Tài liệu Sử dụng Multiplex PCR để phát hiện vi khuẩn Helicobacter Pylori doc

TCNCYH 22 (2) - 2003
Sử dụng multiplex PCR để phát hiện vi khuẩn
Helicobacter pylori
Nguyễn Thị Thanh Lợi và Nguyễn Thị Hồng Hạnh
Viện Công nghệ Sinh học -
Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia

ở Việt Nam, vi khuẩn Helicobacter pylori có thể mang các kiểu gien khác nhau do gien có thể bị
đột biến hoặc khiếm khuyết. Vì thế, việc phát hiện chúng bằng nhân bản một gien (PCR đơn) có
thể cho các kết quả âm tính giả.
Multiplex PCR nhằm khuyếch đại ba gien mã hoá cho các protein độc tính CagA, Urease B và
HP1125 của vi khuẩn Helicobacter pylori đã đợc nghiên cứu và có thể sử dụng trong thực tế lâm
sàng ở Việt Nam.
I. Đặt vấn đề
Cho đến nay, các nhà nghiên cứu đều thống
nhất cho rằng, gần một nửa dân số trên thế giới
bị nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori [7,2].
Loại vi khuẩn Gram-âm này đã gây ra rất nhiều
rối loạn nghiêm trọng về tiêu hoá, bao gồm
viêm loét dạ dày và hành tá tràng với biểu hiện
nặng nhất là ung th dạ dày [4].
Cũng nh nhiều năm trớc đây, ngày nay,
việc phát hiện và chẩn đoán các bệnh do nhiễm
khuẩn Helicobacter pylori vẫn còn là mối quan
tâm của các nhà khoa học, vì vi khuẩn hết sức
đa dạng về mặt sinh học [3,5]. Một vài nghiên
cứu cho thấy, nếu các cặp primers thiết kế cho
phản ứng PCR để phát hiện vi khuẩn H. pylori
ở các nớc phơng Tây không hiệu lực khi phát
hiện các chủng châu á [8].
ở Việt Nam, vi khuẩn Helicobacter pylori,

theo nghiên cứu đợc phân lập từ các bệnh
nhân có thể khiếm khuyết gien cagA hoặc gien
Urease B [6]. Do thế, nếu chỉ tiến hành PCR
đơn để nhằm phát hiện một gien thì các kết quả
âm tính giả có thể xảy ra. Để khắc phục nhợc
điểm này chúng tôi đề nghị sử dụng Multiplex
PCR để khuyếch đại đồng thời nhiều gien trong
một ống nghiệm. Phơng pháp này có u điểm
là nhanh, rẻ tiền và cho nhiều thông tin về vi
khuẩn hơn là PCR đơn, ba gien mã hóa cho ba
protein bệnh lý: UreaseB, CagA và HP1125 -
một protein màng ngoài của vi khuẩn - đợc
lựa chọn cho thử nghiệm.
Mục tiêu nghiên cứu là đánh giá khả năng
sử dụng Multipex PCR trong chẩn đoán vi
khuẩn Helicobacter pylori trong các mẫu bệnh
phẩm của bệnh nhân.
II. Đối tợng và phơng pháp
nghiên cứu
1. Đối tợng
Sinh thiết của ngời bệnh bị loét dạ dày
cha qua điều trị kháng sinh đợc lấy bằng
máy nội soi ống mềm 2T-10 (Olympus-Nhật
bản) và đợc giữ trong môi trờng vận chuyển
(theo Seelinger H.P.J và Schroter G.,1990) và
đợc bảo quản ở -80
0
C.
2. Phơng pháp
2.1. Phân lập vi khuẩn Helicobacter pylori

từ sinh thiết bệnh nhân.
Sinh thiết của bệnh nhân đợc nghiền kỹ,
sau đó dịch nghiền đợc cấy lên môi trờng
thạch đặc trng cho vi khuẩn H.pylori có chứa
7% máu ngựa và một số chất khác nh kháng
sinh [2]. Đĩa có vi khuẩn đợc đặt trong bình vi
hiếu khí của hãng BBL (Becton Dickinson
Microbiology System, Cockeysville) ở 37
0
C.
Sau 48-72 ngày, thu thập vi khuẩn (chủng
VNH-85) cho các nghiên cứu tiếp theo.

Công trình nghiên cứu này đợc thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học- Trung tâm Khoa học tự nhiên và
Công nghệ quốc gia.
1
TCNCYH 22 (2) - 2003

2.2. Tách chiết ADN từ vi khuẩn và sinh
thiết bệnh nhân.
*) Từ vi khuẩn: Vi khuẩn H. pylori đợc thu
thập từ đĩa nuôi cấy và rửa 2 lần bằng 1xPBS.
Tách ADN của vi khuẩn bằng chế phẩm sinh
học QIAmp Tissue Kit.
*) Từ sinh thiết bệnh nhân: Bệnh phẩm đợc
nghiền trong dung dịch 1 x PBS, sau đó đợc ủ
với Proteinase
K 20mg/ml ở 37
0
C trong 2 giờ. Sau khi

