Nghiên cứu thủy phân triglyceride trong dầu dừa để thu nhận các phân đoạn acid béo tự do có hoạt tính sinh học p2

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Dầu dừa
Dầu dừa VCO được sản xuất và tài trợ bởi công ty TNHH chế biến dừa Lương Quới
(tỉnh Bến Tre, Việt Nam).
2.1.2 Chế phẩm enzyme lipase
2.1.2.1 Lypozyme TL 100L
Lypozyme TL 100L, được cung cấp bởi hãng Novozymes (Đan Mạch), đại diện bởi
công ty Brenntag (Việt Nam). Lypozyme TL 100L là chế phẩm enzyme công nghiệp,
dạng lỏng, màu vàng nâu, được trích ly từ nấm Thermomyces lanuginosus, đặc hiệu vị
trí xúc tác sn – 1,3 trên mạch triglyceride. Theo khuyến cáo của nhà sản xuất,
Lypozyme TL 100L hoạt động tối ưu trong khoảng pH 7,0 – 10 và nhiệt độ 20 – 50oC.
Hoạt tính của Lypozyme TL 100L là 100 KLU/g enzyme, trong đó 1LU là lượng chế
phẩm cần thiết để thủy phân glycerol tributyrate tạo thành 1 µmol acid butyric với tốc
độ 1 µmol acid butyric/phút ở điều kiện tiêu chuẩn [43].
2.1.2.2 Lypozyme TL IM
Lypozyme TL IM, được cung cấp bởi hãng Novozymes (Đan Mạch), đại diện bởi
công ty Brenntag (Việt Nam). Lypozyme TL IM là chế phẩm enzyme cố định, dạng
bột, màu trắng, được trích ly từ nấm Thermomyces lanuginosus, đặc hiệu vị trí xúc tác
sn – 1,3 trên mạch triglyceride. Theo khuyến cáo của nhà sản xuất, Lypozyme TL IM
hoạt động tối ưu trong khoảng pH 6 – 8 và nhiệt độ 50 – 75oC. Hoạt tính của
Lypozyme TL IM là 250 IUN/g enzyme, trong đó 1 IUN là lượng chế phẩm cần thiết
để thủy phân glycerol tributyrate tạo thành 1 µmol acid butyric với tốc độ 1 µmol acid
butyric/phút ở điều kiện tiêu chuẩn [43].
2.1.2.3 Candida rugosa lipase (CRL)
Candida rugosa lipase (CRL), ký hiệu L1754, Type VII, được cung cấp bởi hãng
Sigma – Aldrich (Mỹ). CRL là chế phẩm enzyme tự do, màu trắng, dạng bột, có nguồn

23


gốc từ nấm Candida rugosa, khơng đặc hiệu vị trí xúc tác trên mạch triglyceride. Hoạt
tính của CRL là ≥ 700 U/mg enzyme, trong đó 1U là lượng chế phẩm cần thiết để thủy
phân triglyceride tạo thành acid béo tự do với tốc độ 1µmol acid béo/giờ ở pH 7,2 và
37oC [44].
2.1.2.4 Porcine pancreas lipase (PPL)
Porcine pancreas lipase (PPL), ký hiệu L3126, Type II, được cung cấp bởi hãng Sigma
– Aldrich (Mỹ). PPL là chế phẩm enzyme tự do, màu trắng, dạng bột, có nguồn gốc từ
tuyến tụy lợn, đặc hiệu vị trí xúc tác sn – 1,3 trên mạch triglyceride. Hoạt tính của PPL
là 100-500 U/mg protein, hàm lượng protein chiếm ≥ 20%, trong đó 1U là lượng chế
phẩm cần thiết để thủy phân triacetin tạo thành acid béo tự do với tốc độ 1µmol acid
béo/giờ ở pH 7,4 và 37oC [44].
2.1.3 Chủng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy
2.1.3.1 Chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn được dùng để thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các tổ hợp acid
béo tự do là Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtilis (ATCC 11774),
Escherichia coli (ATCC 25922) và Salmonella enteritidis (ATCC 13076). Tất cả được
cung cấp bởi Microbiologics, Inc. (St. Cloud, Minnesota, USA).
2.1.3.2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường dinh dưỡng Nutrient Broth (NB) (Biolife – Italy), Mueller Hinton Agar
(MHA) (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd – Ấn Độ) và Mueller Hinton Borth (MHB)
(HiMedia Laboratories Pvt. Ltd – Ấn Độ).
2.1.3.3 Đối chứng dương
Đĩa giấy tẩm kháng sinh Gentamicine 10µg dùng làm đối chứng dương và đĩa giấy
trắng với đường kính tiêu chuẩn 6mm, dùng để tẩm chất thử. Tất cả được sản xuất và
cung cấp bởi Công ty TNHH Nam Khoa, TpHCM.

24

2.1.4 Chuột thí nghiệm
2.1.4.1 Chuột
Chuột đực giống Wistar 8 tuần tuổi, trọng lượng trung bình khoảng 30 gam/con, được
cung cấp bởi viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh.
2.1.4.2 Thức ăn cơ sở
Thức ăn cơ sở cho chuột hiệu Hamster food, được sản xuất bởi công ty Jolly (Đài
Loan) chứa thành phần: ngũ cốc (40%), đậu Hà Lan (15%), các chất dẫn xuất từ thịt và
động vật (4%), trái cây (táo 4%), dầu cá hồi (1%), hạt lanh (2%), fructooligosaccharides (0,3%). Ngồi ra, cịn có các dẫn xuất có nguồn gốc từ thực vật,
khoáng chất, nấm men, trứng và các dẫn xuất từ trứng. Trong đó, hàm lượng protein
tổng chiếm 16%, chất xơ 7,5%, béo 9,0%, khoáng 4% và độ ẩm 12%.
2.1.4.3 Thức ăn giàu béo – high fat diet (HFD)
Thức ăn với hàm lượng béo cao (HFD) được thực hiện tại phịng thí nghiệm trường
Đại Học Cơng Nghiệp TpHCM theo phương pháp của Subramani (2017) bao gồm:
90% thức ăn cơ sở kết hợp với 2% cholesterol từ Merck Millipore (USA) có độ tinh
khiết ≥ 99%, thêm 8% dầu đậu phộng từ công ty Quy Nguyên và 0,1% Calcium
(Novartis Pharma Limited Petaro Road, Jamshoro, Pakistan) [45]. Các thành phần
được nghiền mịn, phối trộn đồng nhất, tạo hình và sấy đến độ ẩm 12%.
2.1.4.4 Đối chứng dương
Silymarin 70mg được sử dụng để làm đối chứng dương. Silymarin được sản xuất bởi
công ty cổ phần dược phẩm Đồng Nai.
Silymarin là một chiết xuất thảo dược được trích ly từ cây Cúc Gai (Silybum
marianum) có tác dụng bảo vệ gan và hỗ trợ chức năng gan trong điều trị viêm gan.
Hoạt chất có tác dụng bảo vệ gan được xác định là silymarin. Silymarin là hợp chất
thuộc loại flavonoid được chiết từ hạt hoặc từ quả của cây. Theo tài liệu dược lý
silymarin của tác giả Fraschini và cộng sự (2002), silymarin giúp bảo vệ gan và hỗ trợ
chức năng gan trong điều trị bệnh viêm gan là do có 4 tác dụng đã được chứng minh
sau đây [46].
1) Silymarin là chất chống oxy hóa có thể vơ hiệu hóa gốc tự do gây hại. Silymarin có

