Nghiên cứu thủy phân triglyceride trong dầu dừa để thu nhận các phân đoạn acid béo tự do có hoạt tính sinh học p1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THỊ ÁI VÂN

NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN TRIGLYCERIDE TRONG DẦU
DỪA ĐỂ THU NHẬN CÁC PHÂN ĐOẠN ACID BÉO TỰ DO
CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KĨ THUẬT

TP. HỒ CHÍ MINH NĂM 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THỊ ÁI VÂN

NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN TRIGLYCERIDE TRONG DẦU
DỪA ĐỂ THU NHẬN CÁC PHÂN ĐOẠN ACID BÉO TỰ DO
CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Chun ngành:
Cơng nghệ thực phẩm
Mã số chun ngành:
62540101

Phản biện độc lập 1:
Phản biện độc lập 2:

Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS. TS Phan Ngọc Hịa
2. TS. Trần Bích Lam


LỜI CAM ĐOAN
Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết quả
nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất
kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã
được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo theo đúng quy định.

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Ái Vân

i


TÓM TẮT LUẬN ÁN
Phản ứng thủy phân dầu dừa (VCO) với bốn loại enzyme lipase khác nhau để thu nhận
acid béo tự do được nghiên cứu. Các thông số kỹ thuật đã được khảo sát như tỉ lệ
dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/ cơ chất, pH, nhiệt độ và động học enzyme. Kết quả khảo sát
cho thấy, với bốn loại enzyme lipase có nguồn gốc trích ly và tính đặc hiệu khác nhau,
thể hiện khả năng xúc tác phản ứng khác nhau trên cơ chất dầu dừa VCO. Trong đó,
enzyme lipase Candida rugosa (CRL) có nguồn gốc từ nấm men Candida rugosa xúc
tác phản ứng thủy phân dầu VCO để thu nhận acid béo tự do (FFA) là phù hợp nhất.

Hỗn hợp FFA được thu nhận sau phản ứng thủy phân tiếp tục trải qua q trình chưng
cất chân khơng để thu nhận 3 phân đoạn FFA1, FFA2 và FFA3 có hàm lượng acid béo
mạch trung bình (C6 – C10), acid lauric (C12) và acid béo mạch dài (C14 – C18) lần
lượt là 12,6%, 38,4% và 49%. Hoạt tính sinh học của ba phân đoạn acid béo này được
thể hiện qua khả năng kháng khuẩn và tác động đến hàm lượng cholesterol trong máu
của chuột giống Wistar với chế độ ăn giàu béo (HFD). Các phân đoạn acid béo tự do
này được đánh giá khả năng kháng một số loại vi khuẩn thường gây bệnh trong thực
phẩm như Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtilis (ATCC 11774),
Escherichia coli (ATCC 25922) và Salmonella enteritidis (ATCC 13076). Trong đó,
FFA1 thể hiện khả năng ức chế được bốn loại vi khuẩn trên mạnh nhất, kế đến là
FFA2, cịn lại FFA3 khơng thể hiện khả năng kháng đối với bốn loại vi khuẩn kể trên.
Thử nghiệm trên chuột giống Wistar với chế độ ăn HFD, kết quả cho thấy rằng, với
chế độ điều trị bằng FFA3 không những làm tăng trọng lượng, tăng chỉ số men gan
ALT, AST mà cịn gây viêm gan. Trong khi đó, FFA1 giúp giảm chỉ số men gan ALT,
AST; giảm hàm lượng cholesterol tổng và triglyceride, đồng thời giúp giảm trọng
lượng khi so với chuột ăn chế độ HFD. Riêng FFA2 đã giúp chuột ăn chế độ HFD
giảm chỉ số men gan ALT, AST; giảm trọng lượng và tăng chỉ số cholesterol “tốt”
HDL. Như vậy, các acid béo tự do mạch trung bình (MCFA) và acid lauric được thu
nhận từ dầu VCO đã góp phần tăng hiệu quả trong việc giảm các chỉ số sinh hóa máu
dẫn đến làm lành tổn thương gan bởi chế độ ăn giàu béo của chuột giống Wistar.

ii


ABSTRACT
In this study, to obtain free fatty acids (FFAs), virgin coconut oil (VCO) was
hydrolyzed by four types of lipase derived from differently original extraction and
having catalytic specificity for triglyceride. In particular, the lipase extracted from
Candida rugosa was most suitable for the hydrolysis of VCO to acquire FFAs. After
vacuum distillation, the initial FFAs composition was categorized into three groups

that have different carbon chain lengths and are enriched in the content of each FFA
fraction. They include FFA1, FFA2, and FFA3 containing 97,31% of C6 - C12,
76,49% of C12, and 85,86% of C14 – C18, respectively. Then, the antibacterial
properties of FFAs were tested against four food pathogenic bacteria, including
Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtilis (ATCC 11774), Escherichia
coli (ATCC 25922) and Salmonella enteritidis (ATCC 13076). In which, two fractions
FFA1 and FFA2 exhibited significant resistance. The group FFA1 inhibit the growths
of all foodborne pathogens, followed by group FFA2. FFA3, however, was not as
effective as an antibacterial agent. In terms of the effect of groups FFA1, FFA2 and
FFA3 on the cholesterol level in mice fed an HFD diet. The results showed that group
FFA3 not only increased ALT as well as AST level but also caused hepatitis. With
FFA1 treatment, the levels of ALT, AST, cholesterol and triglyceride were reduced in
comparison with HFD-fed mice. Particularly, FFA2 showed better results in reducing
ALT, AST than other groups and increasing HDL cholesterol levels while remaining
the normal status of liver tissue via histologically liver analysis. Additionally, medium
chain fatty acid (MCFA) and lauric acid (C12) present in VCO content contributed to
increasing the efficiency of reducing some blood biochemical values, resulting in the
healing of liver damage caused by high-fat diet (HFD) in Wistar mice.

