Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN THỊ LOAN

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM MULTIPLEX
REALTIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY
NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN VÀ KHẢO SÁT TÍNH
KHÁNG KHÁNG SINH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2022


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN THỊ LOAN

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM MULTIPLEX
REALTIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY
NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN VÀ KHẢO SÁT

TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH
Chun ngành: Cơng nghệ sinh học
Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Lã Thị Huyền
2. PGS.TS. Nguyễn Minh Hiền

Hà Nội, 2022


iii

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan: đây là cơng trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả
cùng cộng tác với các cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được cơng bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý cho phép của
đồng tác giả. Phần cịn lại chưa được ai cơng bố trong bất kì cơng trình nào khác.
Tơi xin đảm bảo tính khách quan và kết quả xử lý số liệu trong nghiên
cứu này.
Hà Nội, ngày

tháng

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Loan

năm 2022


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Lã Thị Huyền, Trưởng
phịng Cơng nghệ tế bào động vật- Viện CNSH và PGS.TS. Nguyễn Minh Hiền,
Trưởng khoa Sinh hoá - Bệnh viện Thanh Nhàn là những người đã trực tiếp hướng
dẫn và giúp đỡ tôi trong q trình nghiên cứu. Các Cơ đã chỉ bảo cho tôi nhiều ý
kiến hướng dẫn qúy báu, động viên và giúp đỡ tơi giải quyết những khó khăn vướng
mắc trong quá trình thực hiện luận án và tạo mọi điều kiện cho tơi hồn thành luận
án này.
Tơi xin chân thành cảm ơn tới tập thể cán bộ nghiên cứu phịng Cơng nghệ tế
bào động vật - Viện CNSH - Viện Hàn Lâm KH và CN Việt Nam đã giúp đỡ, tạo
điều kiện thuận lợi cho tơi trong q trình thực hiện nghiên cứu. Tôi cũng xin trân
trọng cảm ơn các anh chị ở khoa Sinh hoá, khoa Vi sinh, khoa Hồi sức tích cực,
bệnh viện Thanh Nhàn, khoa Hồi sức tích cực bệnh viện Đức Giang, đặc biệt là em
Nguyễn Trọng Linh đã luôn đồng hành cùng tôi trong q trình nghiên cứu.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô khoa CNSH - Học viện KH và CN,
các thầy cô trong hội đồng nghiên cứu sinh đã nhiệt tình dạy bảo và giúp đỡ tơi, cho
tơi các ý kiến q báu để sửa chữa và hồn thiện luận án này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã ln hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất
cho tơi chun tâm làm việc và hồn thành luận án.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, các đồng nghiệp ở Khoa NôngLâm trường Đại học Hoa Lư đã luôn động viên và giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi
cho tơi trong q trình học tập, nghiên cứu và công tác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2022
Tác giả

NCS. Nguyễn Thị Loan

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan ……………………………………………………………………

i

Lời cảm ơn……………………………………………………………………….

ii

Mục lục ………………………………………………........................………….

iii

Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt ………………………………………….

v

Danh mục các bảng ……………………………………………………..………

vi

Danh mục các hình………………………………………………………............

viii

MỞ ĐẦU…………………………………………………………………...........

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..............................................................................

3

1.1.

Tình hình và căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện …...

3

1.1.1. Lịch sử phát hiện và nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện ……...........

3

1.1.2. Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện hiện nay …………………………….

4

1.1.3. Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện ……………………...

7

1.2.

Một số kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện …..

10

1.2.1. Cấy máu và xét nghiệm sinh hoá ……………………………………….

10

1.2.2.

Kỹ thuật xác định sự có mặt của DNA …………… …………………………

11

1.3.

Tình hình nghiên cứu ứng dụng multiplex realtime PCR xác định
các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện ……………………………

15

1.3.1. Trên thế giới …………………………………………………………….

15

1.3.2. Ở Việt Nam ……………………………………………………………..

17

1.4.

Kháng sinh và kháng kháng sinh ở vi khuẩn …………….………….

19

1.4.1. Kháng sinh và cơ chế tác động ………………………………………….

19

1.4.2. Kháng kháng sinh của vi khuẩn và cơ chế kháng kháng sinh …………..

21

1.4.3. Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn trên thế giới và ở Việt Nam…

28

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

35

Đối tượng nghiên cứu …………………………………………….........

35

2.1.1. Các mẫu bệnh phẩm……...……………………………………………...

35

2.1.2. Cách tính cỡ mẫu nghiên cứu …………………………………………...

35

Nguyên vật liệu nghiên cứu …………………………………………...

2.2.
2.2.1. Nguyên vật liệu …………………………………………………………

36
36

2.1.


2.2.2. Các thiết bị ……………………………………………………………...

36

2.2.3. Hoá chất………………………………………………………………....

36

Phương pháp nghiên cứu ……………………………………...……....

38

2.3.1. Nhóm phương pháp vi sinh truyền thống …………………………….....

38

2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử ………………………………………….

39

2.3.3. Phương pháp kiểm tra độ nhậy, độ đặc hiệu, độ ổn định, ngưỡng phát

hiện của bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR ………………………...
2.3.4. Phương pháp thống kê …………………………………………………..

46

Đạo đức nghiên cứu ……………………………………………………

48

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………….....

50

2.3.

2.4.
3.1.

Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật gây nhiễm khuẩn bệnh viện …..

48

50

3.1.1. Kết quả phân bố xét nghiệm theo loại bệnh phẩm ………………….......

51

3.1.2. Tỉ lệ các loại vi sinh vật phân lập được …………………………………

52

3.1.3. Kết quả phân tích gen 16S rARN từ các chủng vi khuẩn phân lập ……..

53

3.2.

Kết quả phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR xác định
đồng thời 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện . ……….
3.2.1. Kết quả lựa chọn, phân tích trình tự gen đích …………………………..

55

3.2.2. Kết quả thiết kế mồi và mẫu dò …………………………………………

58

3.2.3. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dị với gen đích ………...

60

3.2.4. Kết quả phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn ……...

71

3.2.5. Kết quả tối ưu phản ứng realtime PCR ………….……………………...

75

3.2.6. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện …………………………………….

77

3.2.7. Kết quả tạo các đối chứng dương …………………….…………………

78

3.2.8. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu ………………………………....

