Bài giảng Thực hành Vi sinh vật đại cương

8/30/2016

Bài 1: Quan sát hình thái vi sinh vật

Thực hành
Vi sinh vật đại cương

Mục đích

1.
2.
3.
4.

Giới thiệu kính hiển vi quang học
Phương pháp làm tiêu bản nhuộm
Phương pháp nhuộm màu Gram
Quan sát tiêu bản nhuộm

I. Sử dụng kính hiển vi quang học
(light microscope)

• Làm quen với cấu tạo kính hiển vi quang
học. Nắm được cách sử dụng
• Học cách làm tiêu bản cố định và phương
pháp nhuộm Gram
• Quan sát một số hình thái cơ bản của vi
khuẩn, nấm men, nấm mốc

1.1. Cấu tạo kính hiển vi quang học
a. Phần cơ học

• Thân kính: dịch chuyển lên xuống nhờ núm điều chỉnh lớn để
đưa ảnh của vật quan sát vào đúng tiêu điểm
- Bàn xoay (mâm kính): gắn ở phía trên thân kính, nơi gắn các vật
kính
- Ống kính: Gắn ở phía trên thân kính, có thể xoay quanh một trục
thẳng đứng tùy theo vị trí quan sát. Phía trên ống kính có gắn thị
kính
- Bàn kính/khay kính: nơi để tiêu bản quan sát. Trên bàn kính có
các kẹp giữ tiêu bản. Dưới bàn kính có giá giữ bộ tụ quang kính.
- Đế kính (chân kính): cấu tạo vững chắc đỡ toàn bộ KHV
- Ốc điều chỉnh: gồm
+ Ốc điều chỉnh tiêu bản;
+ Ốc điều chỉnh vĩ cấp (điều chỉnh thô/điều chỉnh lớn);
+ Ốc điều chỉnh vi cấp (điều chỉnh tinh/điều chỉnh nhỏ)

b. Phần quang học
 Bộ phận chiếu sáng:
Tụ quang kính: gồm nhiều thấu kính ghép
lại với nhau hội tụ các tia sáng xuất phát
từ nguồn svà tụ quang kính nền đen
áng và được phản xạ lại qua gương
Có 2 loại tụ quang kính: Tụ quang kính nền
sáng và tụ quang kính nền đen

Tụ quang kính nền sáng

Tụ quang kính nền đen

1

8/30/2016

c. Vật kính

c. Thị kính

- gồm một hệ thống thấu kính hội
tụ có tiêu cự ngắn khoảng vài
mm, đặt trong một vỏ bọc kim
loại
- Chức năng: Tạo ảnh thực, phóng
đại, ngược chiều với vật quan
sát.
- Độ phóng đại của vật nghiên cứu
phụ thuộc vào tiêu cự và độ
cong của thấu kính ngồi cùng.
Độ cong càng lớn, thì tiêu cự
càng ngắn độ phóng đại của
vật kính càng lớn
- Các vật kính: 8x, 10x, 40x, 60x
(vật kính khơ), 100x (vật kính
dầu)

- Gồm 2 thấu kính: thấu kính
mắt phía trên, thấu kính tụ
phía dưới. Giữa hai thấu
kính có màn chắn giữ lại
các tia sáng xung quanh, chỉ
để các tia sáng gần với trục

quang đi qua  hình rõ nét
hơn (phóng đại thêm ảnh
của vật kính-vai trị giống
kính lúp)
- Các loại thị kính: 7x, 10x,
15x, 20x
 Độ phóng đại của mẫu
quan sát bằng tích số giữa
độ phóng đại của vật kính
với độ phóng đại của thị
kính

1.2 Giới thiệu một số loại kính hiển vi khác
a. Kính hiển vi điện tử
- KHV điện tử truyền qua (Transmission electron
microscope – TEM): sử dụng chùm điện tử có năng
lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng
các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (1.106
lần). Ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên
film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ
thuật số
- KHV điện tử quét (Scanning electron microscope –
SEM): là một loại kính hiển vi điện tử truyền qua nhưng
khác với TEM: chùm điện tử không truyền qua mẫu mà
hội tụ thành một chùm hẹp và quét trên mẫu, do đó cho
phép ghi ảnh với độ phân giải rất cao
Nghiên cứu vi cấu trúc của vật rắn, nguyên tử, virus…
Scanning transmission electron microscope (STEM)

Phạm vi quan sát của KHV quang học và điện tử

Kính HV điện tử truyền qua (TEM)

