Phân tích vai trò của các yếu tố điều hòa hoạt động (CRE) trên vùng promoter chuyên biệt hạt phấn lúa LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

#include <stdio.h>
#include <stdlib.h>

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

#include <time.h>
/*
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp
Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
*/
int main(int argc, char *argv[])
{
int n;
//Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

TRIỆU BÍCH HUỆ

FILE *fp;

//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

PHÂN TÍCH VAI TRỊ CỦA CÁC YẾU TỐ ĐIỀU HÒA
if(fp==NULL)HOẠT ĐỘNG (CRE) TRÊN VÙNG PROMOTER
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");

{

CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN LÚA

printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");
exit(0);
}

Ngành: Công nghệ Sinh học
//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

Mã số ngành: 8 42 02 01

//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);
srand(time(NULL));
for(int i=1;i<=5;i++)
{

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
n=rand()%100;
fprintf(fp,"%d\t",n);

}

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Tiến Dũng

printf("\nDa ghi xong!\n");
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
fclose(fp);

Thái Nguyên – 2022

#include <stdio.h>
#include <stdlib.h>
#include <time.h>
/*
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp
Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
*/
int main(int argc, char *argv[])
{
int n;
//Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp
FILE *fp;

//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
if(fp==NULL)
{
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");
exit(0);
}

//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);
srand(time(NULL));
for(int i=1;i<=5;i++)
{
n=rand()%100;

fprintf(fp,"%d\t",n);
}

printf("\nDa ghi xong!\n");
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
fclose(fp);


i

LỜI CAM ĐOAN

#include <stdio.h>
#include <stdlib.h>
#include <time.h>
/*

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng

tơi
và nhóm nghiên cứu được sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Nguyễn
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp
Bc2: Mo tep
tin de ghi
hoac doc:
"mode");
Tiến
Dũng.
Các
nộifopen("Ten

dung tep",
nghiên
cứu, kết quả trong luận văn này là trung thực
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Tơi xin hồn tồn chịu
Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

*/

trách nhiệm về nội dung luận văn của mình.

int main(int argc, char *argv[])
{

Thái Nguyên, ngày 08 tháng 1 năm 2022

int n;
//Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

Học viên

FILE *fp;

//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
if(fp==NULL)
{
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");
exit(0);

}

//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);
srand(time(NULL));
for(int i=1;i<=5;i++)
{
n=rand()%100;
fprintf(fp,"%d\t",n);
}

printf("\nDa ghi xong!\n");
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
fclose(fp);

Triệu Bích Huệ


ii

LỜI CẢM ƠN

#include <stdio.h>
#include <stdlib.h>
#include <time.h>
/*

Để hoàn thành luận văn này, lời đầu tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân

thành

và sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Tiến Dũng đã tận tình hướng dẫn và dìu
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp
Bc2: Mo
tin de ghisuốt
hoac doc:
fopen("Ten
"mode"); cứu và thực hiện luận văn.
dắt
tơiteptrong
q
trìnhtep",
nghiên
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

Tôi xin cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Nơng Lâm – Đại học Thái Ngun

Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

*/

và các thầy cô giáo trong trường đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi học tập
và thực hiện luận văn.

int main(int argc, char *argv[])
{
int n;

Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn đến các thầy cơ giáo khoa Cơng nghệ sinh học

–//Bc1:

Công
nghệ
trường Đại học Nông Lâm đã truyền dạy kiến thức và
Khai báo
bien tepthực
tin: FILEphẩm
*fp
FILE *fp;
kỹ
năng cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường, tạo điều kiện thuận lợi

để tơi có thể thực hiện tốt luận văn của mình.
//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp cùng

fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");

if(fp==NULL)
tập
thể lớp Cơng nghệ sinh học K27, nhóm sinh viên trong phịng thí nghiệm
{

Sinh học
phân tử - Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, những
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");
người exit(0);
đã luôn sát cánh bên tơi, giúp đỡ, động viên và góp ý cho tơi trong suốt
}
q

trình học tập và hồn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);
srand(time(NULL));

Thái Nguyên, ngày 08 tháng 1 năm 2022
Học viên

for(int i=1;i<=5;i++)
{
n=rand()%100;
fprintf(fp,"%d\t",n);
}

printf("\nDa ghi xong!\n");
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
fclose(fp);

Triệu Bích Huệ


iii

MỤC LỤC

#include <stdio.h>
#include <stdlib.h>

#include <time.h>
/*

LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI
CẢM
............................................................................................................
ii
Bc1: Khai
báo bienƠN
tep tin:
FILE *fp
Bc2: Mo tep
tin de.................................................................................................................
ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
MỤC
LỤC
iii
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
DANH
MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..............................................v
Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

*/

DANH MỤC BẢNH ................................................................................................. vi
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1

int main(int argc, char *argv[])
{

1. Đặt vấn đề ...............................................................................................................1
int n;

2. Mục đích nghiên cứu ...............................................................................................2
//Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

3.
FILEÝ
*fp;nghĩa của luận văn……………………………………………………………...2
3.1 Ý nghĩa khoa học………………………………………………………………..2
//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

3.2 Ý nghĩa thực tiễn……………………………………………………….………..3
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");

CHƯƠNG
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................4
if(fp==NULL)
{
1.1.
Hoa lúa .................................................................................................................4
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");

1.2. Gen
kiểm sốt q trình phát triển của hạt phấn ..................................................4
exit(0);
1.3.
Gen và promoter ...................................................................................................5
}

1.3.1. Gen ....................................................................................................................5
//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

1.3.2. Promoter ............................................................................................................6
//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);

1.4.
Vai trò của yếu tố điều hòa CRE..........................................................................9
srand(time(NULL));
CHƯƠNG
for(int i=1;i<=5;i++)2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 11
{
2.1.
Đối tượng, phạm vi nghiên cứu .........................................................................11
n=rand()%100;

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................11
fprintf(fp,"%d\t",n);

2.1.2.
Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................11
}
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................................11
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................11
printf("\nDa ghi xong!\n");

2.2.2. Thời gian nghiên cứu ......................................................................................11
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

2.3.

Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu ...............................................................11
fclose(fp);
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................11
2.3.2. Hóa chất ..........................................................................................................12


iv

2.3.3. Thiết bị thí nghiệm ..........................................................................................12

#include <stdio.h>

2.4. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................13

#include <stdlib.h>

2.4.1. Nội dung 1: Phân tích trình tự promoter để xác định các yếu tố CRE ...........13

#include <time.h>
/*

2.4.2. Nội dung 2: Thiết kế vector chuyển gen .........................................................13
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

2.4.3. Nội dung 3: Chuyển gen vào cây Arabidopsis ................................................13
Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

2.5.
Phương
pháp

Bc3: Ghi
hoac doc tep
tin (xu nghiên
lý du lieu) cứu ....................................................................................13
Bc4: ÐóngNghiên
tep tin: fclose(fp);
2.5.1.
cứu sàng lọc gen chuyên biệt hạt phấn ...............................................13
*/

2.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số.............................................................13

int main(int argc, char *argv[])
{

2.5.3. Phương pháp khuyếch đại promoter bằng kỹ thuật PCR ................................14
2.5.4.
Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR ...........................................................15
int n;
//Bc1: Khai
báo bien teppháp
tin: FILEthiết
*fp
2.5.5.
Phương
kế vector tách dòng promoter ...........................................15
FILE *fp;
2.5.6.
Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến .........................16

2.5.7. Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp .................................................16
//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

2.5.8.
Phương pháp tách chiết plasmid .....................................................................17
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
if(fp==NULL)
2.5.9.
Phương pháp định lượng DNA .......................................................................18
{
2.5.10.
Phương pháp xác định trình tự ......................................................................19
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");

2.5.11. Thiết kế vector biểu hiện GUS ......................................................................19
exit(0);

2.5.12.
Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ...............21
}
2.5.13. Phương pháp chuyển gene trên cây Arabidopsis ..........................................21
//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
2.5.14.
Phương pháp đánh giá hoạt động của promoter..........................................22
//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................24
srand(time(NULL));

3.1.

tích trình tự promoter để sàng lọc các yếu tố CRE ...................................24
for(int Phân
i=1;i<=5;i++)
{
3.2.
Biểu hiện của gen RMP1 ở hạt phấn ..................................................................29
n=rand()%100;
3.3. CRE
phổ biến trên vùng promoter RMP1 ..........................................................30
fprintf(fp,"%d\t",n);

3.4. Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen RMP1del ::GFP/GUS.......................33
}

3.5. Vai trò của CRE với khả năng biểu hiện của gen RMP1 ở hạt phấn .................34
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................37
printf("\nDa ghi xong!\n");
4.1.
Kết luận ..............................................................................................................37
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

4.2. Kiến nghị ............................................................................................................37
fclose(fp);

TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................38


v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

#include <stdio.h>
#include <stdlib.h>
#include <time.h>

TỪ VIẾT TẮT

VIẾT ĐẦY ĐỦ

/*

AS

Acetosyringone

ARN pol

RNA polymerases

Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

bp

Base pair

CaMV

Cauliflower mosaic virus

Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
*/

int main(int argc, char *argv[])

CRE

Cis regulatory element

DNA

Deoxyribonucleic acid

MS

Murashige Skoog

{
int n;

//Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp
FILE *fp;

OD

Optical density

PCR

Polymerase Chain Reaction

//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");

RMP

if(fp==NULL)
{

RMPdel

Rice Microspore pollen Promoter
Rice Microspore pollen Promoter Deletion

printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");
RNAi
RNA interference

GFP

exit(0);

Green Fluorescent Protein

}

kb

Kilo base

TSS

Transcription start site

//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);
srand(time(NULL));
for(int i=1;i<=5;i++)
{
n=rand()%100;
fprintf(fp,"%d\t",n);
}

printf("\nDa ghi xong!\n");
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
fclose(fp);


vi

DANH MỤC BẢNH

#include <stdio.h>
#include <stdlib.h>

Bảng 1.1. Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đáp ứng điều kiện bất lợi .............10

#include <time.h>

/*

Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu ....................................................12
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

Bảng
2.2. Thành phần của phản ứng PCR ................................................................14
Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
Bảng
2.3.docThành
hóa chất tách chiết plasmid ...................................................17
Bc3: Ghi hoac
tep tin (xuphần
lý du lieu)
Bc4: Ðóng3.1.
tep tin:
fclose(fp);
Bảng
Các
yếu tố CRE phổ biến trên promoter RMP .........................................26
*/

Bảng 3.2. Các yếu tố CRE chuyên biệt mô trên promoter RMP ..............................27

int main(int argc, char *argv[])
{

Bảng 3.3. Danh sách các CRE phổ biến trên promoter RMP1 .................................31
int n;
//Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

FILE *fp;

//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
if(fp==NULL)
{
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");
exit(0);
}

//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);
srand(time(NULL));
for(int i=1;i<=5;i++)
{
n=rand()%100;
fprintf(fp,"%d\t",n);
}

printf("\nDa ghi xong!\n");
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
fclose(fp);


vii

DANH MỤC HÌNH

#include <stdio.h>
#include <stdlib.h>

Hình 1.1. Cấu trúc mơ phỏng hoa lúa ..............................................................................4

#include <time.h>
/*

Hình 1.2. Cấu trúc gen .....................................................................................................6
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp
Hình
2.1. Sơ đồ miêu tả phản ứng BP ghép nối gene và vector tách dòng ...................16
Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

Hình 2.2. Sơ đồ miêu tả phân tử DNA tham gia vào phản ứng LR ..............................20
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

Hình
Phương
pháp cắt phân đoạn promoter để phân tích CRE .............................21
Bc4: 2.3.
Ðóng tep
tin: fclose(fp);
*/

Hình 3.1. Tần số xuất hiện của các yếu tố CRE phổ biến trên promoter RMP.............28

int main(int argc, char *argv[])

Hình 3.2. Tần số xuất hiện của các yếu tố CRE phổ biến .............................................28

{

Hình
3.3. Biểu hiện của gen RMP1 ở cơ quan sinh sản bằng phần mềm
int n;
RiceEXPro
29
//Bc1: Khai báo.....................................................................................................................
bien tep tin: FILE *fp
FILE 3.4.
*fp; Mô phỏng biểu hiện của gen RMP1 ở cơ quan sinh sản
Hình

bằng phần mềm eFP ......................................................................................................29
//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

Hình
3.5. Tần số xuất hiện các CRE phổ biến (A) và vị trí phân bố của
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
Pollen1LETAT52
và (B) trên promoter RMP1. ...........................................................32
if(fp==NULL)
{
Hình
3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% để sàng lọc
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");

khuẩn lạc tái tổ hợp với vector tách dòng pDONR-RMP1del ::GFP/GUS (A)
exit(0);

và }vector chuyển gen pKG7-RMP1del ::GFP/GUS (B) ...............................................34

Hình 3.7. Kết quả phân tích cây chuyển gen bằng PCR với cặp mồi GUS-F/GUS-R ..35
//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
Hình
3.8. Biểu hiện của gen GUS ở cụm hoa cây chuyển gen......................................36
//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);
srand(time(NULL));
for(int i=1;i<=5;i++)
{
n=rand()%100;
fprintf(fp,"%d\t",n);
}

printf("\nDa ghi xong!\n");
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
fclose(fp);


#include <stdio.h>
#include <stdlib.h>
#include <time.h>
/*
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp
Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
*/
int main(int argc, char *argv[])
{
int n;
//Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

FILE *fp;

//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
if(fp==NULL)
{
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");
exit(0);
}

//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);
srand(time(NULL));
for(int i=1;i<=5;i++)
{
n=rand()%100;
fprintf(fp,"%d\t",n);
}

printf("\nDa ghi xong!\n");
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
fclose(fp);


1

MỞ ĐẦU

#include <stdio.h>
#include <stdlib.h>

#include <time.h>

1. Đặt vấn đề

/*

Promoter là trình tự nucleotide nằm trước gen phía đầu 5’ tính từ điểm khởi

Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

Bc2: Mo
tep tin mã
de ghi (TSS),
hoac doc: fopen("Ten
đầu
phiên
đóng tep",
vai"mode");
trị quan trọng trong việc điều khiển hoạt động
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

phiên mã vì vậy nó được xem như một trong những yếu tố chủ đạo trong nghiên
Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