iii


LỜI CÁM ƠN
Tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến,
PGS. TS Phan Ngọc Hịa, người cơ kính mến đã dẫn đường nghiên cứu khoa học
xuyên suốt cho luận án này.
TS. Trần Bích Lam, cơ giáo tận tụy đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết để
hướng dẫn khoa học cho nghiên cứu này.
GS.TS Lê Văn Việt Mẫn, người thầy đáng kính đã cho tơi những lời khun bổ ích
trong suốt quá trình học tập – nghiên cứu. Tập thể giảng viên bộ môn Công Nghệ

Thực Phẩm, khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM đã
chân thành góp ý và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án.
Bên cạnh đó, tập thể nghiên cứu vô cùng cám ơn quý công ty TNHH Chế Biến Dừa
Lương Quới (tỉnh Bến Tre) đã tài trợ tồn bộ dầu dừa VCO, là ngun liệu chính để
thực hiện nghiên cứu. Đồng thời, chúng tôi xin gửi lời cám ơn đến quý công ty
Novozymes, đại diện bởi công ty Brenntag Việt Nam đã tài trợ hai loại enzyme cơng
nghiệp để phục vụ nghiên cứu này.
Có những giai đoạn khó khăn, thì ơng xã là người ln ở bên động viên, cùng tơi
vượt qua mọi trở ngại để hồn thành luận án.
Con xin cám ơn ba mẹ và anh chị em hai bên gia đình đã ln hỗ trợ và là nguồn
cảm hứng cho con học tập, nghiên cứu.

iv


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................. x
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................... xii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. xiii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ........................................................................................ 5
1.1 Dầu dừa và các hợp chất có hoạt tính sinh học của nó ......................................... 5
1.1.1 Định nghĩa dầu dừa....................................................................................................5
1.1.2 Phân loại .....................................................................................................................5
1.1.2.1 Dầu dừa tinh luyện ................................................................................. 5
1.1.2.2 Dầu dừa tinh khiết .................................................................................. 5
1.1.3 Đặc tính dầu dừa VCO ..............................................................................................6
1.1.4 Các chất có hoạt tính sinh học trong dầu dừa VCO ................................................8
1.1.5 Triglyceride của acid béo no mạch trung bình trong dầu dừa.................................9
1.1.6 Sự chuyển hóa MCT trong cơ thể...........................................................................10

1.1.6.1 Q trình tiêu hóa, hấp thụ MCT.......................................................... 10
1.1.6.2 Q trình chuyển hóa Acid lauric ......................................................... 12
1.1.7 Các nghiên cứu liên quan đến hoạt tính sinh học của MCFA trong dầu dừa ......14
1.2 Các phương pháp thủy phân dầu VCO ............................................................... 16
1.3 Enzyme lipase ..................................................................................................... 17
1.3.1 Tính chất của enzyme lipase ...................................................................................17
1.3.2 Cơ chế xúc tác của các chế phẩm enzyme lipase...................................................18
1.3.3 Phân loại lipase chế phẩm .......................................................................................19
1.3.3 Các nghiên cứu liên quan đến thủy phân chất béo bởi enzyme lipase .................19
1.4 Phương pháp tách phân đoạn.............................................................................. 21
1.5 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu ...................................................................... 21
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 23
2.1 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 23
2.1.1 Dầu dừa ....................................................................................................................23
v


2.1.2 Chế phẩm enzyme lipase.........................................................................................23
2.1.2.1 Lypozyme TL 100L .............................................................................. 23
2.1.2.2 Lypozyme TL IM ................................................................................. 23
2.1.2.3 Candida rugosa lipase (CRL) ............................................................... 23
2.1.2.4 Porcine pancreas lipase (PPL) .............................................................. 24
2.1.3 Chủng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy ................................................................24
2.1.3.1 Chủng vi khuẩn .................................................................................... 24
2.1.3.2 Môi trường nuôi cấy ............................................................................. 24
2.1.3.3 Đối chứng dương .................................................................................. 24
2.1.4 Chuột thí nghiệm .....................................................................................................25
2.1.4.1 Chuột .................................................................................................... 25
2.1.4.2 Thức ăn cơ sở ....................................................................................... 25
2.1.4.3 Thức ăn giàu béo – high fat diet (HFD) ............................................... 25

2.1.4.4 Đối chứng dương .................................................................................. 25
2.1.5 Hóa chất....................................................................................................................26
2.1.6 Thiết bị......................................................................................................................26
2.1.6.1 Thiết bị nghiên cứu quá trình thủy phân dầu VCO .............................. 26
2.1.6.2 Thiết bị nghiên cứu quá trình thu nhận các tổ hợp acid béo tự do ....... 26
2.1.6.3 Thiết bị nghiên cứu hoạt tính sinh học của các tổ hợp acid béo tự do . 27
2.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 27
2.2.1 Khảo sát quá trình thủy phân dầu VCO bởi bốn loại enzyme lipase khác nhau..28
2.2.1.1 Khảo sát nguyên liệu dầu VCO và hoạt tính enzyme lipase. ............... 28
2.2.1.2 Khảo sát các yếu tố tác động lên quá trình thủy phân dầu VCO bởi bốn
loại enzyme lipase. ........................................................................................... 28
2.2.1.3 Động học enzyme lipase. ...................................................................... 28
2.2.1.4 Khảo sát mức độ thủy phân dầu VCO được xúc tác bởi 4 loại enzyme
lipase theo thời gian.......................................................................................... 29
2.2.2 Thu nhận các phân đoạn acid béo tự do .................................................................29
2.2.2.1 Thu nhận sản phẩm sau thủy phân ....................................................... 29
2.2.2.2 Thu nhận các phân đoạn acid béo tự do. .............................................. 29