SIGMA Advanced Analytical Scanning
Electron Microscope SEM

2


8/30/2016

KHV huỳnh quang
(fluorescence microscope)

Kính hiển soi nổi
(stereoscopic microscope)

• Kính hiển vi phản pha
(Phase contrast
microscopy-Nobel prize
1953): Ánh sáng xuyên
qua các vật thể trong
suốt, khơng màutiêu
bản khơng cần nhuộm
• Kính hiển vi nền đen
(dark field microscope):
loại những chùm tia sáng
không phân tán từ ảnh
vật vùng xung quanh
vật quan sát thường tối

Trái: quan sát với KHV quang học.
Phải: với KHV phản pha (40x)

1.3. Cách sử dụng kính hiển vi quang học

C

A

D

B
A.
B.
C.
D.

Nấm men quan sát vơi KHV quang học
Nấm men quan sát dưới KHV nền đen
Nấm men quan sát dưới KHV phản pha
Nấm men quan sát dưới KHV huỳnh quang

c. Quan sát với vật kính dầu
(100x)
- Nếu dùng vật kính dầu chú ý:
+ Nhỏ 1 giọt dầu soi kính vào vị trí
vùng định quan sát trên tiêu bản
(Hình A)
+ Hạ từ từ vật kính cho đến khi chạm

nhẹ vào giọt dầu (Hình B)
+ Nhìn vào thị kính, nhẹ nhàng điều
chỉnh ốc điều chỉnh vĩ cấp nâng vật
kính lên cho đến khi thấy chớp ảnh
trên vi trường
 Khi nâng vật kính lên vẫn phải đảm
bảo đầu vật kính vẫn ngập trong dầu
soi (Hình C)
+ Điều chỉnh thêm ốc chỉnh vi cấp
cho rõ nét.

a. Chuẩn bị:
- Kính hiển vi, dầu soi, dầu lau, sổ ghi chép, bút…
- Chuẩn bị tiêu bản quan sát
- Tư thế ngồi quan sát kính HV: ngồi ngay ngắn, đặt sổ ghi chép bên
tay phải (nếu thuận tay phải)
b. Quan sát với vật kính khơ:
- Cắm điện và bật cơng tắc đèn
- Điều khiển kính tụ quang bằng bàn tay trái: Nâng lên ở mức hợp lý;
+ Mở hệ thống chắn sáng tối đa và điều chỉnh khi có tiêu bản để được
ảnh của mẩu vật đẹp nhất theo ý muốn.
- Đặt tiêu bản quan sát lên khay kính, điều chỉnh vị trí cần quan sát
trên tiêu bản
- Chọn vật kính quan sát: Ví dụ Nấm mốc 4x, 10x; Nấm men 40x
- Sử dụng ốc điều chỉnh vĩ cấp để nâng tiêu bản lên sát với vật kính;
Mắt nhìn vào thị kính, từ từ hạ vật kính xuống đến khi nhìn thấy chớp
ảnh thì sử dụng ốc điều chỉnh vi cấp để chỉnh độ nét của ảnh.

d. Bảo quản sau khi sử dụng kính
- Nâng vật kính lên lấy tiêu bản ra.

- Nếu là vật kính dầu thì dùng khăn
vải/giấy mềm tẩm dầu lau kính xylene
lau nhẹ vào đầu vật kính cho thật sạch.
- Đưa vật kính nhỏ nhất vào vị trí tiêu
bản.
- Tắt cơng tắc đèn, rút phích cắm khỏi
ổ điện.
- Cho kính vào hộp hay đậy kính bằng
bao nilon.
- Chuyển kính vào tủ lớn có hệ thống
đèn bật thường xun để chống mốc và
bụi bẩn.

3


8/30/2016

II. Phương pháp làm tiêu bản nhuộm
(tiêu bản cố định)
- Tiêu bản cố định được nhuộm màu dùng để nghiên cứu các đặc
điểm hình thái học vsv, kiểm tra độ thuần khiết của giống…
- Tiêu bản này có thể bảo quản lâu dài
- VSV quan sát được giết chết trong q trình xử lý  an tồn
cho người quan sát
2.1 Các bước chuẩn bị:
- Chuẩn bị mẫu vật gồm:
+ Mẫu lỏng: dung dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic
+ Mẫu rắn: 01 ống thạch nghiêng nuôi cấy TB nấm men
- chuẩn bị dụng cụ gồm que cấy, đèn cồn, nước cất vơ trùng, bút

viết kính, lam kính sạch
- Chuẩn bị lam kính: + chọn lam kính sạch, hơ qua lại trên ngọn
lửa đèn cồn để làm sạch.
+ Sử dụng bút viết kính ghi ký hiệu mẫu tiêu bản cần nhuộm

