ĐÀO THỊ HƯƠNG xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FENOFIBRAT TRONG bán THÀNH PHẨM VIÊN nén FENOFIBRAT BẰNG HPTLC KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

:

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO THỊ HƯƠNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG FENOFIBRAT TRONG BÁN
THÀNH PHẨM VIÊN NÉN FENOFIBRAT
BẰNG HPTLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2022


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
f
d

ĐÀO THỊ HƯƠNG

Mã sinh viên:1701239

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG FENOFIBRAT TRONG BÁN
THÀNH PHẨM VIÊN NÉN FENOFIBRAT
BẰNG HPTLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
2. ThS. Vũ Thị Thu Trang
Nơi thực hiện:
1. Bộ mơn Hóa phân tích và độc chất

HÀ NỘI - 2022


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho phép em được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất của
mình tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh – Bộ mơn Hóa phân tích và Độc chất, ThS Vũ
Thị Thu Trang - Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm, Mỹ phẩm, Thực phẩm Hà Nội.
Hai cô không chỉ tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện
nghiên cứu mà cịn đưa ra những lời khun chính xác, kịp thời và ln động viên mỗi
khi em thấy khó khăn, nản chí trong q trình thực hiện khóa luận.
Em cũng xin được cảm ơn các giảng viên, nghiên cứu viên, các anh chị kỹ thuật
viên đang công tác tại bộ mơn Hóa phân tích và Độc chất đã ln giúp đỡ em hồn thành
khóa luận này cũng như ln hỗ trợ em rất nhiệt tình trong quá trình sử dụng các dụng
cụ,thiết bị, hóa chất và dung mơi trong suốt q trình thực nghiệm.
Có thể nói rằng, qng thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp đối với bản thân
em tuy không quá dài nhưng quãng thời gian ấy đã đem lại cho em rất nhiều trải nghiệm,
nhiều cảm xúc khó có thể diễn tả bằng lời và đây chắc chắn sẽ là một quãng thời gian
mà em sẽ không bao giờ quên trong suốt hành trình tiếp theo của mình, một quãng thời
gian nhiều kỷ niệm nhất của thời sinh viên.
Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới những người thân, gia đình,
bạn bè đã luôn bên cạnh và đồng hành với em trong suốt khoảng thời gian này. Mọi
người luôn luôn là những nguồn động lực cực kỳ to lớn để em luôn kiên trì, khơng từ bỏ
giữa chừng dù cho hồn cảnh có khó khăn, trở ngại như thế nào.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 6 năm 2022
Đào Thị Hương


LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1. Tổng quan về fenofibrat .........................................................................................3
1.1.1. Cơng thức cấu tạo, tính chất lý hóa của fenofibrat ................................................3
1.1.2. Khái niệm về bệnh tăng lipid máu .........................................................................3
1.1.3. Điều trị bệnh tăng lipid máu ..................................................................................5
1.1.4. Cơ chế tác dụng của fenofibrat ..............................................................................6
1.1.5. Chỉ định của fenofibrat ..........................................................................................7
1.1.6. Đặc điểm dược động học của fenofibrat ............................................................... 7
1.1.7. Liều dùng và cách dùng .........................................................................................8
1.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................9
1.2.1. Vài nét về phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) .....................9
1.2.2. Các nghiên cứu sử dụng HPTLC để định lượng trong kiểm tra chất lượng thuốc12
1.3. Quy trình bào chế viên nén fenofibrat ................................................................ 12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................16
2.1. Nguyên liệu và thiết bị và đối tượng nghiên cứu ...............................................16
2.1.1. Máy móc và trang thiết bị ....................................................................................16
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất và dung môi .....................................................................16
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ............................................................... 16

2.2.1. Chuẩn bị các dung dịch .......................................................................................16
2.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ....................................................................................17
2.3. Thẩm định phương pháp phân tích ....................................................................18
2.3.1. Độ chọn lọc …………………………………………………………………….18


2.3.2. Độ phù hợp của hệ thống sắc ký..........................................................................18
2.3.3. Khoảng tuyến tính đường chuẩn ........................................................................18
2.3.4. Độ đúng của phương pháp ...................................................................................18
2.3.5. Độ chính xác của phương pháp ...........................................................................19
2.3.6. Xử lý số liệu ........................................................................................................19
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ......................................20
3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký .....................................................................................20
3.2. Thẩm định phương pháp phân tích ....................................................................22
3.2.1. Độ chọn lọc ..........................................................................................................22
3.2.2. Độ thích hợp hệ thống .........................................................................................23
3.2.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn .....................................................................24
3.2.4. Độ đúng của phương pháp ...................................................................................25
3.2.5. Độ chính xác của phương pháp ...........................................................................26
3.3. Ứng dụng phương pháp HPTLC vào mẫu thực ................................................28
3.3.1. Ứng dụng vào định lượng fenofibrat trong quá trình bào chế ............................. 28
3.4. Bàn luận ................................................................................................................31
3.4.1. Về quy trình xử lý mẫu ........................................................................................31
3.4.2. Về xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích .............................................32
3.4.3. Về khả năng ứng dụng trong phân tích mẫu thực………………………………34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................33
1. Kết luận ....................................................................................................................33
2. Kiến nghị ..................................................................................................................33
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
AHA
ApoA
ApoB
ApoC
ASCVD
CoA
DBD
DNA
HDL
HPLC
HPTLC
ICH
LC-MS
LDL
LP
PPARα