82

3.2.9. Kết quả xác định độ ổn định ……………………………………………

87

55

3.3.

Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn nghiên cứu và gen
mã hoá beta-lactamase mở rộng của vi khuẩn E. coli
…………………
3.3.1. Kết quả kháng sinh đồ …………………………………………………..

91
92

3.3.2. Kết quả xác định gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng của E. coli ……..

98

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………………...………...

105

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Phần viết tắt

Phần viết đầy đủ

Ac

Acinetobacter baumannii

BV

Bệnh viện

Ct

Thresold cycle (chu kì ngưỡng)

CTX-M

Cefotaxime- Munich

DNA

Deoxyribonucleic Axit

Ec

Escherichia coli

ECDC

European Centre for Disease Control and Prevention (Trung tâm
kiểm sốt và phịng ngừa dịch bệnh Châu Âu)

ESBL

Extended-Spectrum Beta-lactamase (beta-lactamase phổ rộng)

FN

Fall Negative (âm tính giả)

FP

Fall Positive (dương tính giả)

GADPH

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

HAI

Hospital Aquired- Infections

Hu

Human

I

Intermediate (trung gian)

Kp

Klebsiella pneumoniae

MRSA

Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus

MSSA

Methicillin- Susceptible Staphylococcus aureus

NK

Nhiễm khuẩn

NKBV

Nhiễm khuẩn bệnh viện

Pa

Pseudomonas aeruginosa

PCR

Polymerase Chain Reaction

S

Sensitivity (nhạy cảm)

Sa

Staphylococcus aureus

R

Resistant (đề kháng)

VSV

Vi sinh vật

WHO

World Healthy Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1.

Tỷ lệ các tác nhân vi khuẩn gây NKBV ……………………………….. 4

Bảng 1.2.

Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn thường gặp ……….

5

Bảng 1.3.

Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn có tỷ lệ cao nhất ….

6

Bảng 2.1.

Trình tự các cặp mồi, mẫu dị và gen đích của các chủng vi khuẩn ……

Bảng 2.2.

Trình tự mồi 16S rARN và gen mã hố ESBL ………………………...

38

Bảng 2.3.

Thành phần và chương trình chạy phản ứng PCR …………………......

42

Bảng 2.4.

Thành phần phản ứng mutiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu của
mồi và mẫu dị với DNA đích ………………….....................................

Bảng 2.5.

37

44

Thành phần phản ứng mutiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu của
mồi và mẫu dị với DNA đích của vi khuẩn …………………………… 45

Bảng 2.6.

Thành phần phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn … 45

Bảng 2.7.

Thành phần phản ứng realtime PCR trên mẫu chủng chuẩn …………... 46

Bảng 3.1.

Tỷ lệ xét nghiệm và tỷ lệ cấy dương tính theo loại bệnh phẩm ………..

51

Bảng 3.2.

Tỷ lệ phân lập vi sinh vật theo loại bệnh phẩm ………………………..

52

Bảng 3.3.

Các mồi và mẫu dò cho phản ứng realtime PCR ………………............

58

Bảng 3.4.

Giá trị chu kì ngưỡng kiểm tra độ đặc hiệu của từng cặp mồi, mẫu dò với
62

Bảng 3.5.

DNA của vi khuẩn A. baumannii, K. pneumoniae và DNA người
………..
Giá trị chu kì ngưỡng kiểm tra độ đặc hiệu của từng cặp mồi, mẫu dò
với DNA của vi khuẩn S. aureus, E. coli, P. aeruginosa…………………

64

Bảng 3.6.

Giá trị chu kì ngưỡng của phản ứng multiplex realtime PCR kiểm tra
độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi, mẫu dị với DNA đích của vi khuẩn
A.

Bảng 3.7.

baumannii, K. pneumoniae và gen GADPH …………………………..
Giá trị chu kì ngưỡng kiểm tra độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi, mẫu dò
với DNA của vi khuẩn E. coli, S. aureus, P. aeruginosa ………………..

Bảng 3.8.

66

70

Giá trị chu kì ngưỡng của phản ứng multiplex realtime PCR trên các
chủng chuẩn A. baumannii, K. pneumoniae và của người (Hu) ……….

73


Bảng 3.9.

Giá trị chu kì ngưỡng của phản ứng multiplex realtime PCR trên các
chủng chuẩn E. coli, S. aureus, P. aeruginosa ………………………........

Bảng 3.10.

Giá trị chu kì ngưỡng của phản ứng multiplex realtime PCR ở các
nhiệt độ khác nhau ………………………………………......................

Bảng 3.11.

76

Giá trị chu kì ngưỡng của phản ứng multiplex realtime PCR với
Master mix IDT và HQ ………………………………………………...

Bảng 3.12.

75

77

Giá trị chu kì ngưỡng của phản ứng multiplex realtime PCR với các
nồng độ pha loãng …………………………………………………....... 77

Bảng 3.13.

So sánh phương pháp multiplex realtime PCR và nuôi cấy theo mẫu
bệnh phẩm …………………………………………………………....... 86

Bảng 3.14.

Kết quả phát hiện loại vi sinh vật bằng phương pháp multiplex
realtime PCR so sánh với phương pháp cấy máu ……………………..

87

Bảng 3.15.

Giá trị chu kì ngưỡng của các mẫu khảo sát thời gian bảo quản ............

88

Bảng 3.16.

Tỷ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa và Acinetobacter sp ………..

93

Bảng 3.17.

Tỷ lệ kháng kháng sinh của E. coli và K. pneumonia ……………………. 94

Bảng 3.18.

Tỷ lệ kháng kháng sinh của S. aureus ……………………………………...

96

Bảng 3.19.

Tính nhạy cảm kháng sinh của 5 chủng E. coli …………………………...

98

Bảng 3.20.

Các mẫu E. coli có mang gen ESBLs …………………………............

100


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1.

Định nghĩa nhiễm khuẩn bệnh viện ………………….……………

Hình 1.2.

Nhân tố liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn…. 22

Hình 1.3.

Cơ chế trao đổi vật chất di truyền giữa các vi sinh vật……………. 23

Hình 1.4.

Cơ chế kháng thuốc phổ biến của vi khuẩn………………………..

23

Hình 1.5.

Bản đồ về tình trạng kháng kháng sinh trên thế giới đến năm 2050

29

Hình 2.1.

Sơ đồ nghiên cứu ………………………………………………….