2.2. Các bước làm tiêu bản cố định
Bước 1: Chuẩn bị vết bơi: Lấy lam kính đã tiệt trùng; sử dụng bút viết
kính vẽ lên một vịng trịn  định vị vùng làm vết bôi.
Bước 2: Làm vết bôi
+ Đối với mẫu lỏng: Sử dụng que cấy vô trùng, lấy một giọt mẫu, đặt
lên vịng trịn trên lam kính và dàn mỏng ra.
+ Đối với mẫu rắn: Sử dụng que cấy vô trùng lấy 1-2 giọt nước cất
đặt lên vòng tròn; Tiệt trùng que cấy và tiếp tục lấy mẫu ở ống giống;
hòa tan cùng với giọt nước cất  dàn mỏng ra
Bước 3:Làm khô: để khô tự nhiên ở nhiệt độ phịng.
Bước 4: Cố định vết bơi: kẹp chặt tiêu bản, hơ qua lại tiêu bản trên ngọn
lửa đèn cồn vài lần. Mục đích của bước cố định tiêu bản:
- Giết chết vsv an toàn cho người quan sát và giúp cho vsv bắt màu
tốt hơn
- Giúp cho vsv gắn chặt vào lam kính  khi rửa khơng bị trơi đi
- Giữ ngun hình dạng và kích thước khi nhuộm
Lưu ý: + tránh đun tiêu bản còn ướt trên ngọn lửa đèn cồn
+ Tiệt trùng que cấy ngay sau khi sử dụng

III. Phương pháp nhuộm Gram

Cố định tiêu bản

Tiêu bản sau khi cố định

Bước 1: Nhỏ dung dịch Tím gentian ngập vết bơi  để 1-2 phút. Sau đó
rửa thuốc nhuộm thừa với nước sạch: Nghiêng lam kính 45o, cho
nước chảy từ đầu đến cuối lam kính, đến khi khơng cịn màu tím
Bước 2: Cố định màu với dung dịch Lugol: nhỏ dung dịch ngập vết bôi,
để 1 phút  Rửa với nước sạch  vẩy khô
Bước 3: Tẩy màu với cồn 95%: Nghiêng phiến kính 45o, tẩy cồn cho đến
khi khơng cịn màu tím. Sau đó rửa lại ngay bằng nước sạch, vẩy khô.
Bước 4: Nhuộm màu với đỏ phenol: Nhỏ thuốc nhuộm ngập vết bôi, để 1 phút 
Rửa thuốc nhuộm thừa với nước làm khô, sử dụng giấy thấm hoặc hơ
qua ngọn lửa đèn cồn

3.1. Lịch sử:
- Là phương pháp nhuộm màu nhằm phân biệt vi khuẩn Gram
âm và Gram dương
- Do Christian Gram (1853-1938), nhà vật lý người Đan mạch
phát minh
3.2. Chuẩn bị thuốc nhuộm
- Dung dịch thuốc nhuộm thứ nhất: Tím gentian/ Crystal violet
- Dung dịch cố định màu:
Dung dịch lugol
- Dung dịch tẩy màu:
Cồn axeton
- Dung dịch thuốc nhuộm thứ hai: Đỏ phenol/ Fuchsin/
Safranin
- Nước rửa:
Nước sạch
3.3. Các bước nhuộm Gram
Gồm 4 bước

Pseudomonas (gram -)

Lactobacillus sp. (gram +)

E. coli (gram -)

Staphylococcus aureus (gram +)

Salmonella (gram -)

Bacillus cereus (gram +)

4


8/30/2016

Nấm men: giả khuẩn ty (mũi tên)

Nấm men Saccharomyces

nảy chồi (mũi tên)

Nấm men nảy chồi (mũi tên)

Yêu cầu báo cáo thực hành
1. Quan sát tiêu bản làm sẵn
+ Tiêu bản vi khuẩn (E. coli, Staphylococcus…)
+ Tiêu bản nấm mốc (vật kính 4x, 10x)
2. Quan sát tiêu bản cố định
+ Tiêu bản vk lactic (vật kính 100x)

+ Tiêu bản nấm men (vật kính 100x)
3. Mơ tả hình thái (u cầu vẽ hình)
• Hình thái: Hình que, cầu….
• Cách thức sắp xếp: đứng riêng rẽ, nối đơi, nối chuỗi …
• Tính chất bắt màu: Gram âm/dương
• Đặc điểm sinh sản (nấm men, nấm mốc): nảy chồi ?,
hình thành bào tử gì?