Tên tiếng Anh
American heart association
Apolipoprotein A
Apoprotein B
Apoprotein C
Atherosclerotic cardiovascular
disease
Coenzyme A
DNA-binding

Deoxyribonucleic acid
High density lipoprotein
High-performance liquid
chromatography
High perfromance thin layer
chromatography
International conference on
harmonization
Liquid chromatography–mass
spectrometry
Low density lipoprotein
Lipoprotein
Peroxisome proliferatoractivated receptor-alpha

PPRE

Peroxisome prolierator
responsive element

RXR
TG
TLC
VLDL

Retinoid X receptor
Triglycerid
Thin layer chromatography
Very low density lipoprotein

Tên tiếng Việt

Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ

Bệnh tim mạch vữa xơ
Miền liên kết DNA
Lipoprotein tỉ trọng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Hội nghị quốc tế về hài hịa hóa các
thủ tục đăng ký Dược phẩm sử
dụng cho con người
Sắc ký lỏng khối phổ
Lipoprotein tỉ trọng thấp
Thụ thể hoạt hóa tăng sinh
peroxisome
Yếu tố phản ứng của chất
tăng sinh peroxisome
Thụ thể của retinoid X
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Lipoprotein mật độ rất thấp


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1. Một số nghiên cứu định lượng dược chất trong chế phẩm bằng HPTLC
Bảng 3. 1. Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống HPTLC
Bảng 3. 2. Kết quả xây dựng đường chuẩn
Bảng 3. 3. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp HPTLC
Bảng 3. 4. Kết quả thẩm định độ chính xác của phương pháp HPTLC (ngày 1)
Bảng 3. 5. Kết quả thẩm định độ chính xác của phương pháp HPTLC (ngày 2)
Bảng 3. 6. Kết quả định lượng fenofibrat trong bán thành phẩm bằng HPTLC và HPLC

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của fenofibrat
Hình 1.2. Thành phần và cấu trúc của lipoprotein
Hình 1.3. Nguyên nhân gây tăng lipid máu và hình thành mảng xơ vữa động mạch
Hình 1.4. Cơ chế tác dụng của fenofibrat
Hình 1.5. Cấu tạo hệ thống HPTLC của CAMAG
Hình 1.6. Sơ đồ quy trình bào chế viên nén fenofibrat 145 mg
Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu thử fenofibrat
Hình 3.1. Sắc ký đồ khảo sát pha động HPTLC
Hình 3.2. Quét phổ vết fenofirat chuẩn
Hình 3.3. Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của phương pháp
Hình 3.4. Hình ảnh chồng phổ tại vị trí có Rf = 0,51 của vết chất phân tích trên sắc ký
đồ mẫu chuẩn và mẫu placebo thêm chuẩn
Hình 3.5. Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ fenofibrat
Hình 3.6. Sắc ký đồ độ chính xác của phương pháp
Hình 3.7. Sắc ký đồ định lượng mẫu cốm bằng HPTLC
Hình 3.8. Sắc ký đồ định lượng mẫu cốm bằng HPLC

.


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, nền kinh tế công nghiệp ngày càng phát triển mạnh mẽ và không ngừng
đổi mới. Đi kèm với điều đó là thời gian của con người dành cho công việc ngày một
tăng lên, đồng nghĩa với việc thời gian dành cho sinh hoạt ăn uống cá nhân sẽ ngày càng
rút gọn xuống để tiện lợi cho cơng việc. Do đó, nhu cầu sử dụng các loại đồ ăn nhanh,
nước ngọt, thức uống tăng lực,…cũng tăng nhanh một cách khó kiểm sốt .
Mọi người đều hướng tới sự thuận tiện và giảm quỹ thời gian cho việc ăn uống
theo cách truyền thống, nhưng chính điều này lại là các nguyên nhân chính gây tăng

lipid trong máu dẫn các hệ lụy nguy hiểm.
Rối loạn lipid máu là yếu tố quan trọng cho việc hình thành và phát triển của
bệnh vữa xơ động mạch, bệnh động mạch vành, động mạch não... Vữa xơ động mạch
gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng, đe dọa tính mạng như: tăng huyết áp, nhồi máu
cơ tim, tai biến mạch máu não...Bệnh vữa xơ động mạch và động mạch vành là nguyên
nhân chính gây tử vong ở các nước phát triển và tỷ lệ tử vong ngày một gia tăng [2],
[16].
Ở Mỹ, hàng năm có khoảng 1 triệu người chết về bệnh lý tim mạch, trong đó tử
vong liên quan tới xơ vữa động mạch chiếm 42,6%. Ở Pháp, mỗi năm có khoảng 10.000
ca nhồi máu cơ tim và 50.000 ca tử vong liên quan đến xơ vữa động mạch. Theo số liệu
của Tổ chức Y tế thế giới, năm 2010, Việt Nam có 100.000 người tử vong do bệnh động
mạch vành (khoảng 300 người tử vong do bệnh này mỗi ngày) và dự báo đến năm 2020,
các bệnh tim mạch, đặc biệt là xơ vữa động mạch sẽ trở thành nguyên nhân hàng đầu
gánh nặng bệnh tật trên toàn thế giới [2].
Hiện nay, trên thị trường Dược phẩm có nhiều thuốc điều trị tăng lipid máu và
fenofibrat là một trong những thuốc phổ biến được dùng để điều trị tăng lipid máu. Cũng
đã có nhiều phương pháp khác nhau để xác định hàm lượng fenofibrat có trong viên nén
như sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), đo
quang phổ hấp phụ UV-VIS,… Với mục tiêu tìm kiếm phương pháp xây dựng phương
pháp xác định hàm lượng fenofibrat trong bán thành phẩm viên nén một cách nhanh
chóng, đơn giản và kinh tế, đề tài :
“ Xây dựng phương pháp định lượng fenofibrat trong bán thành phẩm viên nén
fenofibrat bằng HPTLC” được thực hiện với mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng fenofibrat trong bán thành phẩm
viên nén fenofibrat bằng HPTLC.