*/

cứu biểu hiện gen. Để nâng cao hiệu quả, các nhà khoa học đã sàng lọc promoter
theo các hướng điều khiển khác nhau theo mục đích nghiên cứu, bao gồm: (i)

int main(int argc, char *argv[])

{

promoter cảm ứng (inducible promoter) chỉ điều khiển gen hoạt động trong điều
int n;

kiện
định;
promoter
cơ định (constitutive promoter) điều khiển gen hoạt
//Bc1:nhất
Khai báo
bien tep(ii)
tin: FILE
*fp
FILE *fp;
động
liên tục ở tất cả các mẫu mô; (iii) promoter chuyên biệt (specific promoter)

điều
kiển gen hoạt động ở mẫu mơ nhất định. Trong số các nhóm trên, promoter
//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
cơfp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
định như 35S, actin hay ubiqutin được sử dụng phổ biến nhất [6], [10],
if(fp==NULL)
[43].Tuy
nhiên, những promoter này thường tạo ra các kiểu hình khơng mong
{

muốn doprintf("\nKhong
hoạt động

khơng định hướng của gen gây ra. Vì thế, để khắc phục điều
mo tap tin duoc\n");
này các exit(0);
nhà khoa học có xu hướng sử dụng các promoter chuyên biệt để điều
}

khiển các gen ở các mô, bộ phận theo chủ đích [33].
Hạt phấn là cơ quan sinh sản quan trọng của cây trồng, liên quan trực tiếp

//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

//Ghinăng
ra man hinh:
printf("%d",
đến
suất.
Đến n);nay đã có nhiều gen liên quan đến quá trình phát triển của
srand(time(NULL));

hạt phấn được xác định và đánh giá ở lúa như OsSCP, OsCP1, OSIPA [41], [60].
for(int i=1;i<=5;i++)

Promoter
chun biệt hạt phấn có tính ứng dụng cao như: (i) tạo các dòng bất
{
dục đựcn=rand()%100;
phục vụ cho sản xuất hạt lai khi promoter này kết hợp với một gen gây
fprintf(fp,"%d\t",n);

bất dục như barnase hoặc bất hoạt gen liên quan q trình trao đổi chất bằng

}

cơng nghệ RNAi (RNA interference) [5], [40] (ii) ứng dụng để kiểm soát các gen
liên quan đến q trình tổng hợp đường, tinh bột, hóc môn sinh trưởng nhằm
printf("\nDa ghi xong!\n");

tăng
cường sức chống chịu của hạt phấn trong điều kiện bất lợi như hạn hán,
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
fclose(fp);
nóng,
lạnh, hay các stress mơi trường khác [28]; (iii) ngoài ra promoter này cũng


2

là công cụ lý tưởng để nghiên cứu chức năng gen, protein liên quan đến quá trình

#include <stdio.h>

phát triển hạt phấn ở thực vật [18].

#include <stdlib.h>

Nhìn chung, các promoter chuyên biệt thường có mặt của các yếu tố điều

#include <time.h>
/*

khiển

hoạt động Cis (Cis Regulatory Elements-CRE) chuyên biệt cho mô hay tế
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp
Bc2: Mo
tin dekhi
ghi hoac
doc: fopen("Ten
tep", "mode");
bào.
Vítepdụ,
phân
tích trình
tự promoter chun biệt hạt phấn của gen ở cây
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

cà chua nhóm nghiên cứu của Twell đã tìm thấy một số yếu tố có vai trị chính
Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

*/

đến hoạt động của promoter như GTGANTG10, POLLEN1LeLAT52 [46]. Các
yếu tố này cũng được tìm thấy ở một số promoter chuyên biệt hạt phấn khác như

int main(int argc, char *argv[])
{

OsSCP, OSIPA, OsLPS10 và OsLPS11 [1], [20], [26]. Ngoài vai trò của các yếu
int n;

tố//Bc1:
này,

sốtepnghiên
Khaimột
báo bien
tin: FILE *fpcứu cho thấy các motif mới hay trình tự bảo thủ cũng chi
FILE *fp;
phối
hoạt động chuyên biệt của promoter.

Nhằm cung cấp nguồn vật liệu (promoter) tốt cho các nghiên cứu liên quan

//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

đến
hạt phấn, gần đây chúng tôi đã phân lập và đánh giá 20 promoter chuyên biệt
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
if(fp==NULL)
hạt
phấn ở giai đoạn sớm (RMP1 đến RMP9) và muộn (OsLPS1 đến OsLPS11)
{

ở cây lúa.
Mặc dù các promoter này đã được đánh giá ở cây lúa và Arabidopsis
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");
exit(0);
nhưng cần
phải được phân tích chi tiết hơn nữa để xác định vai trò của các yếu

tố} CRE, các motif mới hay trình tự bảo thủ chi phối hoạt động chuyên biệt hạt
phấn.
Dựa trên phương pháp phân tích đột biến mất đoạn kết hợp với chuyển gen

//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
//Ghi ra man
n); “Phân tích vai trị của các yếu tố điều hịa hoạt động
chúng
tơihinh:
sẽ printf("%d",
tiến hành
srand(time(NULL));

(CRE) trên vùng promoter chuyên biệt hạt phấn lúa”. Kết quả nghiên cứu
for(int i=1;i<=5;i++)

không
chỉ xác định được vai trò của các yếu tố CRE mà cịn là cơ sở để tối ưu
{
hóa kíchn=rand()%100;
thước promoter, tạo nguồn vật liệu tốt cho các nghiên cứu chọn tạo
fprintf(fp,"%d\t",n);

giống đáp ứng biến đổi khí hậu ở Việt Nam.
}

2. Mục đích nghiên cứu
Đánh giá vai trị của CRE trên promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa
printf("\nDa ghi xong!\n");

(Oryza sativa L.) nhằm cung cấp các thông tin về promoter chuyên biệt hạt phấn
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

đểfclose(fp);

phục vụ cho công tác nghiên cứu.