49

Hình 3.1.

Hình ảnh khuẩn lạc của các vi khuẩn trên môi trường thạch máu… 50

Hình 3.2.

Hình ảnh khuẩn lạc của các vi khuẩn trên mơi trường Chapman…. 54

Hình 3.3.

Hình ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số của các chủng S. aureus,
A. baumannii, E. coli, K. pneumoniae và P. aeruginosa ………….

Hình 3.4.

55

Hình ảnh nhân bản gen 16S rARN từ DNA tổng số của một số
chủng vi khuẩn E. coli, S. aureus, K. pneumoniae ………………..

Hình 3.6.

54

Hình ảnh nhân bản gen 16S rARN từ DNA tổng số của một số
chủng vi khuẩn A. baumannii và P. aeruginosa …………………..

Hình 3.5.

3

55

Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các
chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tương ứng ………………. 56

Hình 3.7.

Kết quả PCR nhân bản gen bla

OXA

-51 like của A. baumannii,

gyrB của P. aerruginossa, gen YccT của E. coli, gen Nuc của S.
aureus và gen Cyt của K. pneumoniae ………………………………..
Hình 3.8.

57

Biểu đồ khuếch đại DNA của vi khuẩn (A): A. baumannii, (B):
Klebsiella pneumoniae và (C): GADPH của người ………………. 61

Hình 3.9.

Biểu đồ khuếch đại DNA của vi khuẩn (A): S. aureus, (B): E. coli,
(C): P. aeruginosa ………………………………………………… 63

Hình 3.10. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hốn hợp mồi và mẫu dò với
DNA đích của vi khuẩn: ống đối chứng khơng có DNA ………..

66

Hình 3.11. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dị với
DNA đích vi khuẩn (A): A. baumannii, (B), K. pneumoniae và (C)
67
DNA người …………………………………………………


Hình 3.12. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dị với
DNA đích của vi khuẩn: ống có hốn hợp các DNA đích …………. 68
Hình 3.13. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dị với
DNA đích của vi khuẩn ống khơng có đối chứng ………………… 68
Hình 3.14. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dị với
DNA đích của vi khuẩn …………………………………………...

69

Hình 3.15. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dị với
DNA đích của vi khuẩn ống có hỗn hợp các DNA đích ………......

70

Hình 3.16. Biểu đồ khuếch đại DNA của các chủng chuẩn (A): A. baumannii,
(B): K. pneumoniae và (C): GADPH của người ….......................... 72
Hình 3.17. Biểu đồ khuếch đại DNA của các chủng (A): E. coli, (B): S.
aureus và P. aeruginosa .........………………………………….....

74

Hình 3.18. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản gen Cyt của chủng K.
pneumoniae ……………………………………………………….. 78
Hình 3.19. Kết quả biến nạp vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR) vào tế
bào E. coli chủng DH5α ………………………………………....... 79
Hình 3.20. Kết quả PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi KpCytF/R ……… 80
Hình 3.21. Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp mang gen Cyt ………………… 80
Hình 3.22. Biểu đồ khuếch đại DNA của một số chủng chuẩn K. pneumoniae

83

Hình 3.24. Biểu đồ khuếch đại DNA của các mẫu đối chứng dương là các chủng
vi khuẩn S. aureus, P. aeruginosa, E. coli sau thời gian bảo
quản…….
Hình 3.25. Biểu đồ khuếch đại DNA của các mẫu đối chứng dương là các

89

chủng A. baumannii, K. pneumoniae, Hu sau thời gian bảo quản… 90
Hình 3.26. Hình ảnh kiểm tra khả năng kháng một số loại kháng sinh của 5 vi
khuẩn A. baumannii, K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli và S.

aureus………………………………………………………………..

92

Hình 3.27. Hình ảnh điện di sản phấm PCR xác định gen SHV, TEM …….....

99

Hình 3.28. Hình ảnh điện di sản phấm PCR xác định gen CTX-M …………... 99


12

MỞ ĐẦU

Nhiễm khuẩn bệnh viện (HospitalAquiredInfections-HAI) (NKBV)

là

một trong những thách thức và mối quan tâm hàng đầu trong công tác chăm sóc
sức khoẻ tại Việt Nam cũng như trên tồn thế giới. NKBV làm tăng tỉ lệ tử vong,
kéo dài thời gian nằm viện (7-15 ngày), tăng việc sử dụng kháng sinh dẫn tới làm
tăng chi phí điều trị cao gấp 2-4 lần. Ngồi ra NKBV cịn góp phần gây ra tình
trạng kháng thuốc của một số vi khuẩn và làm gia tăng việc xuất hiện những tác
nhân gây bệnh mới.
Tác nhân gây NKBV đã có nhiều thay đổi trong vài thập kỷ qua. Các vi
khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện có thể là các vi khuẩn Gram dương và các
trực khuẩn Gram âm, nấm, kí sinh trùng. Trong đó NKBV do trực khuẩn Gram
âm đa kháng thuốc kháng sinh đã và đang trở thành một tai họa thực sự cho các
bệnh viện. Nuôi cấy vi sinh vật là phương pháp phổ biến và là tiêu chuẩn vàng

hiện nay để phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong máu và dịch cơ thể, tuy nhiên
phương pháp này còn nhiều hạn chế như: 1) đòi hỏi nhiều thời gian (1-5 ngày)
tùy thuộc vi sinh vật gây bệnh; 2) kết quả cấy máu âm tính cũng khơng loại trừ
được nhiễm khuẩn bệnh viện; 3) có thể khơng thể hiện đầy đủ cộng đồng vi
sinh vật trong vết thương. Việc phát hiện DNA của vi khuẩn trong mẫu bệnh
phẩm của bệnh nhân được cho là phương pháp có độ nhạy và chính xác cao, thời
gian phát hiện nhanh, có ý nghĩa lớn trong chẩn đốn nhiễm khuẩn. Trong những
năm gần đây có một số cơng trình nghiên cứu sử dụng bộ sinh phẩm do nước
ngoài sản xuất để phát hiện vi sinh vật trong máu và dịch cơ thể đã thu được
nhiều thành công, tuy nhiên chế tạo bộ sinh phẩm để có thể chủ động trong chẩn
đốn, giảm chi phí, phù hợp với hệ vi khuẩn gây bệnh ở Việt Nam là yêu cầu đối
với ngành y tế. Với mong muốn phát triển một bộ sinh phẩm multiplex realtime
PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để xác định nhanh chóng các vi khuẩn gây
nhiễm khuẩn bệnh viện, giúp bác sĩ điều trị sớm đưa ra được quyết định phù
hợp nhằm tăng cơ hội cứu sống bệnh nhân, giảm chi phí