vi


2.2.3 Khảo sát hoạt tính sinh học của các phân đoạn acid béo tự do. ............................29
2.2.3.1 Khả năng kháng khuẩn của FFA, HVCO và VCO. .............................. 29
2.2.3.2 Khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn acid béo FFA1, FFA2 và
FFA3. ................................................................................................................ 29
2.2.3.3 Tác động của các phân đoạn acid béo FFA1, FFA2 và FFA3 đến hàm
lượng cholesterol trong máu. ............................................................................ 30
2.3 Bố trí thí nghiệm................................................................................................. 30
2.3.1 Thí nghiệm khảo sát q trình thủy phân dầu VCO ..............................................30
2.3.1.1 Thí nghiệm khảo sát nguyên liệu dầu VCO và hoạt tính enzyme lipase

.......................................................................................................................... 30
2.3.1.2 Thí nghiệm khảo sát q trình thủy phân dầu VCO ............................. 31
2.3.1.3 Thí nghiệm khảo sát động học enzyme lipase ...................................... 35
2.3.1.4 Thí nghiệm khảo sát mức độ thủy phân dầu VCO theo thời gian ........ 37
Thí nghiệm thu nhận các phân đoạn acid béo tự do.......................................................37
2.3.2....................................................................................................................................37
2.3.2.1 Thí nghiệm thu nhận sản phẩm thủy phân FFA và HVCO .................. 37
2.3.2.2 Thí nghiệm thu nhận các phân đoạn acid béo tự do FFA1, FFA2 và
FFA3 ................................................................................................................. 38
2.3.3 Thí nghiệm khảo sát hoạt tính sinh học của các phân đoạn acid béo tự do..........39
2.3.3.1 Thí nghiệm xác định hoạt tính kháng khuẩn ........................................ 39
2.3.3.2 Thí nghiệm xác định hoạt tính của các phân đoạn acid béo ảnh hưởng
đến hàm lượng cholesterol và trọng lượng chuột ............................................. 40
i). Cân trọng lượng cơ thể, trọng lượng gan và trọng lượng gan tương đối ..... 41
ii). Xác định chỉ số sinh hóa máu và men gan .................................................. 42
iii) Phân tích mơ học......................................................................................... 44
iv) Thu nhận, phân tích cholesterol và thành phần acid béo trong gan chuột .. 45
2.4 Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 45
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................... 46
3.1 Kết quả nghiên cứu quá trình thủy phân dầu VCO bởi enzyme lipase .............. 46
3.1.1 Tính chất nguyên liệu dầu VCO và hoạt tính enzyme lipase ................................46
3.1.1.1 Các chỉ số ban đầu của dầu VCO ......................................................... 46

vii


3.1.1.2 Hoạt tính của bốn loại enzyme lipase trên cơ chất dầu VCO ............... 47
3.1.2 Nghiên cứu quá trình thủy phân dầu VCO bởi 4 loại enzyme lipase ...................48
3.1.2.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ VCO/đệm (w/w) đến mức độ thủy phân dầu VCO
bởi 4 loại enzyme lipase ................................................................................... 48

3.1.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme đến mức độ thủy phân dầu VCO bởi 4 loại
enzyme lipase ................................................................................................... 50
3.1.2.3 Ảnh hưởng pH đến mức độ thủy phân dầu VCO của 4 loại enzyme
lipase ................................................................................................................. 52
3.1.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến mức độ thủy phân của 4 loại enzyme ........... 54
3.1.3 Động học enzyme lipase .........................................................................................56
3.1.3.1 Động học enzyme Lypozyme TL 100L................................................ 56
3.1.3.2 Động học enzyme TL IM ..................................................................... 57
3.1.3.3 Động học enzyme CRL ........................................................................ 58
3.1.3.4 Động học enzyme PPL ......................................................................... 59
3.1.3.5 So sánh động học của 4 loại enzyme lipase xúc tác phản ứng thủy phân
dầu VCO ........................................................................................................... 61
3.1.3.6 Khảo sát mức độ thủy phân dầu VCO bởi bốn loại enzyme lipase theo
thời gian ............................................................................................................ 64
Thu nhận các phân đoạn acid béo tự do .................................................................. 66
3.2 ............................................................................................................................. 66
3.2.1 Thu nhận sản phẩm sau thủy phân (FFA và HVCO) ............................................66
3.2.2 Thu nhận các phân đoạn acid béo tự do FFA1, FFA2, FFA3...............................68
3.2.2.1 Tỷ lệ phần trăm khối lượng giữa các phân đoạn .................................. 68
3.2.2.2 Thành phần acid béo trong từng phân đoạn ......................................... 69
3.3 Hoạt tính sinh học của các phân đoạn acid béo tự do ........................................ 71
3.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn acid béo tự do ....................................71
3.3.1.1 Hoạt tính kháng khuẩn của FFA, HVCO và VCO ............................... 71
3.3.1.2 Hoạt tính kháng khuẩn của FFA1, FFA2 và FFA3 .............................. 73
3.3.2 Hoạt tính của các phân đoạn acid béo tự do tác động đến hàm lượng cholesterol
trong máu ...........................................................................................................................76
3.3.2.1 Thay đổi trọng lượng ở chuột ............................................................... 76

