Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM MULTIPLEX
REALTIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY
NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN VÀ KHẢO SÁT TÍNH
KHÁNG KHÁNG SINH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC


VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM MULTIPLEX
REALTIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY
NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN VÀ KHẢO SÁT
TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH
Chun ngành: Cơng nghệ sinh học
Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hà Nội, 2022


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan: đây là cơng trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả
cùng cộng tác với các cộng sự khác
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
đƣợc cơng bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý cho phép của
đồng tác giả Phần cịn lại chƣa đƣợc ai cơng bố trong bất kì cơng trình nào khác
Tơi xin đảm bảo tính khách quan và k ết quả xử lý số liệu trong nghiên
cứu này
Hà Nội, ngày

tháng

Nghiên cứu sinh

năm 2022


ii

LỜI CẢM ƠN
Trƣớc tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS , Trƣởng

phịng Cơng nghệ tế bào động vật- Viện CNSH và PGS TS ,
Trƣởng khoa Sinh hoá - Bệnh viện Thanh Nhàn là những ngƣời đã trực tiếp hƣớng
dẫn và giúp đỡ tơi trong q trình nghiên cứu Các Cô đã chỉ bảo cho tôi nhiều ý
kiến hƣớng dẫn qúy báu, động viên và giúp đỡ tơi giải quyết những khó khăn vƣớng
mắc trong q trình thực hiện luận án và tạo mọi điều kiện cho tơi hồn thành luận
án này
Tơi xin chân thành cảm ơn tới tập thể cán bộ nghiên cứu phịng Cơng nghệ tế
bào động vật - Viện CNSH - Viện Hàn Lâm KH và CN Việt Nam đã giúp đỡ, tạo
điều kiện thuận lợi cho tơi trong q trình thực hiện nghiên cứu Tôi cũng xin trân
trọng cảm ơn các anh chị ở khoa Sinh hoá, khoa Vi sinh, khoa Hồi sức tích cực,
bệnh viện Thanh Nhàn, khoa Hồi sức tích cực bệnh viện Đức Giang, đặc biệt là em
Nguyễn Trọng Linh đã ln đồng hành cùng tơi trong q trình nghiên cứu
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô khoa CNSH - Học viện KH và CN,
các thầy cô trong hội đồng nghiên cứu sinh đã nhiệt tình dạy bảo và giúp đỡ tơi, cho
tơi các ý kiến q báu để sửa chữa và hồn thiện luận án này
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã ln hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất
cho tôi chuyên tâm làm việc và hồn thành luận án
Cuối cùng tơi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, các đồng nghiệp ở Khoa NôngLâm trƣờng Đại học Hoa Lƣ đã luôn động viên và giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi trong q trình học tập, nghiên cứu và cơng tác
Hà Nội, ngày

tháng
Tác giả

NCS

năm 2022


iii

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan ……………………………………………………………………

i

Lời cảm ơn………………………………………………………………………

ii

Mục lục ………………………………………………

…………

iii

Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt …………………………………………

v

Danh mục các bảng …………………………………………………… ………

vi

Danh mục các hình………………………………………………………

viii

MỞ ĐẦU…………………………………………………………………

1

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN

3

11

3

Tình hình và căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện …

1 1 1 Lịch sử phát hiện và nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện ……

3

1 1 2 Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện hiện nay ……………………………

4

1 1 3 Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện ……………………

7

12

10

Một số kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện …

1 2 1 Cấy máu và xét nghiệm sinh hố ………………………………………

10

122

Kỹ thuật xác định sự có mặt của DNA …………… …………………………

11

13

Tình hình nghiên cứu ứng dụng multiplex realtime PCR xác định
các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện ……………………………

15

1 3 1 Trên thế giới ……………………………………………………………

15

1 3 2 Ở Việt Nam ……………………………………………………………

17

14

19

Kháng sinh và kháng kháng sinh ở vi khuẩn …………… …………

1 4 1 Kháng sinh và cơ chế tác động …………………………………………

19

1 4 2 Kháng kháng sinh của vi khuẩn và cơ chế kháng kháng sinh …………

21

1 4 3 Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn trên thế giới và ở Việt Nam…

28

CHƢƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

35

21

Đối tƣợng nghiên cứu ……………………………………………

35

2 1 1 Các mẫu bệnh phẩm…… ……………………………………………

35

2 1 2 Cách tính cỡ mẫu nghiên cứu …………………………………………

35

Nguyên vật liệu nghiên cứu …………………………………………

36

2 2 1 Nguyên vật liệu …………………………………………………………

36

22


iv

2 2 2 Các thiết bị ……………………………………………………………

36

2 2 3 Hoá chất………………………………………………………………

36

23

Phƣơng pháp nghiên cứu …………………………………… ……

38

2 3 1 Nhóm phƣơng pháp vi sinh truyền thống ……………………………

38

2 3 2 Phƣơng pháp sinh học phân tử …………………………………………

39

2 3 3 Phƣơng pháp kiểm tra độ nhậy, độ đặc hiệu, độ ổn định, ngƣỡng phát
hiện của bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR ………………………
2 3 4 Phƣơng pháp thống kê …………………………………………………
24

Đạo đức nghiên cứu ……………………………………………………

CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………………
31

Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật gây nhiễm khuẩn bệnh viện …

46
48
48
50
50

3 1 1 Kết quả phân bố xét nghiệm theo loại bệnh phẩm …………………

51

3 1 2 Tỉ lệ các loại vi sinh vật phân lập đƣợc …………………………………

52

3 1 3 Kết quả phân tích gen 16S rARN từ các chủng vi khuẩn phân lập ……

53

32

Kết quả phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR xác định

đồng thời 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện ………
3 2 1 Kết quả lựa chọn, phân tích trình tự gen đích …………………………

55

3 2 2 Kết quả thiết kế mồi và mẫu dò …………………………………………

58

3 2 3 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dị với gen đích ………

60

3 2 4 Kết quả phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn ……

71

3 2 5 Kết quả tối ƣu phản ứng realtime PCR ………… ……………………

75

3 2 6 Kết quả xác định ngƣỡng phát hiện ……………………………………

77

3 2 7 Kết quả tạo các đối chứng dƣơng …………………… …………………

78

3 2 8 Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu ………………………………

82

3 2 9 Kết quả xác định độ ổn định ……………………………………………

87

33

55

Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn nghiên cứu và gen

mã hoá beta-lactamase mở rộng của vi khuẩn E coli …………………
3 3 1 Kết quả kháng sinh đồ …………………………………………………

