Tài liệu XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHANH VI KHUẨN DỊCH HẠCH (YERSINIA PESTIS) TỪ MẪU ĐẤT VÀ NƯỚC NHIỄM KHUẨN potx

TCNCYH 38 (5) - 2005
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHANH VI KHUẨN
DỊCH HẠCH (YERSINIA PESTIS) TỪ MẪU ĐẤT VÀ
NƯỚC NHIỄM KHUẨN

Lê Thanh Hoà
1
, Nguyễn Thị Bích Nga
1
,
Nguyễn Thị Ngọc Dao
1
, Đỗ Ngọc Khuê
2
1
Viện Công nghệ Sinh học
(Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
2
Phân Viện Công nghệ mới và Bảo vệ Môi trường
(Trung tâm KHKT - CNQS), Bộ Quốc Phòng


ị



)

.

:

.
ị


ị
Bệnh dịch hạch là một loại bệnh truyền nhiễm cấp tính. Vi khuẩn d ch hạch có thể chọn làm tác nhân
khủng bố sinh học. Chẩn đoán nhanh vi khuẩn này từ đất nước là cần thiết. Vi khuẩn dịch hạch chứa 3 loại
Plasmid đặc hiệu tạo nên các yếu tố độc lực gây bệnh. Mục tiêu: (1) Xác định độ nhạy và chính xác của
phản ứng PCR chẩn đoán vi khuẩ
n dịch hạch. (2) Thực hiện phản ứng PCR với nguồn khuôn là ADN tổng
số, ADN của plasmid pPCP1 và vi khuẩn nguyên vẹn với độ pha loãng khác nhau (3 Giả nghiệm vi khuẩn
trong mẫu đất - nước và thực hiện chẩn đoán nhanh bằng PCR. Đối tượng và phương pháp: Vi khuẩn
dịch hạch đã vô hoạt. ADN tổng số bao gồm ADN của vi khuẩn dịch hạch được tách bằng DNeasy Kit, dùng
cặp mồi PLAF - PLAR (bám trên gen pla) để nhân đoạ
n gen pla có độ dài 480bp. Sau khi xác định độ nhạy
của phản ứng PCR, để thực hiện mục tiêu xây dựng Kit chẩn đoán nhanh Y Pestis, vi khuẩn được hoà
trong mẫu đất và nước theo phương pháp giả nghiệm để kiểm nghiệm phản ứng PCR nhằm xây dựng kit
phát hiện phân tử. Kết quả Với ADN tổng số pha loãng, phản ứng PCR thực hiện thành công ở hàm lượng
0,6ng, tương đương với 1 vi khuẩn Y. Pestis. Với vi khu
ẩn nguyên vẹn (không cần tách ADN tổng số), với
lượng vi khuẩn pha loãng ở nồng độ từ 101 đến 102 (khoảng 100 - 10 vi khuẩn) vẫn cho PCR đặc hiệu. Với
phương pháp giả nghiệm hoà vi khuẩn vào trong mẫu đất, nước, PCR đặc hiệu vẫn thực hiện thành công ở
độ pha loãng khoảng 1 ng ADN và 4 vi khuẩn làm khuôn Kết luận: Như vậy, bước đầu Kit chẩn đoán
phân tử vi khuẩn d ch hạch đã th
ử nghiệm thành công từ các loại mẫu, kể cả từ đất, nước sử dụng chỉ thị
gen pla của Plasmid pPCP1.
Từ khoá: dịch hạch, Yersinia pestis, plasmid pPCP1, gen pla, PCR, giả nghiệm.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi khuẩn dịch hạch (Yersinia Pestis) gây bệnh