Bài 2: Kỹ thuật ria cấy vi sinh vật
Nội dung:
• Giới thiệu các mơi trường ni cấy vsv
• Kỹ thuật ria cấy trên thạch đĩa và thạch ống
• Quan sát hình thái khuẩn lạc
Mục đích
• Nắm được các kỹ năng, thao tác cơ bản về nuôi
cấy vi sinh vật trên các môi trường khác nhau
• Quan sát sự hình thành khuẩn lạc ở các môi
trường nuôi cấy khác nhau

2.1. Giới thiệu các môi trường nuôi cấy vsv
a. Môi trường đặc (rắn)
Môi trường có sử dụng các chất làm đơng đặc mơi trường: 1,5-2%
thạch (agar). Một số loại môi trường chủ yếu:
 Môi trường dinh dưỡng:
• Mơi trường đơn giản/MT cơ sở  peptone + agar; mơi trường
nước thịt peptone
• Mơi trường phức tạp: có bổ sung các chất dinh dưỡng cao thịt,
cao nấm men, casein… + các chất khoáng hoặc các chất đặc hiệu
 Mơi trường chọn lọc: MT có chứa những thành phần ưu tiên sự
sinh trưởng của một số VSV và ức chế các VSV khác (ví dụ Mt

chọn lọc VK sinh protease có bổ sung gelatin/casein…)
 Mơi trường chẩn đốn/ phân biệt: Có các thành phần hoặc hóa
chất giúp phân biệt các vsv bằng mắt thường (Ví dụ: mơi trường
MacConkey phân biệt E. coli và Salmonella)

5


8/30/2016

Một số loại môi trường chọn lọc

Mannitol salt agar

MT dinh dưỡng

MacConkey agar

Sabouraud agar: MT chọn lọc cho nấm

Casein media: chọn lọc Protease

Môi trường thạch nghiêng

2.2. Phương pháp làm môi trường dịch thể

b. Môi trường dịch thể (lỏng)

a. Môi trường dinh dưỡng dịch thể (Nutrient broth)

• Là mơi trường khơng bổ sung thêm chất đông đặc (thạch)

Sử dụng để nuôi cấy các vsv dị dưỡng.
Chuẩn bị: - 500g thịt, loại bỏ xương, mỡ,
Thành phần:
gân, xay nhỏ. Thêm 1000ml nước cất, để
Thịt bị (lợn):
500g
ở nhiệt độ phịng 12h. Sau đó đem đun sôi
Peptone:
10g
30 phút. Đợi nguội lọc bỏ cặn, bã.
NaCl:
5g
- Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1lit,
Nước cất:
1000ml
thêm 0,5% NaCl và 1% pepton. Điều
pH: 7.5±0.2 (25 °C)
chỉnh pH.
- Hấp khử trùng ở 121o/1atm/20 phút

33

Sau khi hấp tiệt trùng, chia vào các ông nghiệm hoặc bình tam
giác để sử dụng
b. Môi trường peptone dịch thể (Peptone Water)
• Hịa tan Peptone 1% và NaCl 0.5% với 1 lít nước.
• Mơi trường này được sử cho các MT lên men đường (bổ sung
thêm 1% đường) và MT kiểm tra phản ứng indole.

2.3 Phương pháp làm môi trường rắn
Môi trường Hansen: Sử dụng để nuôi cấy nấm men
Thành phần:
Glucose:
Pepton:
K2HPO4:
MgSO4.7H2O:
Agar:
Nước cất:

50g
10g
3g
2-5g
15-18g
1000ml

Chuẩn bị:
- Cân chính xác thành phần của mơi
trường, hịa tan với nước cất bằng cách
đun sôi.
- Chỉnh pH từ 5-6; Hấp tiệt trùng ở
121o /1atm/20 phút
- MT có màu vàng nhạt
- Khi sử dụng, ni cấy ở 30-35oC/24-48h

Môi trường Sabouraud: Sử dụng để nuôi cấy nấm mốc, nấm men
Thành phần:
Glucose:

Peptone:
Thạch:

40g/l
10g/l
15g/l

Chuẩn bị:
- Cân chính xác thành phần của môi trường,
đun cho tan các thành phần. Chỉnh pH từ
5,6±0,2 ở 25o C; Hấp tiệt trùng ở 121o/1atm/15
phút
- MT có màu kem hoặc vàng nhạt.