91

3 3 2 Kết quả xác định gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng của E coli ……

98

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………… ………

105

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

92


v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Phần viết tắt

Phần viết đầy đủ

Ac

Acinetobacter baumannii

BV

Bệnh viện

Ct

Thresold cycle (chu kì ngƣỡng)

CTX-M

Cefotaxime- Munich

DNA

Deoxyribonucleic Axit

Ec

Escherichia coli

ECDC

European Centre for Disease Control and Prevention (Trung tâm
kiểm sốt và phịng ngừa dịch bệnh Châu Âu)

ESBL

Extended-Spectrum Beta-lactamase (beta-lactamase phổ rộng)

FN

Fall Negative (âm tính giả)

FP

Fall Positive (dƣơng tính giả)

GADPH

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

HAI

Hospital Aquired- Infections

Hu

Human

I

Intermediate (trung gian)

Kp

Klebsiella pneumoniae

MRSA

Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus

MSSA

Methicillin- Susceptible Staphylococcus aureus

NK

Nhiễm khuẩn

NKBV

Nhiễm khuẩn bệnh viện

Pa

Pseudomonas aeruginosa

PCR

Polymerase Chain Reaction

S

Sensitivity (nhạy cảm)

Sa

Staphylococcus aureus

R

Resistant (đề kháng)

VSV

Vi sinh vật

WHO

World Healthy Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)


vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1 1

Tỷ lệ các tác nhân vi khuẩn gây NKBV ……………………………… 4

Bảng 1 2

Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn thƣờng gặp ………

5

Bảng 1 3

Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn có tỷ lệ cao nhất …

6

Bảng 2 1

Trình tự các cặp mồi, mẫu dị và gen đích của các chủng vi khuẩn ……

Bảng 2 2

Trình tự mồi 16S rARN và gen mã hoá ESBL ………………………

38

Bảng 2 3

Thành phần và chƣơng trình chạy phản ứng PCR …………………

42

Bảng 2 4

Thành phần phản ứng mutiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu của
mồi và mẫu dị với DNA đích …………………

Bảng 2 5

37

44

Thành phần phản ứng mutiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu của
mồi và mẫu dị với DNA đích của vi khuẩn …………………………… 45

Bảng 2 6

Thành phần phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn … 45

Bảng 2 7

Thành phần phản ứng realtime PCR trên mẫu chủng chuẩn …………

Bảng 3 1

Tỷ lệ xét nghiệm và tỷ lệ cấy dƣơng tính theo loại bệnh phẩm ……… 51

Bảng 3 2

Tỷ lệ phân lập vi sinh vật theo loại bệnh phẩm ………………………

52

Bảng 3 3

Các mồi và mẫu dò cho phản ứng realtime PCR ………………

58

Bảng 3 4

Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu của từng cặp mồi, mẫu dò với

46

DNA của vi khuẩn A baumannii, K pneumoniae và DNA ngƣời ……… 62
Bảng 3 5

Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu của từng cặp mồi, mẫu dò
với DNA của vi khuẩn S aureus, E coli, P aeruginosa………………… 64

Bảng 3 6

Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR kiểm tra
độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi, mẫu dị với DNA đích của vi khuẩn A
baumannii, K pneumoniae và gen GADPH ………………………… 66

Bảng 3 7

Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi, mẫu dò
với DNA của vi khuẩn E coli, S aureus, P aeruginosa ………………

Bảng 3 8

70

Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR trên các
chủng chuẩn A baumannii, K pneumoniae và của ngƣời (Hu) ………

73


vii

Bảng 3 9

Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR trên các

chủng chuẩn E coli, S aureus, P aeruginosa ………………………

Bảng 3 10

75

Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR ở các
nhiệt độ khác nhau ………………………………………

Bảng 3 11

76

Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR với
Master mix IDT và HQ ………………………………………………

Bảng 3 12

Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR với các
nồng độ pha loãng …………………………………………………

Bảng 3 13

77

So sánh phƣơng pháp multiplex realtime PCR và nuôi cấy theo mẫu
bệnh phẩm …………………………………………………………

Bảng 3 14

77

86

Kết quả phát hiện loại vi sinh vật bằng phƣơng pháp multiplex
realtime PCR so sánh với phƣơng pháp cấy máu ……………………

87

Bảng 3 15

Giá trị chu kì ngƣỡng của các mẫu khảo sát thời gian bảo quản

88

Bảng 3 16

Tỷ lệ kháng kháng sinh của P aeruginosa và Acinetobacter sp ……… 93

Bảng 3 17

Tỷ lệ kháng kháng sinh của E coli và K pneumonia …………………… 94

Bảng 3 18

Tỷ lệ kháng kháng sinh của S aureus ……………………………………

96

Bảng 3 19

Tính nhạy cảm kháng sinh của 5 chủng E coli …………………………

98

Bảng 3 20

Các mẫu E coli có mang gen ESBLs …………………………

100


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1 1

Định nghĩa nhiễm khuẩn bệnh viện ………………… ……………

Hình 1 2

Nhân tố liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn… 22

Hình 1 3

Cơ chế trao đổi vật chất di truyền giữa các vi sinh vật…………… 23

Hình 1 4

Cơ chế kháng thuốc phổ biến của vi khuẩn………………………

23

Hình 1 5

Bản đồ về tình trạng kháng kháng sinh trên thế giới đến năm 2050

29

Hình 2 1

Sơ đồ nghiên cứu …………………………………………………

49

Hình 3 1

Hình ảnh khuẩn lạc của các vi khuẩn trên mơi trƣờng thạch máu… 50

Hình 3 2

Hình ảnh khuẩn lạc của các vi khuẩn trên mơi trƣờng Chapman… 54

Hình 3 3

Hình ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số của các chủng S aureus,

3

A baumannii, E coli, K pneumoniae và P aeruginosa ………… 54
Hình 3 4

Hình ảnh nhân bản gen 16S rARN từ DNA tổng số của một số
chủng vi khuẩn A baumannii và P aeruginosa ………………… 55

Hình 3 5

Hình ảnh nhân bản gen 16S rARN từ DNA tổng số của một số
chủng vi khuẩn E coli, S aureus, K pneumoniae ………………

Hình 3 6

55

Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các
chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tƣơng ứng ……………… 56

Hình 3 7

Kết quả PCR nhân bản gen bla

OXA

-51 like của A baumannii,

gyrB của P aerruginossa, gen YccT của E coli, gen Nuc của S
aureus và gen Cyt của K pneumoniae ……………………………… 57
Hình 3 8