viii

3.3.2.2 Kết quả sinh hóa máu ........................................................................... 78
3.3.2.3 Kết quả giải phẫu mô học ..................................................................... 83
3.3.2.4 Hàm lượng cholesterol trong gan ở các chế độ điều trị (thí nghiệm đợt
2) ....................................................................................................................... 85
3.3.2.5 Thành phần acid béo trong gan ở các chế độ điều trị (thí nghiệm đợt 2)
.......................................................................................................................... 86
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 89
4.1 Kết luận .............................................................................................................. 89
Về mặt khoa học ...............................................................................................................89
Về mặt ứng dụng ...............................................................................................................90
4.2 Kiến nghị ............................................................................................................ 90

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Dầu dừa thương phẩm ..................................................................................... 6
Hình 1.2 Sơ đồ q trình tiêu hóa MCT [7] ................................................................. 10
Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa acid lauric trong cơ thể [7] ............................................... 13
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................... 27
Hình 2.3 Quy trình thu nhận FFA [45] ......................................................................... 37
Hình 3.1 Ảnh hưởng tỉ lệ dầu/ đệm (w/w) đến mức độ thủy phân dầu VCO bởi 4 loại
enzyme lipase. .............................................................................................................. 49
Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme đến mức độ thủy phân dầu VCO bởi 4 loại
enzyme lipase. .............................................................................................................. 50
Hình 3.3 Ảnh hưởng pH đến mức độ thủy phân của 4 loại enzyme. ........................... 53
Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến mức độ thủy phân dầu VCO bởi 4 loại enzyme
lipase ............................................................................................................................. 54
Hình 3.5 Mối liên hệ giữa 1[S]  và 1V của phản ứng thủy phân dầu VCO bởi enzyme

Lypozyme TL 100L được biểu diễn dưới dạng đồ thị Lineweaver – Burk.................. 57
Hình 3.6 Đồ thị Lineweaver – Burk biểu diễn quá trình thủy phân dầu VCO bởi
enzyme Lypozyme TL IM ............................................................................................ 58
Hình 3.7 Đồ thị Lineweaver – Burk biểu diễn quá trình thủy phân dầu VCO bởi
enzyme CRL ................................................................................................................. 59
Hình 3.8 Đồ thị Lineweaver – Burk biểu diễn quá trình thủy phân dầu VCO bởi
enzyme PPL .................................................................................................................. 61
Hình 3.9 Mức độ thủy phân dầu VCO được xúc tác bởi bốn loại enzyme lipase trong
bốn giờ đầu phản ứng ................................................................................................... 62
Hình 3.10 Mức độ thủy phân dầu VCO được xúc tác bởi 4 loại enzyme lipase .......... 66
Hình 3.11 Thành phần FFA được giải phóng bởi 4 loại enzyme lipase. ...................... 67
Hình 3.12 Thành phần FFA phân đoạn 1. .................................................................... 69
Hình 3.13 Thành phần FFA phân đoạn 2. .................................................................... 70
Hình 3.14 Thành phần FFA phân đoạn 3. .................................................................... 70
Hình 3.15 Khả năng kháng khuẩn của FFA, HVCO và VCO lên 4 loại vi khuẩn thử
nghiệm. ......................................................................................................................... 72

x


Hình 3.16 Đường kính kháng khuẩn của FFA1, FFA2, FFA3 và FFA tổng trên 4 loại
vi khuẩn thử nghiệm ..................................................................................................... 74
Hình 3.17 Sự thay đổi chỉ số enzyme a) Aspartate transaminase (AST) và b) Alanine
transaminase (ALT) với chế độ ăn HFD kết hợp với uống các tác nhân điều trị khác nhau
...................................................................................................................................... 78
Hình 3.18 Kết quả giải phẫu mơ học trên gan chuột. ................................................... 83
Hình 3.19 Hàm lượng cholesterol trong các mẫu thí nghiệm ...................................... 85
Hình 3.20 Kết quả phân tích thành phần acid béo ........................................................ 86