1


2. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để định lượng fenofibrat trong bán thành

phẩm trong quá trình bào chế viên nén fenofibrat.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về fenofibrat
1.1.1. Công thức cấu tạo, tính chất lý hóa của fenofibrat

Hình 1. 1. Cấu trúc của fenofibrat
-Tên hóa học: 1-methylethyl 2-[4-(4-clorobenzoyl) phenoxy]- 2 methylpropanoat [4]
-Công thức: C20H21ClO4
- Đặc điểm: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng.
- Tính chất lý hóa [6], [11], [21], [23]:
 Điểm nóng chảy : 80-81oC
 Độ hịa tan : Trong nước : 0,42 mg / L ở 25°C
 Thực tế khơng tan trong nước ; tan ít trong methanol , ethanol ; hòa tan trong
ether, aceton, benzen , cloroform
 Log P = 5,2
 Áp suất hơi: 6,2 × 10-7 mmHg ở 25oC
1.1.2. Cơ chế tác dụng giảm lipid máu của fenofibrat
1.1.2.1. Khái niệm về bệnh tăng lipid máu
Tăng lipid máu là một tình trạng kết hợp các rối loạn di truyền và mắc phải khác
nhau mô tả mức lipid tăng cao trong cơ thể con người. Rối loạn mỡ máu rất phổ biến,
đặc biệt là ở Tây bán cầu, mà cịn trên tồn thế giới. Ngồi ra, một định nghĩa khách
quan hơn mô tả tăng lipid máu là tăng lipoprotein mật độ thấp ( low density lipoprotein
- LDL), tổng mức cholesterol, triglycerid. Lipid thường bao gồm mức cholesterol,
lipoprotein, chylomicrons, VLDL (very low density lipoprotein), LDL, apolipoprotein
và HDL (high density lipoprotein).
Thông qua một loạt các thử nghiệm và nghiên cứu, người ta đã liên tục chỉ ra

rằng mức cholesterol LDL tăng cao làm tăng nguy cơ phát triển các mảng xơ vữa động
mạch và bệnh mạch vành. Ngược lại, cholesterol lipoprotein tỷ trọng cao (HDL) hỗ trợ
điều chỉnh mức cholesterol để ngăn ngừa sự mất cân bằng có thể làm tăng nguy cơ mắc

3


bệnh xơ vữa động mạch. Mục tiêu giảm cholesterol LDL của mỗi bệnh nhân phụ thuộc
vào nguy cơ tim mạch tổng thể của họ, và liệu pháp y tế nên được điều chỉnh độc lập
cho từng bệnh nhân [2].

Hình 1. 2. Thành phần và cấu trúc của lipoprotein
- Lipoprotein là những phân tử hình cầu gồm 2 phần: nhân và vỏ.
+ Phần vỏ được cấu tạo bởi các phân tử lipid phân cực gồm phospholipid, cholesterol tự
do và các apoprotein. Phần vỏ đảm bảo tính tan của LP trong huyết tương, có tác dụng
vận chuyển các lipid khơng tan.
+ Phần nhân: chứa triglycerid và cholesterol ester hố khơng phân cực.
Ngun nhân gây tăng lipid máu
Tăng lipid máu được chia thành hai loại lớn: tăng lipid máu nguyên phát (gia
đình) hoặc thứ phát (mắc phải). Tăng lipid máu nguyên phát bắt nguồn từ rất nhiều rối
-

loạn di truyền mà bệnh nhân có thể thừa hưởng khi sinh ra, trong khi tăng lipid máu thứ
phát thường bắt nguồn từ căn nguyên cơ bản thay thế, chẳng hạn như chế độ ăn uống
không lành mạnh, thuốc (amiodarone, glucocorticoid), suy giáp, bệnh tiểu đường khơng
kiểm sốt được và / hoặc chế độ sinh hoạt kém [2], [16].
Hậu quả của tăng lipid máu:
Tăng lipid máu, đặc biệt là tăng LDL (tăng cholesterol máu), là một trong những
yếu tố nguy cơ phổ biến nhất góp phần vào sự tiến triển của xơ vữa động mạch và hậu
quả là dẫn tới bệnh mạch vành. Nhiều yếu tố góp phần vào sự phát triển của xơ vữa