25


bản chất là một flavonoid nên nó có thể vơ hiệu hóa các gốc tự do (như lipoperoxid) là
các chất được sinh ra nhiều khi gan bị viêm và bị tổn thương.
2) Silymarin giúp ổn định màng tế bào gan và ngăn chặn chất độc từ ngoài nhiễm vào
trong tế bào gan.
3) Silymarin tăng cường tổng hợp RNA ribosom (ribosomal RNA synthesis), giúp
tổng hợp protein nhằm thúc đẩy phục hồi các tế bào gan bị tổn thương và kích thích sự
phát triển các tế bào gan mới.
4) Silymarin ức chế sự biến đổi gan thành tổ chức xơ, giảm sự hình thành các sợi
collagen đưa đến xơ gan.
2.1.5 Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu có xuất xứ từ Merck (Đức) và Sigma chemical
(Hoa Kỳ), độ tinh khiết ≥ 99,7% gồm Acid clohydric (HCl), Acid boric (H3BO3),
Disodium tetraborat decahydrate (Na2B4O7.10H2O), Sodium dihydrogen phosphate
dihydrate

(NaH2PO4.2H2O),

Disodium

hydrogen

phosphate

dodecahydrate

(Na2HPO4.12H2O), Ethanol absolute (C2H5OH), Isooctane (C8H18), Sodium phosphate
anhydrous (Na2SO4), Phenolphthalein (C20H14O4) và n-hexane được cung cấp bởi cơng

ty hóa chất Hóa Nam (Việt Nam).
2.1.6 Thiết bị
2.1.6.1 Thiết bị nghiên cứu quá trình thủy phân dầu VCO
Hỗn hợp dầu và đệm với các tỉ lệ khảo sát được khuấy tạo nhũ bằng máy đồng hóa cơ
IKA (Đức). Quá trình thủy phân dầu được thực hiện trong thiết bị lắc Yihder (Đài
Loan), có điều chỉnh nhiệt độ và tốc độ lắc.
2.1.6.2 Thiết bị nghiên cứu quá trình thu nhận các tổ hợp acid béo tự do
Hỗn hợp acid béo được thu nhận sau khi loại bỏ dung môi n – hexan bằng máy cô
quay RE 300RC (Đức). Các phân đoạn acid béo được thu nhận bằng phương pháp
chưng cất chân khơng có điều chỉnh nhiệt độ và áp suất phù hợp với phân đoạn cần thu
nhận, bộ chưng cất phân đoạn Fischer (Mỹ) nối với bơm chân không Trivac (Mỹ).

26


2.1.6.3 Thiết bị nghiên cứu hoạt tính sinh học của các tổ hợp acid béo tự do
a) Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu khả năng kháng khuẩn
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được vô trùng bằng nồi hấp tiệt trùng BK75 (Nga). Vi
khuẩn thử nghiệm được cấy trong tủ cấy vi sinh vật MV12 (Việt Nam) và ủ trong tủ ấm
INB 500 (Đức). Mật độ vi sinh vật được đo trên máy đo quang phổ Genesys 20 (Mỹ).
b) Thiết bị nghiên cứu ảnh hưởng đến hàm lượng cholesterol trong máu
Mẫu máu được thu nhận và cho vào ống chứa heparin, sau đó huyết tương được thu
nhận bằng máy ly tâm Hettich EBA 20S (Đức), chỉ số ALT và AST được phân tích
trên thiết bị Beckman Synchron LX20 (Mỹ). Các chỉ số triglyceride, cholesterol tổng,
LDL cholesterol và HDL cholesterol được phân tích trên thiết bị Hitachi 704 (Mỹ).
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu dầu VCO

4 loại enzyme lipase

- Xác định A, X, I, P
- Xác định thành phần acid béo

- Xác định hoạt tính

Nghiên cứu sự thủy phân VCO
- Khảo sát tỉ lệ dầu/đệm
- Khảo sát tỉ lệ enzyme/cơ chất
- Kháo sát nhiệt độ
- Khảo sát pH
- Khảo sát thời gian thủy phân
- Khảo sát động học enzyme
Nghiên cứu thu nhận sản phẩm sau thủy phân

Nghiên cứu thu nhận phân đoạn acid béo

Khảo sát giảm Cholesterol
và trọng lượng chuột

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

27


Nội dung nghiên cứu của luận án được chia làm 3 phần: Phần 1. Nghiên cứu quá trình
thủy phân dầu VCO bởi bốn loại enzyme lipase khác nhau. Phần 2. Nghiên cứu thu
nhận sản phẩm sau thủy phân gồm các phân đoạn acid béo tự do mạch trung bình, acid
lauric và acid béo mạch dài. Phần 3. Khảo sát hoạt tính sinh học của các phân đoạn

acid béo này đến khả năng kháng 4 loại vi khuẩn thường gây bệnh trong thực phẩm.
Đồng thời, khảo sát tác động của chúng đến hàm lượng cholesterol trong máu.
2.2.1 Khảo sát quá trình thủy phân dầu VCO bởi bốn loại enzyme lipase khác nhau.
Mục đích của phần nghiên cứu này là tìm được các điều kiện thủy phân phù hợp của
từng loại enzyme lipase xúc tác quá trình thủy phân dầu VCO, từ đó xác định qui luật
xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO của từng loại enzyme lipase.
2.2.1.1 Khảo sát nguyên liệu dầu VCO và hoạt tính enzyme lipase.
Xác định các chỉ số ban đầu của dầu nguyên liệu như chỉ số acid béo theo TCVN
6127: 2010, chỉ số peroxide theo TCVN 6121: 2010, chỉ số xà phòng theo TCVN
6126: 2007 và chỉ số iod theo TCVN 6122: 2010. Đồng thời, xác định thành phần và
hàm lượng acid béo trong dầu theo phương pháp sắc ký khí với đầu dị ion hóa ngọn
lửa (GC – FID). Hoạt tính của 4 loại enzyme lipase cũng được xác định theo phương
pháp của nhà sản xuất và chuyển về cùng đơn vị đo (U/g).
2.2.1.2 Khảo sát các yếu tố tác động lên quá trình thủy phân dầu VCO bởi bốn loại
enzyme lipase.
Xác định qui luật ảnh hưởng của tỷ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất, nhiệt độ và pH
đến mức độ thủy phân dầu VCO của mỗi loại enzyme lipase.
2.2.1.3 Động học enzyme lipase.
Xác định hằng số Michaelis Menten Km và vận tốc phản ứng cực đại Vmax đặc trưng
cho mỗi enzyme, từ đó nhận định được ái lực liên kết của mỗi loại enzyme với cơ chất
là dầu VCO. Xác định qui luật xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO của mỗi loại
enzyme lipase.