nguy hiểm cho người và động vật, phân bố khắp
thế giới kể cả Việt Nam. Vùng Tây Nguyên và
Duyên Hải miền Trung Việt Nam, cho đến nay, vẫn
có nhiều trường hợp bị dịch hạch, do vậy, loại vi
khuẩn nguy hiểm này vẫn là mối đe doạ sức khoẻ
cộng đồng [3,4]. Dịch hạch do bọ chét và loài gặm
nhấm làm môi giới truyền lây gây bệnh, và tồ
n tại
lưu cữu trong đất và nước, tạo nên nguồn lây sang
người. Có 3 loại plasmid mà vi khuẩn này sở hữu
bao gồm, plasmid CD1 (chung với Y.
pseudotuberculosis và Y. enterocolitica); plasmid
MT1 và pPCP1 (là 2 loại riêng của Y. Pestis) [1].
Chẩn đoán nhanh vi khuẩn dịch hạch không có gì
khác là dựa vào phản ứng PCR, sử dụng các gen
độc lực của các loại plasmid này làm chỉ thị di
truyền phân tử, trong đó gen pla của pPCP1 được
coi là tin tưởng nhất [2,7]. Y. pestis phân lập ở
Việt Nam đã được chính thứ
c giám định, sử dụng
gen pla, giải trình và phân tích trình tự của gen
này và đăng ký Ngân hàng Gen số AY305870 [2].
Plasmid độc lực pPCP1 của vi khuẩn dịch hạch Việt
Nam có mức độ bảo tồn tuyệt đối về thành phần
nucleotit của hệ gen, ít nhất là qua so sánh 480
nucleotit của phân đoạn gen pla, với các chủng
KIM5; CO92 [8,9] và một số chủng của Ấn Độ, thể
hiện tính gây bệnh thống nhất toàn cầu của loài vi
khuẩn này [2]. M
ục tiêu:

1. Xác định độ nhạy và chính xác của
phản ứng PCR chẩn đoán vi khuẩn d ch hạch.
2. Thực hiện phản ứng PCR với nguồn
khuôn là ADN tổng số, ADN của plasmid
pPCP1 và vi khuẩn nguyên vẹn với độ pha
loãng khác nhau.
1
TCNCYH 38 (5) - 2005
3. Giả nghiệm vi khuẩn trong mẫu đất -
nước và thực hiện chẩn đoán nhanh bằng
PCR.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

Vi khuẩn dịch hạch Việt Nam
Vi khuẩn dịch hạch Việt Nam ở dạng môi
trường nuôi cấy và đã bị vô hoạt qua nhiệt ở
100
0
C, do Bộ môn Vi sinh vật, Trường Đại học Y
Hà Nội cung cấp. Môi trường vi khuẩn vô hoạt này
được bảo quản ở –20
0
C, cho đến khi sử dụng.
Tách chiết ADN tổng số và ADN của plasmid
pPCP1
ADN tổng số, là toàn bộ ADN có mặt trong tế
bào vi khuẩn bao gồm của vi khuẩn và của
plasmid, được tách chiết bằng bộ hoá chất là

DNeasy kit của Hãng Qiagen. Lấy 200µl môi
trường vi khuẩn đã vô hoạt, ly tâm thu cặn tế bào.
Dung giải, tinh sạch và ly chiết ADN bằng các dung
dịch của bộ kit theo hướng dẫn, cuối cùng thu ADN
tổng số và bảo quản ở –20
0
C, cho đến khi sử
dụng. ADN của plasmid pPCP1, được thu nhận
bằng một phương pháp khác, là sử dụng bộ hoá
chất QiaPrep Spin Mini Kit của Hãng Qiagen. Về
nguyên tắc, hàm lượng ADN thu được chỉ chứa
ADN của plasmid pPCP1; và như vậy sẽ làm khuôn
chắc chắn cho phản ứng nhân đoạn gen pla trong
hệ gen của plasmid này. ADN thu được bằng các
phương pháp trên được kiểm tra trên thạch
agarose 0,8%, tính toán hàm lượng cần thiết cho
phản ứng PCR, và bảo quản
ở –20
0
C cho đến khi
sử dụng.
Một cách khác cung cấp khuôn cho phản ứng
PCR là sử dụng nguyên vẹn vi khuẩn, do trong quá
trình phản ứng tế bào bị bung ra giải phóng ADN
(kể cả ADN của plasmid) làm khuôn thực hiện
phản ứng [2]. Để thực hiện chẩn đoán nhanh,
chúng tôi hoà loãng vi khuẩn trong các mẫu đất và
nước trước đó đã kiểm tra không có vi khuẩn dịch
hạch bằng phương pháp nuôi cấy và PCR, giả
nghiệm như là m