-

động mạch, bao gồm tổn thương nội mô, tăng lipid máu, các yếu tố viêm và miễn dịch,
xói mịn hoặc vỡ mảng bám, tăng huyết áp và hút thuốc. Xơ vữa động mạch thường
khơng có triệu chứng cho đến khi mảng bám chiếm 70 % đến 80% đường kính của
mạch. Xơ vữa động mạch bắt nguồn sau khi xảy ra tổn thương nội mô cơ bản, xuất phát

4


từ việc mất oxid nitric trong nội mạc. Quá trình này dẫn đến tăng viêm trực tiếp xung
quanh vị trí rối loạn chức năng, cho phép tích tụ lipid trong lớp trong cùng của thành
nội mơ. Các lipid sau đó bị các đại thực bào hấp thụ, dẫn đến việc hình thành các "tế
bào bọt". Sự tích tụ cholesterol này trong các "tế bào bọt" gây ra rối loạn chức năng
trong các ti thể, tiếp theo là quá trình apoptosis và cuối cùng là hoại tử các mô bên dưới.
Các tế bào cơ trơn bao bọc quanh "tế bào bọt" hoặc các mảnh vụn, tạo ra một mảng xơ
sợi ngăn cản các chất béo bên dưới (các mảnh vụn) bị phá hủy [16], [14].

Hình 1. 3. Nguyên nhân gây tăng lipid máu và hình thành mảng xơ vữa động mạch
1.1.2.2. Điều trị bệnh tăng lipid máu

Phương thức điều trị ban đầu tập trung vào điều chỉnh chế độ ăn uống và lối sống, có
thể bổ sung thêm thuốc hạ lipid máu nếu cần. Bệnh nhân tăng lipid máu nhẹ và nguy cơ
ASCVD (atherosclerotic cardiovascular disease) thấp (dưới 7,5% nguy cơ trong 10 năm)
nên tập trung vào chế độ ăn ít chất béo, ít carbohydrate và hoạt động thể chất cường độ
trung bình đến cao (khuyến nghị 30 phút mỗi ngày, 5 đến 6 ngày mỗi tuần) . AHA
(american heart association) khuyên bệnh nhân nên hạn chế tiêu thụ chất béo bão hòa ở
mức khoảng 5% lượng calo hàng ngày của và hạn chế tổng lượng tiêu thụ chất béo bão
hòa chuyển hóa càng nhiều càng tốt. Bỏ thuốc lá, giảm huyết áp và giảm cân đều được
chứng minh là rất có lợi trong việc giảm nguy cơ mắc bệnh mạch máu. Đối với những

bệnh nhân có nguy cơ ASCVD từ trung bình đến cao (trên 7,5% nguy cơ trong 10 năm),
nên bổ sung thêm thuốc hạ lipid máu "statin" [2], [6], [14], [12].
Phân tích tổng hợp, điều tra các thử nghiệm phòng ngừa ban đầu ở bệnh nhân
tăng lipid máu đã phát hiện ra lợi ích của việc giảm cholesterol LDL có hiệu quả trong
việc giảm các biến cố tim mạch, đặc biệt là giảm nguy cơ nhồi máu cơ tim [16].
Fenofibrat đơn trị liệu hiện được chỉ định ở những bệnh nhân tăng TG
(triglycerid) rõ rệt, hoặc những người không dung nạp hoặc đáp ứng kém với liệu pháp

5


statin. Tuy nhiên, trong trường hợp thứ hai, phối hợp với ezetimibe hoặc coleseve lam
chất cơ lập acid mật có thể thích hợp hơn ở bệnh nhân rối loạn lipid máu hỗn.Trong một
nghiên cứu trên 625 bệnh nhân bị tăng lipid máu hỗn hợp, sử dụng đồng thời ezetimibe
và fenofibrat (10 /160 mg / ngày) trong 12 tuần làm giảm đáng kể cholesterol LDL (-20
so với -5,5% khi dùng đơn trị liệu fenofibrat) và TG và sự gia tăng tương tự mức HDL
- cholesterol so với đơn trị liệu bằng fenofibrat. Khả năng dung nạp của liệu pháp phối
hợp cũng tương tự như quan sát được với đơn trị liệu fenofibrat cả trong thử nghiệm này
và trong khi điều trị dài hạn. Ngoài ra, sự kết hợp giữa fenofibrate và colesevelam (160
mg / 3,75 g / ngày) trong 6 tuần có hiệu quả đáng kể hơn so với đơn trị liệu bằng
fenofibrate trong việc giảm mức LDL và non-HDL và apoB (p ≤ 0,0002) mà không ảnh
hưởng đáng kể đến TG - Tác dụng hạ hoặc HDL - cholesterol - tăng của fenofibrat. Sự
kết hợp giữa fenofibrat và metformin cũng dẫn đến bình thường hóa các bất thường liên
quan đến hội chứng chuyển hóa hiệu quả hơn so với một trong hai liệu pháp được chỉ
định [23], [16], [9].
1.1.2.3. Cơ chế tác dụng của fenofibrat

Hình 1. 4. Cơ chế tác dụng của fenofibrat
Sau khi uống, thuốc nhanh chóng bị thủy phân bởi các esterase trong gan và ruột
thành chất chuyển hóa có hoạt tính của nó là acid fenofibric. Các tác dụng hạ lipid máu

của fenofibrat có sự tham gia của trung gian hoạt hóa PPARα, một trong ba đồng dạng

