khoa học ngƣời Đức Haberlandt
(1902) lần đầu ti n đã quan ni m rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh
vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn
ch nh. Theo quan ni m của sinh học hi n đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân
hóa đều mang tồn bộ lƣợng thơng tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả cơ
thể sinh vật đó. Khi gặp điều ki n thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển
thành một cá thể hồn ch nh. Đó là tính tồn năng của tế bào.
Tính tồn năng của tế bào mà Haberlandt n u ra chính là cơ sở lý luận
của phƣơng pháp nu i cấy mô tế bào thực vật [10].
1 2 3 2 Sự ph n hóa v phản ph n hóa ủa tế

o

10
Cơ thể thực vật trƣởng thành là một ch nh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan chức năng hác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hi n các
chức năng cụ thể khác nhau. Tuy nhiên tất các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ tế
bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình
thành snhiều tế bào ph i sinh chƣa mang chức năng ri ng bi t (chuyên hóa). Sau
đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục đƣợc biến đổi thành các tế bào
chuy n hóa đặc hi u cho các m , cơ quan có chức năng hác nhau [10].
Tính phân hóa của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế
bào của các m chuy n hóa đảm nhi m các chức năng hác nhau trong cơ thể.
Q trình phân hóa có thể biểu di n nhƣ sau:
Tế bào phơi sinh

Tế bào dãn

Tế bào phân hố có chức năng ri ng bi t

Tuy nhiên, không phải các tế bào đã chuy n hóa cũng mất đi hả năng
phân hóa của mình mà khi gặp điều ki n thuận lợi, trong trƣờng hợp cần thiết
các tế bào này lại quay trở về dạng phơi sinh và phân chia liên tiếp. Đó gọi là
q trình phản phân hóa tế bào.

Phân hóa tế bào

Tế bào phơi sinh

Tế bào dãn

Tế bào chun hố

Phản phân hố tế bào
Về bản chất của sự phân hóa và phản phân hóa là một q trình hoạt
hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong q trình phát triển cơ
thể, cứ một gen đƣợc hoạt hóa để cho ra tính trạng mới, cịn một số gen khác
lại b đình ch hoạt động. Điều này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã
hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh
trƣởng phát triển của cơ thể thực vật đƣợc hài hịa. Mặt khác, khi tế bào nằm
trong một khối mơ của cơ thể thƣờng b ức chế bởi các tế bào xung quanh.


11
Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm ích thƣớc của khối mô sẽ tạo điều ki n
thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [10].
Q trình phát sinh hình thái trong ni cấy mơ, tế bào thực vật thực chất
là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. K thuật ni cấy
mô, tế bào xét đến cùng là k thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế
bào thực vật một cách có đ nh hƣớng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa
của tế bào tr n cơ sở tính tồn năng của tế bào thực vật [10].
1 2 3 3 Sự trẻ hóa
Trong ni cấy in vitro, khả năng ra chồi, r ở các thành phần khác nhau
là rất khác nhau. Vì vậy để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái
sinh lý hay tuổi mẫu: các mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều ki n và
m i trƣờng nuôi cấy nhanh, d tái sinh, đặc bi t trong nuôi cấy mơ sẹo, phơi.
Ngồi ra mơ non trẻ mới đƣợc hình thành, sinh trƣởng mạnh, mức độ nhi m
mầm b nh ít hơn. Vì vậy vi c trẻ hố là một bi n pháp quan trọng nhất trong
nhân giống sinh dƣỡng [10].
. .4. Cá giai o n trong kỹ thuật nhân giống in vitro
Q trình ni cấy in vitro đƣợc chia ra 5 giai đoạn:
Giai o n 1: Chọn lọc và chuẩn b cây mẹ
Trƣớc khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây

mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này phải sạch b nh, đặc bi t là
b nh virus và ở giai đoạn sinh trƣởng mạnh. Vi c trồng các cây mẹ trong điều
ki n m i trƣờng thích hợp với chế độ chăm sóc và phịng trừ sâu b nh hi u
quả trƣớc khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ l mẫu nhi m, tăng hả năng sống và
sinh trƣởng của mẫu cấy in vitro.
Giai o n 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử tr ng đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm
bảo các yêu cầu: tỷ l nhi m thấp, tỷ l sống cao, mô tồn tại và sinh trƣởng tốt.