ẫu thu được từ hiện trường. Sau
đó, mẫu giả nghiệm được sử dụng tách chiết ADN
tổng số và thực hiện phản ứng PCR.
Thực hiện phản ứng PCR:
Phản ứng PCR được thực hiện 1 chu kỳ trong 5
phút ở 95
0
C; 35 chu kỳ (95
0
C: 1 phút; 51
0
C: 1
phút; 72
0
C: 2 phút) và 1 chu kỳ cuối cùng ở 72
0
C
trong 10 phút. Với mồi xuôi là PLAF
(5'ATCTTACTTTCCGTGAGAAG3') và mồi ngược là
PLAR (5’ CTTGGATGTTGAGCTTCCTA 3'), phản ứng
PCR cho sản phẩm là đoạn ADN có độ dài 480bp
nằm trong cấu trúc của gen pla [6]. Sản phẩm PCR
của Y. pestis Việt Nam được dòng hoá vào plasmid
vectơ có tên gọi là pCR2.1 (Invitrogen Inc.), sau
khi tinh sạch bằng bộ hoá chất QiaQuick
Purification Kit (Qiagen Inc.). Plasmid tái tổ hợp
được chọn lọc theo qui trình (xem [10]). ADN của
plasmid tái tổ hợp được tách chiết bằng Kit của
Qiagen (QiaPrep Spin Mini Kit). Độ dài của đoạn
gen pla có trong plasmid tái tổ hợp được ki

ểm tra
trên thạch 0,8%, sau khi xử lý bằng enzym giới
hạn EcoRI.
0.56kb
2.3kb
2.0bp
123M
480bp
Bố trí thí nghiệm:
Khảo sát độ nhạy của PCR với độ pha loãng
cao nhất có thể thực hiện được: ADN tổng số sau
khi tách chiết và kiểm tra hàm lượng, được pha ở
nồng độ gốc 100ng/µl. Từ nồng độ này, ADN tổng
số được pha loãng theo cơ số 2, gấp đôi liên tục,
tức là: 100ng/µl; 50ng/µl; 25ng/µl; 12,5ng/µl;
6,25ng/µl; 3,125ng/µl Với các độ pha loãng
khác nhau như thế này, 1µl của mỗi một nồng độ
được sử dụng cho phản ứ
ng PCR với cặp mồi PLAF
- PLAR, thực hiện theo qui trình ở mục 3.
Giả nghiệm pha loãng vi khuẩn vô hoạt trong
mẫu đất - nước và thực hiện phản ứng PCR: Vi
khuẩn được pha ở nồng độ gốc 1000 vi khuẩn/µl
trong mẫu hỗn hợp đất-nước lấy từ tự nhiên, sau
đó được pha loãng liên tục theo cơ số 2. Với các
độ pha loãng khác nhau như thế này, 1 µl của mỗi
một nồng độ
được sử dụng cho phản ứng PCR với
cặp mồi PLAF - PLAR, thực hiện theo qui trình mô
tả ở trên.

