Khảo sát hoạt tính và tinh sạch Protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae và Aspergillus Kawasaki trên môi trường bán rắn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH



ĐẬU THỊ KIM DUNG



KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI
CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ
ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN





Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học






Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************



KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI
CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ
ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN


Luận văn kỹ sƣ



Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực hiện :
TS. NGUYỄN NGỌC HẢI ĐẬU THỊ KIM DUNG
PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG Khóa : 2002 - 2006
CN. ĐỖ THỊ TUYẾN





Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006



MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC

DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY







SURVEYING ACTIVITY OF PROTEASE AND PURIFYING
PROTEASE EXTRACTING FROM TWO FUNGAL SPECIES
ASPERGILLUS ORYZAE AND ASPERGILLUS KAWASAKI ON
SEMI SOLID MEDIUM





Graduation thesis
Major : Biotechnology




Professors : Student :
PhD. NGUYEN NGOC HAI ĐAU THI KIM DUNG
Vice Professor-PhD. NGUYEN TIEN THANG Term : 2002 - 2006
BA. ĐO THI TUYEN

HCMC, 09/2006
iv
LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến :
* Ban Giám hiệu trƣờng đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức
cho em trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.
* Thầy Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn, giải đáp mọi thắc mắc của em
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
* Thầy Nguyễn Tiến Thắng, cô Đỗ Thị Tuyến, là cán bộ trực thuộc phòng Các
Chất Có Hoạt Tính Sinh Học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình
hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện để em có thể hoàn tất khóa luận này.
* Anh Nguyễn Diên Sanh, anh Nguyễn Duy Long là những cán bộ nghiên cứu
thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã hỗ trợ cũng nhƣ cung cấp cho em nhiều kiến thức
xung quanh đề tài.
* Các bạn lớp CNSH K28 đã động viên, giúp đỡ tôi những lúc khó khăn cũng
nhƣ chia xẻ những vui buồn trong suốt thời gian học tập.
* Các bạn phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học đã giúp đỡ, động viên tôi
trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
* Cuối cùng con xin cảm ơn bố mẹ đã, đang và mãi mãi là chỗ dựa vững chắc cả
về tinh thần lẫn vật chất cho con niềm tin và động lực bƣớc vào đời.

TÓM TẮT KHÓA LUẬN


Đậu Thị Kim Dung, Đại học Nông Lâm Tp.HCM. Tháng 9/2006. “KHẢO SÁT
HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC
v
ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG
BÁN RẮN”. Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 10/2/2006 đến ngày 1/6/2006 tại Viện Sinh
Học Nhiệt Đới TP.HCM.
Hội đồng hƣớng dẫn :
PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG
TS. NGUYỄN NGOC HẢI
CN. ĐỖ THỊ TUYẾN
Chế phẩm enzyme thô dạng bột của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và
Aspergillus kawasaki đƣợc chiết bằng nƣớc cất, thu đƣợc dịch chiết enzyme thô. Dịch
chiết thô này đƣợc tủa với muối (NH
4
)
2
SO
4
ở các nồng độ (% độ bão hòa) : 50, 55, 60,
65, 70, 75 và cồn 96
0
ở các tỷ lệ dịch chiết enzyme : cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6

Cặn tủa thu đƣợc hòa vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính protease nhằm tìm ra
nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease. Từ đó khảo sát điều kiện tối ƣu
cho hoạt động của protease từ dịch tủa enzyme thu đƣợc từ nồng độ muối và tỷ lệ cồn
tối ƣu. Cuối cùng, dịch tủa pha trong đệm đƣợc chạy qua sắc ký lọc gel và xác định
trọng lƣợng phân tử protease bằng điện di. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau :
 Ở cả hai chủng, nồng độ muối 65% độ bão hòa và tỷ lệ cồn 1 : 4 là tối ƣu để
tủa protease.
 Protease của cả hai chủng hoạt động mạnh nhất ở pH = 7 và nhiệt độ 47
0
C.
 Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae cao hơn hoạt tính của Aspegillus
kawasaki.