Biểu đồ khuếch đại DNA của vi khuẩn (A): A baumannii, (B):
Klebsiella pneumoniae và (C): GADPH của ngƣời ……………… 61

Hình 3 9

Biểu đồ khuếch đại DNA của vi khuẩn (A): S aureus, (B): E coli,
(C): P aeruginosa ………………………………………………… 63

Hình 3 10 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hốn hợp mồi và mẫu dò với
DNA đích của vi khuẩn: ống đối chứng khơng có DNA ………
Hình 3 11 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dị với
DNA đích vi khuẩn (A): A baumannii, (B), K pneumoniae và (C)
DNA ngƣời …………………………………………………

66

67


ix

Hình 3 12 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dị với
DNA đích của vi khuẩn: ống có hốn hợp các DNA đích ………… 68
Hình 3 13 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dị với
DNA đích của vi khuẩn ống khơng có đối chứng ………………… 68
Hình 3 14 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dị với
DNA đích của vi khuẩn …………………………………………

69

Hình 3 15 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dị với
DNA đích của vi khuẩn ống có hỗn hợp các DNA đích ………

70

Hình 3 16 Biểu đồ khuếch đại DNA của các chủng chuẩn (A): A baumannii,
(B): K pneumoniae và (C): GADPH của ngƣời …

72

Hình 3 17 Biểu đồ khuếch đại DNA của các chủng (A): E coli, (B): S
aureus và P aeruginosa

…………………………………

74

Hình 3 18 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản gen Cyt của chủng K
pneumoniae ……………………………………………………… 78
Hình 3 19 Kết quả biến nạp vector pCR2 1 (đã gắn sản phẩm PCR) vào tế
bào E coli chủng DH5α ………………………………………

79

Hình 3 20 Kết quả PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi KpCytF/R ……… 80
Hình 3 21 Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp mang gen Cyt ………………… 80
Hình 3 22 Biểu đồ khuếch đại DNA của một số chủng chuẩn K pneumoniae

83

Hình 3 24 Biểu đồ khuếch đại DNA của các mẫu đối chứng dƣơng là các chủng
vi khuẩn S aureus, P aeruginosa, E coli sau thời gian bảo quản…… 89
Hình 3 25 Biểu đồ khuếch đại DNA của các mẫu đối chứng dƣơng là các
chủng A baumannii, K pneumoniae, Hu sau thời gian bảo quản… 90
Hình 3 26 Hình ảnh kiểm tra khả năng kháng một số loại kháng sinh của 5 vi
khuẩn A baumannii, K pneumoniae, P aeruginosa, E coli và S
aureus………………………………………………………………
Hình 3 27 Hình ảnh điện di sản phấm PCR xác định gen SHV, TEM ……

99

Hình 3 28 Hình ảnh điện di sản phấm PCR xác định gen CTX-M …………

99

92


1

MỞ ĐẦU

Nhiễm khuẩn bệnh viện (HospitalAquiredInfections-HAI) (NKBV) là
một trong những thách thức và mối quan tâm hàng đầu trong công tác chăm sóc
sức khoẻ tại Việt Nam cũng nhƣ trên toàn thế giới NKBV làm tăng tỉ lệ tử
vong, kéo dài thời gian nằm viện (7-15 ngày), tăng việc sử dụng kháng sinh dẫn
tới làm tăng chi phí điều trị cao gấp 2-4 lần Ngồi ra NKBV cịn góp phần gây
ra tình trạng kháng thuốc của một số vi khuẩn và làm gia tăng việc xuất hiện
những tác nhân gây bệnh mới
Tác nhân gây NKBV đã có nhiều thay đổi trong vài thập kỷ qua Các vi

khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện có thể là các vi khuẩn Gram dƣơng và các
trực khuẩn Gram âm, nấm, kí sinh trùng Trong đó NKBV do trực khuẩn Gram
âm đa kháng thuốc kháng sinh đã và đang trở thành một tai họa thực sự cho các
bệnh viện Nuôi cấy vi sinh vật là phƣơng pháp phổ biến và là tiêu chuẩn vàng
hiện nay để phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong máu và dịch cơ thể, tuy nhiên
phƣơng pháp này còn nhiều hạn chế nhƣ: 1) đòi hỏi nhiều thời gian (1-5 ngày)
tùy thuộc vi sinh vật gây bệnh; 2) kết quả cấy máu âm tính cũng khơng loại trừ
đƣợc nhiễm khuẩn bệnh viện; 3) có thể khơng thể hiện đầy đủ cộng đồng vi
sinh vật trong vết thƣơng Việc phát hiện DNA của vi khuẩn trong mẫu bệnh
phẩm của bệnh nhân đƣợc cho là phƣơng pháp có độ nhạy và chính xác cao,
thời gian phát hiện nhanh, có ý nghĩa lớn trong chẩn đốn nhiễm khuẩn Trong
những năm gần đây có một số cơng trình nghiên cứu sử dụng bộ sinh phẩm do
nƣớc ngoài sản xuất để phát hiện vi sinh vật trong máu và dịch cơ thể đã thu
đƣợc nhiều thành cơng, tuy nhiên chế tạo bộ sinh phẩm để có thể chủ động
trong chẩn đốn, giảm chi phí, phù hợp với hệ vi khuẩn gây bệnh ở Việt Nam là
yêu cầu đối với ngành y tế Với mong muốn phát triển một bộ sinh phẩm
multiplex realtime PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để xác định nhanh
chóng các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện, giúp bác sĩ điều trị sớm đƣa ra
đƣợc quyết định phù hợp nhằm tăng cơ hội cứu sống bệnh nhân, giảm chi phí