xi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học và chỉ số chất lượng của dầu VCO [57]. ...................... 7
Bảng 1.2 Giới hạn kim loại nặng trong dầu dừa VCO [57] .......................................... 7
Bảng 1.3 Thành phần acid béo trong dầu dừa VCO [57] ............................................... 8
Bảng 2.1 Phương pháp xác định các chỉ số của dầu VCO. .......................................... 30
Bảng 2.2 Phân nhóm chuột và chế độ ăn của mỗi nhóm (đợt 1). ................................. 41
Bảng 2.3 Phân nhóm chuột và chế độ ăn của mỗi nhóm (đợt 2). ................................. 41
Bảng 3.1 Chỉ số ban đầu của dầu VCO ........................................................................ 46
Bảng 3.2 Thành phần acid béo trong dầu VCO nguyên liệu ........................................ 47
Bảng 3.3 Hoạt tính của bốn loại enzyme lipase khi bắt đầu thí nghiệm ...................... 48
Bảng 3.4 Vận tốc phản ứng thủy phân dầu VCO bởi enzyme Lypozyme TL100L ở các
nồng độ cơ chất ban đầu khác nhau.............................................................................. 56
Bảng 3.5 Vận tốc phản ứng thủy phân dầu VCO bởi enzyme Lypozyme TL IM ở các
nồng độ cơ chất ban đầu khác nhau.............................................................................. 57
Bảng 3.6 Vận tốc phản ứng thủy phân dầu VCO bởi enzyme CRL ở các nồng độ cơ
chất ban đầu khác nhau ................................................................................................ 59
Bảng 3.7 Vận tốc phản ứng thủy phân dầu VCO bởi enzyme PPL ở các nồng độ cơ chất
ban đầu khác nhau ........................................................................................................ 60
Bảng 3.8 Thông số động học của bốn loại enzyme lipase ........................................... 61
Bảng 3.9 Tỷ lệ giữa các phân đoạn. ............................................................................. 68
Bảng 3.10 Đường kính vịng kháng khuẩn của FFA, HVCO và VCO lên 4 loại vi
khuẩn thử nghiệm. ........................................................................................................ 72
Bảng 3.11 Đường kính kháng khuẩn của các phân đoạn FFA1, FFA2, FFA3 và FFA
tổng. .............................................................................................................................. 74
Bảng 3.12 Sự thay đổi trọng lượng chuột ở các chế độ điều trị khác nhau. ................. 76
Bảng 3.13 Ảnh hưởng của các chế độ ăn và điều trị khác nhau lên chỉ số sinh hóa máu.
...................................................................................................................................... 79

xii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu
ATCC

Thuật ngữ tiếng Anh
American

Type

Tiếng Việt

Culture

Collection

Bộ sưu tập giống chủng Hoa Kỳ

ALT

Alanine transaminase

Chỉ số men gan ALT

AST

Aspartate transaminase

Chỉ số men gan AST

B. substilis

Bacillus substilis

Bacillus substilis

CRL

Candida rugosa lipase

Lipase từ nấm Candida rugosa

CFU

Colony Forming Unit

Đơn vị tạo thành khuẩn lạc

E. coli

Escherichia Coli

Escherichia Coli

E

Enzyme

Enzyme

FFA

Free Fatty Acid

Acid béo tự do

GC – FID
HDL

Gas Chromatography - Flame Sắc ký khí với đầu dị ion hóa ngọn lửa
Ionisation Detector
High density lipoprotein
Lipoprotein cholesterol tỷ trọng cao

HVCO

Hydrolyzed virgin coconut oil Dầu dừa thủy phân chưa hoàn toàn

HFD

High fat diet

Chế độ ăn giàu chất béo

LCFA

Long chain fatty acid

Acid béo mạch dài

LCT

Long chain triglyceride

Mạch triglyceride dài

LDL

Low density lipoprotein

Lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp

LCAD
MCAD

Long-chain acyl-CoA

Acyl-CoA dehydrogenase mạch dài

dehydrogenase
Medium

chain

acyl-CoA Acyl-CoA dehydrogenase mạch trung

dehydrogenase

bình

MCFA

Medium chain fatty acid

Acid béo mạch trung bình

MCT

Medium chain triglyceride

Mạch triglyceride trung bình

PPL

Porcine pancreas lipase

Lipase từ tụy heo

P

Product

Sản phẩm

SCAD

Short-chain

acyl-CoA

Acyl-CoA dehydrogenase mạch ngắn

dehydrogenase

S

Substrate

Cơ chất

S. aureus

Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus

S. enteritidis Salmonella enteritidis

Salmonella enteritidis
xiii


TC

Total cholesterol

Cholesterol tổng

VCO

Virgin coconut oil

Dầu dừa tinh khiết

VLCAD

Very-long-chain acylCoAdehydrogenase

Acyl-CoA dehydrogenase mạch rất dài

xiv


MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam có sản lượng dầu thực vật thấp, nhập khẩu nhiều, nhưng một số nguồn dầu
trong nước chưa được khai thác chế biến tốt, nhiều nơi vẫn cịn bán ngun liệu thơ,
trong khi từ các nguyên liệu này có thể tạo ra các sản phẩm có giá trị sử dụng cao. Dầu
dừa là một nguồn dầu béo chính của Việt Nam. Dầu dừa có thành phần acid béo mạch
cacbon từ C6 đến C18, chủ yếu là các acid béo bão hịa, có đặc điểm là hàm lượng lớn
các acid béo no mạch trung bình, khó bị oxi hóa. Ở một số nước Đơng Nam Á như
Philippines, Indonesia và Thái Lan, từ dầu dừa đã sản xuất nhiều sản phẩm có giá trị,
dùng trong dược phẩm và mỹ phẩm.
Theo một số cơng bố thì dầu dừa VCO có khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol
trong máu (Harini, 2009). Những nghiên cứu trước đây cũng đã chứng minh rằng, các
triglyceride của acid béo mạch trung bình dễ dàng được hấp thu và giải phóng thành
năng lượng, làm tăng cảm giác no sớm, nên giảm ăn, do đó giúp giảm được trọng