2
TCNCYH 38 (5) - 2005
III. KẾT QUẢ
Kết quả khảo nghiệm độ nhạy phản ứng PCR
với các nguồn ADN làm khuôn khác nhau.

Từ 3 loại khuôn là ADN tổng số đã được tách
chiết, ADN của plasmid pPCP1 và vi khuẩn nguyên
vẹn tế bào, với cặp mồi đặc hiệu PLAF - PLAR,
phản ứng PCR thực hiện thành công, nhân một
đoạn gen pla của plasmid pPCP1 có độ dài 480 bp
(hình 1). Sau khi dòng hoá và giải trình trình tự
thu nhận chuỗi nucleotit, chuỗi này được đưa vào
truy cập Ngân hàng Gen, sử dụng chươ
ng trình
BLAST ở địa chỉ:
(
kết quả truy
cập giới thiệu ở hình 2.
Hình 1. Kết quả phản ứng PCR thu nhận sản
phẩm đoạn gen pla từ vi khuẩn dịch hạch
phân lập ở Việt Nam
Ghi chú: M: Chỉ thị ADN, ở đây dùng ADN của
thực khuẩn thể Lambda cắt bằng enzym giới hạn
HindIII. Sản phẩm PCR có độ dài 480 bp, sử dụng
cặp mồi PLAF - PLAR, với các cách xử lý ADN làm
khuôn khác nhau: số 1: Từ ADN tổng số của vi
khuẩn; số 2: Từ ADN plasmid pPCP1 tách chiết từ
vi khuẩn; số 3: Từ vi khuẩn nguyên ế bào (không
tách chiết ADN).

t
Độ nhạy của phản ứng PCR với độ pha loãng
cao nhất, đã được thực hiện thành công, với độ
pha loãng cao nhất của các loại khuôn, sau khi
tính toán, như sau:
- Với khuôn là ADN tổng số:
Phản ứng thực
hiện được ở nồng độ là 0,6ng, tương đương với 1
vi khuẩn Y. Pestis.
- Với khuôn là ADN của plasmid pPCP1:
Phản
ứng thực hiện được ở nồng độ là 0,2ng;
- Với khuôn là vi khuẩn nguyên vẹn (không cần
tách ADN tổng số):
Phản ứng thực hiện được ở
nồng độ với lượng vi khuẩn là khoảng 5 - 10 vi
khuẩn.
- Tiến hành pha loãng các loại khuôn và thực
hiện phản ứng PCR và nhận thấy, PCR đặc hiệu
vẫn thực hiện thành công ở độ pha loảng rất cao,
tương đương với hàm lượng khuôn ADN tổng số là
0,1ng - 0,6ng/phản ứng.


Số đăng ký Ngân hàng Gen Tên loài có kết quả tương đồng Hệ s
ố Giá trị
3

TCNCYH 38 (5) - 2005
gi|48629|emb|X15136.1|YPPLA Y.pestis plasmid pKYP1 pla
gene 952 0.0 gi|5763810|emb|AL109969.1|YPPCP1 Yersinia
pestis plasmid pPCP1
952 0.0
gi|2996216|gb|AF053945.1|AF053945 Yersinia pestis plasmid
p 952 0.0 gi|155524|gb|M27820.1|YEPTPA Yersinia pestis
plasminogen ac
936 0.0 gi|23194196|gb|AF528089.1|
Yersinia pestis isolate assc Pla
872 0.0
gi|23194194|gb|AF528088.1| Yersinia pestis isolate pusc
Pla
872 0.0 gi|23194192|gb|AF528087.1| Yersinia pestis
isolate suau Pla
872 0.0 gi|23194190|gb|AF528086.1|
Yersinia pestis isolate sull Pla
872 0.0
gi|23194188|gb|AF528085.1| Yersinia pestis isolate nabc
Pla
872 0.0 gi|23194186|gb|AF528084.1| Yersinia pestis
isolate nasp Pla
872 0.0 gi|23194184|gb|AF528083.1|
Yersinia pestis isolate ansp Pla
872 0.0
gi|23194182|gb|AF528082.1| Yersinia pestis isolate anbc
Pla
872 0.0
Hình 2. Kết quả truy cập Ngân hàng Gen sử dụng chuỗi nucleotit của gen pla thu nhận từ vi
khuẩn dịch hạch Việt Nam đã được xác định với hệ số đồng nhất 100% với gen pla của plasmid

pPCP1 của vi khuẩn dịch hạch (Yersinia Pestis) thế giới.
Ghi chú: Phần mềm sử dụng là chương trình BLAST của NCBI (Dãy số và ký tự bên trái là số đăng ký;
ở giữa là tên loài; hai dãy cuối cho biết mức độ chính xác của kết quả phân tích sinh - tin học t ong
chương trình BLAST.