3

3. Ý nghĩa của luận văn

#include <stdio.h>

3.1. Ý nghĩa khoa học

#include <stdlib.h>
#include <time.h>
/*

Cung cấp các dữ liệu khoa học về vai trò các yếu tố CRE đến hoạt động

của
promoter chuyên biệt hạt phấn lúa đáp ứng lại điều kiện bất lợi, đặc biệt là
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp
Bc2:trung
Mo tep tin
de ghiđiều
hoac doc:
fopen("Ten
"mode");
tập
vào
kiện
khô tep",

hạn.
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

Phân tích vai trị của các yếu tố điều hòa hoạt động (CRE) trên vùng

*/

int main(int argc, char *argv[])

promoter chuyên biệt hạt phấn lúa (Oryza sativa L) góp phần nâng cao hiệu quả

{

công
int n; tác bảo tồn và chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt, năng suất cao, có
//Bc1:
Khai báo
bien tepứng
tin: FILE
*fp stress của mơi trường, phù hợp với điều kiện canh tác lúa
khả
năng
thích
với
FILE *fp;

vùng khơ hạn và cơ cấu sản xuất lúa chịu stress như nắng nóng, nhiệt độ cao ở

Việt
//Bc2:Nam.
Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
if(fp==NULL)
{
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");
exit(0);
}

//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);
srand(time(NULL));
for(int i=1;i<=5;i++)
{
n=rand()%100;
fprintf(fp,"%d\t",n);
}

printf("\nDa ghi xong!\n");
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
fclose(fp);


4

CHƯƠNG 1

#include <stdio.h>

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

#include <stdlib.h>
#include <time.h>

1.1. Hoa lúa

/*

Lúa là cây tự thụ phấn, hoa được cấu tạo gồm hai bộ phận chính: cơ quan

Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

Bc2: Mo
tep tin
de ghi(nhị)
hoac doc:
tep", "mode");
sinh
sản
đực
vàfopen("Ten
cơ quan
sinh sản cái (nhụy). Nhụy hoa bao gồm có đầu
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

nhụy, chỉ nhụy và noãn. Đầu nhụy làm nhiệm vụ tiếp nhận hạt phấn và kết nối
Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

*/

với nỗn thơng qua ống nhụy. Noãn nằm ở đế hoa sau khi thụ tinh sẽ phát triển
thành hạt.

int main(int argc, char *argv[])
{
int n;

Cơ quan sinh sản đực bao gồm 6 chỉ (tua nhị) mang 6 bao phấn. Mỗi nhị

gồm
phần
làtepchỉ
nhị*fpvà bao phấn. Ở giai đoạn trưởng thành, hạt phấn được giải
//Bc1:2
Khai
báo bien
tin: FILE
FILE *fp; khỏi bao phấn và tiếp xúc với nhụy. Bao phấn gồm 2 phần chứa hạt phấn
phóng

được liên kết với nhau bởi vách ngăn. Trước khi hoa nở, nhị và nhụy được bao
//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

bọc
bởi vỏ hạt.
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
if(fp==NULL)
{
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");

exit(0);
}

//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);
srand(time(NULL));
for(int i=1;i<=5;i++)
{
n=rand()%100;
fprintf(fp,"%d\t",n);
}

Hình 1.1. Cấu trúc mơ phỏng hoa lúa
1.2.
Gen ghi
kiểm
sốt q trình phát triển của hạt phấn
printf("\nDa
xong!\n");
Nghiên cứu đầu tiên về biểu hiện gen ở hạt phấn lúa được Parnell (1921)

//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
fclose(fp);

quan sát khi nhuộm với iod [27]. Tiếp đến là Brink và MacGillivray (1924) cũng
tiến hành thí nghiệm tương tự ở hạt phấn ngơ [8]. Quá trình phát triển của hạt


5

phấn gồm 2 giai đoạn: tiểu bào tử (microspore) và giai đoạn hạt phấn trưởng

#include <stdio.h>

thành (pollen). Hầu hết các nghiên cứu sàng lọc gen liên quan cũng được tập

#include <stdlib.h>

trung ở hai giai đoạn này[33].Cho tới nay có rất nhiều gen liên quan đến quá

#include <time.h>
/*

trình
phát triển của hạt phấn được sàng lọc. Honys và cộng sự (2006) đã xác định
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp
Bc2: Mo3.500
tep tin degen
ghi hoac
doc: fopen("Ten
được
biểu
hiện ởtep",
hạt"mode");
phấn của cây Arabidopsis. Một số gen đã được
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

đánh giá như MORI/GEMI, TIO, MSP1, MSP2 và MSP3 [32]. Theo dự đốn
Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

*/

có khoảng 13.977 gen biểu hiện ở hạt phấn cây Arabidopsis [4], [7], [43].
Trong đó, 11,565 gen biểu hiện ở giai đoạn tiểu bào tử, 7.235 gen biểu hiện ở

int main(int argc, char *argv[])
{

giai đoạn hạt phấn trưởng thành. Tỷ lệ gen đặc hiệu ở các giai đoạn này lần
int n;

lượt
vàtep
8,6%
//Bc1:là
Khai6,9
báo bien
tin: FILE[4].
*fp
Ở lúa, Endo và cộng sự (2004) xác định được 259 gen chuyên biệt cho bao

FILE *fp;

phấn. Mức độ biểu hiện của các gen thay đổi theo từng giai đoạn phát triển của
//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

hạt
phấn [13]. Lu và cộng sự (2006) một số nghiên cứu trước đây cho rằng có 26
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
if(fp==NULL)

gen
tăng mức độ biểu hiện ở giai đoạn hình thành nhị hoa [23]. Wei và cộng sự
{

(2010) chia
làm 5 giai đoạn: tiều bào tử đơn nhân, hai nhân, ba nhân chưa hoàn
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");
exit(0); chỉnh và giai đoạn hạt phấn nảy mầm [68]. Phân tích microarray cho
chỉnh, hồn
}
thấy
có khoảng 22.000 đến 25.062 nhân tố phiên mã được phát hiện trong quá

trình
hình thành và phát triển hạt phấn [68]. Trong đó có khoảng 1.000 gên
//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
//Ghi ra man
hinh:hạt
printf("%d",
chuyên
biệt
phấnn); được tìm thấy, bao gồm 453 gen ở giai đoạn ba nhân, 184
srand(time(NULL));

gene ở giai đoạn đơn nhân, 78 gene ở giai đoạn phân bào giảm phân và 291 gene
for(int i=1;i<=5;i++)

ở {giai đoạn hạt phấn trưởng thành [33].
1.3. Genn=rand()%100;
và promoter

fprintf(fp,"%d\t",n);

1.3.1. Gen
}

Mendel (1865) là người đầu tiên đưa ra khái niệm nhân tố di truyền.
Johansen (1909) đã đề xuất thuật ngữ gen để chỉ nhân tố di truyền xác định một
printf("\nDa ghi xong!\n");

tính trạng nào đó. Sau đó, Morgan trong những năm 1920 đã cụ thể hóa khái
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

niệm
về gen, khẳng định nó nằm trên nhiễm sắc thể và chiếm một locus nhất
fclose(fp);
định, gen là đơn vị chức năng xác định một tính trạng.