6


8/30/2016

2.4. Kỹ thuật ria cấy
2.4.1. Kỹ thuật ria cấy trên thạch ống
Mục đích: sử dụng kỹ thuật này trong cấy truyền
giống, nhân giống, giữ giống, phân lập/chọn lọc giống
a. Chuẩn bị
- Dụng cụ: môi trường thạch nghiêng, que cấy, đèn cồn,
bút viết kính
- Mơi trường sử dụng: Hansen agar
- Ống giống: Nấm men Saccharomyces sp.
- Tiệt trùng buồng cấy, tay, dụng cụ trước khi tiến hành
- Ghi tên giống, thời gian nuôi cấy lên môi trường mới

Các bước ria cấy trên thạch ống

b. Các bước tiến hành:
Bước 1: Lấy giống cần cấy
+ Đốt đèn cồn  tiệt trùng que cấy bằng cách hơ que cấy thẳng đứng
trên ngọn lửa đèn cồn đến khi đầu que cấy nóng đỏ  để nguội
+ Lấy ống giống cần cấy: sử dụng ngón tay út + má lịng bàn tay lấy
nút bơng, tiệt trùng miệng ống  Lấy một lượng giống cần cấy 
tiệt trùng miệng ống, đậy nút bông
Bước 2: Cấy truyền sang môi trường mới:
+ Đưa que cấy đã lấy giống xuống đáy ống môi trường mới. Ria que
cấy từ trái sang phải theo đường zich zắc chữ chi về phía miệng ống
+ Tiệt trùng miệng ống  đậy nút bông đem nuôi cấy
Lưu ý: + Tiến hành ria cấy giống trong buồng cấy/phịng vơ trùng
+ Mọi thao tác kỹ thuật cần được tiến hành xung quanh ngọn
lửa đèn cồn

2.4.2. Kỹ thuật ria cấy trên thạch đĩa
Mục đích: sử dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu phân lập, chọn lọc
giống nhằm tách khuẩn lạc thuần.
Các bước chuẩn bị như phương pháp ria trên ống. Chỉ khác phần kỹ
thuật ria
Kỹ thuật ria 2-3 lần đốt que cấy:
Bước 1: Sử dụng que cấy vô trùng, lấy 1 ít giống cần cấy
- Vơ trùng miệng đĩa, hé mở nắp hộp lồng, đưa que cấy đã lấy giống
vào, ria ở 1/3 đĩa  dừng lại, đốt que cấy lần 1
Bước 2: Đợi que cấy nguội; Xoay đĩa sang trái1 góc 45o; Đặt que
cấy vào đường ria cuối cùng của lần ria thứ nhất ria ngang tiếp 1/3
đĩa  đốt que cấy lần 2

Bước 3: Làm tiếp tục như bước 2, ria nốt 1/3 đĩa còn lại  vô trùng
miệng đĩa, nuôi cấy trong tủ ấm ở trạng thái úp ngược

7


8/30/2016

2.5. Đánh giá sinh trưởng của vsv trên môi
trường thạch
 VSV sinh trưởng trên mơi trường đặc (rắn) sẽ hình thành khuẩn lạc
 Khuẩn lạc là sự tập trung một số lượng lớn tế bào ở cùng một nơi, được
hình thành từ một tế bào ban đầu.
 Sự sinh trưởng được đánh giá thơng qua các tiêu chí:
khuẩn lạc vi khuẩn

khuẩn lạc vk lactic

khuẩn lạc nấm men



Số lượng khuẩn lạc (đếm bằng phương pháp pha lỗng nồng độ)
Hình thái, kích thước của khuẩn lạc
Rìa, bề mặt, trạng thái, kết cấu khuân lạc
Màu sắc của khuẩn lạc;
Mùi của môi trường
Hai dạng khuẩn lạc thường gặp:

- Khuẩn lạc láng bóng (dạng S): thường có bề mặt cong lồi, rìa gọn mịn,

mặt láng bóng, nhẵn.
- Khuẩn lạc nhám (dạng R): bề mặt nhám xù xì, rìa nhọn hay có góc cạnh.
khuẩn lạc nấm mốc

8


8/30/2016

u cầu báo cáo
• Quan sát hình thái khuẩn lạc ở các đĩa ni
cấy:
- Hình thái khuẩn lạc
- Màu sắc
- Trạng thái
- Rìa
- Bề mặt
- Kích thước: sử dụng thước đo

9