28


2.2.1.4 Khảo sát mức độ thủy phân dầu VCO được xúc tác bởi 4 loại enzyme lipase
theo thời gian.
Với điều kiện thủy phân phù hợp của mỗi enzyme đã được xác định ở trên, tìm qui luật
ảnh hưởng của thời gian đến mức độ thủy phân dầu VCO của từng loại enzyme lipase.

2.2.2 Thu nhận các phân đoạn acid béo tự do
Mục đích của phần nghiên cứu này là thu nhận các phân đoạn acid béo tự do có chiều
dài mạch cacbon như mong muốn.
2.2.2.1 Thu nhận sản phẩm sau thủy phân
Sản phẩn sau thủy phân là các acid béo tự do (FFA) và dầu VCO còn lại sau thủy phân
(HVCO). Xác định thành phần và hàm lượng FFA bằng phương pháp sắc ký khí ion
hóa ngọn lửa (GC – FID). Trên cơ sở này, lựa chọn một loại enzyme lipase phù hợp
với hàm mục tiêu để xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO nhằm thu nhận FFA phục
vụ các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2.2 Thu nhận các phân đoạn acid béo tự do.
Chưng cất phân đoạn, giữ cố định áp suất là 7,5mmHg, thay đổi nhiệt độ để thu nhận
các phân đoạn acid béo có chiều dài mạch cacbon như mong muốn. Trong đó, tổ hợp
acid béo FFA1 chứa chủ yếu các acid béo tự do mạch trung bình (C6 – C10), FFA2
chứa chủ yếu acid lauric (C12) và FFA3 chứa chủ yếu acid béo tự do mạch dài (C14 –
C18). Đánh giá tỷ lệ khối lượng của từng phân đoạn.
2.2.3 Khảo sát hoạt tính sinh học của các phân đoạn acid béo tự do.
Mục đích của phần nghiên cứu này là xác định hoạt tính sinh học của từng phân đoạn
acid béo FFA1, FFA2 và FFA3. Xác định qui luật kháng khuẩn và qui luật tác động
đến hàm lượng cholesterol trong máu của các phân đoạn acid béo tự do từ dầu VCO.
2.2.3.1 Khả năng kháng khuẩn của FFA, HVCO và VCO.
Khảo sát khả năng kháng bốn loại vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm của các acid béo
tự do (FFA), HVCO còn lại sau thủy phân gồm hỗn hợp di- , mono-glyceride và dầu
VCO nguyên trạng.
2.2.3.2 Khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn acid béo FFA1, FFA2 và FFA3.
Xác định qui luật kháng bốn loại vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm của các phân
đoạn acid béo tự do, có chiều dài mạch cacbon khác nhau.

29

2.2.3.3 Tác động của các phân đoạn acid béo FFA1, FFA2 và FFA3 đến hàm lượng
cholesterol trong máu.
Đánh giá tác động đến hàm lượng cholesterol trong máu chuột được cho ăn chế độ ăn
giàu béo (HFD) của các phân đoạn acid béo tự do trên.
2.3 Bố trí thí nghiệm
2.3.1 Thí nghiệm khảo sát q trình thủy phân dầu VCO
2.3.1.1 Thí nghiệm khảo sát nguyên liệu dầu VCO và hoạt tính enzyme lipase
a). Xác định các chỉ số ban đầu của dầu VCO
Bảng 2.1 Phương pháp xác định các chỉ số của dầu VCO.
Chỉ tiêu xác định

Tiêu chuẩn áp dụng
TCVN 6127 : 2010

Chỉ số acid

(ISO 660 : 2009)
TCVN 6121 : 2010

Chỉ số peroxide

(ISO 3960 : 2007)
TCVN 6126 : 2007

Chỉ số xà phòng

(ISO 3657 : 2002)
TCVN 6122 : 2010

Chỉ số Iod

(ISO 3961 : 2009)
AOAC 996.06

Thành phần acid béo

(GC – FID)

b). Xác định hoạt tính của bốn loại enzyme lipase
Hoạt tính của bốn loại enzyme lipase khảo sát trong luận án này được xác định theo
hướng dẫn của nhà sản xuất và được trình bày ở phụ lục 1.1.
Bốn loại enzyme trên có đơn vị đo hoạt tính khác nhau. Do đó, chúng sẽ được chuyển
đổi về cùng một đơn vị là U/g, là số đơn vị hoạt độ U có trong 1g chế phẩm enzyme,
với 1U là lượng chế phẩm cần thiết để xúc tác thủy phân liên kết carbocyl-ester tạo
thành acid béo tự do với tốc độ 1µmol acid béo/phút ở điều kiện tiêu chuẩn.

30


2.3.1.2 Thí nghiệm khảo sát q trình thủy phân dầu VCO
Dầu VCO được thủy phân bởi 4 loại enzyme lipase nhằm thu nhận acid béo tự do
(FFA). Điều kiện xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO của mỗi enzyme là khác nhau.
Bốn yếu tố ảnh hưởng đến mức độ thủy phân dầu VCO như tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ
enzyme/cơ chất, pH và nhiệt độ của mỗi enzyme được khảo sát.
Quá trình thủy phân được thực hiện theo phương pháp của tác giả Sharma và cộng sự
(2013). Hỗn hợp ban đầu bao gồm 100g dầu VCO và đệm (w/w) được cho vào becher
1000mL, với tỉ lệ khảo sát. Hỗn hợp được tạo nhũ bằng thiết bị khuấy ở tốc độ 10000
vịng/phút trong vịng 15 phút. Sau đó lượng enzyme với các tỉ lệ khác nhau được
thêm vào hỗn hợp, enzyme được hòa tan bằng thiết bị khuấy ở tốc độ 350 vòng/phút
trong vòng 5 phút. pH của dung dịch ở các mức pH khảo sát được điều chỉnh trên dung

dịch đệm. Hỗn hợp được tiến hành thủy phân trong thiết bị có tốc độ lắc 150 vịng/phút và
điều chỉnh nhiệt độ ở các mức khảo sát [36]. Sau 2 giờ phản ứng, dừng quá trình thủy
phân bằng cách bất hoạt enzyme bằng 1mL ethanol 99,5%. Mức độ thủy phân dầu VCO
được tính theo cơng thức của Zenevicz (2016) [41].
𝐷𝐻   =

𝑉!"#  ×  𝑀!"# ×𝑀!"
x  100                            (2.1)
1000×  𝑚

Trong đó:
DH: Mức độ thủy phân dầu VCO (%)
𝑉!"# : Thể tích KOH cần dùng để chuẩn độ (mL)
𝑚: Khối lượng dầu phản ứng (g)
𝑀!"# :  Nồng độ mol của dung dịch KOH (mol/L)
𝑀!" : Khối lượng phân tử trung bình của acid béo có trong dầu VCO,
𝑀!" được tính như sau:
𝑀!" =

!
! M!

!