đợc phenol hoá để loại protein, ADN đợc tủa
bằng cồn tuyệt đối có bổ sung Natri axetate
đến nồng độ cuối cùng 0,3M. Độ sạch của
ADN đợc kiểm tra bằng phơng pháp điện di
trên gel agaroza 0,8%., dung dịch đệm 1xTAE.
2.3. PCR đơn và Multiplex PCR
*) PCR đơn
5-10ng ADN đợc dùng làm khuôn mẫu
cho phản ứng khuyếch đại gien cagA
+
, Urease
B và Hp1125. Phản ứng đợc thực hiện trên
máy PTC-100
TM
Programmable Thermal
controller.
+) Gien cagA
+
:
Cặp mồi F
1
, F
2
đợc dùng để khuyếch đại
đầu 5 gien cagA
+
kích thớc 460 bp có trình tự
sau:
F
1

:5-ACC-ATT-GAT-CAA-ACA-ACA-
ACA-CC-3
F
2
:5-AGG-GGG-TTG-TAT-GAT-ATT-
TTC-CAT-3
Chu trình nhiệt của phản ứng:
94
0
C 1phút 58
0
C 1 phút
72
0
C 1 phút
Lặp lại 35-40 chu kỳ.
+) Gien ureaseB
Cặp mồi F
3
, F
4
đợc dùng để khuyếch đại
toàn bộ gien ureaseB kích thớc 1700 bp có
trình tự là:
F
3
:5-CAG-CAT-ATG-AAA-AAG-ATT-
AGC-AG-3
F
4

:5-AAT-GCT-AAA-GAG-TTG-CGC-
CAA-G-3
Chu trình nhiệt của phản ứng: 94
0
C 1 phút.,
58
0
C 1 phút., 72
0
C 1 phút
Lặp lại 35 40 chu kỳ.
+) Gien Hp1125
Cặp mồi đợc sử dụng để khuyếch đại 540
bp của đầu 5 của gien có trình tự là:
L:5-ATG-AAG-AGA-TCT-TCT-GTA-
TTT-AGT-T-3
R:5-TTA-CTT-CAC-TAA-TTT-GAT-
CCA-CT-3
Chu trình nhiệt của phản ứng: 94
0
C 1 phút
55
0
C 1 phút
72
0
C 1 phút
Lặp lại 35-40 chu kỳ.
Sản phẩm PCR của từng gen trên đợc kiểm
tra trên gel agaroza 0,8%. Đệm điện di 1xTAE

*) Multiplex PCR
Phản ứng đợc thực hiện với sự có mặt cả 3
cặp mồi của 3 gien: cagA
+
, Urease B, Hp1125.
Phản ứng PCR đợc tối u hoá trong thể tích
25àl: 5ng ADN tổng số đợc dùng làm khuôn
cho phản ứng, 1àM của mỗi cặp mồi, 2,5àl của
10 x dịch đệm, 200àM của mỗi dNTP, 2,5 đơn
vị AmpliTaq DNA polymerase, thêm H
2
O (khử
ion và đã khử trùng) đến 25àl.
Chu trình nhiệt của phản ứng: 94
0
C 1 phút
50
0
C 1 phút 30 giây
72
0
C 2 phút
Lặp lại 35 40 chu kỳ.
Sản phẩm của phản ứng Multiplex PCR
đợc kiểm tra trên gel agaroza 0,8%. Đệm điện
di 1xTAE.

2
TCNCYH 22 (2) - 2003
III. Kết quả

1. Sử dụng phơng pháp PCR đơn để
phát hiện các gien ureaseB, cagA và HP1125
của chủng vi khuẩn Helicobacter pylori
VNH - 85 (chủng Việt Nam).
Các kết quả phân tích các sản phẩm PCR
đơn của ba gien cagA., Hp1125 và UreaseB
đợc trình bày ở hình 1. Trong nghiên cứu này,
các gien đợc khuyếch đại có phân tử lợng
khoảng 460 bp (cagA)., 540bp (Hp1125) và
1700 kb (UreaseB) là những kích thớc chờ
đợi.
ảnh điện di đồ 1 cũng cho thấy, không có
một băng ADN nào đợc khuyếch đại thêm,
ngoài những băng của cagA, Hp1125 và
UreaseB, chứng tỏ các cặp mồi thiết kế đặc
trng cho phân tích.




2. Sử dụng Multiplex PCR để phát hiện
cùng một lúc ba gien cagA, UreaseB và
Hp1125 trong vi khuẩn
H. pylori chủng VNH - 85 (chủng Việt
Nam).
Sau hàng loạt các thử nghiệm để tối u hoá
phản ứng Multiplex PCR, chúng tôi đã khuyếch
đại đợc cả ba gien trong một ống nghiệm.
Hình 2 là kết quả điện di đồ của các sản phẩm
PCR.

Nh đã thấy, ba gien cagA., Hp1125 và
Urease B đã đợc khuyếch đại và cho các sản
phẩm có phân tử lợng nh đã chờ đợi: 1700 bp
cho gien UreaseB., 540 bp cho gien HP1125 và
460 bp cho gien cagA.