MỤC LỤC



NỘI DUNG TRANG
Bìa ..................................................................................................................................... i
Trang tựa .......................................................................................................................... ii
vi
Lời cảm tạ ...................................................................................................................... iii
Tóm tắt khóa luận ........................................................................................................... iv
Mục lục ............................................................................................................................ v
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... viii

Danh sách các bảng ........................................................................................................ ix
Danh sách các hình và đồ thị .......................................................................................... xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Mục đích nghiên cứu ................................................................................................. 2
1.3 Yêu cầu ...................................................................................................................... 2
2.1 Khái quát chung về enzyme ...................................................................................... 3
2.1.1 Lƣợc sử các công trình nghiên cứu enzyme ........................................................... 3
2.1.2 Định nghĩa về enzyme ............................................................................................ 5
2.1.3 Phân loại enzyme .................................................................................................... 6
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme ........................ 7
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme ................................................................................................. 7
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme ......................................... 7
2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống .......................................... 9
2.1.5.1 Nguồn thu nhận ................................................................................................... 9
2.1.5.2 Vai trò ................................................................................................................ 11
2.2 Khái quát chung về enzyme protease ...................................................................... 11
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease ................................................................................ 11
2.2.2 Lƣợc sử phát triển các enzyme protease .............................................................. 12
2.2.2.1 Protease từ động vật .......................................................................................... 12
2.2.2.2 Protease từ thực vật ........................................................................................... 12
2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật ........................................................................................ 13
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease......................................................................... 13
2.2.3.1 Từ động vật ........................................................................................................ 13
2.2.3.2 Từ thực vật ......................................................................................................... 13
2.2.3.3 Từ vi sinh vật ..................................................................................................... 14
2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease ............................................................................ 14
2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ...................................... 15
2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................... 15
2.3.1.1 Phân loại ........................................................................................................... 15

2.3.1.2 Đặc điểm ............................................................................................................ 15
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt ................................ 16
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease ................................. 18
2.5.1 Trích ly enzyme .................................................................................................... 19
2.5.2 Quá trình tủa ........................................................................................................ 20
2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký ....................................................... 22
2.5.4 Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di SDS –
PAGE ............................................................................................................................. 27
PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 29
3.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................................. 29
3.2 Vật liệu .................................................................................................................... 29
3.2.1 Chế phẩm enzyme thô .......................................................................................... 29
3.2.2 Hóa chất ................................................................................................................ 29
vii
3.2.3 Thiết bị .................................................................................................................. 29
3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm .......................................................................................... 30
3.3.1 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 30
3.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lƣợng và hoạt tính enzyme của dịch chiết enzyme
thô .................................................................................................................................. 30
3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH
4
)
2
SO
4
và tỷ lệ cồn tối ƣu để tủa
enzyme protease ............................................................................................................ 36
3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt động của protease .... 37
3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel...................................... 37
3.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme bằng phƣơng pháp điện

di SDS – PAGE ............................................................................................................. 41
3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 44
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.......................................................................... 45
4.1 Hàm lƣợng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô ................................................ 45
4.2 Nồng độ muối (NH
4
)
2
SO
4
tối ƣu cho việc tủa protease .......................................... 45
4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 46
4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 48
4.3 Tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease ..................................................................... 49
4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 49
4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 51
4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 96
0
và tủa bằng muối (NH
4
)
2
SO
4
.................... 53
4.5 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease...................... 54
4.5.1 pH tối ƣu ............................................................................................................... 54
4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae ........................................................ 54
4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki .................................................... 54
4.5.2 Nhiệt độ tối ƣu ...................................................................................................... 55

4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ..................................................................... 55
4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................ 56
4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel ................................................................................... 56
4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae ................................................................................... 57
4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki .............................................................................. 59
4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc
Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki ................................................................. 62
4.7.1 Tủa protease bằng muối ........................................................................................ 62
4.7.2 Tủa protease bằng cồn .......................................................................................... 62
4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di trên gel SDS –
PAGE ............................................................................................................................. 63
PHẦN 5 : KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 67
5.1 Kết luận.................................................................................................................... 67
5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................................... 67
5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki ................................................................ 67
5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki .......................... 68
5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 69
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 70


viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC THUẬT NGỮ



Asp.oryzae : Aspergillus oryzae
Asp.kawasaki : Aspergillus kawasaki
CP : Chế phẩm (Chế phẩm enzyme dạng bột thô do phòng vi sinh
ứng dụng Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp).
ix
CBB : Coomasie Brilliant Blue.
ĐVHT : Đơn vị hoạt tính.
HT : Hoạt tính
HTR : Hoạt tính riêng.
TCA : Trichloacetic acid
A.U : Độ hấp thụ.

mS/cm : Milisiemens/cm (đơn vị đo lƣờng độ dẫn điện).
UI : Đơn vị hoạt tính enzyme.