lượng (St – Onge và cộng sự, 2002). Mặt khác, nhiều nghiên cứu cho thấy, khi ở trạng
thái tự do, các acid béo mạch trung bình trong dầu dừa thể hiện được khả năng kháng
khuẩn và kháng nấm (Shilling và cộng sự, 2013; Beena Shino và cộng sự, 2016). Đặc
biệt là công dụng của acid lauric – một acid béo mạch trung bình điển hình trong dầu
dừa, đã thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu và chế biến thực phẩm nhờ hoạt tính
sinh học cao, như khả năng kháng vi khuẩn, kháng nấm mốc và kháng virút (Kim và
cộng sự, 2016; Sun và cộng sự, 2003; F.M. Dayrit, 2014).
Tùy thuộc vào điều kiện thủy phân dầu dừa, có thể thu được các sản phẩm thuỷ phân
có tính chất khác nhau, vì thế có giá trị sinh học khác nhau. Tuy nhiên, việc nghiên
cứu thủy phân dầu dừa bằng enzyme đến nay vẫn chưa có hệ thống, đặc biệt là tính
chất sinh học của các phân đoạn acid béo trong dầu VCO thì hầu như chưa được
nghiên cứu.
Từ những cơ sở trên, luận án này sẽ nghiên cứu thủy phân triglyceride trong dầu dừa
để thu nhận các phân đoạn acid béo tự do có hoạt tính sinh học.

1


Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của luận án là chọn được loại enzyme lipase phù hợp để thủy phân dầu VCO
nhằm thu nhận các phân đoạn acid béo tự do có khả năng kháng lại một số loại vi
khuẩn gây bệnh trong thực phẩm và có khả năng cải thiện hàm lượng cholesterol trong
máu.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng được sử dụng để thu nhận chất có hoạt tính sinh học là dầu VCO, do cơng
ty TNHH Chế Biến Dừa Lương Quới, tỉnh Bến Tre sản xuất và tài trợ. Các enzyme
lipase được sử dụng để thủy phân dầu VCO có nguồn gốc trích ly đa dạng như từ nấm
men Candida rugosa (Sigma – Alrich), từ tụy heo lipase porcine pancreas (Sigma –
Alrich); từ nấm mốc Thermomyces lanuginosus, có 2 chế phẩm là Lypozyme TL 100L
(chế phẩm enzyme tự do) và Lypozyme TL IM (chế phẩm enzyme cố định)

(Novozymes). Các chủng vi khuẩn thử nghiệm là Staphylococcus aureus (ATCC
25923), Bacillus subtilis (ATCC 11774), Escherichia coli (ATCC 25922) và
Salmonella enteritidis (ATCC 13076) được cung cấp bởi công ty Microbiologics Co.
(USA). Chuột giống Wistar được cung cấp bởi Viện Pasteur TpHCM.
Dầu VCO được thủy phân bởi bốn loại enzyme lipase trên. Xác định qui luật ảnh
hưởng của các yếu tố như tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất, pH và nhiệt độ đến mức
độ thủy phân dầu VCO của mỗi loại enzyme lipase. Xác định thông số động học 𝐾! và
𝑉!"# của mỗi loại enzyme lipase xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO. Xác định loại
enzyme lipase phù hợp nhất để thủy phân dầu VCO. Thu nhận sản phẩm sau thủy phân
là các acid béo tự do (FFA). Từ hỗn hợp acid béo sau thủy phân, thu nhận các phân
đoạn acid béo tự do mạch trung bình MCFA (FFA1), acid lauric (FFA2) và acid béo tự
do mạch dài LCFA (FFA3). Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn FFA1,
FFA2, FFA3 lên bốn loại vi khuẩn thử nghiệm ở trên. Khảo sát ảnh hưởng của các
phân đoạn acid béo tự do này đến hàm lượng cholesterol trong máu của chuột giống
Wistar với chế độ ăn giàu béo (HFD).

2


Đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học và tính mới
-

Đã xác định được qui luật thủy phân dầu VCO của bốn loại enzyme lipase bị
tác động bởi bốn yếu tố như: tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất, pH và nhiệt
độ, đồng thời xác định các thông số động học của mỗi loại enzyme lipase trên
cơ chất dầu VCO. Trên cơ sở đó, đã chọn được loại enzyme lipase và điều kiện
thủy phân dầu VCO phù hợp để thu sản phẩm và phân đoạn acid béo như mong
muốn FFA1, FFA2 và FFA3.

-

Đã xác định được khả năng kháng lại bốn loại vi khuẩn Staphylococcus aureus
(ATCC 25923), Bacillus subtilis (ATCC 11774), Escherichia coli (ATCC
25922) và Salmonella enteritidis (ATCC 13076) của các phân đoạn acid béo
FFA1, FFA2 và FFA3. Khả năng kháng khuẩn của 3 phân đoạn acid béo này
được thể hiện như sau, hoạt tính kháng khuẩn của FFA1 cao hơn FFA2. Riêng
FFA3 không thể hiện khả năng kháng cả bốn loại vi khuẩn kể trên.

-

Bước đầu xác định được ảnh hưởng của các phân đoạn FFA1, FFA2 và FFA3
đến sự chuyển hóa trong cơ thể chuột. FFA1 và FFA2 vừa giúp giảm hàm
lượng cholesterol trong máu vừa giúp giảm trọng lượng của chuột được cho ăn
chế độ HFD. Riêng FFA3 (phân đoạn chứa nhiều acid béo tự do mạch dài, C14
– C18), không những không cải thiện trọng lượng chuột được cho ăn chế độ
HFD mà còn gây viêm gan.

Ý nghĩa thực tiễn
-

Đã xác định được điều kiện thủy phân dầu VCO phù hợp nhất cho từng loại
enzyme lipase và chọn được loại enzyme thủy phân VCO với mức độ thủy phân
cao nhất trong thời gian ngắn nhất và hàm lượng acid béo mạch trung bình
(MCFA) được giải phóng lên đến 61.37%.