M 1



IV. Bàn luận
Vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng Việt
Nam đa dạng về mặt sinh học. Chúng có thể
khiếm khuyết một trong hai gien cagA và
urease B [1]. Nguyên nhân do các quá trình
siêu đột biến xảy ra trong hệ gien của vi khuẩn.
Trong một nghiên cứu trên hơn một trăm bệnh
nhân, Hạnh và cs
cũng nhận thấy, tỷ lệ các chủng
Helicobacter pylori mang gien urease B khiếm
khuyết là khoảng 20%. Tơng tự nh vậy, số
các chủng Helicobacter pylori không tổng hợp
protein cagA chiếm một tỷ lệ đáng kể [Hạnh.
Kết quả cha công bố].
Với những lý do nh trên, để phát hiện vi
khuẩn Helicobacter pylori bằng phơng pháp
PCR, không thể khuyếch đại một gien riêng rẽ,
vì các kết quả âm tính giả có thể xảy ra. Chúng
tôi đã tối u hoá các điều kiện của phản ứng

Hình 2- Phát hiện ba gen Urease B
(1)., Hp1125 (2) và cagA (3) bằng
phơng pháp Multiplex PCR
Kb



2
1.5

0.5




1

2
3

M 1 2 3
Kb
1.5
1
0.5
Hình 1- Phát hiện các gien cagA (1), HP1125 (2)
và UreaseB (3) bằng phơng pháp PCR đơn.

3
TCNCYH 22 (2) - 2003

PCR đơn hoặc Multiplex PCR cho ba gien
ureaseB., cagA và Hp1125. Chúng tôi đề nghị
sử dụng phơng pháp Multiplex PCR để phát
hiện vi khuẩn Helicobacter pylori trong sinh
thiết dạ dày, trong phân và vi khuẩn phân lập từ
ngời bệnh Việt Nam. Phơng pháp có giá trị
trong các trờng hợp, các sàng lọc vi khuẩn
Helicobacter pylori bằng test Urease cho kết
quả âm tính.
V. Kết luận
1. Chúng tôi đã khuyếch đại nhiều gien
trong một ống nghiệm bằng phơng pháp
Multiplex PCR để phát hiện vi khuẩn
Helicobacter pylori.
2. Multiplex PCR là phơng pháp phát hiện
Helicobacter pylori cho kết quả nhanh và đầy
đủ thông tin về sự có mặt của vi khuẩn trong
các sinh thiết bệnh nhân. Phơng pháp có thể
đợc áp dụng trong thực tế lâm sàng của Việt
Nam.
Tài liệu tham khảo
1. Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Nguyễn Thị
Thanh Lợi : Sự tồn tại của các chủng
Helicobacter pylori khiếm khuyết gien urease B
ở các bệnh nhân viêm loét và ung th dạ dày
Việt Nam. Đại hội lần thứ hai hội nghị khoa
học hoá sinh y dợc năm 2001-Các báo cáo
khoa học.Tr. 106-113.
2. Trần Công Tớc, Trần Quỳnh Hoa,
Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Bùi Phơng Thuận và

Lê Văn Phủng. Sự có mặt cuả vi khuẩn
Helicobacter pylori mang cagA+status trong
các sinh thiết dạ dày cuả ngời Việt Nam. Sinh
học. 23 (2): 51-54
3. Atherton, J. C., Cao, P., Peek, R. M. J.,
Tummuru, M. K., Blaser, M.
J., Cover, T. L : Mosaicism in vacuolating
cytotoxin alleles of
Helicobacter pylori. Association of
specific vacA types with cytotoxin
production and peptic ulceration. J. Biol. Chem.
1995, 270: 17771 - 17777.
4. Correa, P : Helicobacter pylori and
gastric carcinogenesis.
Amm J Surg Patho. 1995, 19 Suppl. 1: S37 -
S43.
5. Cristina, N et al: Helicobacter pylori
genotype may determine gastric
histopathology. Amer. J . Pathology. 2001, 158
: 647 - 654.
6. Hazell, S. L. The role of Helicobacter
pylori Urease: a contentious issue . Eur. J.
Gastroenterol. Hepato. 4. 1992, (Suppl. 1) : 55 -
59.
7. Hopkins, R. J. and Morris, Jr. J. G.:
Helicobacter pylori: the missing link in
perspective. Am. J. Med. 1984, 97: 265 - 277.
8. Van de Ende, A., Pan, Z, J., Bart, R. W.,
van de Hurst., Feller, M., Xio, S.D., Tytgat, G
and Dankert, J (1998). cagA- postive

Helicobacter pylori population in China and the
Netherland are distinct. Infect. 2001, Immun.
66 : 1822 - 1826.

Summary
Multiplex PCR and detection of three genes
of Helicobacter pylori

Bacterium Helicobacter pylori is the causative agent of many gastric disorders. That is why, its
correct detection is necessary. However, monitoring the bacteria by amplifying only one gene has
used to give false-negative results due to the
biodiversity of the bacteria. The conditions for Multiplex PCR amplifying three virulent genes of
the bacteria such as cagA., ureaseB and Hp1125 were optimized. It is recommended to detect
Helicobacter pylori in clinical setting in Viet nam.

4