DANH SÁCH CÁC BẢNG


BẢNG TRANG
Bảng 2.1 Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính của protein .......................................... 22
Bảng 3.1 Đƣờng chuẩn Albumin ................................................................................... 32
x
Bảng 3.2 Đƣờng chuẩn Tyrosine ................................................................................... 34
Bảng 3.3 Khối lƣợng (NH
4
)
2
SO
4
tƣơng ứng với mỗi nồng độ ...................................... 36
Bảng 3.4 Thể tích cồn tƣơng ứng với các tỷ lệ. ............................................................ 36
Bảng 4.1 Hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein của dịch chiết enzyme thô
của hai chủng Asp.oryzae và Asp. kawasaki ................................................................. 45
Bảng 4.2 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch
hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối ................................................ 46
Bảng 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối ............................................................ 46
Bảng 4.4 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch
pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối .................................................. 48
Bảng 4.5 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối ....................................................... 48
Bảng 4.6 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch

hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn .................................................. 50
Bảng 4.7 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn .............................................................. 50
Bảng 4.8 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch
pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn .................................................... 51
Bảng 4.9 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1 g chế phẩm enzyme
thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn .......................................................... 52
Bảng 4.10 So sánh việc tủa enzyme bằng tác nhân cồn và muối ở hai chủng
Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki. ................................................................ 53
Bảng 4.11 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo pH ................ 54
Bảng 4.12 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo pH ............ 55
Bảng 4.13 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo nhiệt độ ......... 55
Bảng 4.14 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo nhiệt độ .... 56
Bảng 4.15 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae qua sắc ký lọc gel ....... 59
Bảng 4.16 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki qua sắc ký lọc gel .... 61
Bảng 4.17 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease
bằng muối ...................................................................................................................... 62
xi
Bảng 4.18 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease
bằng cồn ......................................................................................................................... 62
Bảng 4.19 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử của những protein trong thang. ............. 65
Bảng 4.20 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 3 của Asp.oryzae .......... 66
Bảng 4.21 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 2 của Asp.kawasaki ..... 66

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ


HÌNH TRANG
Hình 2.1 Đƣờng biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến tốc độ
xii
phản ứng ......................................................................................................................... 8
Hình 2.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ
cơ chất ......................................................................................................................... 8
Hình 2.3 Công thức cấu tạo enzyme protease ............................................................... 11
Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi ............................................... 16
Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên môi
trƣờng CBS – MEA2%. ................................................................................................. 16
Hình 2.6 Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký ......................... 23
Hình 2.7 Quá trình lọc gel ............................................................................................. 26
Hình 3.1 Máy quang phổ UV-Vis ................................................................................. 31
Hình 3.2 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ .................................... 38

Hình 4.1 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P-100 khi tủa protease bằng
muối đối với nấm Aspergillus oryzae ........................................................................... 58
Hình 4.2 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng
cồn đối với nấm Aspergillus oryzae .............................................................................. 58
Hình 4.3 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng
muối đối với nấm Aspergillus kawasaki........................................................................ 60
Hình 4.4 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa protease bằng
cồn đối với Aspergillus kawasaki .................................................................................. 60


ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1 Đồ thị so sánh hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme protease trong dịch
chiết enzyme thô giữa hai chủng nấm mốc Asp.oryzae và Asp.kawasaki ..................... 45
Đồ thị 4.2 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô
của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối................................................................... 47
Đồ thị 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô
của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối ............................................................. 49
Đồ thị 4.4 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô
của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn ..................................................................... 51
Đồ thị 4.5 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô
của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn ................................................................. 52
xiii
Đồ thị 4.6 Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.oryzae. ....... 54
Đồ thị 4.7 Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.kawasaki ..... 55
Đồ thị 4.8 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.oryzae ............. 55
Đồ thị 4.9 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.kawasaki. ....... 56
Đồ thị 4.10 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bƣớc tinh sạch khi tủa
protein bằng muối. ......................................................................................................... 62
Đồ thị 4.11 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bƣớc tinh sạch khi tủa
protease bằng cồn. ......................................................................................................... 63

Đồ thị 4.12 Sự tƣơng quan giữa Lg của trọng lƣợng phân tử và giá trị Rf. .................. 65




1

PHẦN 1 : MỞ ĐẦU


1.2 Đặt vấn đề
Để duy trì sự sống, cơ thể mỗi sinh vật phải thực hiện rất nhiều phản ứng hóa
sinh. Nhƣ vậy điều gì đã giúp các phản ứng này đƣợc tiến hành mau lẹ phi thƣờng mà
vẫn nhịp nhàng cân đối. Đó là nhờ khả năng xúc tác và điều hòa to lớn của enzyme.
Có bản chất là một protein, enzyme không chỉ có thể thực hiện khả năng xúc
tác sinh học bên trong cơ thể mà còn có thể thực hiện các xúc tác bên ngoài cơ thể khi
tạo cho chúng một điều kiện thích hợp để hoạt động. Bởi lẽ đó, trong vòng vài chục
năm gần đây việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzyme trên thế giới đã phát
triển với tốc độ rất mạnh mẽ.
Nhân tố quan trọng có tác dụng thúc đẩy cho sự phát triển của nền công nghiệp
sản xuất enzyme đó là khả năng to lớn của vi sinh vật - những nhà máy chế tạo
enzyme. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh do đó có khả năng tạo ra
một lƣợng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme do chúng
tạo ra có hoạt lực cao và chúng ta có thể tận dụng các phế thải của ngành khác để làm
môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme.
Protease là một trong những nhóm enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và
phổ biến trong đời sống. Protease đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau nhƣ công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học…Hoạt tính của
enzyme nói chung và của protease nói riêng chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố. Điều
kiện tối thích để mỗi loại enzyme hoạt động là khác nhau. Do đó, để sử dụng enzyme

hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện hoạt động tối ƣu cho hoạt động của enzyme đó.
Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính protease và tìm hiểu về kĩ thuật sắc ký lọc gel dùng
trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài :“Khảo sát hoạt tính và tinh
sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus
kawasaki trên môi trƣờng bán rắn”.
Aspergillus oryzae từ lâu đã đƣợc dùng nhƣ là nguồn vi sinh vật đƣợc nuôi
cấy để thu nhận enzyme protease. Tuy nhiên, đối với Aspergillus kawasaki thì ngƣời ta
2

chỉ biết đến nhƣ là nguồn vi sinh vật để thu nhận amylase. Do đó, qua đề tài, chúng ta
có thể đánh giá đƣợc hiệu quả sử dụng protease của chủng Aspergillus kawasaki.
1.2 Mục đích nghiên cứu.
 Xác định các điều kiện thu nhận và đặc tính của enzyme protease từ hai chủng
nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspgillus kawasaki.
 So sánh hoạt tính enzyme protease giữa hai chủng nấm mốc Aspergillus
oryzae và Aspergillus kawasaki.
1.3 Yêu cầu.
 Thu nhận enzyme , xác định nồng độ muối (NH
4
)
2
SO
4
bão hòa và tỷ lệ cồn tối
ƣu trong việc tủa enzyme - bƣớc đầu trong quá trình tinh sạch enzyme.
 Xác định pH và nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của enzyme protease.
 Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.
 Xác định trọng lƣợng phân tử của enzyme protease bằng kỹ thuật điện di SDS
– PAGE.

3

PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát chung về enzyme
2.1.1 Lƣợc sử các công trình nghiên cứu enzyme
Từ trƣớc thế kỷ 17, khi loài ngƣời hoàn toàn chƣa hiểu biết gì về ezyme,
ngƣời ta đã biết sử dụng rộng rãi các quá trình enzyme trong hoạt động thực tế nhƣ
làm bánh mì, làm bia, rƣợu,…Việc ứng dụng enzyme trong giai đoạn này hoàn toàn có
tính chất kinh nghiệm thuần túy và sử dụng enzyme thông qua hoạt động sống của tế
bào vi sinh vật.
Ngay từ thế kỷ 17, các nhà khoa học đã quen dùng từ “ferment” do nhà khoa
học ngƣời Hà Lan Van Heltmon đề xƣớng. Theo nghĩa tiếng La Tinh thì “fermentatio”
nghĩa là sự lên men, đó cũng là nguồn gốc của từ “ferment”. Theo ý kiến của ông, yếu
tố tham gia tích cực vào quá trình lên men rƣợu là “ferment”. Yếu tố đó là gì thì còn là
điều bí ẩn. Các nhà khoa học đã không vừa lòng với hiểu biết này và đã đi sâu vào
thực nghiệm, quan sát, mô tả.
Đến nửa cuối thế kỷ 18 bắt đầu có những thí nghiệm đầu tiên thô sơ và đơn

giản chứng minh tác dụng của men tiêu hóa đƣợc nhà tự nhiên học ngƣời Pháp
Réaunur tiến hành vào năm 1713 và đƣợc Spallanzani ngƣời Ý khẳng định lại một
cách chặt chẽ hơn vào năm 1783 với tác dụng của dịch dạ dày phân hủy thịt.
Năm 1814, viện sĩ viện hàn lâm khoa học Petecbua là Kirchov ngƣời Nga
làm thí nghiệm chứng minh nƣớc chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển
hóa tinh bột thành đƣờng ở nhiệt độ 40 – 60
0
C .
Năm 1817 hai nhà khoa học Manaxenia (Nga) và Buchner (Đức) đã làm thí
nghiệm thành công quá trình lên men bằng chất dịch vô bào từ nấm men. Nhà sinh lý
học thực vật K.Tinniriazev đã viết “Không còn nghi ngờ gì nữa, lần đầu tiên ngƣời ta
đã chứng minh đƣợc rằng hiện tƣợng lên men chung quy chỉ là một quá trình hóa học,
nó có thể dễ dàng lập lại ngoài cơ thể sống nhờ những enzyme hòa tan chiết xuất từ
những tế bào đã bị phá hủy cấu trúc”.
Năm 1833, hai nhà khoa học ngƣời Pháp là A.Payen và J.Person thu nhận
đƣợc chế phẩm enzyme amylase ở dạng kết tủa bằng cách thêm cồn vào dịch chiết từ
hạt lúa nảy mầm. Kết tủa này có khả năng phân giải tinh bột thành đƣờng và đƣợc gọi
4