12
Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại m , đúng giai đoạn phát triển của cây.
Quan trọng nhất là đ nh chồi ngọn, đ nh chồi nách và sau đó là đ nh chồi hoa,
cuối c ng là đoạn thân, mảnh lá…Chồi ngọn, chồi nách đƣợc sử dụng để nhân
nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc…ở súp lơ thì d ng
hoa từ non, ở bầu bí các mảnh lá mầm là ngun li u ni cấy thích hợp để nhân
nhanh in vitro. Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể đƣợc sử dụng làm mẫu cấy.
Giai o n 3: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số
lƣợng th ng qua các con đƣờng: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất đ nh,
tạo phơi vơ tính.
Phải xác đ nh đƣợc m i trƣờng và điều ki n ngoại cảnh thích hợp để có
hi u quả là cao nhất. Nếu m i trƣờng có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo
chồi. Điều ki n ni cấy thƣờng là 25 - 27oC và 16 giờ chiếu sáng/ngày,
cƣờng độ ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuy nhi n đối với mỗi loại đối tƣợng
ni cấy địi hỏi có chế độ nuôi cấy hác nhau: nhân nhanh súp lơ cần quang
chu kì chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân nhanh phong lan phalenopsis ở giai đoạn
đầu cần che tối.
Giai o n 4: Tạo cây in vitro hoàn ch nh
Để tạo r cho chồi, ngƣời ta chuyển chồi từ m i trƣờng nhân nhanh sang môi

trƣờng tạo r . M i trƣờng tạo r thƣờng đƣợc bổ sung một lƣợng nhỏ Auxin. Một
số chồi có thể phát sinh r ngay sau khi chuyển từ m i trƣờng nhân nhanh giàu
Cyto inin sang m i trƣờng khơng chứa chất điều hịa sinh trƣởng.
Giai o n 5: Thích ứng cây in vitro ngồi điều ki n tự nhiên
Để đƣa cây từ ống nghi m ra vƣờm ƣơm với tỷ l sống cao, cây sinh
trƣởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:


13
Cây trong ống nghi m đã đạt đƣợc nhƣng ti u chuẩn hình thái nhất đ nh
(số lá, số r , chiều cao cây). Cây con cao 5 - 7 cm và có từ 3 - 4 lá có thể
chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vơ trùng có bổ sung các chất dinh dƣỡng.
Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thốt
nƣớc. Phải chủ động điều ch nh đƣợc độ ẩm, sự chiếu sáng của vƣờm ƣơm,
cũng nhƣ có chế độ dinh dƣỡng phù hợp [10].
. .5. Môi ường nuôi cấy
1 2 5 1 Th nh phần ủa môi trường
Thành phần của m i trƣờng nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo lồi
thực vật, loại tế bào, mơ và cơ quan đƣợc ni cấy. Mặc dù có sự đa dạng về
thành phần và nồng độ các chất, nhƣng tất cả các loại m i trƣờng nuôi cấy
đều gồm các thành phần sau:

 Thành phần hữu ơ
- Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzym và
cofactor của các phản ứng sinh hóa. Quan trọng nhất là các vitamin nhóm B.
+ Thiamin cần cho trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp một số
aminoaxit, hàm lƣợng sử dụng 0,1 – 5mg/l.
+ Axit nicotinic tham gia tạo coenzym của chuỗi hô hấp, sử dụng 0,1 - 5mg/l.
+ Pyridoxin là một coenzym quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi
chất, sử dụng 0,1 – 1mg/l.

- Myo-inositol: là một loại đƣờng - rƣợu li n quan đến quá trình tổng hợp
phospholipit, pectin của thành tế bào và các h thống trong màng tế bào, tham
gia vào dinh dƣỡng khoáng, vận chuyển đƣờng và trao đổi hydratcacbon. Ngồi
ra cịn tham gia vào tích trữ vận chuyển và giải phóng auxin.
- Các aminoaxit amit: có vai trị quan trọng trong vi c phát sinh hình thái.