điều trị cũng như tác dụng phụ chúng tôi thực hiện luận án: “Nghiên cứu phát triển
bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm
khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh” với 3 mục tiêu sau:
1. Phân lập và định danh được các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến
thường gặp.
2. Phát triển thành công bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện 5 tác nhân vi
khuẩn thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: Acinetobacter baumannii, Klebsiella
pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus.
3. Xác định tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được và khảo sát sự
tồn tại gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng (Extended- Spectrum Beta- lactamase:
ESBL) ở vi khuẩn Escherichia coli.
Nội dung nghiên cứu:
1. Nuôi cấy, phân lập các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện từ các mẫu bệnh

phẩm.
2. Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện 5 tác nhân vi
khuẩn thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: A. baumannii, K. pneumoniae,
E. coli, P. aeruginosa và S. aureus.
3. Xác định khả năng kháng kháng sinh của 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh
viện và gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng ở vi khuẩn E. coli.
Tính mới của luận án
1. Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đề xuất quy trình phát triển bộ sinh phẩm
multiplex realtime PCR để phát hiện đồng thời 5 vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện
phổ biến: A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa và S. aureus.
2. Luận án đã cung cấp các thông tin mới về tỷ lệ phân lập và tỷ lệ kháng một số loại
kháng sinh của 5 vi khuẩn: A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa và
S. aureus và gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng ở vi khuẩn E. coli tại bệnh viện
Thanh Nhàn.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình và căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện
1.1.1. Lịch sử phát hiện và nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện
Trong thời kỳ trung cổ, các bệnh viện đã được thành lập để điều trị các nạn
nhân bệnh dịch hạch và sau đó là các bệnh viện với các nhân viên y tế đang phục vụ
xã hội như hiện nay. Năm 1869, Sir James Young Simpon đã thực hiện nghiên cứu
dịch tễ học bệnh viện với hơn 4000 bệnh nhân ở Scotlen và Anh, và ông nhận thấy
tỷ lệ tử vong cao hơn ở những bệnh nhân đã được ở lại trong bệnh viện điều trị hậu
phẫu. Ông đã sử dụng thuật ngữ “hospitalism” cho sự rủi ro liên quan đến chăm sóc
tại bệnh viện. Sau nhiều năm các cơng trình nghiên cứu chuyên sâu của các tác giả
Oliver Wendell Holmes, Ignaz Philipp Semmelweis, Louis Pasteur, Josheph Lister
và Rober Koch đã xác định được các yếu tố nguy cơ liên quan đến nhiễm khuẩn
bệnh viện và giới thiệu các nguyên tắc khắc phục chính như rửa tay và khử trùng
các dụng cụ trong phẫu thuật giảm sự lan truyền của bệnh và tử vong [1].

Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), nhiễm khuẩn bệnh viện được định nghĩa
như sau: “Nhiễm khuẩn bệnh viện là những nhiễm khuẩn mắc phải trong thời gian
người bệnh điều trị tại bệnh viện và nhiễm khuẩn này không hiện diện cũng như
không nằm trong giai đoạn ủ bệnh tại thời điểm nhập viện. Nhiễm khuẩn thường
xuất hiện sau 48 giờ kể từ khi người bệnh nhập viện” [2] (Hình 1.1).

Hình 1.1. Thời gian xảy ra nhiễm khuẩn bệnh viện [2]
Để chẩn đoán NKBV người ta thường dựa vào định nghĩa và tiêu chuẩn chẩn
đoán cho từng vị trí NKBV. Ví dụ nhiễm khuẩn vết mổ sau phẫu thuật, nhiễm

khuẩn máu có liên quan đến dụng cụ đặt trong lòng mạch, nhiễm khuẩn đường
tiết niệu. Dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng và sinh học các nhà khoa học đã xác
định có


khoảng 50 loại nhiễm khuẩn bệnh viện khác nhau có thể xảy ra tại bệnh viện.
NKBV dẫn đến nhiều hệ luỵ cho người bệnh và hệ thống y tế như tăng biến
chứng và tử vong cho người bệnh, kéo dài thời gian nằm viện trung bình từ 7 đến 15
ngày, tăng sử dụng kháng sinh dẫn đến tăng sự kháng thuốc của vi sinh vật và tăng
chi phí điều trị [3], [4].
1.1.2. Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện hiện nay
1.1.2.1. Trên thế giới
Tại Châu Âu (2016-2017), tỷ lệ NKBV của khu vực là 6,3% trong đó các
nhiễm khuẩn (NK) thường gặp nhất là: nhiễm khuẩn hô hấp (41,8%), nhiễm khuẩn
tiêu hoá (20,8%), nhiễm khuẩn tiết niệu (18,4%), tiếp đến là nhiễm khuẩn sau khi
phẫu thuật, nhiễm khuẩn da và mô mềm và một số nhiễm khuẩn khác [5], [6].
Theo báo cáo của Trung tâm kiểm sốt và phịng ngừa bệnh tật Châu Âu
(ECDC), tỷ lệ các vi khuẩn gây NKBV (2017) tại một số nước Châu Âu và tỷ lệ
chung cho cả khu vực [7] thể hiện trên Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Tỷ lệ các tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện [7]

Vi khuẩn

Bỉ (%)

P. aeruginosa

17,1

Pháp (%) Ý (%)

UK (%)

Châu Âu (%)

23,1

19,4

7,2

19,9

S. aureus

12,2

18,0

20,1

30,6

18,5

K. pneumoniae

13,4

11,5

17,6

9,0

15,2

E. coli

20,7

12,2

9,7

18,9

13,5

0

2,7

14,7

1,8

4,5

A. baumannii

Nghiên cứu tại bệnh viện Đại học Truyễn Nhiễm và bệnh Nhiệt đới Serbia,
(từ 7/2016 đến 7/2018), tỷ lệ các loại vi khuẩn gây NKBV K. pneumoniae (14%), A.
baumannii (13,2%), P. aeruginosa (10,8%), E. coli (1,2%), S. aureus (1,6%) [8].
Các nghiên cứu tại một số quốc gia về tỷ lệ mắc NKBV và loại NK hay gặp:


Bảng 1.2. Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn thường gặp tại một số
quốc gia
Năm

2013

Tên quốc gia

BV Đại học MartinSlovakia [9]

Tỷ lệ NKBV

NKBV có tỷ lệ cao nhất
NK tiết niệu: 24,3%

5,2%.