là diastase. Đây là thực nghiệm đặt nền móng cho các tiến bộ trong lĩnh vực enzyme
vào nửa sau thế kỷ 19.
Năm 1835, Berzelius lần đầu tiên đã đề ra khả năng giải thích tác dụng của
enzyme trên cơ sở hóa học. Ông gọi hiện tƣợng làm tăng quá trình phản ứng là sự xúc
tác và chất gây ra hiện tƣợng này là chất xúc tác.
Năm 1856, Pasteur đã tiến hành nghiên cứu bản chất của quá trình lên men
rƣợu. Theo ông, chính nấm men hay vi khuẩn lên men mà ta nhìn thấy dƣới kính hiển
vi là nguyên nhân gây ra hiện tƣợng lên men rƣợu . Ông cho rằng chỉ có nấm men hay
vi khuẩn còn sống mới có thể thực hiện quá trình lên men. Từ đó dẫn đến hai khái
niệm mâu thuẫn nhau : men hữu hình (ferment hữu hình ) và men không nhìn đƣợc
(ferment hòa tan).

Năm 1862, nhà khoa học ngƣời Nga Danilevxki đã sử dụng một kỹ thuật đặc
biệt để tách chiết trypsine ra khỏi hỗn hợp với amylase trong dịch tụy bằng kỹ thuật
“phƣơng pháp hấp thụ chọn lọc enzyme” (tức là gắn enzyme lên bề mặt chất đỡ) và
“phản hấp thụ” (nghĩa là giải phóng enzyme ra khỏi bề mặt chất đỡ) rồi kết tinh. Hiện
nay chúng ta gọi đó là một dạng của “kỹ thuật sắc ký ”.
Năm 1894, nhà khoa học ngƣời Pháp G.Bertrand phát hiện ra một loại enzyme
mới là enzyme oxy hóa với việc phát hiện ra enzyme lacasae trong nhựa mủ cây sơn ta
Rhus succedanea.
Từ những thành tựu ban đầu đó, enzyme bắt đầu đƣợc chú ý nghiên cứu nhiều
hơn vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20. Liên tiếp trong những năm 1930, 1931 hai nhà
khoa học D.Northop và M.Kunitz đã tách đƣợc pepsine và trypsine dƣới dạng tinh thể.
(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
Năm 1913, hai nhà khoa học L.Michalis và Menten đã nghiên cứu cơ chế xúc
tác nhờ enzyme có sử dụng chất đồng vị, sử dụng phƣơng pháp quang học và phƣơng
pháp hóa học nghiên cứu các nhóm hoạt động của enzyme đã đem lại cho chúng ta
“phƣơng trình Michalis-Menten” nổi tiếng trong nghiên cứu động học của enzyme.
(Nguyễn Hữu Chấn, 1984).
Hiện nay enzyme đã trở thành một ngành khoa học mũi nhọn phát triển rất
nhanh trên thế giới phân nhánh rất nhiều và liên quan chặt chẽ tới các ngành nhƣ hóa
lý, hóa sinh, vi khuẩn, vi sinh học, sinh lý, y học,…Hàng năm trên thế giới xuất bản
hàng chục nghìn công trình nghiên cứu về cơ chế tác dụng của enzyme, các phƣơng
5

pháp tách chiết và tinh chế, sự điều hòa về rối loạn hoạt động của cơ thể ở trạng thái
sinh lý và bệnh lý.
2.1.2 Định nghĩa về enzyme
Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có hoạt tính xúc tác sinh học, do
tế bào sống tiết ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau
phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác. (Nguyễn Tiến Thắng, 2004)
Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể

sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với
tốc độ nhịp nhàng, có trật tự, theo những chiều hƣớng xác định. Pavlôv đã nói : “Hoạt
động đầu tiên của enzyme là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống. Không có sự sống
nào lại không có quá trình enzyme”. Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa của
Anghen : “Sự sống, đó là phƣơng thức tồn tại của thể protein”. (Lê Ngọc Tú và ctv,
1982).
Enzyme có trong mọi tế bào, mọi mô của mọi sinh vật nhƣng mỗi loại mô, mỗi
loại tế bào thƣờng có những hệ thống enzyme đặc biệt. Các enzyme không chỉ tham
gia xúc tác các phản ứng sinh học trong cơ thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng
ngoài tế bào (in vitro). (Nguyễn Hữu Chấn, 1984).
Enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp
suất thấp và nhiệt độ bình thƣờng của cơ thể. Trong khi đó các chất xúc tác hóa học
cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Hơn nữa, các enzyme có khả năng chọn
lựa cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng nhƣ đối với chất mà nó tác dụng.
(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
Các loại enzyme trong cơ thể đƣợc tổng hợp, hoạt động một cách rất hài hòa để
sao cho các chất ban đầu đƣợc chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng thành một mắt
xích hoàn chỉnh. Sự trục trặc nào đó ở một trong toàn bộ mắt xích này sẽ làm rối loạn
cho cả hệ thống. Trong khi đó điều khiển tổng hợp và hoạt động của enzyme lại do
gen. Mỗi một gen chịu trách nhiệm điều khiển tổng hợp một enzyme. (Nguyễn Đức
Lƣợng, 2004).
Ƣu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh học có thể tóm tắt
nhƣ sau :
 Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng
sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lƣợng hóa học có trong vật chất.
6

 Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển
hóa rất cao.
 Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản

ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.
 Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lƣợng thƣờng rất ít.
 Enzyme luôn luôn đƣợc tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lƣợng
enzyme đƣợc tổng hợp rất lớn và luôn luôn tƣơng ứng với số lƣợng các phản ứng xảy
ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi
enzyme.
 Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Ngày nay các nhà khoa
học đã tìm ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lƣợng này
là rất nhỏ so với số lƣợng có thật trong mỗi tế bào. Trong hơn 1000 loại enzyme đã
biết, loài ngƣời mới thu nhận và kết tinh đƣợc khoảng 200 loại. (Nguyễn Đức Lƣợng,
2002).
2.1.3 Phân loại enzyme
Khi số lƣợng enzyme đƣợc phát hiện còn ít, ngƣời ta đặt tên enzyme theo ý
thích từng ngƣời tìm ra nó. Dần dần theo thời gian, số lƣợng enzyme tìm ra ngày càng
nhiều nên cần có một hệ thống phân loại theo quy ƣớc quốc tế. Enzyme đƣợc phân loại
theo tính chất của nó, đƣợc xếp vào từng nhóm nhỏ tƣơng ứng với các enzyme có bản
chất tƣơng tự nhau, làm cho việc tìm hiểu và nghiên cứu trở nên dễ dàng hơn.
Theo quy ƣớc quốc tế, tên gọi của enzyme thƣờng đƣợc đặt theo cơ chất đặc
hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó, tên enzyme
thƣờng có hai phần. Phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân các phản
ứng. Tuy nhiên, có nhiều enzyme theo thói quen vẫn đƣợc gọi theo tên cũ, không theo
hệ thống nhƣ trypsine, pepsine.
Năm 1930, Hiệp Hội Hóa Sinh Quốc Tế (IOB) đã thống nhất phân loại enzyme
ra làm 6 lớp và đƣợc đánh số thứ tự từ một đến sáu. Các số thứ tự này là cố định cho
mỗi lớp. Mỗi lớp lại chia làm nhiều tổ, mỗi tổ có nhiều nhóm. Chính vì thế theo hệ
thống phân loại, mỗi enzyme thƣờng có bốn số : số thứ tự một chỉ lớp, số thứ tự hai
chỉ tổ, số thứ ba chỉ nhóm, số thứ tƣ chỉ enzyme. Tên của các lớp, tổ và nhóm nhƣ sau
:

7

I. Oxydoreductase
a. Dehydrogenase
b. Oxydase
c. Oxygenase
d. Peroxydase
II. Transferase
a. Acyltransferase
b. Glucosyltransferase
c. Aminotransferase
d. Phosphotransferase
III. Hydrolase
a. Peptide hydrolase
b. Lipase
IV. Liase
a. Pyruvate decarboxylase
b. Fumarate hydrolase
V. Isomerase
VI. Ligase
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme
Hoạt tính xúc tác của enzyme là do cấu trúc không gian ba chiều của các
phân tử protein quyết định. Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, gấp hàng trăm,
hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác.
Tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau
nhƣ nồng độ enzyme, bản chất và nồng độ của các chất phản ứng (cơ chất), nhiệt độ,
pH môi trƣờng, nồng độ ion trong môi trƣờng, nồng độ các chất kìm hãm, các chất
hoạt hóa enzyme. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh huởng đến vận tốc phản ứng enzyme.
a) Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc bậc nhất vào nồng
độ enzyme. Đƣờng biểu diễn có dạng nhƣ ở hình 2.1

8








Hình 2.1 : Đƣờng biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng

b) Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất
Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ enzyme đƣợc giữ cố định và
nồng độ cơ chất thay đổi, ngƣời ta nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi nồng độ cơ
chất tăng. Khi nồng độ cơ chất tiếp tục gia tăng, đƣờng biểu diễn uốn cong và với
nồng độ cơ chất cao thì vận tốc không còn gia tăng nữa và đƣờng biểu diễn tiệm cận
với giá trị v
max
.