r

Kết quả phản ứng PCR với nguồn khuôn là vi khuẩn dịch hạch giả nghiệm pha loãng trong mẫu đất -
nước.
123456789M
Hình 3. Kết quả phản ứng PCR thu
nhận sản phẩm đoạn gen pla từ khuôn
là ADN tổng số đã pha loãng


Ghi chú: M: Chỉ thị ADN, ở đây dùng ADN của thực khuẩn thể Lambda cắt bằng enzym giới hạn
HindIII. Sản phẩm PCR có độ dài 480bp, sử dụng cặp mồi PLAF - PLAR. Đường chạy 1 - 9: sản phẩm PCR,

4
TCNCYH 38 (5) - 2005

(
với khuôn pha loảng gấp đôi từ số 1 (1000 vi
khuẩn); đến đường số 9 (khoảng 4 vi khuẩn) vẫn
có sản phẩm PCR dương tính mũi tên chỉ dẫn)

Với kết quả khảo sát độ nhạy phản ứng PCR đã
đạt được, chúng tôi thấy có thể xây dựng phương
pháp chẩn đoán nhanh vi khuẩn dịch hạch có
nguồn lây trong thiên nhiên. Vì an toàn sinh học,

mẫu vi khuẩn nghiên cứu chúng tôi đang có đã bị
vô hoạt, hơn nữa không thể phân lập trong tự
nhiên và duy trì loại vi khuẩn này ở phòng thí
nghiệm của chúng tôi, do vậy, chúng tôi đề xuất
xây dựng chẩn đoán nhanh bằng phươ
ng pháp giả
nghiệm. Thực chất của phương pháp này là pha vi
khuẩn dịch hạch vô hoạt vào trong hỗn hợp đất -
nước lấy từ thiên nhiên, với nồng độ gốc có số
lượng ban đầu là 1000 vi khuẩn/µl; sau đó pha
loãng tiếp theo cơ số 2 liên tục: 1) 1000 vi
khuẩn/µl; 2) 500 vi khuẩn/µl; 3) 250 vi khuẩn/µl;
4) 125 vi khuẩn/µl; 5) 62,5 vi khuẩn/µl; 6) 31,25 vi
khuẩn/µl; 7) 15,625 vi khuẩn/µl; 8) 7,8125 vi
khuẩn/µl; 9) 3,90625 vi khuẩn/µl; 10) 1,953125 vi
khuẩn/µl.
Với khuôn là 1µl ở mỗi nồng độ pha loãng,
chúng tôi ti
ến hành phản ứng PCR đặc hiệu trên
gen pla, với cặp mồi PLAF - PLAR. Hình ảnh sản
phẩm PCR thực hiện thành công ở các nồng độ
pha loãng được trình bày ở hình 3. Sản phẩm của
phản ứng PCR nhìn thấy rất rõ ở các đường chạy
số 1 - 7; và vẫn phát hiện được ở đường chạy số
9, với nồng độ pha loãng 9 lần theo cơ số 2 từ
1000 vi khuẩn ban đầu; tương đương v
ới 4 vi
khuẩn làm khuôn (đường chạy số 9, hình 3).
IV. BÀN LUẬN
Do thành phần cặp mồi PLAF - PLAR được thiết