14
- Các thành phần hữu cơ phức tạp: Cazein thủy phân, d ch chiết nấm
men, nƣớc ép hoa quả… cung cấp th m nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin và
các khoáng chất.
 Thành phần vơ ơ
Gồm các muối khống, các ngun tố cần phải cung cấp là nitơ,
phospho, kali và sắt.
- Nitơ đƣợc đƣa vào m i trƣờng ở 2 dạng: nitrat (NO3-) và amon (NH4+) với
hàm lƣợng nitrat là 25 mM.
- Phospho đƣợc đƣa vào m i trƣờng ở dạng muối phosphate và 2 loại
muỗi đƣợc sử dụng nhiều nhất là NaH2PO4 và KH2PO4.
- Kali đƣợc cung cấp dƣới dạng KNO3, KCl và KH2PO4. Hàm lƣợng kali
trong m i trƣờng nuôi cấy thay đổi từ 2 – 25 mM.
- Sắt là nguyên tố vi lƣợng đƣợc đƣa vào m i trƣờng ở dạng muối
FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3..nhƣng cây rất khó hấp thụ, phải cho vào m i trƣờng
Na2EDTA để tạo ra muối phức NaFeEDTA để cây d dàng hấp thụ.


Nguồn cacbon

Loại hydratcacbon đƣợc sử dụng để đƣa vào m i trƣờng nuôi cấy phổ
biến là đƣờng saccarozơ với hàm lƣợng 6% (W/v). Những loại đƣờng
hác nhƣ: fructozơ, glucozơ, maltozơ, lactozơ,..ch dùng trong những

trƣờng hợp cá bi t. Hàm lƣợng đƣờng thấp đƣợc sử dụng trong nuôi cấy tế
bào trần, ngƣợc lại các hàm lƣợng đƣờng cao hơn có thể dùng cho ni cấy
hạt phấn, phơi [11].
 Chất iều hịa sinh trưởng
Các chất điều hịa sinh trƣởng là thành phần khơng thể thiếu trong mơi
trƣờng ni cấy, có vai trị quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái
thực vật in vitro. Hi u quả tác động của chất điều hòa sinh trƣởng phụ thuộc


15
vào: nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của chất điều hịa sinh trƣởng, mẫu
ni cấy [9]. Các chất điều hồ sinh trƣởng thực vật đƣợc chia thành các
nhóm chính sau đây: auxin, cytokinin, gibberellin.
- Nhóm Auxin: Đƣợc đƣa vào m i trƣờng nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự
sinh trƣởng và giãn nở tế bào, tăng cƣờng các quá trình sinh tổng hợp và trao
đổi chất, kích thích sự hình thành r và tham gia cảm ứng phát sinh phơi vơ
tính ... (Epstein&cs, 1989). Các loại Auxin thƣờng sử dụng cho nuôi cấy:
+ IAA (Indole acetic acid)
+ IBA (Indole butyric acid)
+ NOA (Naphthoxy acetic acid)
+ α - NAA (α- Naphthaleneacetic acid)
+ 2,4 D (2.4 diclorophenolxy acetic acid)...
IAA ít sử dụng do kém bền với nhi t và ánh sáng, nếu dùng thì ở hàm
lƣợng cao 1,0 -3,0 mg/l (Dodds & Robert, 1999). Các Auxin khác có hàm
lƣợng sử dụng từ 0,1-2,0 mg/l.
- Nhóm Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh
trƣởng của chồi in vitro (Miller, 1962). Các Cytokinin có biểu hi n ức chế sự
tạo r và sinh trƣởng của mô sẹo nhƣng có ảnh hƣởng dƣơng tính rõ r t đến
sự phát sinh phơi vơ tính của mẫu ni cấy. Các loại Cyto inin thƣờng dùng
trong nuôi cấy mô là:

+ Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine).
+ Kinetin (6-furfurylamino purine).
+ BAP (Bezylamino purine).
+ TDZ (Thidiazuzon).
+ 2 - ip (isopentenyi adenine)


16
Hàm lƣợng sử dụng của các Cyto inin dao động từ 0,1 - 2,0 mg/l. Ở
những nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ r t đến sự hình thành
chồi nách, đồng thời ức chế mạnh sự tạo r của chồi ni cấy. Trong các loại
Cytokinin nói trên, Kinetin và BAP là hai loại đƣợc sử dụng rộng rãi hơn cả.
Đa số các trƣờng hợp phải sử dụng phối hợp cả Auxin và Cytokinin ở
những tỷ l khác nhau [11].
- Nhóm Gibberellin: Ngồi hai nhóm chính là Auxin và Cytokinin, trong
ni cấy m ngƣời ta cịn sử dụng thêm Gibberellin để kích thích kéo dài tế
bào, qua đó làm tăng ích thƣớc của chồi ni cấy... GA3 là loại Gibberellin
đƣợc sử dụng thƣờng xuyên nhất. Tuy nhiên do mẫn cảm với nhi t độ nên
phải lọc qua màng lọc vô trùng rồi mới đƣa vào m i trƣờng.