K

m
: Hằng số Michalis, là nồng độ cơ chất ứng với vận tốc bằng 1/2 vận tốc v
max
.
Hình 2.2 : Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất

c) Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng
enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng
chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vƣợt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ
giảm và dẫn đến mức triệt tiêu.
Nếu đƣa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ tối ƣu, hoạt tính enzyme sẽ bị
giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính.
V

[E]

V = k[E]
V
max

[S]
v
2
Km
0
9

Ngƣợc lại, ở nhiệt độ 0
0

C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhƣng khi
đƣa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức tối ƣu.
Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), ngƣời ta
thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tƣơng ứng với hai hiện tƣợng khác nhau :
 Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 40
0
C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng.
Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lƣợng cho phản ứng.
 Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme, ở vào khoảng 45
0
C),
vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80
– 100
0
C.
Nhiệt độ tối ƣu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ
chất, pH, lực ion của môi trƣờng.
d) Ảnh hƣởng của pH
Sự thay đổi pH gây nên :
 Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptid của
enzyme, do đó làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ
chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptid của enzyme.
 Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn
cản sự tạo thành enzyme – cơ chất trong trƣờng hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất phải ở
dƣới dạng ion.
Nhƣ vậy, hoạt tính của enzyme phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trƣờng. Đó là vì
pH môi trƣờng có ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và trung tâm
hoạt động của nó, phức chất enzyme – cơ chất và ảnh hƣởng đến độ bền của enzyme.
Ngƣời ta có thể xác định một giới hạn pH tối ƣu cho hoạt động của một
enzyme. Ngoài pH tối ƣu, vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng. Điều này cho thấy

tầm quan trọng của môi trƣờng phản ứng trong quá trình nghiên cứu các phản ứng
enzyme in vitro.
Mỗi một enzyme có một pH tối ƣu khác nhau, có thể rất acid (từ 1,5 -2),
hoặc rất kiềm (9,5 – 10). pH tối ƣu của đa số các enzyme vào khoảng chung quanh giá
trị trung tính (6 – 8). Tuy nhiên pH tối ƣu của một enzyme cũng không cố định mà phụ
thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau nhƣ bản chất và nồng độ cơ chất, tính chất dung dịch
đệm, nhiệt độ.

10

2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống
2.1.5.1 Nguồn thu nhận
Enzyme đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : động vật (pepsin từ dạ
dày, trypsin từ tụy tạng…), từ thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ
thơm…). Tuy nhiên không thể dùng hai nguồn này làm nguyên liệu để sản xuất với
quy mô công nghiệp lớn các chế phẩm enzyme nhằm thỏa mãn các nhu cầu của nền
kinh tế quốc dân. Nhƣ vậy trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu
vi sinh vật (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn. Enzyme thu
nhận từ vi sinh vật có nhiều ƣu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vƣợt xa các
enzyme từ động vật và thực vật :
 Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với một lƣợng
lớn và có thể mở rộng để sản xuất tới phạm vi cần thiết, đồng thời việc thu chế phẩm
cũng dễ dàng và có thể thỏa mãn trong một mức độ lớn nhu cầu của các ngành công
nghiệp khác nhau.
 Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Do đó vi sinh vật có thể đồng
hóa bất kỳ chất nào trong thiên nhiên. Trong khi đó có nhiều chất mà thực vật và động
vật không thể đồng hóa đƣợc.
 Enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vƣợt xa các sinh vật khác.
Do vậy chỉ cần một lƣợng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lƣợng lớn cơ chất.
 Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lƣợng lại nhỏ,

kích thƣớc bé, nhƣng tỷ lệ enzyme trong tế bào tƣơng đối lớn nên quá trình sản xuất
chế phẩm enzyme khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao.
 Phần lớn thức ăn để nuôi cấy vi sinh vật dễ kiếm và rẻ tiền. Đa số vi sinh
vật cho enzyme thƣờng có khả năng phát triển trên môi trƣờng đơn giản, rẻ tiền nhƣ
các phụ phế liệu, phế phẩm của các nghành sản xuất.
 Ƣu việt lớn của sự thu enzym từ vi sinh vật là có khả năng tăng cƣờng
sinh tổng hợp các enzym nhờ chọn giống khi tạo đƣợc những biến chủng có hoạt lực
cao. Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động môi trƣờng, có khả năng thích ứng với
nguồn dinh dƣỡng. Vì vậy, khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác động
lên chúng bằng các tác nhân khác nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzym cũng nhƣ
hoạt tính của chúng và tăng tối đa sự sinh tổng hợp các enzym trong vi sinh vật nuôi
11