6

#include <stdio.h>

Vào những năm 1950, DNA (deoxyribonucleic acid) được chứng minh là

vật chất di truyền. Mơ hình cấu trúc DNA của Watson và Crick được đưa ra và

#include <stdlib.h>

lý thuyết trung tâm (central dogma) ra đời. Gen được xem là một đoạn DNA trên

#include <time.h>
/*

nhiễm
sắc thể mã hóa cho một polypeptide hay RNA.
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp
Cuối những năm 1970, việc phát hiện ra gen gián đoạn ở sinh vật

Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

eukaryote cho thấy có những đoạn DNA khơng mã hóa cho các amino acid trên
Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

*/

phân tử protein. Vì thế, khái niệm về gen một lần nữa được điều chỉnh như sau:
Gen là một đoạn DNA đảm bảo cho việc tạo ra một polypeptide, nó bao gồm cả

int main(int argc, char *argv[])
{

phần phía trước là vùng 5’ khơng dịch mã (5’ untranslation) hay cịn gọi là vùng
int n;

ngược
hướng
(upstream)
và phía sau là vùng 3’ khơng dịch mã (3’ untranslation)
//Bc1: Khai

báo bien tep
tin: FILE *fp
FILE còn
*fp; gọi là vùng cùng hướng (downstream) của vùng mã hóa cho protein, và
hay

bao gồm cả những đoạn khơng mã hóa (intron) xen giữa các đoạn mã hóa (exon).
//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

Vùng mã hoá

fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
if(fp==NULL)
{
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");
exit(0);

Hình 1.2. Cấu trúc gen

}

1.3.2. Promoter
//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

Promoter là trình tự nucleotide cần thiết để ARN pol bám vào khởi động

//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);

quá
trình phiên mã. Trình tự này nằm ngay trước vị trí khởi đầu phiên mã ở các

srand(time(NULL));
hệfor(int
geni=1;i<=5;i++)
của sinh vật nhân sơ. Trong khi đó promoter ở hệ gen của sinh vật nhân
{

chuẩn thường
gồm vị trí nhận biết bởi ARN pol và các trình tự đặc biệt nhận biết
n=rand()%100;
bởi yếu fprintf(fp,"%d\t",n);
tố phiên mã [2].
}

Trình tự cơ bản của promoter (code promoter) thường gồm các nucleotide

ở vị trí -10 đến vài nucleotide sau vị trí khởi đầu phiên mã đối với gen ở sinh vật
nhân
sơ hoặc
gồm các nucleotide ở vị trí - 40 đến + 20 đối với gen của sinh vật
printf("\nDa
ghi xong!\n");
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
nhân
chuẩn. Hầu hết các trình tự gen sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn đều có chứa
fclose(fp);

một đoạn ngắn giàu A- T gọi là hộp TATA. Hộp TATA thường ở vị trí - 10 ở
promoter sinh vật nhân sơ nhưng phân bố ở vị trí - 25 ở promoter sinh vật nhân

7

chuẩn. Khi promoter chỉ có trình tự cơ bản thì mức độ phiên mã xảy ra rất thấp,

#include <stdio.h>

tuy nhiên sẽ tăng lên rất nhiều khi có thêm trình tự nằm phía trước trình tự cơ

#include <stdlib.h>

bản. Trình tự thứ hai này thường nằm ở vị trí - 35 đối với gen sinh vật nhân sơ,

#include <time.h>
/*

hoặc vị trí - 70 đến - 90 ở gen sinh vật nhân chuẩn [2].
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

Promoter của gen ở sinh vật nhân chuẩn mã hóa cho protein được nhận biết

Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

Bc3:ARN
Ghi hoac pol
doc tepII
tinkhi
(xu lý mà
du lieu)
bởi
hầu hết các yếu tố phiên mã đã có mặt ở promoter. Phiên

Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

mã ở sinh vật nhân chuẩn cũng địi hỏi các trình tự tăng cường enhancer đặc thù
*/

cho từng gen hoặc nhóm gen, có thể nằm phía trước, sau hoặc ngay trong gen để

int main(int argc, char *argv[])
{

tăng cường mức độ phiên mã trên promoter [2].
n;
a.intPromoter
không đặc hiệu
//Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

Promoter không đặc hiệu hay còn gọi là promoter cơ định (constitutive

FILE *fp;

promoter) tham gia điều khiển quá trình biểu hiện gen ở tất cả hoặc hầu như tất
tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
cả//Bc2:
cácMoloại
mô khác nhau trong tất cả hay hầu như mọi giai đoạn phát triển của
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");

sinh vật. CaMV35S promoter điều khiển sự biểu hiện ARN 35S được phân lập
if(fp==NULL)

từ{ virut khảm súp lơ (cauliflower mosaic virus – CaMV) là một ví dụ điển hình
printf("\nKhong
mo tap
tin duoc\n");
của nhóm
promoter
này.
CaMV là một virus dạng sợi đôi ở thực vật thuộc họ cải.
exit(0);

Hệ gen của virus này là một phân tử DNA vòng sợi kép có kích thước 8kb với
}

ba qng ngắt là sợi đơn, hai bản phiên mã mARN chính (19S và 35S) và sáu
//Bc3: Ghiđọc
hoac doc
tin (xu lý mã
du lieu)
khung
mởtepđược
hóa bởi DNA. Sự phiên mã xảy ra từ tiểu nhiễm sắc thể
//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);

vịng và khơng tiếp hợp trong nhân của tế bào thực vật và DNA virion được tổng
srand(time(NULL));

hợp
trong tế bào chất thông qua sự phiên mã ngược của mARN 35S. CaMV35S
for(int i=1;i<=5;i++)
{

promoter
là trình tự có kích thước vào khoảng 350 bp nằm ở phía đầu của mARN
n=rand()%100;
35S ( -343
đến +8, với vị trí Cap ở +1), trong đó khoảng 250 bp gối lên 3% đoạn
fprintf(fp,"%d\t",n);

kết
thúc của gen V1, khung đọc mở cuối cùng trong 6 khung đọc mở lớn. Có 3
}
vùng trên promoter, promoter trung tâm chứa hộp TATA (vị trí từ - 46 đến +8)
và hai vùng chính khác có chức năng tăng cường. Vùng A (- 90 đến – 46) chủ
printf("\nDa ghi xong!\n");

yếu cần cho biểu hiện ở rễ và vùng B (- 343 đến – 90) cần cho biểu hiện ở lá [12].
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

Tiểu
vùng của vùng B (B1 đến B5) có thể được nhận dạng dựa trên những tương
fclose(fp);
tác khác biệt với những nhân tố phiên mã khác nhau. Tuy nhiên, vùng B hoàn


8

chỉnh cho phép biểu hiện đa dạng hơn so với trường hợp kết hợp các tiểu vùng.

#include <stdio.h>

Vai trò của các vùng khác nhau trên CaMV35S promoter trong việc gây bệnh

#include <stdlib.h>

của CaMV mới được nghiên cứu trong thời gian gần đây [12]. Các nghiên cứu

#include <time.h>
/*

cho thấy việc loại bỏ hộp TATA làm mất khả năng gây nhiễm. Hai vùng tăng
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

cường
tách
liên
quan đến
khả năng gây nhiễm đã được xác định là (- 207
Bc2: Mo tep
tin debiệt
ghi hoac
doc: fopen("Ten
tep", "mode");
Bc3: –
Ghi150)
hoac docvà
tep (tin (xu
lieu) – 56). Vùng tăng cường thậm chí có thể hoạt động theo
đến
95lý du
đến
Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

hướng ngược chiều [24].
*/

b. Promoter đặc hiệu

int main(int argc, char *argv[])