2

điều trị cũng nhƣ tác dụng phụ chúng tôi thực hiện luận án: “Nghiên cứu phát
triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hi ện một số tác nhân gây
nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh” với 3 mục tiêu
sau:
1 Phân lập và định danh đƣợc các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện
phổ biến thƣờng gặp
2 Phát triển thành công bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện 5 tác

nhân vi khuẩn thƣờng gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: Acinetobacter baumannii,
Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus
aureus
3 Xác định tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc và
khảo sát sự tồn tại gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng (Extended- Spectrum Betalactamase: ESBL) ở vi khuẩn Escherichia coli
Nội dung nghiên cứu:
1 Nuôi cấy, phân lập các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện từ các
mẫu bệnh phẩm
2 Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện 5 tác
nhân vi khuẩn thƣờng gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: A baumannii, K pneumoniae,
E coli, P aeruginosa và S aureus
3 Xác định khả năng kháng kháng sinh của 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn
bệnh viện và gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng ở vi khuẩn E coli
Tính mới của luận án
1 Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đề xuất quy trình phát triển bộ sinh phẩm
multiplex realtime PCR để phát hiện đồng thời 5 vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện
phổ biến: A baumannii, K pneumoniae, E coli, P aeruginosa và S aureus
2 Luận án đã cung cấp các thông tin mới về tỷ lệ phân lập và tỷ lệ kháng một số
loại kháng sinh của 5 vi khuẩn: A baumannii, K pneumoniae, E coli, P aeruginosa và
S aureus và gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng ở vi khuẩn E coli tại bệnh viện
Thanh Nhàn


3

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
1 1 Tình hình và căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện
1 1 1 Lịch sử phát hiện và nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện
Trong thời kỳ trung cổ, các bệnh viện đã đƣợc thành lập để điều trị các nạn
nhân bệnh dịch hạch và sau đó là các bệnh viện với các nhân viên y tế đang phục vụ

xã hội nhƣ hiện nay Năm 1869, Sir James Young Simpon đã thực hiện nghiên cứu
dịch tễ học bệnh viện với hơn 4000 bệnh nhân ở Scotlen và Anh, và ông nhận thấy
tỷ lệ tử vong cao hơn ở những bệnh nhân đã đƣợc ở lại trong bệnh viện điều trị hậu
phẫu Ông đã sử dụng thuật ngữ “hospitalism” cho sự rủi ro liên quan đến chăm sóc
tại bệnh viện Sau nhiều năm các cơng trình nghiên cứu chuyên sâu của các tác giả
Oliver Wendell Holmes, Ignaz Philipp Semmelweis, Louis Pasteur, Josheph Lister
và Rober Koch đã xác định đƣợc các yếu tố nguy cơ liên quan đến nhiễm khuẩn
bệnh viện và giới thiệu các nguyên tắc khắc phục chính nhƣ rửa tay và khử trùng
các dụng cụ trong phẫu thuật giảm sự lan truyền của bệnh và tử vong [1]
Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), nhiễm khuẩn bệnh viện đƣợc định nghĩa
nhƣ sau: “Nhiễm khuẩn bệnh viện là những nhiễm khuẩn mắc phải trong thời gian
người bệnh điều trị tại bệnh viện và nhiễm khuẩn này không hiện diện cũng như
không nằm trong giai đoạn ủ bệnh tại thời điểm nhập viện Nhiễm khuẩn thường
xuất hiện sau 48 giờ kể từ khi người bệnh nhập viện” [2] (Hình 1 1)

Hình 1 1 Thời gian xảy ra nhiễm khuẩn bệnh viện [2]
Để chẩn đoán NKBV ngƣời ta thƣờng dựa vào định nghĩa và tiêu chuẩn chẩn
đốn cho từng vị trí NKBV Ví dụ nhiễm khuẩn vết mổ sau phẫu thuật, nhiễm khuẩn

máu có liên quan đến dụng cụ đặt trong lòng mạch, nhiễm khuẩn đƣờng tiết
niệu Dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng và sinh học các nhà khoa học đã xác định có


4

khoảng 50 loại nhiễm khuẩn bệnh viện khác nhau có thể xảy ra tại bệnh viện
NKBV dẫn đến nhiều hệ luỵ cho ngƣời bệnh và hệ thống y tế nhƣ tăng biến
chứng và tử vong cho ngƣời bệnh, kéo dài thời gian nằm viện trung bình từ 7 đến
15 ngày, tăng sử dụng kháng sinh dẫn đến tăng sự kháng thuốc của vi sinh vật và
tăng chi phí điều trị [3], [4]

1 1 2 Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện hiện nay
1 1 2 1 Trên thế giới
Tại Châu Âu (2016-2017), tỷ lệ NKBV của khu vực là 6,3% trong đó các
nhiễm khuẩn (NK) thƣờng gặp nhất là: nhiễm khuẩn hơ hấp (41,8%), nhiễm khuẩn
tiêu hố (20,8%), nhiễm khuẩn tiết niệu (18,4%), tiếp đến là nhiễm khuẩn sau khi
phẫu thuật, nhiễm khuẩn da và mô mềm và một số nhiễm khuẩn khác [5], [6]
Theo báo cáo của Trung tâm kiểm sốt và phịng ngừa bệnh tật Châu Âu
(ECDC), tỷ lệ các vi khuẩn gây NKBV (2017) tại một số nƣớc Châu Âu và tỷ lệ
chung cho cả khu vực [7] thể hiện trên Bảng 1 1
Bảng 1 1 Tỷ lệ các tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện [7]
Vi khuẩn

Bỉ (%)

P aeruginosa

17,1

Pháp (%)

Ý (%)

UK (%)

Châu Âu (%)

23,1

19,4

7,2

19,9

S aureus

12,2

18,0

20,1

30,6

18,5

K pneumoniae

13,4

11,5

17,6

9,0

15,2

E coli

20,7

12,2

9,7

18,9

13,5

0

2,7

14,7

1,8

4,5

A baumannii

Nghiên cứu tại bệnh viện Đại học Truyễn Nhiễm và bệnh Nhiệt đới Serbia,
(từ 7/2016 đến 7/2018), tỷ lệ các loại vi khuẩn gây NKBV K pneumoniae (14%), A
baumannii (13,2%), P aeruginosa (10,8%), E coli (1,2%), S aureus (1,6%) [8]
Các nghiên cứu tại một số quốc gia về tỷ lệ mắc NKBV và loại NK hay gặp:


5

Bảng 1 2 Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn thƣờng gặp tại một số
quốc gia
Năm

2013

Tên quốc gia

BV Đại học Martin-

Tỷ lệ NKBV

NKBV có tỷ lệ cao nhất
NK tiết niệu: 24,3%

5,2%

Slovakia [9]

NK hô hấp: 22,7%
NK phẫu thuật: 22,7%
Viêm phổi bệnh viện

2015

Mỹ [10]

3,2%

NK đƣờng tiêu hoá,

NK tại chỗ phẫu thuật

2016

Ấn Độ [11]

3,7%
NK tiết niệu 31,9%

2017

Canada [12]

7,3%

Viêm phổi: 23,4%
NK vết mổ: 20,2%
NK máu: 15,2%
NK vết mổ: 29,0%
NK đƣờng hô hấp dƣới