cấy. Điều đó cho phép ta có thể tạo đƣợc những enzym theo ý muốn, dễ dàng thu nhận
đƣợc enzym có độ thuần khiết cao.
2.1.5.2 Vai trò
Cùng với những thành tựu đạt đƣợc trong nghiên cứu lí thuyết về enzym, các
nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tế ngày càng đƣợc mở rộng và đạt hiệu quả
cao. Các chế phẩm enzym đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ
trong hoá phân tích để định tính, định lƣợng các chất trong nông nghiệp, y học, công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp dƣợc liệu, công nghiệp nhẹ nhƣ công nghiệp dệt, công
nghiệp da.
 Trong y học có thể sử dụng enzym tinh chế để chữa bệnh, sản xuất các
sinh tố và các chất kháng sinh.
 Sử dụng chế phẩm enzym trong nông nghiệp để chế biến các sản phẩm
nông nghiệp sản xuất thức ăn cho động vật đặc biệt là động vật còn non, xử lý hạt
trƣớc khi gieo.
 Trong công nghiệp thực phẩm, chế phẩm enzym đƣợc sử dụng khá rộng
rãi trong nhiều ngành chế biến khác nhau : chế biến thịt, cá, sữa, công nghiệp sản xuất
bánh mì và các thứ bánh kẹo khác. Sử dụng chế phẩm enzym thƣờng làm tăng nhanh

quá trình chế biến, tăng hƣơng vị và giá trị dinh dƣỡng của sản phẩm. Ngoài ra, sử
dụng enzym còn có thể tái tạo hƣơng vị của các loại rau quả tƣơi sau khi chế biến.
Ngày nay, ngƣời ta cũng đã đạt đƣợc nhiều kết quả trong việc sử dụng một số enzyme
trong bảo quản đồ hộp và một số nguyên liệu khác.
2.2 Khái quát chung về enzyme protease
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân
liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do,
một ít peptid ngắn, pepton.





Hình 2.3 : Công thức cấu tạo enzyme protease
12

2.2.2 Lƣợc sử phát triển các enzyme protease
2.2.2.1 Protease từ động vật
Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa đƣợc nghiên cứu sớm hơn
cả.
Từ thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học ngƣời Pháp là Reaunur đã làm thí nghiệm
rất đơn giản và đã phát hiện đƣợc rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu
hóa thịt.
Năm 1836, Schwam đã quan sát đƣợc hoạt động phân giải protein của dịch
vị. Tuy nhiên, mãi đến hơn 30 năm sau ngƣời ta mới tách đƣợc enzyme này.
Năm 1857, Corvisart tách đƣợc trypsine từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên
thu nhận đƣợc ở dạng chế phẩm, trong chế phẩm vẫn còn lẫn nhiều protein khác.
Năm 1862, Danilevxki dùng phƣơng pháp hấp phụ trên colondion đã tách
đƣợc trypsine với amylase tụy tạng. Phƣơng pháp này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên

cứu tinh chế enzyme và protein.
Năm 1872, Hommarsten đã tách đƣợc chế phẩm chymotrypsine (renin).
Ngoài những enzyme của hệ tiêu hóa, các nhà khoa học cũng có những
nghiên cứu đầu tiên về protease trong máu. Schidt đã nêu giả thiết rằng trong máu có
enzyme fibrin (ngày nay gọi là trombin) tham gia trong quá trình đông máu. Ông đã
tiến hành việc tách chiết enzyme này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm nhận đƣợc có tác
dụng làm cho dung dịch fibrinogen đông lại nhanh chóng.
2.2.2.2 Các protease từ thực vật
So với các protease từ động vật, các protease từ thực vật đƣợc phát hiện
muộn hơn.
Năm 1874, Group – Besanez công bố đã nhận đƣợc protease từ hạt của một
loại đậu. Họ cũng nhận thấy dịch chiết từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có hoạt động
phân giải protein. Ý kiến này dựa trên cơ sở thực nghiệm là sau khi cho dịch chiết từ
các nguyên liệu trên tác dụng với fibrin, nuớc lọc của hỗn hợp cho phản ứng màu
Biure.
Bằng chứng này không thật sự vững chắc nên Group – Besanez không tiếp
tục nghiên cứu. Vì vậy Wurtz đƣợc xem nhƣ là ngƣời đầu tiên tách chiết thành công
protease từ thực vật (1879). Ông nêu lên rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có