Promoter đặc hiệu chuyên biệt (specific promoter) với các yếu tố Cis

{

int n;
chuyên
biệt điều khiển gen hoạt động ở mẫu mô nhất định. Sự biểu hiện đặc hiệu
//Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

làFILE
sự*fp;biểu hiện các sản phẩm của gene giới hạn ở một hoặc một vài mô (hạn chế
về không gian – spatial limitation) hoặc ở một vài giai đoạn phát triển (đặc hiệu
//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
thời
gian – temporal limitation). Cần nhấn mạnh rằng không có một promoter
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");

hồn tồn đặc hiệu: các promoter dường như hoạt động ở một số mô, trong khi
if(fp==NULL)

ở {một số mô khác không hoặc chỉ hoạt động yếu. Hiện tượng này được biết đến
printf("\nKhong

mo tap
tin duoc\n"); đặc hiệu mô (tissue specific promoter): Các loại
là sự biểu
hiện yếu.
Promoter
exit(0);

promoter đặc hiệu mô chỉ điều khiển biểu hiện gen ở những mô nhất định, ví dụ
}

promoter đặc hiệu rễ [22], promoter đặc hiệu bó mạch thực vật, promoter đặc
//Bc3:hoa
Ghi hoac
doc [31],
tep tin (xu[42],
lý du lieu)
hiệu
[9],
[50]. Thuộc nhóm promoter này có promoter điều khiển
//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);

biểu hiện gen mã hóa sucrose synthase. Sucrose synthase là một trong những
srand(time(NULL));

enzyme
quan trọng tham gia vào mọi hoạt động sống của tế bào. Ở lúa, người ta
for(int i=1;i<=5;i++)
đã{ phát hiện được ba gen cùng mã hóa cho sucrose synthase (Rsuc1, Rsuc2,
n=rand()%100;
Rsuc3) [34].

Tuy nhiên mức độ biểu hiện của các gen này ở các mô là khác nhau.
fprintf(fp,"%d\t",n);

Gene
Rsuc2 khơng có tính đặc hiệu mơ cao. Gen Rsuc3 đặc hiệu cao ở hạt [34].
}
Chỉ có gen Rsuc1 biểu hiện đặc hiệu ở bó mạch, rễ, mầm. Kích thước của gen
Rsuc1 là 8167 bp, trong đó kích thước của vùng 5’ tương đối lớn, chiếm khoảng
printf("\nDa ghi xong!\n");

3 kb. Promoter của Rsuc1 chứa các trình tự đặc trưng của một promoter như hộp
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

TATA,
fclose(fp); hộp CCAAT…và các trình tự đặc hiệu, quyết định sự biểu hiện gen đặc
hiệu bó mạch như hộp ASL, hộp GAGA.… [34].


9

c. Promoter cảm ứng

#include <stdio.h>

Là promoter cảm ứng với môi trường (environmentally inducible promoter)

#include <stdlib.h>

chỉ điều khiển gen hoạt động trong các điều kiện nhất định. Chẳng hạn trong các

#include <time.h>
/*

điều kiện cực đoan (stress) như hạn, nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, oxy hóa cao,
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

nồng
độ muối quá cao…các gen chống chịu thường biểu hiện với tốc độ rất nhanh.
Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
Ghi hoac
tep tin
(xu lý du
lieu) sự phiên mã cũng như cấu trúc promoter của chúng và
VìBc3:vậy
vấndocđề
khởi
động
Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
các
protein tham gia vào việc điều khiển biểu hiện gen thông qua việc nhận biết
*/

và hoạt hóa q trình khởi động phiên mã được đặc biệt quan tâm [3].

int main(int argc, char *argv[])

Để nâng cao hiệu quả, các nhà khoa học đã sàng lọc promoter theo các

{

int n;
hướng
điều khiển khác nhau tùy mục đích nghiên cứu, bao gồm: (i) promoter
//Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

cảm ứng(inducible promoter) chỉ điều khiển gen hoạt động trong điều kiện nhất
FILE *fp;

định; (ii) promoter cơ định (constitutive promoter) điều khiển gene hoạt động
//Bc2:
Mo tep
tin decả
ghi hoac
fopen("Ten
"mode");
liên
tục
ở tất
cácdoc:
mẫu
mô;tep",
(iii)
promoter chuyên biệt (specific promoter) điều
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
khiển
gen hoạt động ở mẫu mơ nhất định. Trong số các nhóm trên, promoter cơ
if(fp==NULL)

định
như 35S, actin hay ubiqutin được sử dụng phổ biến nhất [6], [10], [44]. Tuy

{
nhiên những
promoter
thường tạo ra kiểu hình khơng mong muốn do hoạt
printf("\nKhong
mo tap tinnày
duoc\n");
exit(0); định hướng của gen gây ra. Vì thế để khắc phục điều này các nhà
động khơng
}

khoa học có xu hướng sử dụng các promoter chun biệt để điều khiển các gen
ở //Bc3:
các Ghi
mơ,
phận
chủ đích [3].
hoacbộ
doc tep
tin (xutheo
lý du lieu)
//GhiVai
ra mantrò
hinh: của
printf("%d",
1.4.
yếun);tố điều hòa CRE
srand(time(NULL));

Yếu tố điều hòa cis định vị trên vùng điều hòa của promoter, là vị trí nhận

for(int i=1;i<=5;i++)

biết
của yếu tố phiên mã, tham gia điều hòa biểu hiện của gen đáp ứng với các
{
điều kiệnn=rand()%100;
bất lợi [1]. Việc phát hiện ra yếu tố điều hịa cis (cis regulatory element,
fprintf(fp,"%d\t",n);
CRE) nằm
trong trình tự của promoter của gen được coi là một thành cơng trong
}

việc giải mã tồn bộ cơ chế điều hịa phiên mã của gen. Rất nhiều kết quả thu
được gần đây đã khẳng định sự tham gia của CRE trong con đường dẫn truyền
ghi xong!\n");
tínprintf("\nDa
hiệu điều
khiển các q trình sinh học diễn ra trong tế bào. Nhiều nghiên cứu
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
liên
quan đến CRE đã cung cấp những dẫn liệu khá đầy đủ về chức năng của
fclose(fp);

chúng vào sự phát triển của cây trồng. Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đã


10

được tìm ra như ABRE cảm ứng với ABA, MYBRS và MYCRS đáp ứng hạn,

#include <stdio.h>

DRE và LTRE cảm ứng với nhiệt độ… (Bảng 1.1).

#include <stdlib.h>

Bảng 1.1. Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đáp ứng điều kiện bất lợi

#include <time.h>
/*

Yếu
tố điều
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp
Trình tự bảo thủ
Bc2: Mocis
tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
hòa
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

ABRE

CCACGTGG

Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

*/

MYBRS

(A/C)ACC(A/T)A(A/C)C

int main(int argc, char *argv[])
{

MYCRS

CACATG

int n;
//Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

DRE

TACCGACAT

FILE *fp;

ACCGACA;CCGAAA;
//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
LTRE
GTCGAC
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");

Chức năng
Tham gia vào quá trình đáp ứng với ABA.
Tham gia vào quá trình đáp ứng hạn.
Tham gia vào quá trình đáp ứng sớm với
điều kiện hạn và cảm ứng với ABA.

Liên quan đến sự đáp ứng với điều
kiện mặn, hạn và nhiệt độ thấp.
Yếu tố đáp ứng nhiệt độ thấp, điều hòa
đáp ứng điều kiện lạnh.