!
 x !""

Trong đó,
xi là tỷ lệ phần trăm theo khối lượng của từng acid thành phần thứ i
Mi là khối lượng phân tử của thành phần acid béo thứ i (phụ lục 2)

n là số acid béo có mặt trong dầu VCO
31


a). Thủy phân dầu VCO bởi enzyme Lypozyme TL 100L
Dung dịch đệm Tris – HCl được sử dụng để giữ ổn định độ pH của dung dịch thủy
phân, thay đổi một yếu tố và cố định các yếu tố còn lại để khảo sát ảnh hưởng của yếu
tố đó đến mức độ thủy phân dầu VCO.
Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất,
pH và nhiệt độ đến mức độ thủy phân của dầu VCO được xúc tác bởi enzyme
Lypozyme TL 100L
TN1

1.1

1.2

Yếu tố thay đổi

Yếu tố cố định
•

pH dung dịch thủy phân: 7,0

Tỉ lệ dầu/ đệm (w/w)

•

Nhiệt độ thủy phân: 50oC

1/1 – 1/2 – 1/3 – 1/4 – 1/5

•

Tỉ lệ enzyme/cơ chất: 387 U/gVCO

•

Thời gian thủy phân: 120 phút

•

Tỉ lệ dầu/đệm: được chọn từ kết quả
TN1.1

Tỉ lệ enzyme/cơ chất (U/gVCO)
344 – 387 – 430 – 473 – 516

•

Nhiệt độ thủy phân: 50oC

•

pH dung dịch thủy phân: 7,0

•

Thời gian thủy phân: 120 phút

•

Tỉ lệ dầu/đệm: được chọn từ kết quả
TN1.1

13

pH thủy phân

•

6,0 – 7,0 – 8,0 – 9,0 – 10,0

Tỉ lệ enzyme/cơ chất: được chọn từ kết
quả TN1.2

•

Nhiệt độ thủy phân: 50oC

•

Thời gian thủy phân: 120 phút

•

Tỉ lệ dầu/đệm: được chọn từ kết quả
TN1.1

1.4

•

Nhiệt độ thủy phân (oC)

Tỉ lệ enzyme/cơ chất: được chọn từ kết
quả TN1.2

35 – 40 – 45 – 50 – 55
•

pH thủy phân: được chọn từ kết quả
TN1.3

•

32

Thời gian thủy phân: 120 phút


b). Thủy phân dầu VCO bởi enzyme Lypozyme TL IM
Dung dịch đệm Tris – HCl được sử dụng để giữ ổn định độ pH của dung dịch thủy
phân, thay đổi một yếu tố và cố định các yếu tố còn lại để khảo sát ảnh hưởng của yếu
tố đó đến mức độ thủy phân dầu VCO.
Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất,
pH và nhiệt độ đến mức độ thủy phân của dầu VCO được xúc tác bởi enzyme
Lypozyme TL IM
TN2

2.1

2.2

2.3

2.4

Yếu tố thay đổi

Yếu tố cố định
•

pH dung dịch thủy phân: 8,0

Tỉ lệ dầu/ đệm (w/w)

•

Nhiệt độ thủy phân: 60oC

1/1 – 1/2 – 1/3 – 1/4 – 1/5

•

Tỉ lệ enzyme/cơ chất: 1,1 U/gVCO

•

Thời gian thủy phân: 120 phút

•

Tỉ lệ dầu/đệm: được chọn từ kết quả TN2.1

Tỉ lệ enzyme/cơ chất (U/gVCO)

•

Nhiệt độ thủy phân: 60oC

1 – 1,1 – 1,2 – 1,3 – 1,4

•

pH dung dịch thủy phân: 8,0

•

Thời gian thủy phân: 120 phút

•

Tỉ lệ dầu/đệm: được chọn từ kết quả TN2.1

•

Tỉ lệ enzyme/cơ chất: được chọn từ kết quả

pH thủy phân

TN2.2

6,0 – 7,0 – 8,0 – 9,0

Nhiệt độ thủy phân (oC)

•

Nhiệt độ thủy phân: 60oC

•

Thời gian thủy phân: 120 phút

•

Tỉ lệ dầu/đệm: được chọn từ kết quả TN2.1

•

Tỉ lệ enzyme/cơ chất: được chọn từ kết quả
TN2.2

50 – 55 – 60 – 65 – 70 – 75
•

pH thủy phân: được chọn từ kết quả TN2.3

•

Thời gian thủy phân: 120 phút

c). Thủy phân dầu VCO bởi enzyme CRL
Dung dịch đệm phosphate được sử dụng để giữ ổn định độ pH của dung dịch thủy
phân, thay đổi một yếu tố và cố định các yếu tố còn lại để khảo sát ảnh hưởng của yếu
tố đó đến mức độ thủy phân dầu VCO.

33


Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất,
pH và nhiệt độ đến mức độ thủy phân của dầu VCO được xúc tác bởi enzyme CRL
TN3

3.1

3.2

3.3

3.4

Yếu tố thay đổi

Yếu tố cố định
•

pH dung dịch thủy phân: 7,0

Tỉ lệ dầu/ đệm (w/w)

•

Nhiệt độ thủy phân: 40oC

1/1 – 1/2 – 1/3 – 1/4 – 1/5 – 1/6

•

Tỉ lệ enzyme/cơ chất: 3540 U/gVCO

•

Thời gian thủy phân: 120 phút

•

Tỉ lệ dầu/đệm: được chọn từ kết quả TN3.1

Tỉ lệ enzyme/cơ chất (U/gVCO)

•

Nhiệt độ thủy phân: 40oC

1770 – 3540 – 5310 – 7080 – 8850

•

pH dung dịch thủy phân: 7,0

•

Thời gian thủy phân: 120 phút

•

Tỉ lệ dầu/đệm: được chọn từ kết quả TN3.1

•

Tỉ lệ enzyme/cơ chất: được chọn từ kết quả

pH thủy phân

TN3.2

6,0 – 6,5 – 7,0 – 7,5 – 8,0

Nhiệt độ thủy phân (oC)

•

Nhiệt độ thủy phân: 40oC

•

Thời gian thủy phân: 120 phút

•

Tỉ lệ dầu/đệm: được chọn từ kết quả TN3.1

•

Tỉ lệ enzyme/cơ chất: được chọn từ kết quả
TN3.2

30 – 35 – 40 – 45 – 50
•

pH thủy phân: được chọn từ kết quả TN3.3

•

Thời gian thủy phân: 120 phút

d). Thủy phân dầu VCO bởi enzyme PPL
Dung dịch đệm borat được sử dụng để giữ ổn định độ pH của dung dịch thủy phân,
thay đổi một yếu tố và cố định các yếu tố còn lại để khảo sát ảnh hưởng của yếu tố đó
đến mức độ thủy phân dầu VCO.