NK hô hấp: 22,7%
NK phẫu thuật: 22,7%
Viêm phổi bệnh viện

2015

Mỹ [10]

3,2%

NK đường tiêu hoá,
NK tại chỗ phẫu thuật.

2016

Ấn Độ [11]

3,7%
NK tiết niệu 31,9%

2017

Canada [12]

7,3%

Viêm phổi: 23,4%

NK vết mổ: 20,2%
NK máu: 15,2%
NK vết mổ: 29,0%
NK đường hô hấp dưới

2017

Swizeland [13]

4,5%

18,2%
NK đường tiết niệu:14,9%
NK máu:12,8%

2016-2018

BV Đại học truyền

NK tiết niệu: 36,3%

nhiễm và bệnh Nhiệt

NK máu: 19,6%

đới Serbia [8]

Viêm phổi:15,7%

1.1.2.2. Tại Việt Nam

Tình hình NK tại Việt Nam chưa được xác định đầy đủ, ít có tài liệu và giám
sát về NKBV được công bố.
Nghiên cứu của bệnh viện (BV) Bệnh Nhiệt đới Trung ương và VINAREX
(2013) khảo sát trên 3671 bệnh nhân của 15 khoa Hồi sức tích cực tại 15 BV của 3


miền cho thấy tỷ lệ NKBV là 27,3% và tỷ lệ các loại vi khuẩn thường gặp: A.
baumannii (31%), P. aeruginosa (18%), K. pneumoniae (12%) và S. aureus (6%)
[14].
Các nghiên cứu gần đây của các BV về tỷ lệ NKBV và NK có tỷ lệ cao nhất:
Bảng 1.3. Tỷ lệ NKBV và loại nhiễm khuẩn có tỷ lệ cao nhất
Tỷ lệ

NKBV có tỷ lệ cao

NKBV

nhất

Năm

Khu vực

2015-2016

BV Sản nhi- Ninh Bình [15]

7,17%

NK hô hấp: 56,73%,

2016

Đại học Y dược Huế [16]

5,2%

NK Vết mổ: 60%

2106

BV TW Quân Đội 108 [17]

3,86%

NK vết mổ: 37,25%.

2016-2017

BV Đa Khoa Ninh Thuận [18]

2,4%

NK hô hấp: 40,6%

2016-2017

BV Đa Khoa Nông Nghiệp [19]

2017

BV Đa Khoa Vĩnh Phúc [20]

6,94%. NK hô hấp: 55,55%
2,7%

NK hô hấp: 42%

Tỷ lệ NKBV ở Việt Nam tương đương với các kết quả nghiên cứu của WHO
với qui mô vùng, quốc gia và liên quốc gia, tỉ lệ này dao động từ 2,7% đến 10%
người bệnh nhập viện, trong đó các vi khuẩn gây NKBV chủ yếu là các trực khuẩn
Gram âm với tỷ lệ gần 70% với các vi khuẩn: A. baumannii, P. aeruginosa, K.
pneumoniae, E. coli, các vi khuẩn Gram dương chiếm khoảng 30% chủ yếu là S.
aureus.
Một số nghiên cứu tại các bệnh viện về tỷ lệ các loại vi khuẩn gây NKBV:


Bảng 1.4. Tỷ lệ vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại một số bệnh viện
Tên các bệnh viện

Ac

BV Chợ Rẫy-2014 [21]

Kp

Ec

Sa

59,3 12

12

3,3

5,8

BV Bạch Mai-2015[22]

21,4 14,3

34,8

14,3

/

BV Đa khoa Phú Thọ-2016 [23]

21,5 14,45 7,1

7,1

14,4

BV Sản- Nhi Ninh Bình (2015-2016) [15]

7,7

20,2

13,5

22,1

/

13,73 11,13

BV Đa khoa Nông nghiệp (2016-2017) [19]

Pa

25

25,15 24,07

Ac: Acinetobacter baumannii, Pa: Pseudomonas aeruginosa, Kp: Klebsiella pneumoniae, Ec:
Escherichia coli, Sa: Staphylococcus aureus.
1.1.3.

Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện

Các tác nhân gây NKBV biến đổi theo nhóm cộng đồng dân cư, các chuyên
khoa điều trị khác nhau và có sự khác nhau giữa các quốc gia.
1.1.3.1. Tụ cầu Staphylococcus aureus
S. aureus là vi khuẩn Gram dương hàng đầu gây nhiều bệnh khác nhau từ
bệnh nhẹ về da, nhiễm trùng đa dạng ở phổi, xương, tim, nhiễm khuẩn huyết và
đóng vai trị quan trọng trong NKBV liên quan đến truyền dịch, ống thở, nhiễm

khuẩn vết bỏng và nhiễm khuẩn vết mổ. S. aureus kháng methicillin (MRSA) và S.
aureus mẫn cảm với methicillin (MSSA) là nguyên nhân gây NKBV dẫn tới điều trị
khó khăn [24].
Trong thập kỷ qua các trường hợp nhiễm MRSA ngày càng gia tăng, MRSA
gây NKBV và NK mắc phải từ cộng đồng bao gồm viêm nội mạc tim, viêm tuỷ
xương, hội chứng sốc nhiễm độc, viêm phổi, ngộ độc thực phẩm và nhọt độc [25].
MRSA kháng methicillin ở tụ cầu qua trung gian PBP2a, đây là một loại protein
được gọi là protein liên kết penicillin (78 kDa). Protein này có ái lực thấp với nhóm
kháng sinh β-lactam. Gen femA mã hố cho protein PBP2a kháng methicillin, do đó
gen này được sử dụng như một marker phân tử phát hiện MRSA [26], [27].
1.1.3.2. Vi khuẩn Acinetobacter baumannii
A. baumannii là cầu trực khuẩn, Gram âm, hiếu khí, khơng lên men glucose,