2017

Swizeland [13]

4,5%

18,2%
NK đƣờng tiết niệu:14,9%
NK máu:12,8%

2016-2018

BV Đại học truyền

NK tiết niệu: 36,3%

nhiễm và bệnh Nhiệt

NK máu: 19,6%

đới Serbia [8]

Viêm phổi:15,7%

1 1 2 2 Tại Việt Nam
Tình hình NK tại Việt Nam chƣa đƣợc xác định đầy đủ, ít có tài liệu và giám
sát về NKBV đƣợc công bố
Nghiên cứu của bệnh viện (BV) Bệnh Nhiệt đới Trung ƣơng và VINAREX
(2013) khảo sát trên 3671 bệnh nhân của 15 khoa Hồi sức tích cực tại 15 BV của 3


6

miền cho thấy tỷ lệ NKBV là 27,3% và tỷ lệ các loại vi khuẩn thƣờng gặp: A
baumannii (31%), P aeruginosa (18%), K pneumoniae (12%) và S aureus (6%)
[14]
Các nghiên cứu gần đây của các BV về tỷ lệ NKBV và NK có tỷ lệ cao nhất:
Bảng 1 3 Tỷ lệ NKBV và loại nhiễm khuẩn có tỷ lệ cao nhất
Năm

Khu vực

Tỷ lệ

NKBV có tỷ lệ cao

NKBV

nhất

2015-2016

BV Sản nhi- Ninh Bình [15]

7,17%

NK hơ hấp: 56,73%,

2016

Đại học Y dƣợc Huế [16]

5,2%

NK Vết mổ: 60%

2106

BV TW Quân Đội 108 [17]

3,86%

NK vết mổ: 37,25%

2016-2017

BV Đa Khoa Ninh Thuận [18]

2,4%

NK hô hấp: 40,6%

2016-2017

BV Đa Khoa Nông Nghiệp [19]

6,94%

NK hô hấp: 55,55%

2017

BV Đa Khoa Vĩnh Phúc [20]

2,7%

NK hô hấp: 42%

Tỷ lệ NKBV ở Việt Nam tƣơng đƣơng với các kết quả nghiên cứu của WHO

với qui mô vùng, quốc gia và liên quốc gia, tỉ lệ này dao động từ 2,7% đến 10%
ngƣời bệnh nhập viện, trong đó các vi khuẩn gây NKBV chủ yếu là các trực khuẩn
Gram âm với tỷ lệ gần 70% với các vi khuẩn: A baumannii, P aeruginosa, K
pneumoniae, E coli, các vi khuẩn Gram dƣơng chiếm khoảng 30% chủ yếu là S
aureus
Một số nghiên cứu tại các bệnh viện về tỷ lệ các loại vi khuẩn gây NKBV:


7

Bảng 1 4 Tỷ lệ vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại một số bệnh viện
Tên các bệnh viện

Ac

Pa

Kp

Ec

Sa

BV Chợ Rẫy-2014 [21]

59,3

12

12

3,3

5,8

BV Bạch Mai-2015[22]

21,4

14,3

34,8

14,3

/

BV Đa khoa Phú Thọ-2016 [23]

21,5

14,45

7,1

7,1

14,4

BV Sản- Nhi Ninh Bình (2015-2016) [15]

7,7

20,2

25

13,5

22,1

BV Đa khoa Nơng nghiệp (2016-2017) [19]

/

13,73

11,13

25,15

24,07

Ac: Acinetobacter baumannii, Pa: Pseudomonas aeruginosa, Kp: Klebsiella pneumoniae, Ec:
Escherichia coli, Sa: Staphylococcus aureus

1 1 3 Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện
Các tác nhân gây NKBV biến đổi theo nhóm cộng đồng dân cƣ, các chuyên
khoa điều trị khác nhau và có sự khác nhau giữa các quốc gia
1 1 3 1 Tụ cầu Staphylococcus aureus

S aureus là vi khuẩn Gram dƣơng hàng đầu gây nhiều bệnh khác nhau từ
bệnh nhẹ về da, nhiễm trùng đa dạng ở phổi, xƣơng, tim, nhiễm khuẩn huyết và
đóng vai trò quan trọng trong NKBV liên quan đến truyền dịch, ống thở, nhiễm
khuẩn vết bỏng và nhiễm khuẩn vết mổ S aureus kháng methicillin (MRSA) và S
aureus mẫn cảm với methicillin (MSSA) là nguyên nhân gây NKBV dẫn tới điều trị
khó khăn [24]
Trong thập kỷ qua các trƣờng hợp nhiễm MRSA ngày càng gia tăng, MRSA
gây NKBV và NK mắc phải từ cộng đồng bao gồm viêm nội mạc tim, viêm tuỷ
xƣơng, hội chứng sốc nhiễm độc, viêm phổi, ngộ độc thực phẩm và nhọt độc [25]
MRSA kháng methicillin ở tụ cầu qua trung gian PBP2a, đây là một loại protein
đƣợc gọi là protein liên kết penicillin (78 kDa) Protein này có ái lực thấp với nhóm
kháng sinh β-lactam Gen femA mã hố cho protein PBP2a kháng methicillin, do đó
gen này đƣợc sử dụng nhƣ một marker phân tử phát hiện MRSA [26], [27]
1 1 3 2 Vi khuẩn Acinetobacter baumannii
A baumannii là cầu trực khuẩn, Gram âm, hiếu khí, không lên men glucose,


8

đƣợc tìm thấy phổ biến trong đất, nƣớc và mơi trƣờng A baumannii có khả năng
thích ứng với điều kiện và môi trƣờng sống đa dạng, tồn tại lâu trong môi trƣờng
bệnh viện, đặc biệt trên những dụng cụ y tế Nhờ khả năng tạo màng sinh học
(biofilm) với tính bám dính cao, vi khuẩn A baumannii có thể gắn chặt vào bề mặt
Loài này đƣợc chỉ ra là nguyên nhân gây các loại nhiễm trùng khác nhau ở bệnh
viện bao gồm: nhiễm trùng do viêm phổi, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đƣờng tiết
niệu [28]
Theo các cơng trình cơng bố gần đây A baumannii đã và đang trở thành vi
khuẩn siêu kháng thuốc, nổi lên nhƣ tác nhân hàng đầu gây NKBV tại các bệnh viện
trên thế giới Trƣớc đây, carbapenem thƣờng đƣợc sử dụng để điều trị các bệnh
nhiễm khuẩn do A baumannii, đặc biệt đối với các chủng kháng thuốc nhƣng hiện