34


Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất,
pH và nhiệt độ đến mức độ thủy phân của dầu VCO được xúc tác bởi enzyme PPL
TN4

4.1

4.2

4.3

4.4

Yếu tố thay đổi

Yếu tố cố định
•

pH dung dịch thủy phân: 8,0

Tỉ lệ dầu/ đệm (w/w)

•

Nhiệt độ thủy phân: 40oC

1/1 – 1/2 – 1/3 – 1/4 – 1/5 – 1/6

•

Tỉ lệ enzyme/cơ chất: 681 U/gVCO

•

Thời gian thủy phân: 120 phút

•

Tỉ lệ dầu/đệm: được chọn từ kết quả TN4.1

Tỉ lệ enzyme/cơ chất (U/gVCO)

•

Nhiệt độ thủy phân: 40oC

227 – 454 – 681 – 908 – 1135

•

pH dung dịch thủy phân: 8,0

•

Thời gian thủy phân: 120 phút

•

Tỉ lệ dầu/đệm: được chọn từ kết quả TN4.1

•

Tỉ lệ enzyme/cơ chất: được chọn từ kết quả

pH thủy phân

TN4.2

7,0 – 7,5 – 8,0 – 8,5 – 9,0

Nhiệt độ thủy phân (oC)

•

Nhiệt độ thủy phân: 40oC

•

Thời gian thủy phân: 120 phút

•

Tỉ lệ dầu/đệm: được chọn từ kết quả TN4.1

•

Tỉ lệ enzyme/cơ chất: được chọn từ kết quả
TN4.2

30 – 35 – 40 – 45 – 50
•

pH thủy phân: được chọn từ kết quả TN4.3

•

Thời gian thủy phân: 120 phút

2.3.1.3 Thí nghiệm khảo sát động học enzyme lipase
Sau khi xác định được điều kiện thủy phân phù hợp nhất của mỗi loại enzyme ứng với
cơ chất dầu VCO ở phần 2.3.1.2, mức độ thủy phân được xác định định kỳ 2 phút/ lần
trong 10 phút đầu phản ứng với các khối lượng dầu ban đầu thay đổi như sau: 100g,
50g, 12,5g và 3g. Giai đoạn bắt đầu phản ứng, lượng cơ chất mất dần đồng thời với
sản phẩm tạo thành gây ra sự thay đổi đột ngột với thời gian, tuy nhiên, khi thời gian
tăng dần thì tỉ lệ này giảm đi, đạt tới khơng khi tất cả lượng cơ chất được chuyển thành
sản phẩm dưới tác dụng của enzyme lipase. Khoảng thời gian này được mơ hình hóa
thơng qua phương trình động học bậc một như sau:

35


𝑆 =   [𝑆! ]𝑒 !!"                      (2.2)
Trong đó:
[S]: Nồng độ cơ chất còn lại ở thời điểm t (mmol FFA liên kết/mL)
[𝑆! ]:  Nồng  độ  cơ  chất  ban  đầu (mmol FFA liên kết/mL)
k: Hằng số tỷ lệ giả bậc một đối với phản ứng
Vận tốc của phản ứng (2.2) trên được xác định như sau:
𝑣=−

𝑑𝑆
𝑑𝑃
=  
=   −𝑘 𝑆!   𝑒 !!"                          (2.3)
𝑑𝑡
𝑑𝑡

Cơ sở lựa chọn mơ hình để nghiên cứu động học của mỗi loại enzyme lipase xúc tác
phản ứng thủy phân dầu VCO được dựa trên loại enzyme đơn chất xúc tác q trình
phản ứng. Theo mơ hình được đưa ra bởi Michaelis-Menten, vận tốc phản ứng thủy
phân phụ thuộc vào ái lực liên kết giữa enzyme với cơ chất.

 


 


 


 

V=

!!"# ∗  [!]

(2.4)

!! !  [!]

Trong đó:
V: Vận tốc phản ứng (mmol FFA tự do được giải phóng/mL∗h)
Vmax: Vận tốc phản ứng cực đại (mmol FFA tự do được giải phóng/mL∗h)
Km: Hằng số Michaelis –Menten (mmol FFA tự do được giải phóng/mL)
[S]: Nồng độ cơ chất (mmol FFA liên kết/mL).

Các thông số động học của phản ứng thủy phân (Km và Vmax) có thể được xác định
bằng cách viết lại công thức (2.4) ở dạng nghịch đảo, được đưa ra bởi Lineweaver –
Burk.
!

!!

   =  !
!

!"#

!

*[!] + !

!

!"#

36

(2.5)


2.3.1.4 Thí nghiệm khảo sát mức độ thủy phân dầu VCO theo thời gian
Điều kiện thủy phân phù hợp nhất của mỗi loại enzyme lipase được xác định ở phần
2.3.1.2. Trên cơ sở đó, mức độ thủy phân (DH) dầu VCO bởi enzyme lipase theo thời
gian được khảo sát và xác định theo cơng thức (2.1).
2.3.2 Thí nghiệm thu nhận các phân đoạn acid béo tự do

2.3.2.1 Thí nghiệm thu nhận sản phẩm thủy phân FFA và HVCO
Khi quá trình thủy phân dầu VCO được xúc tác bởi mỗi loại enzyme lipase đạt mức độ
thủy phân cao nhất, kết thúc phản ứng thủy phân. Sản phẩm thủy phân gồm các acid
béo tự do (FFA) và dầu còn lại sau thủy phân (HVCO) được thu nhận theo sơ đồ ở
hình 2.2
Hỗn hợp sau thủy phân

Ethanol 99.5%

Vô hoạt enzyme

KOH 0.5N vừa đủ

Tạo muối các FFA

N-hexane

Muối FFA, HVCO, H2O

Muối FFA
(phần dưới phễu chiết)

HCl 4M

Acid hóa đến pH 1÷2

N-hexane dư

Tách chiết

Na2SO4 khan

Thu phần trên

Tách chiết

HVCO
(phần trên phễu chiết)

Bay hơi dung môi

HVCO tinh sạch

Nước

Bay hơi dung mơi

FFA tinh sạch

Hình 2.2 Quy trình thu nhận FFA [47]

37


Việc thu nhận FFA và HVCO được dựa theo phương pháp của tác giả Shimada và
cộng sự (1998). Quá trình tách hỗn hợp sau thủy phân được thực hiện trong phễu chiết.
Hỗn hợp sau thủy phân được vô hoạt enzyme bằng ethanol 99,5% với tỉ lệ 1/1 (w/v),
trung hòa lượng FFA sinh ra bằng KOH 0,5N, sau đó cho vào phễu chiết, n-hexane
được thêm vào để tách phần dầu chưa được thủy phân (HVCO) ra khỏi hỗn hợp. Lớp
trên chứa HVCO và n-hexane được tách ra khỏi hỗn hợp, sau đó thu nhận HVCO bằng