Đặc trưng của các promoter hoạt động cảm ứng stress là có mang các yếu

if(fp==NULL)
{

tố hoạt hóa
cis (cis-acting element) đóng vai trị là vị trí liên kết với nhân tố phiên
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");
exit(0);
mã (được
kích hoạt bởi các tín hiệu stress) để điều hịa biểu hiện của các gen liên
}

quan Các yếu tố hoạt hóa Cis đáp ứng điều kiện stress được chia thành 3 nhóm,
bao
gồm (1)nhóm liên quan tới con đường điều hịa phụ thuộc hormone ABA
//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
//Ghi ra
man hinh:
n);
như
yếu
tố printf("%d",
cis ABRE
(chứa motif –T/CACGTGG với trình tự lõi ACGT),

srand(time(NULL));

MYCRS (trình tự nhận biết MYC - CANNTG), MYBRS (trình tự nhận biết
for(int i=1;i<=5;i++)

MYB
– A/TAACCA và C/TAACG/TG)…, (2) nhóm khơng phụ thuộc ABA như
{
n=rand()%100;
yếu tố cis
DRE (có trình tự lõi A/GCCGAC)… và (3) liên quan đến cả hai con
fprintf(fp,"%d\t",n);

đường trên như yếu tố cis NAC (có chứa trình tự lõi CATGTG), ZFHDRS (chứa
}

một motif bảo thủ TT/AAATT)...[1].
printf("\nDa ghi xong!\n");
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
fclose(fp);


11

CHƯƠNG 2

#include <stdio.h>

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

#include <stdlib.h>
#include <time.h>
/*

2.1.
Bc1: Đối
Khai báotượng,
bien tep tin:phạm
FILE *fp vi nghiên cứu
Bc2: MoĐối
tep tin tượng
de ghi hoacnghiên
doc: fopen("Ten
tep", "mode");
2.1.1.
cứu
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

Cây lúa Oryza sativa L. và cây Arabidopsis thaliana.

Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
*/

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Đánh giá vai trò của các yếu tố CRE trên promoter chuyên biệt hạt phấn từ

int main(int argc, char *argv[])
{

cây lúa Oryza sativa L.

int n;

2.2.
Địa
điểm
vàtin:thời
//Bc1:
Khai báo
bien tep
FILE *fpgian nghiên cứu
FILE *fp;
2.2.1.
Địa điểm nghiên cứu

Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử - Khoa Công nghệ sinh học và Công

//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

nghệ
thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên.
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
if(fp==NULL)
2.2.2.
Thời gian nghiên cứu
{

Đềprintf("\nKhong
tài được thực
hiện từ tháng 5/2020 đến tháng 6/2021.
mo tap tin duoc\n");

2.3. Vậtexit(0);
liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu
}

2.3.1. Vật liệu nghiên cứu
- Vật liệu thực vật: Giống lúa Oryza sativa L. do Phịng thí nghiệm Sinh

//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

//Ghiphân
ra man hinh:
học
tử -printf("%d",
Khoa n);
Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại
srand(time(NULL));

học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên cung cấp.
for(int i=1;i<=5;i++)
{

- Các vật liệu khác:
n=rand()%100;
 Cấu
trúc vector tách dòng pDONR201
fprintf(fp,"%d\t",n);

}

 Hệ thống vector chuyển gen pKGWFS7 mang gen chọn lọc kanamycin.
 Mồi sử dụng trong nghiên cứu (Bảng 2.1)
 Chủng vi khuẩn chuyển gen E.coliDH5α của hãng Invitrogen và vi

printf("\nDa ghi xong!\n");

khuẩn
Agrobacterium do phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa Cơng nghệ
//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
fclose(fp);
Sinh
học và công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

cung cấp.


12

Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu

#include <stdio.h>
#include <stdlib.h>
#include <time.h>
/*
Gene

Kích
Primer

Sequence (5'-3')

Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

RMP1

Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

AAAAAGCAGGCT
AATGAATTTCATTTTCAGAGCGCAGTTGCTTG
Bc4:
Ðóng tep tin: fclose(fp); AGAAAGCTGGGT
RMP1-R
GTTAATTAGCTAGGCTACAGGGGAGG
*/
RMP1del-F
AAAAAGCAGGCT TGAAGAGACGAGGGGCATTATCATC
int main(int argc, char *argv[])
AGAAAGCTGGGT
RMP1del-R
{
GTTAATTAGCTAGGCTACAGGGGAGG
int
n;
attB
attB1
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT
//Bc1:
Khai báo bien tep tin: FILE
*fp

attB2
FILE
*fp; forward
GUS
β-GUS
CTCATTTGGAATTTTGCCGATT
CGAGTGAAGATCCCCTTTTTA
β-GUS reverse
RMP1-F
Bc3:
Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

thước
(bp)
1403

623

//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");

2.3.2.
Hóa chất
if(fp==NULL)
{

Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu được đặt mua từ các hãng có
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");

uy tín như Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Invitrogen (Mỹ).

exit(0);

}

Các muối đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần nền khoáng B5, MS.

Chất dẫn dụ Acetosyringone (AS), chất bổ sung: Yeast extract, L-Cysteine,
//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

trypton,
sucrose, agarose… và các thành phần hóa chất trong phân tích sinh học
//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);
srand(time(NULL));
phân
tử của các hãng sản xuất như Duchafe, sigma,…:
for(int i=1;i<=5;i++)

2.3.3. Thiết bị thí nghiệm
{

Các n=rand()%100;
thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm:
fprintf(fp,"%d\t",n);
- Buồng
cấy vô trùng
}

- Máy đo pH
- Máy đo OD
- Máy ly tâm lạnh

printf("\nDa ghi xong!\n");

//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

- Máy vortex

fclose(fp);

- Bể ổn nhiệt
- Máy lắc ổn nhiệt


13

- Nồi hấp khử trùng

#include <stdio.h>

- Máy li tâm lạnh

#include <stdlib.h>

- Máy điện di

#include <time.h>
/*

Và các trang thiết bị khác như lị vi sóng, cân điện tử, bình trụ, bình tam giác,

Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

Bc2:eppendorf,
Mo tep tin de ghi hoac
fopen("Ten
tep", "mode");
ống
đầudoc:
cơn
các loại,
pipet, đĩa petri,…của phịng thí nghiệm khoa công
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm trường Đại học Nơng Lâm Thái Ngun.
Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

*/

2.4. Nội dung nghiên cứu
2.4.1. Nội dung 1: Phân tích trình tự promoter để xác định các yếu tố CRE

int main(int argc, char *argv[])
{
int n;

Dựa trên kết quả phân tích dữ liệu công bố về các gen biểu hiện trên cây lúa,

tiến
hành
lựa

chọn
gen biểu hiện ở hạt phấn cho nghiên cứu.
//Bc1:
Khai báo
bien
tep tin:các
FILE *fp
FILE *fp;Nội dung 2: Thiết kế vector chuyển gen
2.4.2.