6


của chất tăng sinh peroxisome được kích hoạt bởi thụ thể (PPAR). PPAR có chức năng
trong các miền bao gồm miền liên kết DNA (DBD) và miền liên kết phối tử. Trong quá
trình liên kết với phối tử tương ứng, PPARα tạo thành một heterodimer với thụ thể
retinoid X (RXR), một thụ thể khác và tương tác với yếu tố phản ứng của chất tăng sinh
peroxisome (PPRE), nằm trong trình khởi động của các gen mục tiêu thông qua DBD.
Điều này dẫn đến việc kích hoạt gen mục tiêu phiên mã, bao gồm cả q trình chuyển
hóa gen điều hịa lipid [3], [23].
Fenofibrat có thể ức chế triglycerid (TG) tổng hợp thơng qua việc giảm tính khả
dụng của acid béo tự do bằng cách thúc đẩy q trình oxy hóa β. Fenofibrat có thể làm
giảm hoạt động của acetyl-CoA carboxylase và giảm tổng hợp acid béo, do đó ức chế
tổng hợp acid béo. Hơn nữa, fenofibrat còn tăng khả năng loại bỏ mảng xơ vữa. Sự phân
giải lipid thông qua việc kích hoạt apolipoprotein (ApoA V) và lipoprotein lipase, và
giảm sản xuất chất ức chế lipoprotein lipase ApoC III. Fenofibrat cũng kích thích sự
tổng hợp lipoprotein tỷ trọng cao (HDL), ApoA I và ApoA II, và giảm sản xuất
lipoprotein loại tỷ trọng rất thấp (VLDL) và ApoB, đồng thời tăng cường biểu hiện của
liên kết adenosine triphosphate của chất vận chuyển A1 và thụ thể người B1, dẫn đến
dòng chảy cholesterol qua trung gian HDL từ các đại thực bào [6], [23], [14].
1.1.3. Chỉ định của fenofibrat
Fenofibrat được sử dụng trong điều trị rối loạn lipoprotein huyết các tip IIa, IIb,
III, IV và V, phối hợp với chế độ ăn [5].
1.1.4. Đặc điểm dược động học của fenofibrat
Fenofibrat được hấp thu ngay ở đường tiêu hóa cùng với thức ăn. Hấp thu thuốc
bị giảm nhiều nếu uống sau khi nhịn ăn qua đêm. Thuốc nhanh chóng thủy phân thành
acid fenofibric có hoạt tính; chất này gắn nhiều vào albumin huyết tương và có thể đẩy
các thuốc kháng vitamin K ra khỏi vị trí gắn. Nồng độ đỉnh trong huyết tương xuất

hiện khoảng 5 giờ sau khi uống thuốc. Ở người có chức năng thận bình thường, thời
gian bán thải trong huyết tương vào khoảng 20 giờ nhưng thời gian này tăng lên rất
nhiều ở người mắc bệnh thận và acid fenofibric tích lũy đáng kể ở người bệnh suy thận
uống fenofibrat hằng ngày. Acid fenofibric đào thải chủ yếu theo nước tiểu (70% trong
vòng 24 giờ, 88% trong vòng 6 ngày), chủ yếu dưới dạng liên hợp glucuronic, ngồi
ra cịn có acid fenofibric dưới dạng khử và chất liên hợp glucuronic của nó [5,6].
Khơng thấy xảy ra điều gì nghiêm trọng khi ngừng dùng fenofibrat, thậm chí sau khi
đã điều trị lâu ngày và cắt thuốc đột ngột.

7


1.1.5. Liều dùng và cách dùng
Ðiều trị fenofibrat nhất thiết phải phối hợp với chế độ ăn hạn chế lipid. Phải
uống thuốc cùng với bữa ăn.
Người lớn: 300 mg/ngày (1 viên 300 mg, uống vào một bữa ăn chính hoặc uống
3 lần, mỗi lần 1viên 100 mg cùng với các bữa ăn). Liều ban đầu thường là 200 mg một
ngày (uống một lần hoặc chia làm 2 lần). Nếu cholesterol tồn phần trong máu vẫn
cịn cao hơn 4g/l thì có thể tăng liều lên 300 mg/ngày. Cần duy trì liều ban đầu cho
đến khi cholesterol máu trở lại bình thường; sau đó có thể giảm nhẹ liều hàng ngày
xuống. Phải kiểm tra cholesterol máu 3 tháng một lần. Nếu các thơng số lipid máu lại
tăng lên thì phải tăng liều lên 300 mg/ngày [5].
1.1.6. Các nghiên cứu định lượng fenofibrat
Fenofibrat trong nguyên liệu, chế phẩm (viên nang) được định lượng bằng phương
pháp HPLC với detector UV [4], với điều kiện phân tích như sau:
- Điều kiện sắc ký:
+
Pha động : Nước được acid hóa đến pH 2,5 bằng acid phosphoric - acetonitril
(30 : 70)
+