nay khơng cịn hiệu quả bởi sự xuất hiện của các chủng đa kháng hoặc đa kháng
thuốc phổ rộng Nhiều cơ chế kháng liên quan đến tính kháng carbapenem ở A
baumannii nhƣ sản xuất carbapenemase, bất hoạt kháng sinh, các protein màng bị
biến đổi, tăng biểu hiện các bơm màng hay sự mất các kênh màng, thay đổi tính
thấm của màng Tính kháng với carbapenem ở A baumannii liên quan chủ yếu tới
sự biểu hiện của β-lactamase, carbapenemase; trong khi những cơ chế khác chỉ
đóng vai trị thứ yếu Bên cạnh đó, carbapenemase phổ biến nhất ở A baumannii
là β-lactamase mã hoá bởi bla-OXA Trong một nghiên cứu của Gadsby NJ và
cộng sự (2015) đã sử dụng gen bla-OXA-51 like để phát hiện A baumannii gây
nhiễm trùng đƣờng hô hấp dƣới [29]
1 1 3 3 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae
K pneumoniae là vi khuẩn Gram âm, bắt màu đậm ở hai cực, vi khuẩn có
nhiều hình thể, có khi nhƣ cầu khuẩn, có khi lại hình dài, có vỏ, không di động,
không sinh nha bào Dễ mọc trên môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng nhƣ thạch dinh
dƣỡng hay thạch máu, khuẩn lạc lầy nhầy, màu xám
K pneumoniae thƣờng gây bệnh nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp, một loại vi
khuẩn phát triển rất tốt trong đƣờng hô hấp của ngƣời, là mầm “bệnh cơ hội” chiếm
10% tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện, là nguyên nhân phổ biến trong nhiễm khuẩn


9

đƣờng tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch
đồng thời là tác nhân gây bệnh chủ yếu gây nhiễm khuẩn cộng đồng [30]
Mối nguy hiểm của K pneumoniae trong các cơ sở y tế đang gia tăng do khả
năng kháng kháng sinh phổ rộng beta-lactam của chúng Các nghiên cứu chỉ ra rằng
K pneumoniae kháng kháng sinh phổ rộng có xu hƣớng đa kháng thuốc dẫn đến
khả năng thất bại trong điều trị [31] K pneumoniae đã kháng lại tất cả các loại
kháng sinh bao gồm cả các kháng sinh mạnh nhất hiện nay nhƣ cephalosporin và
carbapenem Gadsby NJ và cộng sự (2016) trong một nghiên cứu đã chọn gen

citrate synthase (gtlA) để phát hiện vi khuẩn này do gây nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp
dƣới [32]
1 1 3 4 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
P aeruginosa (Trực khuẩn mủ xanh) là trực khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng riêng
lẻ, thành đơi, có khi xếp thành chuỗi, di động nhờ một lông duy nhất ở một cực, có
pili, khơng có bào tử, là vi khuẩn hiếu khí, phát triển tốt trên các môi trƣờng thông
thƣờng, nhiệt độ 30 – 37oC, có thể mọc ở 42oC, pH: 7,0 - 7,2
P aeruginosa phát hiện thấy có mặt ở nhiều nơi trong bệnh viện nhƣ: nền
nhà, giƣờng, chăn, đệm, tay nhân viên y tế, dụng cụ y tế Loài này đƣợc biết thuộc
nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội thƣờng gây nhiễm khuẩn có mủ ở vết thƣơng, vết
mổ, vết bỏng, từ vết thƣơng vi khuẩn có thể vào máu gây nhiễm khuẩn huyết và các
bệnh nhân nhiễm khuẩn do P aeruginosa thƣờng gặp nhiều ở các khoa Hồi sức cấp
cứu, khoa Bỏng, khoa Tiết niệu, khoa Chăm sóc bệnh nhân sau phẫu thuật P
aeruginosa cũng là một trong những vi khuẩn kháng kháng sinh mạnh nhất hiện
nay, cũng trong cùng một nghiên cứu Gadsby NJ và cộng sự (2016) đã chọn gen
mục tiêu là DNA gyrase subunit B (gyrB) để phát hiện P aeruginosa gây nhiễm
khuẩn đƣờng hô hấp dƣới, bởi vì gen này có tỷ lệ phát hiện cao hơn và đặc hiệu
[32]
1 1 3 5 Vi khuẩn E coli
E coli là vi khuẩn Gram âm phổ biến nhất gây nhiễm khuẩn bệnh viện và
chúng đƣợc tìm thấy với tần suất cao ở nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp và nhiễm khuẩn


10

đƣờng tiết niệu Cả hai loài E coli và P aeruginosa đều là các tác nhân gây nhiễm
khuẩn bệnh viện nghiêm trọng ở các đơn vị chăm sóc y tế và nhiễm khuẩn cộng
đồng [33]
Nhiều nghiên cứu trong nƣớc và quốc tế đã khẳng định vi khuẩn E coli gây
nhiễm khuẩn chủ yếu trên đƣờng tiết niệu, sinh dục của phụ nữ và nhiễm khuẩn vết

mổ [34]
Họ vi khuẩn đƣờng ruột (Enterobacteriaceae) thƣờng cƣ trú trên đƣờng tiêu
hóa của ngƣời và động vật đang là mối quan tâm lớn trong NKBV do có khả năng
kháng cao với các nhóm kháng sinh amiglycoside, β-lactam và có khả năng truyền
tính kháng qua plasmid Gadsby NJ và cộng sự (2016) đã sử dụng gen YccT để phát
hiện sự có mặt của vi khuẩn E coli gây nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp dƣới [32]
1 2 Một số kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện
1 2 1 Cấy máu và xét nghiệm sinh hố
Phƣơng pháp này dựa vào việc ni cấy một mẫu máu trên mơi trƣờng giầu
dinh dƣỡng sau đó nhận diện và kiểm tra tính mẫn cảm của các tác nhân gây bệnh
sử dụng các xét nghiệm hóa sinh tiêu chuẩn Cấy máu hiện đang đƣợc cho là tiêu
chuẩn vàng để chẩn đoán mầm bệnh trong nhiễm khuẩn bệnh viện Quy trình cấy
máu đƣợc thực hiện trong các hệ thống khép kín có tích hợp hệ thống đo liên tục
các hằng số hố lý Sự có mặt của vi sinh vật đƣợc chỉ thị một cách gián tiếp thông
qua các tham số hoá lý nhƣ độ đục, sự chuyển màu của chai nuôi cấy, sự thay đổi áp
suất trong bình ni cấy hay sự biến đổi nồng độ CO2 [35] Theo các hƣớng dẫn
mới nhất của các hiệp hội nghề y quốc tế có uy tín thì lƣợng máu lấy ra phải đảm
bảo đủ cho 2 quy trình cấy máu chẩn đốn vi sinh vật hiếu khí và kị khí với thể tích
mẫu bệnh phẩm cho mỗi quy trình cấy máu là 20-30 ml [36] Đây là một khó khăn
khi phải tiến hành lấy một lƣợng máu lớn từ các bệnh nhân sơ sinh Một hạn chế
khác của cấy máu đó là phải tiến hành ni cấy ngay khi có bệnh phẩm nhằm tránh
hiện tƣợng dƣơng tính giả do tạp nhiễm vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm đƣợc
lƣu giữ lâu Đặc biệt, quy trình thực hiện cấy máu thƣờng kéo dài từ 48-72 giờ mới
có kết quả vì thế để khắc phục tình trạng nhiễm khuẩn bệnh nhân thƣờng đƣợc điều