-

Đã thu nhận được các phân đoạn acid béo tự do FFA1, FFA2 và FFA3, đồng
thời xác định được thành phần cũng như hàm lượng của các acid béo tự do

trong các phân đoạn trên.

3


-

Đã chứng minh được, các acid béo có mạch cacbon từ C6 đến C12 (FFA1 và
FFA2) là có hoạt tính kháng bốn loại vi khuẩn thử nghiệm, còn acid béo có
mạch cacbon từ C14 đến C18 (FFA3) thì khơng có hoạt tính kháng bốn loại vi
khuẩn kể trên.

-

Đã xác định được hai phân đoạn FFA1 và FFA2 có khả năng cải thiện hàm
lượng cholesterol trong máu và trọng lượng của chuột giống Wistar được cho
ăn chế độ HFD. Trong khi đó, phân đoạn FFA3, chứa chủ yếu là các acid béo
mạch dài, khơng những gây viêm gan mà cịn làm tăng trọng so với chuột được
cho ăn chế độ HFD.

Bố cục của luận án:
Luận án gồm có 4 chương. Mở đầu. Chương 1 Tổng quan. Chương 2 Vật liệu và
phương pháp nghiên cứu. Chương 3 Kết quả và biện luận. Chương 4 Kết luận và kiến
nghị.

4


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 Dầu dừa và các hợp chất có hoạt tính sinh học của nó
1.1.1 Định nghĩa dầu dừa
Theo A.M. Marina và cộng sự (2009), dầu dừa (CO) được thu nhận từ cơm dừa khô 12
tháng tuổi, cơm dừa trải qua giai đoạn sấy khô bằng nhiệt hoặc sử dụng ánh nắng mặt
trời. Dầu có màu vàng, khơng thích hợp cho việc sử dụng làm dầu thực phẩm, cần phải
trải qua quá trình tinh chế. Nếu quá trình tách chiết dầu dừa không hợp vệ sinh và
không trải qua quá trình tinh luyện thì dầu dừa dễ bị nhiễm nấm mốc và oxi hóa [1].
1.1.2 Phân loại
1.1.2.1 Dầu dừa tinh luyện
Theo tác giả Fabian Dayrit và cộng sự (2008), dầu dừa tinh luyện là sản phẩm của quá
trình tinh luyện, làm sạch, khử màu, khử mùi (RBD) của dầu dừa CO để phù hợp trong
chế biến thực phẩm. Dầu dừa tinh luyện không mùi vị lạ, màu vàng nhạt, khó bị ơxy
hóa, giữ được hương vị và chất lượng của dầu [2].
1.1.2.2 Dầu dừa tinh khiết
Theo tác giả Marina và cộng sự (2009), Dầu dừa tinh khiết cịn có tên gọi là dầu dừa
nguyên chất (virgin coconut oil – VCO) xuất phát từ phương pháp thu nhận giảm thiểu
sự biến đổi của dầu. Dầu VCO không màu và trong gần như nước. Dầu VCO được sản
xuất từ cơm dừa trắng, trải qua q trình sấy lạnh, sau đó được ép thủy lực hoặc ly tâm
để lấy dầu. Ngoài ra, VCO cũng khơng trải qua q trình tinh chế hóa học, tẩy trắng
hoặc khử mùi (RBD) nên khi so với các loại dầu dừa trải qua quá trình RBD thì các
tính chất hóa lý của VCO ít bị biến đổi hơn [3].

5


a)

b)

Hình 1.1 Dầu dừa thương phẩm

a). Dầu dừa tinh luyện; b). Dầu dừa VCO
(Nguồn công ty TNHH chế biến Dừa Lương Qưới)
1.1.3 Đặc tính dầu dừa VCO
Theo Hiệp Hội Dừa Châu Á - Thái Bình Dương (APCC, Asian and Pacific Coconut
Community), mà Việt Nam là thành viên chính thức, với cơ quan đại diện là Tổng
Công ty Công Nghiệp Dầu Thực Vật Việt Nam (VOCARIMEX), thì tiêu chuẩn của
dầu dừa VCO (APCC standards for virgin coconut oil) được qui định như các bảng
1.1, 1.2 và 1.3 sau.

6


Bảng 1.1 Thành phần hóa học và chỉ số chất lượng của dầu VCO [4].
Thành phần

Đơn vị

Độ ẩm

Max 0,1(%)

Các chất dễ bay hơi ở 120o C

Max 0,2(%)

Acid béo tự do

Max 0,2(%)

Chỉ số Peroxide

Max 3 meq/kg

Chỉ số khúc xạ ở 40oC

1,4480 – 1,4492

Tạp chất khơng tan

Max 0,05(%w/w)

Chỉ số xà phịng hóa

250 – 260

Chỉ số Iod

4,1 – 11

Thành phần khơng xà phịng hóa

Max 0,2 – 0,5(%w/w)

Trọng lượng riêng ở 30oC

0,915 – 0,920

Màu sắc

Trắng, trong suốt

Mùi

Mùi tự nhiên của dừa

Phụ gia

Khơng có

Bảng 1.2 Giới hạn kim loại nặng trong dầu dừa VCO [4]
Tên kim loại

Đơnvị (mg/kg)

Sắt (Fe)

Max 5

Đồng (Cu)

Max 0,4

Chì (Pb)

Max 0,1

Asen (As)

Max 0,1

7


Bảng 1.3 Thành phần acid béo trong dầu dừa VCO [4]
Acid béo

Mạch C

Hàm lượng (%)