2.4.3. Nội dung 3: Chuyển gen vào cây Arabidopsis
//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

2.5.
Phương pháp nghiên cứu
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
if(fp==NULL)
2.5.1.
Nghiên cứu sàng lọc gen chuyên biệt hạt phấn
{

Dựaprintf("\nKhong
trên mokết
quả phân
tap tin duoc\n");

tích

dữ

liệu

microarray

database

exit(0);
( />}

Sử dụng mẫu hạt phấn lúa để tiến hành phân tích lựa chọn các gen biểu hiện

chuyên
biệt ở hạt phấn sử dụng cho nghiên cứu. Gen chuyên biệt hạt phấn là
//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
//Ghi ra man
printf("%d",
những
genhinh:biểu
hiệnn);duy nhất ở hạt phấn, dựa trên bản đồ nhiệt (heat map) biểu
srand(time(NULL));

hiện của gen được thể hiện thông qua màu sắc.
for(int i=1;i<=5;i++)

2.5.2.
Phương pháp tách chiết DNA tổng số
{
Sử n=rand()%100;
dụng bộ kit bộ kít DNeasy plant mini kit của hãng Qiagene để tách chiết
fprintf(fp,"%d\t",n);

DNA tổng số từ hạt phấn lúa. Quy trình tách chiết được tiến hành theo hướng
}

dẫn của nhà sản xuất ( Các bước tiến hành như sau:
printf("\nDa ghi xong!\n");

- Bao phấn lúa được nghiền bằng máy TissueLyserll trong 30 giây.

//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

- Bổ sung 400 µl dung dịch AP1 (10mM Tris – HCl pH8.0; 1mM EDTA

fclose(fp);

pH8.0) và 4 µl RNase A. Mẫu được trộn đều và ủ ở 65oC trong 10 phút.


14

- Bổ sung 130 µl AP3, đảo đều sau đó ủ trên đá 5 phút.

#include <stdio.h>

- Ly tâm mẫu ở tốc độ 14,000 vịng/phút trong 5 phút.

#include <stdlib.h>

- Chuyển tồn bộ dịch nổi sang cột lọc và ly tâm ở tốc độ 14,000

#include <time.h>
/*

vòng/phút
trong 2 phút.
Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp
- Chuyển cột lọc sang ống mới và bổ sung 650 µl dung dịch AW1, ly tâm

Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

1 phút ở tốc độ 8,000 vịng/phút.
Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

- Tiếp đến bổ sung 500 µl dung dịch AW2, ly tâm 1 phút ở tốc độ 8,000

*/

vòng/phút.

int main(int argc, char *argv[])
{
int n;

- Hịa tan DNA bằng 100 µl dung dịch TAE để sử dụng cho nghiên cứu.

2.5.3.
Phương
khuyếch đại promoter bằng kỹ thuật PCR
//Bc1: Khai

báo bien teppháp
tin: FILE *fp
Vùng promoter nằm phía 5’ trước mã mở đầu ATG của gen được khuyếch

FILE *fp;

đại từ DNA tổng số bằng phương pháp Gateway PCR với cặp mồi đặc hiệu
//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

RMP
(Bảng 2.1) theo thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như sau:
fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR

if(fp==NULL)
{

STT
1
}

printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");
exit(0);

Thành phần

Nước khử ion

32 µl

2

MgSO4 (25mM)

4µl

3

dNTPs (10mM)

5µl

//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
//Ghi ra man hinh: printf("%d", n);

4

Mồi xi (10pmol/µl)

1µl

5

Mồi ngược (10pmol/µl)

1µl

6

KOD enzyme

1µl

srand(time(NULL));
for(int i=1;i<=5;i++)
{

Nồng độ

7

n=rand()%100;

KOD plus buffer ( 1Unit/ µl)

5µl

fprintf(fp,"%d\t",n);
}

8

DNA khn ( 10 – 20 ng/µl)

Tổng thể tích

1µl
50µl

printf("\nDa ghi xong!\n");

Phản ứng PCR được tiến hành theo 2 bước: bước 1, phản ứng PCR được

//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

fclose(fp);
thực
hiện với 10 chu kỳ ở điều kiện 95oC/15s, 55oC/30s và 72oC/2min sử dụng

cặp mồi đặc hiệu có gắn trình tự adapter attB1 và attB2; bước 2, sử dụng 10 µl


15

sản phẩm PCR ở bước 1 làm DNA khuôn, thực hiện phản ứng ở 25 chu kỳ theo

#include <stdio.h>

trình tự như sau: 5 chu kỳ đầu 94oC/15s, 45oC/30s và 72oC/2min ; 20 chu kỳ sau

#include <stdlib.h>
#include <time.h>
o

94 C/15s, 55oC/30s và 72oC/2min.

/*

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong TAE 1X

Bc1: Khai báo bien tep tin: FILE *fp

Mo tep tinchuẩn
de ghi hoac
fopen("Ten
"mode");
cóBc2:maker
vàdoc:chụp
ảnhtep",dưới
ánh sáng cực tím.
Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)

Mẫu DNA thu được cần phải tinh sạch bằng kit tinh sạch HiGene PCR

Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);

*/

purification của hãng Solgenet để chuẩn bị cho tách dòng.
2.5.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

int main(int argc, char *argv[])
{
int n;

Quá trình tinh sạch được thực hiện theo HiGene PCR purification của

hãng
gồm
//Bc1: Solgenet

Khai báo bien tep
tin: FILEcác
*fp bước sau:
FILE *fp;

- Bổ sung Binding Buffer vào sản phẩm PCR, tỉ lệ 1: 1 về thể tích.
- Chuyển sang cột lọc li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút ở 4oC, loại bỏ dịch.

//Bc2: Mo tep tin de ghi hoac doc: fopen("Ten tep", "mode");

- Bổ sung 700µl Washing buffer, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút.

fp=fopen("F:\\INTEGER.txt","wt");

- Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml, mở nắp 3 phút cho bay cồn.

if(fp==NULL)
{

- Bổ
sung 25µl nước khử ion, để 5 phút, li tâm 12000 vòng/phút trong 1
printf("\nKhong mo tap tin duoc\n");

phút, thuexit(0);
dịch. Sản phẩm DNA tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose
}
0,8%
trong TAE 1X có marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Bảo

quản

sản phẩm DNA tinh sạch trong tủ -20oC.
//Bc3: Ghi hoac doc tep tin (xu lý du lieu)
//Ghi ra Phương
man hinh: printf("%d",
2.5.5.
phápn);thiết kế vector tách dòng promoter
srand(time(NULL));

Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch được gắn vào vector tách dòng

for(int i=1;i<=5;i++)

pDONR201
bằng phương pháp Gateway sử dụng enzyme BP clonase. Các
{
n=rand()%100;
bước tiến
hành như sau:
fprintf(fp,"%d\t",n);

}

- Thành phần phản ứng
+ DNA (10ng/ul): 2 µl
+ Vector (75ng/ul): 1 µl

printf("\nDa ghi xong!\n");

+ BP clonase enzyme: 1 µl

//Bc4: Ðóng tep tin: fclose(fp);
fclose(fp);

Tổng số: 4 µl

- Ủ ở nhiệt độ phòng 1hr