kế dựa trên chuỗi gen pla, gen đặc hiệu riêng của
plasmid pPCP1, mà plasmid này lại thuộc sở hữu
duy nhất của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis,
cho nên tính đặc hiệu của cặp mồi này là rất cao.
Điều này được chứng minh bằng kết quả của
chúng tôi là phản ứng PCR với cặp mồi PLAF -
PLAR là hết sức đặc hiệu và rất nhạy, được thực
hiện thành công ngay cả khi với lượng ADN (các
loại) có hàm lượng rất thấp, 0,1 - 0,6ng hay
khoảng 1 - 10 vi khuẩn nguyên vẹn làm khuôn.
Mặc dù được pha loãng vào trong đất và nước
và thực hiện phản ứng PCR, trong môi trường đất
- nước giả nghiệm có vi khuẩn dịch hạch như thế
này, ở nồng độ pha loãng với số lượng chỉ cần
khoảng 4 vi khuẩn làm khuôn, phản ứng PCR chẩn
đoán sự có mặt của chúng vẫ
n cho kết quả dương
tính.
Chúng tôi cho rằng, việc chẩn đoán một loại vi
sinh vật gây bệnh có sở hữu plasmid độc lực như
vi khuẩn dịch hạch với pPCP1, phương pháp tốt
nhất và chính xác nhất vẫn là phát hiện gen “độc
lực” của chúng nằm trên loại plasmid đó. Phương
pháp của chúng tôi phù hợp với định hướng chẩn
đoán trực tiếp bằng PCR trên các gen “độc lực”
của các plasmid c
ộng sinh ở vi khuẩn gây bệnh, đã
được thực hiện trong những năm gần đây trên thế
giới [5,11].
V. KẾT LUẬN

Với nguồn làm khuôn là ADN hỗn hợp (ADN
tổng số); ADN của plasmid tách riêng hay nguyên
vẹn tế bào vi khuẩn không cần tách chiết, phản
ứng PCR vẫn cho kết quả hết sức đặc hiệu, tạo cơ
sở xây dựng phương pháp chẩn đoán nhanh và
chính xác.
Phản ứng PCR đặc hiệu, cho phép thu nhận
được đoạn gen pla có độ dài 480 cặp nucleotit có
nguồn gốc từ plasmid pPCP1 của vi khuẩn dịch
hạch phân lập tạ
i Việt Nam.
Giả nghiệm hỗn hợp vi khuẩn với đất - nước,
phản ứng PCR vẫn cho kết quả dương tính ở độ
pha loãng cao, chứa số lượng vi khuẩn khoảng 4 vi
khuẩn làm khuôn trong 1 phản ứng.
Từ kết quả giả nghiệm chúng tôi khẳng định
phương pháp chẩn đoán nhanh vi khuẩn dịch hạch
từ đất - nước và môi trường nhiễm khuẩn thực
hiện nhanh, chính xác, phát hi
ện trực tiếp vi khuẩn
ở số lượng rất thấp (4 - 10 vi khuẩn) mà không
cần thiết nuôi cấy và tách chiết ADN.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đào Xuân Vinh (1989). Đặc điểm sinh
học của các chủng vi khuẩn dịch hạch phân lập ở
Tây Nguyên, Luận án PTS. Y học, Trường Đại học
Y Hà Nội.
2. Đào Xuân Vinh, Chu M.C. và cs. (2002).
"Bước đầu nghiên cứu DNA của một số chủng Y.
pestis phân lập tại Tây Nguyên bằng enzym cắt