được tìm thấy phổ biến trong đất, nước và mơi trường. A. baumannii có khả năng
thích ứng với điều kiện và môi trường sống đa dạng, tồn tại lâu trong môi trường
bệnh viện, đặc biệt trên những dụng cụ y tế. Nhờ khả năng tạo màng sinh học
(biofilm) với tính bám dính cao, vi khuẩn A. baumannii có thể gắn chặt vào bề mặt.
Loài này được chỉ ra là nguyên nhân gây các loại nhiễm trùng khác nhau ở bệnh
viện bao gồm: nhiễm trùng do viêm phổi, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đường tiết
niệu [28].
Theo các cơng trình cơng bố gần đây A. baumannii đã và đang trở thành vi
khuẩn siêu kháng thuốc, nổi lên như tác nhân hàng đầu gây NKBV tại các bệnh viện
trên thế giới. Trước đây, carbapenem thường được sử dụng để điều trị các bệnh
nhiễm khuẩn do A. baumannii, đặc biệt đối với các chủng kháng thuốc nhưng hiện
nay khơng cịn hiệu quả bởi sự xuất hiện của các chủng đa kháng hoặc đa kháng
thuốc phổ rộng. Nhiều cơ chế kháng liên quan đến tính kháng carbapenem ở A.
baumannii như sản xuất carbapenemase, bất hoạt kháng sinh, các protein màng bị
biến đổi, tăng biểu hiện các bơm màng hay sự mất các kênh màng, thay đổi tính
thấm của màng. Tính kháng với carbapenem ở A. baumannii liên quan chủ yếu tới

sự biểu hiện của β-lactamase, carbapenemase; trong khi những cơ chế khác chỉ
đóng vai trị thứ yếu. Bên cạnh đó, carbapenemase phổ biến nhất ở A. baumannii
là β-lactamase mã hoá bởi bla-OXA. Trong một nghiên cứu của Gadsby NJ và
cộng sự (2015) đã sử dụng gen bla-OXA-51 like để phát hiện A. baumannii gây
nhiễm trùng đường hô hấp dưới [29].
1.1.3.3. Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae
K. pneumoniae là vi khuẩn Gram âm, bắt màu đậm ở hai cực, vi khuẩn có
nhiều hình thể, có khi như cầu khuẩn, có khi lại hình dài, có vỏ, khơng di động,
không sinh nha bào. Dễ mọc trên môi trường nuôi cấy thông thường như thạch dinh
dưỡng hay thạch máu, khuẩn lạc lầy nhầy, màu xám.
K. pneumoniae thường gây bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp, một loại vi
khuẩn phát triển rất tốt trong đường hô hấp của người, là mầm “bệnh cơ hội” chiếm
10% tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện, là nguyên nhân phổ biến trong nhiễm khuẩn


đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch
đồng thời là tác nhân gây bệnh chủ yếu gây nhiễm khuẩn cộng đồng [30].
Mối nguy hiểm của K. pneumoniae trong các cơ sở y tế đang gia tăng do khả
năng kháng kháng sinh phổ rộng beta-lactam của chúng. Các nghiên cứu chỉ ra rằng
K. pneumoniae kháng kháng sinh phổ rộng có xu hướng đa kháng thuốc dẫn đến
khả năng thất bại trong điều trị [31]. K. pneumoniae đã kháng lại tất cả các loại
kháng sinh bao gồm cả các kháng sinh mạnh nhất hiện nay như cephalosporin và
carbapenem. Gadsby NJ và cộng sự (2016) trong một nghiên cứu đã chọn gen
citrate synthase (gtlA) để phát hiện vi khuẩn này do gây nhiễm khuẩn đường hô hấp
dưới [32].
1.1.3.4. Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
P. aeruginosa (Trực khuẩn mủ xanh) là trực khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng riêng
lẻ, thành đơi, có khi xếp thành chuỗi, di động nhờ một lơng duy nhất ở một cực, có
pili, khơng có bào tử, là vi khuẩn hiếu khí, phát triển tốt trên các môi trường thông
thường, nhiệt độ 30 – 37oC, có thể mọc ở 42oC, pH: 7,0 - 7,2.

P. aeruginosa phát hiện thấy có mặt ở nhiều nơi trong bệnh viện như: nền
nhà, giường, chăn, đệm, tay nhân viên y tế, dụng cụ y tế. Lồi này được biết thuộc
nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội thường gây nhiễm khuẩn có mủ ở vết thương, vết
mổ, vết bỏng, từ vết thương vi khuẩn có thể vào máu gây nhiễm khuẩn huyết và các
bệnh nhân nhiễm khuẩn do P. aeruginosa thường gặp nhiều ở các khoa Hồi sức cấp
cứu, khoa Bỏng, khoa Tiết niệu, khoa Chăm sóc bệnh nhân sau phẫu thuật. P.
aeruginosa cũng là một trong những vi khuẩn kháng kháng sinh mạnh nhất hiện
nay, cũng trong cùng một nghiên cứu Gadsby NJ và cộng sự (2016) đã chọn gen
mục tiêu là DNA gyrase subunit B (gyrB) để phát hiện P. aeruginosa gây nhiễm
khuẩn đường hơ hấp dưới, bởi vì gen này có tỷ lệ phát hiện cao hơn và đặc hiệu
[32].
1.1.3.5. Vi khuẩn E. coli
E. coli là vi khuẩn Gram âm phổ biến nhất gây nhiễm khuẩn bệnh viện và
chúng được tìm thấy với tần suất cao ở nhiễm khuẩn đường hô hấp và nhiễm khuẩn