Ct C18 (25 ì 4 cm; 5àm)
+
Tc độ dòng: 1 ml/min
+
Detector: Quang phổ tử ngoại ở bước sóng 286 nm.
+
Thể tích tiêm: 5 µl
- Xử lý mẫu:
+ Dung dịch thử: Hòa tan 0,100 g chế phẩm trong pha động và pha loãng thành 100,0
ml với pha động.
+ Dung dịch đối chiếu (1): Hịa tan 25,0 mg fenofìbrat chuẩn trong pha động và pha
loãng thành 25,0 ml với pha động.
+ Dung dịch đối chiểu (2): Hòa tan 5,0 mg fenofibrat chuẩn, 5,0 mg tạp chất A chuẩn
của fenofibrat, 5,0 mg tạp chất B chuẩn cùa fenofibrat và 10,0 mg tạp chất G chuẩn của
fenofibrat trong pha động và pha loãng thành 100,0 ml với pha động. Pha loãng 1,0 ml
dung dịch thu được thành 50,0 ml với pha động
+ Cách tiến hành: Tiêm dung dịch đối chiếu (2). Điều chỉnh độ nhạy của hệ thống sắc
ký sao cho chiều cao của các pic trên sắc ký đồ đạt ít nhất 50 % thang đo. Tiêm dung
dịch đối chiếu (1) 6 lần. Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối của diện tích
pic của fenofibrat lớn nhất là 1,0 %. Tiêm dung dịch thử và dung dịch đối chiểu (1).

8


-

Trong thử độ hòa tan của viên nén, viên nang fenofibrat … định lượng fenofibrat
giải phóng được tiến hành tương tự với điều kiện trên [4].

1.2. Phương pháp nghiên cứu

1.2.1. Vài nét về phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kỹ thuật sắc ký dùng để tách các chất được tiến hành
khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh
của TLC là các hạt có kích thước 10-30 µm, được rải đều và kết dính thành lớp mỏng
đồng nhất, dày khoảng 250 µm trên giá đỡ làm bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Một
số chất thường được dùng làm pha tĩnh là silica, dẫn chất siloxan, cellulose, nhôm oxyd,
gel sephadex,… trong đó được dùng phổ biến nhất là silica (SiO2) và nhôm oxyd.
Pha động là hệ dung môi đơn hoặc nhiều thành phần, thay đổi tùy thuộc vào cơ chế sắc
ký. Cơ chế tách có thể là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối
hợp đồng thời của nhiều cơ chế, tùy thuộc vào tính chất của hai pha. Để tăng cường sức
rửa giải, thường kết hợp từ 2-3 dung môi. Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao
dẫn. Các chất phân tích sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào bản chất của
chúng, kết quả là chúng được tách riêng, có vị trí khác nhau trên bản mỏng. Đại lượng
đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf . Trị số này
được tính bằng tỷ lệ giữa quãng đường di chuyển của chất phân tích và quãng đường di
chuyển của pha động.
Rf = dR/dM
Trong đó:
dR là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)
dM là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động ( đo trên cùng đường
đi của vết, đơn vị cm)
Rf có giá trị dao động giữa 0 và 1
- Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao ( HPTLC)
HPTLC là một hình thức hiện đại của TLC (sắc ký lớp mỏng). Pha tĩnh trong HPTLC
là những hạt hấp phụ có kích thước nhỏ, đồng đều nên tăng cường khả năng tách chất
phân tích. Hơn nữa, HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảp tính ứng
dụng và độ tin cậy,độ lặp lại cao nhất các số liệu đưa ra. Trong đó, các thơng số của q
trình phân tích được ghi lại và kiểm sốt chặt chẽ, do đó có đọ lặp lại cao. Các bước của
quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hanh bằng thiết bị tự động
hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp phải trong q trình phân tích [1].

9


Hình 1. 5. Cấu tạo hệ thống HPTLC của CAMAG
- Ứng dụng : TLC cùng với HPTLC là phương pháp được ứng dụng rộng rãi nhất
để phân tích trong các ngành Dược phẩm, hóa học lâm sàng, hóa học pháp y, hóa
sinh, mỹ phẩm, phân tích thực phẩm, phân tích mơi trường và các lĩnh vực khác. Đó
là do có nhiều ưu điểm, ví dụ, nó là phương pháp sắc ký duy nhất cung cấp tùy chọn
trình bày kết quả dưới dạng hình ảnh. Các ưu điểm khác bao gồm [1] :
+ Bản mỏng có sẵn nên dễ dàng triển khai phép phân tích
+ Chuẩn bị mẫu đơn giản, ít gặp vấn đề về nền mẫu
+ Không cần xử lý trước đối với dung mơi như lọc và khử khí
+ Tiêu thu pha động ít cho mỗi mẫu
+ Phân tích đồng thời mẫu thử và mẫu chuẩn – độ chính xác và độ đúng tốt hơn,
hiếm khi cần chuẩn nội
+ Thời gian phân tích ngắn hơn và chi phí cho mỗi lần phân tích ít hơn
+ Khơng chịu ảnh hưởng từ lần phân tích trước- pha tĩnh và pha động ln mới cho
mỗi lần phân tích, khơng có nhiễm chéo
+ Có thể phát hiện với nhiều chế độ khác nhau đặc hiệu cho mỗi nhóm chất
Bên cạnh rất nhiều ưu điểm trên, HPTLC cũng có một số nhược điểm trong q
trình phân tích như sau:
+ Độ tái lặp có thể không đạt được nếu điều kiện độ ẩm không được kiểm sốt
+ u cầu có chất chuẩn