11

trị trƣớc bằng kháng sinh phổ rộng nên gây ảnh hƣởng không nhỏ đến hiệu quả điều
trị cũng nhƣ làm tăng tính kháng kháng sinh của vi sinh vật gây bệnh ở ngƣời bệnh

Kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ từ 14,5% đến 25% bệnh nhân đƣợc xác định
nguyên nhân gây nhiễm khuẩn huyết bằng cấy máu [37], [38]
1 2 2 Kỹ thuật xác định sự có mặt của DNA
Việc phát hiện sự có mặt DNA của vi khuẩn trong bệnh phẩm của bệnh
nhân đƣợc cho là một phƣơng pháp có độ nhậy cao, thực hiện nhanh, có giá trị hỗ
trợ cho cấy máu để chẩn đoán nhiễm khuẩn Các quy trình chẩn đốn NKBV dựa
trên sự có mặt của DNA vi khuẩn thƣờng hƣớng tới việc phát hiện các đoạn DNA
đặc trƣng của loài nhƣ các đoạn riboxom 16S, 5S, 23S, các gen đặc hiệu của vi
khuẩn [39]
1 2 2 1 Kỹ thuật khuếch đại DNA (Polymerase Chain Reaction -PCR)
PCR là một kỹ thuật cho phép khuếch đại các trình tự DNA đặc hiệu Mặc dù
kỹ thuật đƣợc phát minh vào năm 1985 bởi nhà hoá sinh học ngƣời Mỹ Karry
Mullis và đựơc phát triển bởi Saiki và cộng sự nhƣng nguyên lý của phản ứng đã
đƣợc mô tả trƣớc đó hàng thập kỷ bởi Khorana và đồng nghiệp [40] Kỹ thuật đã
đƣợc ứng dụng rộng rãi rất nhiều về lĩnh vực hình sự, mơ bệnh học, chấn đốn trƣớc
sinh và chẩn đoán các mầm bệnh Kỹ thuật thƣờng đƣợc áp dụng nhất cho các phát
hiện của mầm bệnh từ cấy máu dƣơng tính [41]
Hỗ trợ cho phƣơng pháp nuôi cấy, phƣơng pháp PCR đã đƣợc sử dụng để
phát hiện vi khuẩn trong máu [42], dịch xƣơng khớp [43], dịch não [44], mô tim
[45] và các mẫu sinh thiết mô vết thƣơng [46]
1 2 2 2 Kỹ thuật multiplex PCR
PCR là một trong những kỹ thuật phổ biến hiện nay trong nghiên cứu và
đƣợc sử dụng rộng rãi trong chẩn đốn Tuy nhiên PCR đơn mồi có nhƣợc điểm là
chỉ thực hiện đƣợc phản ứng riêng lẻ, chỉ phát hiện đƣợc một tác nhân vi khuẩn gây
bệnh do đó sẽ mất rất nhiều thời gian để khảo sát nhiều mầm bệnh kéo theo giá
thành rất cao Vì vậy để tăng cƣờng khả năng chẩn đoán và bổ sung những hạn chế
của PCR, Chamberlain và cộng sự đã mô tả và phát triển kỹ thuật multiplex PCR


12

vào năm 1988 [47]
Các xét nghiệm multiplex PCR cho phép phát hiện nhanh chóng các tác nhân
gây bệnh trực tiếp từ máu Multiplex PCR khuếch đại nhiều DNA đích trong cùng
một mẫu tại cùng một thời điểm sử dụng một hỗn hợp mồi Kỹ thuật này thƣờng
dựa trên sự khuếch đại DNA trong vùng sao chép của vi sinh vật Đây là vùng
khơng mã hố của DNA có vị trí giữa các gen và có tính bảo thủ cao giúp phân biệt
giữa các loài vi khuẩn, nấm và các sinh vật khác
Multiplex PCR nhắm mục tiêu tới hệ gen của nhiều tác nhân gây bệnh khác
nhau liên quan tới nhiễm khuẩn bệnh viện Phƣơng pháp này có độ nhậy cao, chính
xác, phát hiện đƣợc nhiều tác nhân gây bệnh trong khoảng thời gian ngắn
1 2 2 3 Kỹ thuật multiplex realtime PCR
Kỹ thuật multiplex realtime PCR cho phép phát hiện nhanh và định lƣợng
sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng
huỳnh quang trong đó sự gia tăng về số lƣợng DNA tƣơng ứng với sự tăng lên của
tín hiệu huỳnh quang Tín hiệu huỳnh quang đo đƣợc phản ánh số lƣợng sản phẩm
đƣợc khuếch đại trong mỗi chu kỳ Tuỳ thuộc vào số lƣợng bản DNA đích ban đầu
có trong ống phản ứng mà giá trị Ct (chu kỳ ngƣỡng) của các mẫu là khác nhau
Dựa vào các đặc điểm này có thể xác định số bản sao DNA đích có trong mẫu
nghiên cứu dựa trên mẫu chuẩn đã biết rõ số lƣợng DNA đích ban đầu
Phƣơng pháp realtime PCR nhanh hơn so với PCR truyền thống và không
cần thao tác sau khuếch đại cho việc xác định vi khuẩn Áp dụng các phƣơng pháp
phân tử này đến nay đã đƣợc dùng trong việc phát hiện các loài vi khuẩn cụ thể từ
các mô nhiễm trùng nhƣ viêm màng não do vi khuẩn Đối với các vi khuẩn gây
NKBV đã có rất nhiều nghiên cứu sử dụng realtime PCR để xác định các đối tƣợng
này [48], [49]
Trong phản ứng realtime PCR, ngƣời ta thƣờng sử dụng các lại thuốc nhuộm
liên kết DNA sợi đôi (SYBR Green I) để phát huỳnh quang và các mẫu dị hoặc mồi
đặc hiệu trình tự đƣợc đánh dấu huỳnh quang (Taqman PCR)
Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) đặc biệt đƣợc gắn với một module phát tín