 Các thành phần khác
- Tác nhân tạo gel: quyết đ nh trạng thái vật lý của m i trƣờng nuôi cấy.
Chất tạo gel đƣợc sử dụng phổ biến là agar; Hàm lƣợng sử dụng của agar 0,5
– 10% (W/v).
- Than hoạt tính: đƣợc dụng để hấp thụ các chất màu các hợp chất
phenol, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Than hoạt tính cũng hút các chất
hữu cơ nhƣ phytohoocmon, vitamin, sắt chelat, kẽm... Hàm lƣợng sử dụng
của than hoạt tính là 0,2-0,3 % (W/v).
1 2 5 2 pH ủa môi trường
pH của đa số các m i trƣờng nuôi cấy đều đƣợc điều ch nh trong phạm

vi 5,5 – 6. pH dƣới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, cịn pH lớn
hơn 6,0 agar có thể rất cứng. Nếu trong m i trƣờng có GA3 thì phải điều ch nh
giá tr pH trong phạm vi nói trên vì ở pH kiềm hoặc q axit thì GA3 sẽ chuyển
sang dạng khơng có hoạt tính. Trong q trình ni cấy, pH của m i trƣờng có
thể giảm xuống do một số mẫu thực vật sản sinh ra các axit hữu cơ [11].
1 2 5 3 T nh thẩm thấu ủa môi trường


17
Hấp thụ nƣớc của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy b chi phối bởi
thế năng của nƣớc trong d ch bào và trong m i trƣờng dinh dƣỡng.
Các thành phần chính có ảnh hƣởng đến thế năng của nƣớc trong m i trƣờng
bao gồm: hàm lƣợng đƣờng, hàm lƣợng agar, một số thành phần muối khoáng.
Đƣờng vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy đồng thời còn
tham gia vào điều ch nh khả năng thẩm thấu của m i trƣờng. Hàm lƣợng
đƣờng cao, mô nuôi cấy hó hút đƣợc nƣớc. Hàm lƣợng đƣờng thấp là một
trong những nguyên nhân gây ra hi n tƣợng thuỷ tinh hố ở mẫu ni cấy,
đây là trở ngại chính cho vi c chuyển cây từ ống nghi m ra vƣờn ƣơm hoặc
đồng ruộng [11].
1.2.6. Tầm quan tr ng của phương pháp nuôi ấy mô tế bào thực vật
Phƣơng pháp này có ý ngh a v c ng to lớn đối với vi c nghiên cứu lý
luận sinh học cơ bản, đồng thời có giá tr đóng góp trực tiếp cho thực ti n sản
xuất và đời sống.
Về mặt lý luận sinh học cơ bản: đã mở ra khả năng to lớn cho vi c tìm
hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống. Thực tế đã cho phép chúng ta tách và
nuôi cấy trƣớc hết là mô phân sinh (meristem) rồi từ đó cho ra nhóm tế bào
khơng chun hố gọi là mơ sẹo (callus) và từ mơ sẹo thì có thể kích thích
tái sinh và tạo cây hồn ch nh. Trong một cơ thể rất khó phân bi t từng giai
đoạn một cách chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Phƣơng pháp
ni cấy mơ có thể khắc phục đƣợc hó hăn tr n tạo ra các bƣớc phát sinh

hình thái đƣợc phân bi t một cách rõ r t. Điều này tạo thuận lợi cho công tác
nghiên cứu về các quy luật sinh trƣởng, phát triển cùng mối quan h giữa
chúng với bên ngoài.
Về mặt thực ti n sản xuất: Phƣơng pháp nu i cấy m đƣợc sử dụng để
bảo tồn và nhân nhanh các giống cây trồng quý, có giá tr kinh tế cao. Hi n
nay phƣơng pháp này đã trở thành phổ biến và áp dụng trong công tác chọn
giống cây trồng. Bằng phƣơng pháp này ch sau thời gian ngắn chúng ta có