10


+ Độ nhạy bị ảnh hưởng do lượng mẫu thực hiện phân tích nhỏ.
+

Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký trên hệ thống HPTLC
Pha tĩnh: Đối với HPTLC, hầu hết các bản mỏng silica gel HPTLC 60 được sản

xuất từ silica gel có hình dạng hạt khơng đều. Mặc dù đã thu được hiệu quả tách tốt hơn
rất nhiều so với TLC thông thường, nhưng để nâng cao hơn nữa chất lượng phép thử
như tách tốt hơn, giảm nhiễu nền dẫn tới tăng độ nhạy thì bên cạnh giảm kích thước hạt
thì chế tạo các hạt gel silica hình cầu với độ tinh khiết cao của chất hấp phụ là giải pháp
mà nhiều nhà sản xuất bản mỏng đã đạt được.
+
Pha động: Thành phần chính của dung mơi rửa giải TLC là các dung mơi hữu
cơ có bản chất khác nhau tùy thuộc vào chất phân tích và u cầu tách. Ngồi ra, một số
chất cịn được thêm vào để điều chỉnh khả năng di chuyển cũng như cải thiện khả năng
tách trong quá trình sắc ký.
Acid hoặc base: Thêm acid hoặc base chính là thay đổi pH pha động. Trong nhiều
trường hợp khả năng tách có thể được cải thiện bằng cách bổ sung acid, thường là acid
acetic, acid formic hoặc acid propionic; hoặc bổ sung base như dung dịch amoniac,
triethylamin hoặc pyridin. Việc này có thể có tác dụng giảm kéo đi, dẫn đến vết sắc
ký sắc nét hơn, ít khuếch tán hơn, đồng thời làm thay đổi đáng kể tỷ lệ lưu giữ và đôi
khi thay đổi thứ tự di chuyển qua các thành phần của mẫu.
Thuốc thử tạo cặp ion: Sử dụng thuốc thử tạo cặp ion có thể thành cơng trong cả
việc cải thiện chất lượng của quá trình tách và thu được sự phân giải các hợp chất mà
trước đây tách rất khó. Cơ sở của phương pháp là dựa trên sự hình thành phức giữa các
ion mang điện tích trái dấu của chất tan và ion thuốc thử trái dấu.
Chất chọn lọc đối quang : Một số chất chọn lọc đối quang cho vào pha động đã
thành công trong việc tách một số lượng đáng kể các chất racemic, điển hình là
cyclodextrin.
+
Dung mơi pha mẫu và thể tích mẫu: Dung mơi pha mẫu, thể tích mẫu và dạng
chấm mẫu có thể ảnh hưởng tới khả năng tách sắc ký. Để thu được kết quả tách sắc ký

tốt cần chú ý:
Pha mẫu trong dung mơi khơng phân cực vì dung mơi phân cực vết chấm có xu
hướng lan rộng
Dung mơi dùng để hòa tan mẫu phải dễ bay hơi
Khi chấm mẫu tránh xê dịch bản mỏng ảnh hưởng tới vùng mẫu chấm
Thể tích mẫu thích hợp, đường kính vết càng nhỏ càng tốt
+
Độ ẩm bình khai triển sắc ký: Độ ẩm tương đối của phịng thí nghiệm tiêu chuẩn
được kiểm sốt không được vượt quá 60%. Nếu độ ẩm tương đối không quá 60% sẽ chỉ

11


gây ra sự thay đổi nhỏ trong hoạt động của lớp chất hấp phụ, nhưng khi vượt quá 60%
sẽ gây ra sự thay đổi rõ rệt. Do đó, để duy trì khả năng tái lặp tốt, các bản mỏng phải
bảo quản kín và duy trì độ ẩm mơi trường phịng thí nghiệm trong khoảng làm việc tối
ưu. Hơi acid và base sẽ gây ra sự thay đổi trong hoạt động của lớp chất hấp phụ. Có thể
kiểm sốt độ ẩm bình triển khai sắc ký bằng thiết bị có dịng khơng khí có độ ẩm xác
định được tạo bởi dung dịch muối bão hịa.
+
Phát hiện: Nhiều hợp chất có hấp thụ ánh sáng UV hoặc có đặc tính huỳnh quang
khi bị kích thích bởi tia cực tím hoặc ánh sáng nhìn thấy có thể phát hiện được trực tiếp.
Nhưng hầu hết các hợp chất khơng có màu rõ ràng nên phải sử dụng thuốc thử thích hợp
để hiện màu. Tuy nhiên, việc phun thuốc thử đòi hỏi phải sử dụng thiết bị hút hơi dung
mơi thích hợp vì các giọt nhỏ của thuốc thử có thể gây hại cho người phân tích hoặc độc
hại cho bầu khí quyển xung quanh. Ngồi ra, khi phun thuốc thử khơng đồng đều trên
bản mỏng sẽ ảnh hưởng tới kết quả. Trong những năm gần đây, kỹ thuật nhúng được sử
dụng để thay thế cho phương pháp phun truyền thống. Khi sử dụng thuốc thử hiện màu
cần xem xét các vấn đề sau:
Độ nhạy thu được.