13

hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra Tín hiệu
huỳnh quang đo đƣợc phản ánh số lƣợng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ
Các bƣớc tiến hành để phát triển một thí nghiệm multiplex realtime PCR
 Thiết kế trình tự mồi và mẫu dò
Để thiết kế một phản ứng multiplex Taqman, trƣớc hết cần thiết kế từng thí
nghiệm Taqman đơn
Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm):
Thiết kế tất cả các mồi với nhiệt độ Tm xấp xỉ nhau (55-60oC), và tất cả các
mẫu dò với nhiệt độ Tm xấp xỉ nhau (khoảng 5-10oC cao hơn mồi) Điều này quan
trọng để đảm bảo rằng các bộ mồi và mẫu dò khác nhau khơng bổ sung lẫn nhau bởi
vì tất cả chúng đều hiện diện trong cùng một phản ứng
Chiều dài mồi nên thiết kế để không dài quá 30 nucleotide, tỷ lệ GC trong mẫu
dò khoảng 30%-80% với C nhiều hơn G
Chương trình luân nhiệt realtime PCR dùng mồi Taqman thƣờng chỉ có hai
giai đoạn nhiệt độ là: Biến tính 94-95oC trong 15-30 giây; giai đoạn vừa bắt cặp vừa kéo
dài ở 60oC trong 30-60 giây và thiết bị realtime sẽ hoạt động ở giai đoạn này
Ở giai đoạn nhiệt độ 60oC thì mồi Taqman sẽ bắt cặp sợi đích trƣớc vì đây
là nhiệt độ bắt cặp tốt nhất của mồi Taqman (thấp hơn Tm của mồi Taqman là
65oC-70oC, nhƣng bằng hay cao hơn Tm của mồi là 55oC-60oC) rồi sau đó mồi
mới bắt cặp vào Chính nhờ vậy mà khi mồi Taqman tổng hợp sợi bổ sung,
enzyme này mới có cơ hội thủy giải đƣợc mồi Taqman cản đầu nó Nếu mồi bắt
cặp trƣớc vào sợi đích thì sẽ khơng có cơ hội để mồi Taqman bắt cặp vào sợi
đích và nhƣ vậy thì mồi Taqman sẽ khơng thể bị thủy giải khi enzyme Taq
polymerase tổng hợp sợi bổ sung Do đó nên sử dụng phần mềm thƣơng mại ví
dụ nhƣ Beacon Designer để đơn giản hoá việc thiết kế cả bộ mồi và mẫu dò cho
phản ứng multiplex [50]

 Lựa chọn chất phát và hấp thụ huỳnh quang cho phản ứng multiplex
Phản ứng multiplex realtime PCR cần sử dụng các chất phát huỳnh quang
khác nhau cho từng phản ứng khuếch đại riêng biệt Để phân biệt từng phản ứng,


14

chọn chất phát huỳnh quang với phổ kích thích cận nhau thấp nhất Chất huỳnh
quang đƣợc chọn cũng cần tƣơng hợp với đầu lọc phát quang và kích thích của thiết
bị realtime PCR Dựa trên các thông số thiết bị của đơn vị để có một danh sách các
chất huỳnh quang tƣơng ứng Ví dụ đối với phản ứng 5 mục tiêu trên hệ thống iQ5
nên sử dụng FAM, HEX, Cy5, TAMRA và Texas Red [51]
Tối ƣu hóa từng phản ứng riêng lẻ trƣớc phản ứng multiplex
Bƣớc đầu tiên để tập hợp một phản ứng multiplex là tối ƣu hoá các phản ứng
riêng lẻ Xác định hiệu qủa từng phản ứng bằng cách dựng một đƣờng chuẩn sử dụng
một dãy các mẫu pha loãng Hiệu quả của phản ứng riêng lẻ cần phải từ 90-100%
 Đánh giá tính hiệu quả của phản ứng multiplex
Chạy các phản ứng singleplex và multiplex cho gen mục tiêu trên cùng một
bản mẫu và so sánh giá trị chu kì ngƣỡng Giá trị thu đƣợc từ một mục tiêu cho
trƣớc trong thí nghiệm đơn và đa mồi không đƣợc quá khác biệt Nếu giá trị chu kì
ngƣỡng từ các phản ứng đơn và đa quá khác biệt cần tối ƣu hoá lại phản ứng Điều
này có thể thực hiện bằng các thay đổi nồng độ của các thành phần phản ứng
 Tối ƣu hóa phản ứng multiplex
Nếu một phản ứng multiplex không đƣợc tối ƣu hố, sự khuếch đại của mục
tiêu có hiệu suất thấp hay số lƣợng ít có thể bị ức chế bởi mục tiêu có hiệu suất cao,
số lƣợng nhiều Điều này là do các thành phần phản ứng nhƣ DNA polymerase và
nucleotide trở nên hạn chế trong các chu kỳ cuối và sự khuếch đại của mục tiêu có
hiệu suất thấp, số lƣợng ít sẽ bị ảnh hƣởng
Ƣu điểm của phƣơng pháp multiplex realtime PCR
Multiplex realtime PCR có ƣu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép

chúng ta định lƣợng số bản sao khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao
trên một phạm vi động học lớn Các kết quả của realtime có thể là chất lƣợng (sự có mặt
hoặc khơng của trình tự đích) hoặc định lƣợng (số bản sao DNA) Realtime PCR có thể
đánh giá mà khơng cần điện di gen, thời gian thí nghiệm đƣợc rút ngắn và số lƣợng
nguyên liệu đƣợc đƣa vào qui trình tăng lên Cuối cùng, do các phản ứng đƣợc chạy và
số liệu đƣợc đánh giá trong một hệ thống kín nên các cơ hội nhiễm bẩn đƣợc giảm thiểu