đoạn (Restriction)". Tạp chí Y học thực hành, số
10 (432 + 433), tr. 29 - 31.
3. Lê Thanh Hoà (2003a). “Các loại plasmid
của vi khuẩn dịch hạch (Yersinia Pestis) và ứng
5
TCNCYH 38 (5) - 2005
dụng chẩn đoán phân tử tại Việt Nam”, tr 69 - 78.
Sách: "Từ khoa học sinh học phân tử đến cuộc
sống và chăm sóc sức khoẻ". Báo cáo khoa học
Hội nghị Sinh học phân tử và Hoá sinh toàn quốc.
Hà Nội, 22 - 24/10/2003. Nhà xuất bản Nông
nghiệp, Hà Nội, Việt Nam, 384 trang.
4. Lê Thanh Hoà (2003b). Giám định phân
tử vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Yersinia pestis
(Lehmann and Neumann 1896) phân lập tại Việt
Nam sử dụng gen pla của plasmid pPCP1. Tạp chí
Y học Việt Nam, 283(4): 1 - 11.
5. Chu, M.C. (2000). Laboratory Manual of
Plague Diagnostic Test CDC, 3rd edition, WHO, pp.
67 - 89.
6. Engelthaler, D. M., Hinnebusch, B. J.,
Rittner, C. M., Gage, K. L. (2000). Quantitative
competitive PCR as a technique for exploring Flea -
Yersina pestis dynamics. Am J Trop Med Hyg.
62(5): 552 - 560.
7. Hu, P., Elliott, J., McCready, P.,
Skowronski, E., Garnes, J., Kobayashi, A.
Brubaker, R.R, and Garcia, E. (1998).
Structural organization of virulence - associated
plasmids of Yersinia pestis. J. Bacteriol. 180 (19):

5192 - 5202.
8. Parkhill, J., Wren, B. W., Thompson,
N.R. và cộng sự. (2001). Genome sequence of
Yersinia pestis, the causative agent of plague.
Nature 413, 523 - 527.
9. Perry, R. D., Straley, S. C., Fetherston,
J. D., Rose, D. J., Gregor, J. and Blattner, F.
R. (1998). DNA sequencing and analysis of the
low - Ca2 + - response plasmid pCD1 of Yersinia
pestis KIM5. Infect Immun. 66 (10): 4611 - 4623.
10. Sambrook, J. and Russell, D. (2001).
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (3rd ed.)
Cold Springs Harbor Press, Cold Springs Harbor
N.Y
11. Tsukano, H., Itoh, K., Suzuki, S.,
Watanabe, H. (1996). Detection and
identification of Yersinia pestis by polymerase
chain reaction (PCR) using multiplex primers.
Microbiol. Immunol. 40(10): 773 - 775.
Summary
MOLECULAR APPROACH FOR RAPID DIAGNOSTIC KIT TO DETECT YERSINIA
PESTIS FROM INFECTED SOIL - WATER SAMPLE

Yersinia pestis is the cause for the acute infection and may be chosen for biological terrorism. Rapid
diagnosis of this agent from infected soil - water is essential. Y. pestis habours 3 specific plasmids
providing virulent factors to the bacterium. Objectives: (1) Testing the sensitivity and accurateness of
PCR for Y. pestis. (2) Carrying out PCR using total genomic DNA serially diluted as a template. (3)
Undertaking PCR on artificical experimentation by diluting Y. pestis in soil water as samples to test PCR –
based fast diagnostic approach. Methods: Yersinia pestis (inactivated) was used. Genomic DNA was
extracted by DNeasy kit (Qiagen Inc). Using primer - pairs PLAF - PLAR (binding on pla gene of plasmid

pPCP1) a specific product of PCR was 480 bp. After determination of the PCR sensitivity, a molecular -
based diagnostic kit was developed. Sensitivity and specificity of this kit was tested by PCR using diluted
genomic DNA and bacterium itself; and mix of these templates in water and soil as samples. Results: With
the diluted genomic DNA, it was successful to obtain specific PCR with 0,6ng template, which is equal to a
single bacterium. Additionally, successful PCR amplification was obtained using the whole bacterium
(without extraction of genomic DNA) and diluted quantity ranging from 101 to 102. Based on these results,
the bacterium was artificially diluted with sample of soil - water as a natural isolate for PCR amplification.
As a result, specific PCR product was obtained by 1 ng genomic and 4 bacteria per template.
Conclusions: Evidently, approach for PCR - based diagnostic kit was successfully carried out from any
template including soil - water samples with high fidelity, using the pla gene genetic marker of pPCP1 of Y.
pestis.
Keywords: plague, Yersinia pestis, plasmid pPCP1, gen pla, PCR, artificial experimentation.



6