cách sử dụng thiết bị cơ quay ở 70oC nhằm thu hồi dung môi n-hexane. Lớp dưới chứa
muối của hỗn hợp FFA được acid hóa bằng dung dịch HCl 4N dư để chuyển các muối của
acid béo về dạng acid béo tự do. Tiếp tục dùng phễu chiết để thu nhận FFA bằng cách sử
dụng dung mơi n-hexane để hịa tan acid béo tự do. Lúc này, lớp trên bao gồm FFA và nhexane sẽ được tách ra khỏi hỗn hợp. Na2SO4 khan được thêm vào để loại bỏ nước dư.
Dùng thiết bị cô quay chân không để thu hồi n-hexane và thu nhận hỗn hợp FFA tự do
[47].
2.3.2.2 Thí nghiệm thu nhận các phân đoạn acid béo tự do FFA1, FFA2 và FFA3
a). Thu nhận các phân đoạn acid béo tự do FFA1, FFA2 và FFA3
Hỗn hợp FFA tự do chứa hàm lượng acid béo bão hịa đến 94,92%, các acid béo bão
hịa này có chiều dài mạch cacbon từ C6 đến C18 (phụ lục), được chưng cất chân
không phân đoạn nhằm thu nhận các phân đoạn acid béo có chiều dài mạch cacbon
mong muốn như sau:
• Phân đoạn 1 (FFA1): chứa chủ yếu các acid béo mạch trung bình, từ C6 đến C10.
• Phân đoạn 2 (FFA2): chứa chủ yếu là acid lauric.
• Phân đoạn 3 (FFA3): chứa chủ yếu các acid béo mạch dài, từ C14 đến C18.
Quá trình chưng cất được thực hiện theo phương pháp của tác giả Nandi và cộng sự
(2005) có hiệu chỉnh. 100g FFA được chưng cất trong bộ chưng cất chân không, làm
việc tại áp suất 7,5 mmHg. Hỗn hợp FFA ban đầu được gia nhiệt đến nhiệt độ 145150oC để thu các acid béo ở phân đoạn 1 (FFA1). Tiếp tục nâng nhiệt độ lên 160165oC để thu phân đoạn 2 chủ yếu là acid lauric C12 (FFA2). Phần cịn lại trong bình
cầu là hỗn hợp acid béo của phân đoạn 3 có độ dài mạch từ C14 đến C18 (FFA3) [42].

38


Tỷ lệ phần trăm khối lượng của các phân đoạn được tính như sau:
!!"

H = !  𝑥  100
!đ

Trong đó:

H: Tỉ lệ phần trăm theo khối lượng của phân đoạn được chưng cất (%)
𝑚!" : Khối lượng sản phẩm chưng cất được (g)
𝑚!đ : Khối lượng hỗn hợp FFA ban đầu đem đi chưng cất (g)
b) Phân tích thành phần acid béo tự do
Thành phần và hàm lượng acid béo trong sản phẩm sau thủy phân là FFA và trong mỗi
phân đoạn FFA1, FFA2 và FFA3 được phân tích tại trung tâm dịch vụ phân tích thí
nghiệm TpHCM – Case bằng thiết bị phân tích sắc kí khí với đầu dị ion hóa ngọn lửa
(GC-FID) hiệu Shimadzu 2010 Plus (Nhật Bản), theo phương pháp của tác giả Nyam
và cộng sự (2009). Đầu tiên FFA sẽ được chuyển về về dạng metyl ester (FAME) bằng
Methanolic BF3 trước khi tiêm mẫu. 2µl mẫu được đưa vào bộ phận tiêm mẫu sử dụng
chế độ tiêm mẫu chia dòng (split mode tỉ lệ 1:25) theo dịng khí mang He với tốc độ
dịng 12 psi đưa vào cột sắc kí. Cột sắc kí mao quản DB-FFAP có các kích thước như
sau: đường kính trong 0,25 mm, chiều dài 30m và độ dày 0,25 µm. Nhiệt độ đầu dị
ion hóa ngọn lửa FID và nhiệt độ tiêm mẫu được duy trì ở 250oC trong suốt quá trình
phân tích. Chương trình nhiệt bắt đầu từ 100oC sau đó được tăng lên 7oC/ phút cho đến
khi đạt 250oC và duy trì nhiệt độ này cho đến khi quá trình phân tích kết thúc. Những
peak thu nhận được tính tốn và so sánh với chất chuẩn [48].
2.3.3 Thí nghiệm khảo sát hoạt tính sinh học của các phân đoạn acid béo tự do
2.3.3.1 Thí nghiệm xác định hoạt tính kháng khuẩn
Khả năng kháng khuẩn của VCO và các sản phẩm sau thủy phân gồm có acid béo tự
do (FFA) và mạch triglyceride chưa được thủy phân hoàn toàn (HVCO) được thực
hiện theo TCVN 4884:2001 (2001) [49]. Các phân đoạn acid béo tự do FFA1, FFA2
và FFA3 được khảo sát khả năng kháng khuẩn theo tiêu chuẩn CLSI (2012) [50].

39


Chuẩn bị dịch khuẩn
Cấy ria tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch Nutrient Broth (có bổ sung agar), vi khuẩn
được tồn trữ trong ống thạch nghiêng và bảo quản lạnh ở 4oC. Từ ống tồn trữ, chọn 2-3

khuẩn lạc đưa vào erlen chứa môi trường Nutrient Broth để thực hiện quá trình tăng
sinh trong thiết bị tủ ấm lắc ở 37oC với tốc độ 100 rpm trong 18- 24 giờ [50].
Mật độ vi khuẩn sau khi tăng sinh được pha loãng trong nước muối sinh lý 0,9%
chuyển về độ đục chuẩn McFarland (108 CFU/mL) [50]. Sau đó, huyền dịch được tiếp
tục pha loãng để đạt mật độ vi khuẩn là 106 CFU/mL [49].
Tiến hành thử kháng khuẩn
Dùng micropipet hút 1 ml huyền dịch vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 106 CFU/ml)
cho vào đĩa petri cùng với môi trường MHA sau đó chờ khơ bề mặt [49]. Hoặc dùng
que trải đều dịch khuẩn với độ đục 1,5x108 CFU/ml trên bề mặt đĩa thạch chứa môi
trường MHA, đợi 3-5 phút cho đến khi bề mặt thạch khơ hồn tồn [50].
Dùng đĩa giấy 6 mm vô trùng chứa 0,023g các dịch kháng khuẩn đặt lên mặt thạch đã
khô, đè nhẹ để đĩa giấy cố định trên mặt thạch. Ổn định đĩa thạch ở nhiệt độ phịng
trong vịng 30 phút sau đó đưa vào tủ ấm ở 37oC, sau 18-24 giờ và ghi nhận kết quả
bằng cách đo đường kính khu vực trong suốt xung quanh đĩa giấy [50].
2.3.3.2 Thí nghiệm xác định hoạt tính của các phân đoạn acid béo ảnh hưởng đến
hàm lượng cholesterol và trọng lượng chuột
Thí nghiệm này được thực hiện tại phịng thí nghiệm Sinh Học Động Vật, Viện Công
Nghệ Sinh Học và Thực Phẩm, trường Đại Học Công Nghiệp TpHCM. 40 con chuột
đực, giống Wistar được chia thành 8 nhóm (mỗi nhóm 5 con) được ổn định một tuần
trước khi đưa vào thí nghiệm. Chuột được cảm ứng béo phì theo phương pháp của
Subramani (2017) bằng cách cho ăn chế độ giàu béo với thức ăn bán tổng hợp theo
cơng thức được trình bày ở mục 2.1.4.3. Các lơ thí nghiệm được chia theo bảng 2.6,
chuột được cho ăn chế độ giàu béo (HFD) và uống các chất thử khác nhau với hàm
lượng 3,7mL/kg/ngày theo phương pháp của tác giả Harini và cộng sự (2009) [11].
Riêng nhóm 6, lơ ăn HFD kết hợp uống Silymarin với hàm lượng 60mg/kg/ngàytheo