đường tiết niệu. Cả hai loài E. coli và P. aeruginosa đều là các tác nhân gây nhiễm
khuẩn bệnh viện nghiêm trọng ở các đơn vị chăm sóc y tế và nhiễm khuẩn cộng
đồng [33].
Nhiều nghiên cứu trong nước và quốc tế đã khẳng định vi khuẩn E. coli gây
nhiễm khuẩn chủ yếu trên đường tiết niệu, sinh dục của phụ nữ và nhiễm khuẩn vết
mổ [34].
Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) thường cư trú trên đường tiêu
hóa của người và động vật đang là mối quan tâm lớn trong NKBV do có khả năng
kháng cao với các nhóm kháng sinh amiglycoside, β-lactam và có khả năng truyền
tính kháng qua plasmid. Gadsby NJ và cộng sự (2016) đã sử dụng gen YccT để phát
hiện sự có mặt của vi khuẩn E. coli gây nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới [32].
1.2. Một số kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện
1.2.1. Cấy máu và xét nghiệm sinh hoá
Phương pháp này dựa vào việc nuôi cấy một mẫu máu trên mơi trường giầu

dinh dưỡng sau đó nhận diện và kiểm tra tính mẫn cảm của các tác nhân gây bệnh
sử dụng các xét nghiệm hóa sinh tiêu chuẩn. Cấy máu hiện đang được cho là tiêu
chuẩn vàng để chẩn đốn mầm bệnh trong nhiễm khuẩn bệnh viện. Quy trình cấy
máu được thực hiện trong các hệ thống khép kín có tích hợp hệ thống đo liên tục
các hằng số hố lý. Sự có mặt của vi sinh vật được chỉ thị một cách gián tiếp thông
qua các tham số hoá lý như độ đục, sự chuyển màu của chai ni cấy, sự thay đổi áp
suất trong bình ni cấy hay sự biến đổi nồng độ CO 2 [35]. Theo các hướng dẫn
mới nhất của các hiệp hội nghề y quốc tế có uy tín thì lượng máu lấy ra phải đảm
bảo đủ cho 2 quy trình cấy máu chẩn đốn vi sinh vật hiếu khí và kị khí với thể tích
mẫu bệnh phẩm cho mỗi quy trình cấy máu là 20-30 ml [36]. Đây là một khó khăn
khi phải tiến hành lấy một lượng máu lớn từ các bệnh nhân sơ sinh. Một hạn chế
khác của cấy máu đó là phải tiến hành ni cấy ngay khi có bệnh phẩm nhằm tránh
hiện tượng dương tính giả do tạp nhiễm vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm được
lưu giữ lâu. Đặc biệt, quy trình thực hiện cấy máu thường kéo dài từ 48-72 giờ mới
có kết quả vì thế để khắc phục tình trạng nhiễm khuẩn bệnh nhân thường được điều


trị trước bằng kháng sinh phổ rộng nên gây ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu quả điều
trị cũng như làm tăng tính kháng kháng sinh của vi sinh vật gây bệnh ở người bệnh.
Kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ từ 14,5% đến 25% bệnh nhân được xác định
nguyên nhân gây nhiễm khuẩn huyết bằng cấy máu [37], [38].
1.2.2. Kỹ thuật xác định sự có mặt của DNA
Việc phát hiện sự có mặt DNA của vi khuẩn trong bệnh phẩm của bệnh
nhân được cho là một phương pháp có độ nhậy cao, thực hiện nhanh, có giá trị hỗ
trợ cho cấy máu để chẩn đốn nhiễm khuẩn. Các quy trình chẩn đốn NKBV dựa
trên sự có mặt của DNA vi khuẩn thường hướng tới việc phát hiện các đoạn DNA
đặc trưng của loài như các đoạn riboxom 16S, 5S, 23S, các gen đặc hiệu của vi
khuẩn [39].
1.2.2.1. Kỹ thuật khuếch đại DNA (Polymerase Chain Reaction -PCR)
PCR là một kỹ thuật cho phép khuếch đại các trình tự DNA đặc hiệu. Mặc dù

kỹ thuật được phát minh vào năm 1985 bởi nhà hoá sinh học người Mỹ Karry
Mullis và đựơc phát triển bởi Saiki và cộng sự nhưng nguyên lý của phản ứng đã
được mơ tả trước đó hàng thập kỷ bởi Khorana và đồng nghiệp [40]. Kỹ thuật đã
được ứng dụng rộng rãi rất nhiều về lĩnh vực hình sự, mơ bệnh học, chấn đốn trước
sinh và chẩn đốn các mầm bệnh. Kỹ thuật thường được áp dụng nhất cho các phát
hiện của mầm bệnh từ cấy máu dương tính [41].
Hỗ trợ cho phương pháp nuôi cấy, phương pháp PCR đã được sử dụng để
phát hiện vi khuẩn trong máu [42], dịch xương khớp [43], dịch não [44], mô tim
[45] và các mẫu sinh thiết mô vết thương [46].
1.2.2.2. Kỹ thuật multiplex PCR
PCR là một trong những kỹ thuật phổ biến hiện nay trong nghiên cứu và
được sử dụng rộng rãi trong chẩn đốn. Tuy nhiên PCR đơn mồi có nhược điểm là
chỉ thực hiện được phản ứng riêng lẻ, chỉ phát hiện được một tác nhân vi khuẩn gây
bệnh do đó sẽ mất rất nhiều thời gian để khảo sát nhiều mầm bệnh kéo theo giá
thành rất cao. Vì vậy để tăng cường khả năng chẩn đoán và bổ sung những hạn chế
của PCR, Chamberlain và cộng sự đã mô tả và phát triển kỹ thuật multiplex PCR


vào năm 1988 [47].
Các xét nghiệm multiplex PCR cho phép phát hiện nhanh chóng các tác nhân
gây bệnh trực tiếp từ máu. Multiplex PCR khuếch đại nhiều DNA đích trong cùng
một mẫu tại cùng một thời điểm sử dụng một hỗn hợp mồi. Kỹ thuật này thường
dựa trên sự khuếch đại DNA trong vùng sao chép của vi sinh vật. Đây là vùng
khơng mã hố của DNA có vị trí giữa các gen và có tính bảo thủ cao giúp phân biệt
giữa các loài vi khuẩn, nấm và các sinh vật khác.
Multiplex PCR nhắm mục tiêu tới hệ gen của nhiều tác nhân gây bệnh khác
nhau liên quan tới nhiễm khuẩn bệnh viện. Phương pháp này có độ nhậy cao, chính
xác, phát hiện được nhiều tác nhân gây bệnh trong khoảng thời gian ngắn.
1.2.2.3. Kỹ thuật multiplex realtime PCR
Kỹ thuật multiplex realtime PCR cho phép phát hiện nhanh và định lượng

sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng
huỳnh quang trong đó sự gia tăng về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của
tín hiệu huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm
được khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Tuỳ thuộc vào số lượng bản DNA đích ban đầu
có trong ống phản ứng mà giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) của các mẫu là khác nhau .
Dựa vào các đặc điểm này có thể xác định số bản sao DNA đích có trong mẫu
nghiên cứu dựa trên mẫu chuẩn đã biết rõ số lượng DNA đích ban đầu.
Phương pháp realtime PCR nhanh hơn so với PCR truyền thống và không
cần thao tác sau khuếch đại cho việc xác định vi khuẩn. Áp dụng các phương pháp
phân tử này đến nay đã được dùng trong việc phát hiện các loài vi khuẩn cụ thể từ
các mô nhiễm trùng như viêm màng não do vi khuẩn. Đối với các vi khuẩn gây
NKBV đã có rất nhiều nghiên cứu sử dụng realtime PCR để xác định các đối tượng
này [48], [49].
Trong phản ứng realtime PCR, người ta thường sử dụng các lại thuốc nhuộm
liên kết DNA sợi đôi (SYBR Green I) để phát huỳnh quang và các mẫu dị hoặc mồi
đặc hiệu trình tự được đánh dấu huỳnh quang (Taqman PCR).
Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module phát tín


hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu
huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ.
Các bước tiến hành để phát triển một thí nghiệm multiplex realtime PCR
 Thiết kế trình tự mồi và mẫu dò
Để thiết kế một phản ứng multiplex Taqman, trước hết cần thiết kế từng thí
nghiệm Taqman đơn.
Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm):
Thiết kế tất cả các mồi với nhiệt độ Tm xấp xỉ nhau (55-60 oC), và tất cả các
mẫu dò với nhiệt độ Tm xấp xỉ nhau (khoảng 5-10oC cao hơn mồi). Điều này quan
trọng để đảm bảo rằng các bộ mồi và mẫu dò khác nhau khơng bổ sung lẫn nhau bởi
vì tất cả chúng đều hiện diện trong cùng một phản ứng.

Chiều dài mồi nên thiết kế để không dài quá 30 nucleotide, tỷ lệ GC trong mẫu
dò khoảng 30%-80% với C nhiều hơn G.
Chương trình luân nhiệt realtime PCR dùng mồi Taqman thường chỉ có hai
giai đoạn nhiệt độ là: Biến tính 94-95oC trong 15-30 giây; giai đoạn vừa bắt cặp vừa
kéo dài ở 60oC trong 30-60 giây và thiết bị realtime sẽ hoạt động ở giai đoạn này.
Ở giai đoạn nhiệt độ 60oC thì mồi Taqman sẽ bắt cặp sợi đích trước vì đây
là nhiệt độ bắt cặp tốt nhất của mồi Taqman (thấp hơn Tm của mồi Taqman là
65oC-70oC, nhưng bằng hay cao hơn Tm của mồi là 55oC-60oC) rồi sau đó mồi
mới bắt cặp vào. Chính nhờ vậy mà khi mồi Taqman tổng hợp sợi bổ sung,
enzyme này mới có cơ hội thủy giải được mồi Taqman cản đầu nó. Nếu mồi bắt
cặp trước vào sợi đích thì sẽ khơng có cơ hội để mồi Taqman bắt cặp vào sợi
đích và như vậy thì mồi Taqman sẽ khơng thể bị thủy giải khi enzyme Taq
polymerase tổng hợp sợi bổ sung. Do đó nên sử dụng phần mềm thương mại ví
dụ như Beacon Designer để đơn giản hoá việc thiết kế cả bộ mồi và mẫu dò cho
phản ứng multiplex [50].
 Lựa chọn chất phát và hấp thụ huỳnh quang cho phản ứng multiplex
Phản ứng multiplex realtime PCR cần sử dụng các chất phát huỳnh quang
khác nhau cho từng phản ứng khuếch đại riêng biệt. Để phân biệt từng phản ứng,


chọn chất phát huỳnh quang với phổ kích thích cận nhau thấp nhất. Chất huỳnh
quang được chọn cũng cần tương hợp với đầu lọc phát quang và kích thích của thiết
bị realtime PCR. Dựa trên các thông số thiết bị của đơn vị để có một danh sách các
chất huỳnh quang tương ứng. Ví dụ đối với phản ứng 5 mục tiêu trên hệ thống iQ5
nên sử dụng FAM, HEX, Cy5, TAMRA và Texas Red [51].
Tối ưu hóa từng phản ứng riêng lẻ trước phản ứng multiplex
Bước đầu tiên để tập hợp một phản ứng multiplex là tối ưu hoá các phản ứng
riêng lẻ. Xác định hiệu qủa từng phản ứng bằng cách dựng một đường chuẩn sử dụng
một dãy các mẫu pha loãng. Hiệu quả của phản ứng riêng lẻ cần phải từ 90-100%.
 Đánh giá tính hiệu quả của phản ứng multiplex

Chạy các phản ứng singleplex và multiplex cho gen mục tiêu trên cùng một
bản mẫu và so sánh giá trị chu kì ngưỡng. Giá trị thu được từ một mục tiêu cho
trước trong thí nghiệm đơn và đa mồi không được quá khác biệt. Nếu giá trị chu kì
ngưỡng từ các phản ứng đơn và đa quá khác biệt cần tối ưu hoá lại phản ứng. Điều
này có thể thực hiện bằng các thay đổi nồng độ của các thành phần phản ứng.
 Tối ưu hóa phản ứng multiplex
Nếu một phản ứng multiplex không được tối ưu hố, sự khuếch đại của mục
tiêu có hiệu suất thấp hay số lượng ít có thể bị ức chế bởi mục tiêu có hiệu suất cao,
số lượng nhiều. Điều này là do các thành phần phản ứng như DNA polymerase và
nucleotide trở nên hạn chế trong các chu kỳ cuối và sự khuếch đại của mục tiêu có
hiệu suất thấp, số lượng ít sẽ bị ảnh hưởng.
Ưu điểm của phương pháp multiplex realtime PCR
Multiplex realtime PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép
chúng ta định lượng số bản sao khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạy
cao trên một phạm vi động học lớn. Các kết quả của realtime có thể là chất lượng (sự
có mặt hoặc khơng của trình tự đích) hoặc định lượng (số bản sao DNA). Realtime
PCR có thể đánh giá mà không cần điện di gen, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và
số lượng nguyên liệu được đưa vào qui trình tăng lên. Cuối cùng, do các phản ứng
được chạy và số liệu được đánh giá trong một hệ thống kín nên các cơ hội nhiễm bẩn
được giảm thiểu