Caproic acid

C 6:0

0,10 – 0,95

Caprylic acid

C 8:0

4 – 10

Capric acid

C 10:0

4–8

Lauric acid

C 12:0

45 – 56

Myristic acid

C 14:0

16 – 21

Palmitic acid

C 16:0

7,5 – 10,2

Stearic acid

C 18:0

2–4

Oleic acid

C 18:1

4,5 – 10

Linoleic acid

C 18:2

0,7 – 2,5

1.1.4 Các chất có hoạt tính sinh học trong dầu dừa VCO
Dầu dừa là một trong những nguồn tự nhiên chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học có
khả năng kháng oxi hóa (Carandang, 2008) như: tocopherol, tocotrienol, phytosterol,
phytostanol, flavonoid, các hợp chất polyphenol khác và phospholipid. Bên cạnh đó,
dầu dừa cịn chứa các thành phần có khả năng kháng khuẩn (Shilling và cộng sự,
2013) là các acid béo mạch trung bình.
Nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học trong dầu VCO đã được xác định là có lợi ích
cho sức khỏe con người như tocopherol, tocotrienol, phytosterol...Tocopherol được
biết đến là hợp chất chống oxi hóa đóng vai trị quan trọng trong việc ngăn chặn một
số triệu chứng mãn tính như triệu chứng liên quan đến tim mạch và ung thư.
Tocotrienol được xem là hợp chất chống oxi hóa tốt hơn cả tocopherol, rất hiệu quả
trong việc chữa trị nhiều triệu chứng khác nhau. Phytosterol được biết đến với vai trò
giảm hàm lượng cholesterol trong máu đặc biệt là hàm lượng Low Density Lipoprotein
(LDL) cholesterol – loại cholesterol xấu ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Bên cạnh
đó, phospholipid trong dầu VCO là chất nhũ hóa quan trọng và là thành phần thiết yếu
của tất cả tế bào sống. Đặc biệt hơn, triglyceride mạch trung bình (MCT) cũng như các
acid béo tự do mạch trung bình, là thành phần chính trong dầu VCO (chiếm từ 53,1% 74,95%), là nguồn cung cấp năng lượng tốt, không những cho những người bị bệnh

8


hoặc đang ở giai đoạn hồi sức mà còn cho cả những trẻ sinh non. Ngoài ra, các hợp
chất polyphenol cịn được biết đến là có tác dụng hỗ trợ q trình chuyển hóa một số
amino acid trong tế bào ruột kết [5].

Ngày nay, có sự quan tâm đáng kể về việc sử dụng thực phẩm để phòng ngừa và hỗ trợ
điều trị một số bệnh. Nhiều nghiên cứu cho thấy việc tiêu thụ thực phẩm có chứa hợp
chất phenolic sẽ cải thiện đáng kể tình trạng sức khỏe con người. Tác dụng có lợi từ
các chất chống oxi hóa đã được tìm hiểu nhiều trong thực phẩm. Tác giả Dia và cộng
sự (2005) đã xác định hàm lượng phenolic trong dầu VCO được sản xuất từ các
phương pháp khác nhau. Kết quả cho thấy, dầu dừa VCO chứa hàm lượng phenolic
chiếm đến 66,56 mg catechin/kg, trong khi đó, trong dầu dừa tinh luyện thì khơng phát
hiện phenolic [6]. Tác giả Marina và cộng sự (2009) đã phân tích hàm lượng phenolic
trong dầu dừa VCO có nguồn gốc từ Malaysia và Indonesia và cho kết quả tương tự.
Nghiên cứu này cũng cho thấy khả năng chống oxi hóa của dầu VCO và khẳng định
rằng, chính thành phần phenolic đã đóng góp tích cực vào hoạt động chống oxi hóa
trong dầu VCO [1]. Trong nghiên cứu của tác giả Nevin và cộng sự (2003) về vai trò
của VCO giúp giảm hàm lượng cholesterol tổng, phospholipids, LDL và VLDLcholesterol đồng thời tăng hàm lượng HDL- cholesterol trong huyết thanh của chuột
giống Sprague–Dawley. Theo nhóm tác giả trên, thì tính chất này có được là nhờ vào
thành phần các hợp chất polyphenol có trong dầu VCO [7]. Mặc dù, các chất có hoạt
tính sinh học trong dầu dừa VCO là đa dạng, nhưng nghiên cứu này chỉ tập trung khai
thác hoạt tính sinh học của các acid béo tự do bão hòa được thu nhận từ quá trình thủy
phân dầu VCO, vì đây là thành phần chiếm chủ yếu trong dầu đến 94,8%.
1.1.5 Triglyceride của acid béo no mạch trung bình trong dầu dừa
Dầu dừa đặc trưng bởi thành phần triglyceride mạch trung bình (MCT), MCT được
biết đến vì có nhiều lợi ích dinh dưỡng cho sức khỏe, là thành phần có hoạt tính sinh
học cao nhờ thành phần acid béo no mạch trung bình của nó. MCT là chất lỏng ở nhiệt
độ phòng. MCT trong VCO bao gồm các triglyceride của các acid béo có chiều dài
mạch từ C6 tới C12 bao gồm: acid caproic (C6), acid caprylic (C8), acid capric (C10)
và acid lauric (C12). Acid lauric là thành phần acid béo chính của VCO chiếm gần
50% [8]. Vị trí phân bố của acid lauric trong triglyceride ở vị trí sn-1 / sn-3 hoặc vị trí
9