40


phương pháp của tác giả Guo và cộng sự (2016) [51]. Sau 28 ngày cảm ứng bệnh và

điều trị, mẫu máu mỗi nhóm được thu nhận để phân tích hàm lượng cholesterol tổng,
LDL cholesterol, HDL cholesterol, triglyceride, ALT, AST và nhuộm HE mơ gan
[11]. Các mẫu được phân tích và đọc kết quả tại Bệnh viện 175, TpHCM.
Bảng 2.6 Phân nhóm chuột và chế độ ăn của mỗi nhóm (đợt 1).
Nhóm

Chế độ ăn

Chất thử

1

HFD

FFA tổng

2

HFD

FFA 1

3

HFD

FFA 2

4

HFD

FFA 3

5

HFD

VCO

6

HFD

Silymarin

7

HFD

Khơng

8

Thức ăn cơ sở (đối chứng)

Khơng

Bảng 2.7 Phân nhóm chuột và chế độ ăn của mỗi nhóm (đợt 2).
Nhóm

Chế độ ăn

Chất thử

1

Thức ăn cơ sở

FFA1

2

HFD

FFA 1

3

HFD

Không

4

Thức ăn cơ sở (đối chứng)

Không

i). Cân trọng lượng cơ thể, trọng lượng gan và trọng lượng gan tương đối

Theo phương pháp của Buu và cộng sự (2018), vào ngày bắt đầu (ngày 1) và ngày kết
thúc thí nghiệm (ngày 28), tất cả các động vật thí nghiệm được nhịn ăn qua đêm để
giảm sự khác biệt về trọng lượng do thức ăn gây nên. Trọng lượng cơ thể được cân
trực tiếp bằng cân điện tử. Khi kết thúc thí nghiệm, chúng được gây mê bằng cách sử
dụng diethyl eter. Mẫu máu được thu thập và cho vào ống có chứa heparin để chống

41


đơng, nhằm phân tích các chỉ tiêu sinh hóa. Sau đó, mẫu gan được thu gom, rửa sạch
bằng dung dịch nước muối lạnh (nhiệt độ ≤ 4oC) và cân bằng cân điện tử. Trọng lượng
gan tương đối được tính theo công thức (trọng lượng gan tương đối (g/100g) = trọng
lượng gan / trọng lượng cơ thể x 100). Sau đó, gan được bảo quản bằng dung dịch
formalin 10% để tiến hành đánh giá mô học bằng phương pháp nhuộm Hematoxylin
và Eosin [52].
ii). Xác định chỉ số sinh hóa máu và men gan
Mẫu máu được thu nhận và cho vào ống heparin, sau đó huyết tương được thu nhận
bằng máy ly tâm [52]. Các chỉ số sinh hóa máu được phân tích tại bệnh viện 175
TpHCM bao gồm triglycerides (TG), cholesterol toàn phần (TC), cholesterol
lipoprotein mật độ cao (HDL-cholesterol), cholesterol lipoprotein mật độ thấp (LDLcholesterol), chỉ số men gan như ALT và AST.
a) Nguyên tắc xác định Cholesterol tổng
Cholesterol được đo bằng enzyme trong huyết thanh hoặc huyết tương trong phản ứng
kết hợp thủy phân ester cholesteryl và oxy hóa nhóm 3-OH của cholesterol. Một trong
các sản phẩm phụ của phản ứng là H2O2 được định lượng bởi phản ứng oxi hóa
peroxide bằng enzyme peroxidase tạo sản phẩm màu. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng
500 nm. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ cholesterol, các phản ứng xảy ra như
sau [53].
Cholesteryl esterhydrolase
Ester Cholesteryl + H2O -----------------------------------> cholesterol + acid béo tự do
Cholesterol oxidase

Cholesterol + O2 ----------------------------> cholest-4-en-3-one + H2O2
Peroxidase
2H2O2+4-aminophenazone + phenol -----------------> 4-(p-benzoquinone- monoimino)-phenazone + 4 H2O

b) Nguyên tắc xác định Triglyceride
Triglyceride trong huyết thanh hoặc huyết tương được đo bằng phương pháp enzyme
bằng cách sử dụng một loạt các phản ứng, trong đó triglyceride được thủy phân giải
phóng glycerol. Glycerol sau đó được oxy hóa bằng enzyme glycerol oxidase. H2O2 là
một trong số các sản phẩm phụ của phản ứng. H2O2 được định lượng bởi phản ứng oxi

42


hóa peroxide bằng enzyme peroxidase tạo sản phẩm màu. Độ hấp thụ được đo ở bước
sóng 500 nm. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ triglyceride, các phản ứng xảy ra
như sau [53].
lipase
Triglyceride + 3H2O ------------> glycerol + acid béo tự do
glycerokinase
Glycerol + ATP ----------------------> glycerol-3-phosphate + ADP
glycerophosphate oxidase
Glycerol-3-phosphate + O2 -----------------------------> C3H7O6P+ H2O2
peroxidase
H2O2 + 4C13H17N3O + 4ClC6H4OH -------------> 4-(p-benzoquinone-monoimino)- phenazone + 2H2O + HCl.

c) Nguyên tắc xác định HDL – Cholesterol
HDL được đo trực tiếp trong huyết thanh dựa trên nguyên tắc: ApoB chứa lipoprotein
trong mẫu thử được phản ứng với thuốc thử chặn khiến chúng không phản ứng với
thuốc thử cholesterol trong điều kiện xét nghiệm. Do đó, ApoB chứa lipoprotein được
loại trừ khỏi xét nghiệm và chỉ HDL-cholesterol được phát hiện trong điều kiện khảo

nghiệm, các phản ứng xảy ra như sau [53].
(1) ApoB + α-cyclodextrin + Mg+2 + dextran SO4------>Phức hợp không phản ứng với các lipoprotein chứa
ApoB
PEG-cholesteryl esterase
(2) Ester HDL-cholesteryl --------------------------> HDL-cholesterol không được ester hóa + acid béo tự do
cholesterol oxidase
(3) Cholesterol khơng được ester hóa + O2 PEG------------------------->C27H44O + H2O2
peroxidase
+

(4) H2O2 + 5C13H17N3O + N-CH2-CH2-N-(3-C6H5CH2)-N_ NH2CH2CH2NH2+ H2O + H ---------------> thuốc
nhuộm qunoneimine + H2O.

d) Nguyên tắc xác định LDL – Cholesterol
Chỉ tiêu LDL – Cholesterol được xác định dựa trên phương pháp kết tủa truyền thống
giữa acid polyvinyl sulfonic (PVS) và polyethylene-glycol ether (PEGME) đã được
điều chỉnh để tăng cường tỉ lệ tối ưu của PVS/ PEGME với các chất hoạt động bề mặt
có chọn lọc. LDL, VLDL và chylomicron (CM) phản ứng với PVS và PEGME. Kết

43


quả phản ứng là các enzyme cholesterol oxidase (CHOD) và cholesterol esterase
(CHER) không thể tiếp cận với LDL, VLDL và CM, trong khi HDL phản ứng được
với các enzyme trên. Bổ sung R2 chứa một chất hoạt động bề mặt đặc hiệu giải phóng
LDL từ phức hợp PVS/ PEGME. LDL được giải phóng sẽ phản ứng với các enzyme
trên tạo ra H2O2 và H2O2 được định lượng bằng phản ứng Trinder [54].
e) Nguyên tắc xác định hoạt độ ALT
Sử dụng phương pháp đo tỷ lệ chuyển hóa để xác định hoạt độ ALT trong huyết thanh
hoặc huyết tương. ALT xúc tác thuận nghịch phản ứng chuyển hóa L-alanine và αketoglutarate thành pyruvate và L-glutamate. Các pyruvate sau đó được khử thành

lactate khi có mặt của enzyme chuyển hóa hydro (LDH), đồng thời với q trình này là
NADH bị oxy hóa chuyển thành NAD. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 340 nm. Độ
hấp thụ thay đổi tỷ lệ thuận với hoạt độ ALT trong mẫu [55].
f) Nguyên tắc xác định hoạt độ AST
Sử dụng phương pháp enzyme để đo hoạt độ AST trong huyết thanh hoặc huyết tương.
AST xúc tác thuận nghịch phản ứng chuyển hóa L-aspartate và α-ketoglutarate thành
oxaloacetate và L-glutamate. Các oxaloacetate sau đó được khử thành malate nhờ
enzyme malate dehydrogenase xúc tác, đồng thời với quá trình này là NADH bị oxy
hóa chuyển thành NAD. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 340 nm. Độ hấp thụ thay đổi
tỷ lệ thuận với hoạt độ AST trong mẫu [56].
iii) Phân tích mơ học
Mẫu gan được lưu giữ trong 10% formalin và được xử lý để nghiên cứu mô học bằng
phương pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin. Mẫu được phân tích tại bệnh viện 175
TpHCM theo phương pháp của Buu và cộng sự (2018). Các mẫu gan được khử nước
bằng alcohol, làm sạch bằng xylol, sau đó nhúng vào parafin, được cắt thành các lát
mỏng có độ dày từ 4-6 µm và nhuộm với Hematoxylin và Eosin. Các tiêu bản sau đó
được kiểm tra dưới kính hiển vi để đánh giá mức độ tổn thương gan [52].

44


iv) Thu nhận, phân tích cholesterol và thành phần acid béo trong gan chuột
Mẫu gan chuột được xử lý để phân tích hàm lượng cholesterol theo phương pháp của
Arika và cộng sự (2001). 200 mg mẫu gan chuột đã xay nhuyễn được cho vào phễu
chiết có chứa 30 ml hỗn hợp dung môi chloroform/methanol tỉ lệ 2:1 (v/v), thêm vào 6
ml H2SO4 0,05% để nhận thấy rõ sự phân lớp giữa 2 pha trong dung dịch. Pha bên
dưới là hỗn hợp chứa cholesterol và lipid. Tinh sạch hỗn hợp chứa cholesterol và lipid
bằng thiết bị li tâm trong 20 phút với tốc độ 2400 rpm (mỗi 10 ml hỗn hợp pha dưới
thêm vào khoảng 2ml H2SO4 0,05% sau đó cho vào ống falcon và được đưa vào máy
ly tâm thực hiện quá trình ly tâm). Sau quá trình ly tâm, dùng pippet để loại bỏ lớp trên

và thu nhận lớp dưới có chứa lipid và cholesterol của gan chuột tinh sạch [57]. Hàm
lượng lipid và cholesterol trong gan chuột được phân tích bằng sắc kí khí với đầu dị
ion hóa ngọn lửa tại trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Case theo phương pháp
của tác giả Nyam và cộng sự (2009) [48].
2.4 Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần, phân tích thống kê được thực hiện
bằng phần mềm R version 3.1.3 (cập nhật ngày 03-09-2015). Dữ liệu được trình bày
dưới dạng độ lệch chuẩn ± trung bình. Riêng các thí nghiệm trên động vật, sự khác
biệt giữa các nhóm được phân tích bằng cách sử dụng phương pháp phân tích phương
sai (Nested ANOVA) trước khi sử dụng Duncan, giá trị có ý nghĩa thống kê khi p
<0,05.

45


CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu q trình thủy phân dầu VCO bởi enzyme lipase
3.1.1 Tính chất nguyên liệu dầu VCO và hoạt tính enzyme lipase
3.1.1.1 Các chỉ số ban đầu của dầu VCO
Dầu VCO trước khi đưa vào thí nghiệm được xác định tính chất thơng qua các chỉ số
đặc trưng. Kết quả phân tích được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Chỉ số ban đầu của dầu VCO
Chỉ tiêu xác định

Kết quả

Chỉ số acid (mgKOH/g)

0.31 ± 0.03

Chỉ số peroxide (meq/kg)

0

Chỉ số xà phòng (mgKOH/g)

171.8 ± 6.2

Chỉ số iod (g/100g)

5.17 ± 0.27

Kết quả trên cho thấy, so với tiêu chuẩn dầu VCO do Hiệp Hội Dừa Châu Á - Thái Bình
Dương qui định (bảng 1.1), thì dầu VCO được sử dụng làm nguyên liệu nghiên cứu có
chỉ số iod và chỉ số xà phịng thấp hơn, chứng tỏ thành phần acid béo no rất cao và hàm
lượng các acid béo mạch dài (C14 – C18) cũng cao. Ngoài ra chất lượng dầu là tươi
mới, thể hiện ở chỉ số acid rất thấp và peroxide không xuất hiện. Như vậy, dầu VCO
được sử dụng làm nguyên liệu nghiên cứu chưa bị oxi hóa. Các chỉ số khác như acid,
iod, xà phịng hóa đều nằm trong giới hạn cho phép của chất lượng sản phẩm dựa theo
TCVN 6127: 2010 đối với chỉ số acid, TCVN 6126: 2007 đối với chỉ số xà phịng hóa,
TCVN 6121: 2010 đối với chỉ số peroxide và TCVN 6122: 2010 đối với chỉ số iod. Mẫu
dầu VCO này được sử dụng để phục vụ cho tất cả các thí nghiệm trong luận án.
Thành phần acid béo trong dầu VCO nguyên liệu được xác định bằng (GC – FID) theo
tiêu chuẩn AOAC 996.06 và được trình bày trong bảng 3.2.

46