Độ chọn lọc của thuốc thử đối với chất cần phân tích.
Hiệu ứng nền, đặc biệt là nơi sẽ quét quang phổ.
Độ ổn định của sắc ký đồ sau khi phun thuốc thử.
Sự dễ dàng khi chuẩn bị thuốc thử.
Các nguy cơ liên quan đến việc chuẩn bị và sử dụng thuốc thử.
1.2.2. Một số nghiên cứu sử dụng HPTLC để định lượng trong kiểm tra chất lượng thuốc

Sắc ký lớp mỏng và HPTLC được sử dụng rộng rãi trong định tính, đánh giá độ tinh
khiết (tạp chất) của thuốc dạng nguyên liệu, thành phẩm… Trong Dược điển, chưa có
chuyên luận riêng định lượng hàm lượng dược chất trong nguyên liệu và thành phẩm.
Tuy nhiên, đã có một số nghiên cứu định lượng dược chất trong chế phẩm bằng HPTLC
trong q trình sản xuất được cơng bố (bảng 1.1).
Bảng 1. 1. Một số nghiên cứu định lượng dược chất trong chế phẩm bằng HPTLC

1.3.

Kiểm tra chất lượng trong quá trình bào chế viên nén fenofibrat.

12


Viên nén fenofibrat 145 mg được nhóm nghiên cứu của Viện Cơng nghệ Dược
Dược chất/ Dạng
bào chế

Phương pháp phân tích

Bước
TLTK
sóng (nm)

Pha tĩnh: Bản mỏng TLC silica gel
Tenoxicam / dạng 60 GF254
gel vi nang
Pha động: Cloroform : Metanol
(9:1)

260

[27]

292

[28]

250

[7]

265

[8]

253

[19]

284

[22]

263

[26]

Pha tĩnh: Bản mỏng TLC silica gel
Gatifloxacin/ bán
thành phẩm và
tiểu phân nano

60 GF254
Pha động: n-propanol - dung dịch
amoniac 25% (5:1:0,9)

Clopidogrel
bisulphat/ bán
thành phẩm và

Pha tĩnh: Bản mỏng TLC silica gel
60 GF254
Pha động: cloroform- methanol

viên nén

(7:1)

Stavudine,

Pha tĩnh : Bản mỏng TLC silica gel

lamivudine và
nevirapine/viên
nén

60 GF254
Pha động: cloroform- methanol
(9: 1)

Atorvastatin
calcium,
ezetimibe và
fenofibrate / viên
nén

Pha tĩnh: bản mỏng TLC silica gel
60GF 254
Pha động : toluene – cloroform methanol - acid acetic băng
(4,6:3:1,4:0,1)
Pha tĩnh : bản mỏng TLC silica gel
60 GF254
Pha động:methanol - ethyl acetat
(8: 2)

Paliperidone/viên
nén Pali XR 6
Atorvastatin,
Ezetimibe và
Fenofibrate /
công thức thuốc
viên nén

Pha tĩnh: Bản mỏng TLC silica gel
60GF 254
Pha động : cloroform- toluene –
methanol- acid acetic(6:3:0.5:0.15)

phẩm Quốc gia bào chế theo quy trình được trình bày ở hình 1.6:

13


Pha tĩnh: bản mỏng TLC silica gel
Nebivolol và
hydroclorothiazid
/ viên nén

60 GF254
Pha động: 1,4-dioxane - toluen triethylamine (5:3:0,1)

281

[18]

Hình 1. 6. Sơ đồ quy trình bào chế viên nén fenofibrat 145 mg

14


Một số chỉ tiêu cần kiểm tra của các giai đoạn sản xuất :
+

Thuốc viên các loại (Viên nén, viên bao …) :
Hình thức

-

Độ ẩm
Định lượng (nếu có)
Viên :
Các chỉ tiêu được quy định trong tiêu chuẩn thành phẩm (trừ chỉ tiêu định tính)
Hình thức của viên sau khi rửa các lớp bao (áp dụng đối với viên bao đường)

+

Độ dày của viên (áp dụng đối với viên bao đường và viên bao film)
Vỉ :
Hình thức vỉ

+
+

Số lượng viên/vỉ
Độ kín lọ

+
+

Hình thức
Độ kín nang cứng
Cốm :

+
+
+
+
+

-

Hình thức
Độ ẩm
Định lượng (nếu có)
Như vậy,trong quy trình bào chế viên nén fenofibrat, cần phải kiểm soát hàm
lượng hoạt chất trong các giai đoạn sau : trộn đồng nhất, dập viên và bao phim. Số mẫu
+
+
+

của mỗi lần kiểm sốt lớn, do đó phương pháp HPTLC với những ưu điểm ở trên rất
phù hợp để ứng dụng vào định lượng fenofibrat. Ở nghiên cứu này, HPTLC được sử
dụng để định lương fenofibrat trong cốm và viên nén bán thành phẩm ở các giai đoạn
sau quá trình trộn đồng nhất và sau khi kết thúc quá trình bao phim ( viên nén fenofibrat
bán thành phẩm).

15


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị và đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Máy móc và trang thiết bị

- Cân phân tích METTLER TOLEDO – AB204-Thụy Sĩ (d = 0,1 mg)
- Cân phân tích METTLER TOLEDO -XPE 105- Thụy Sĩ (d = 0,01 mg)
- Hệ thống HPTLC CAMAG, CAT No 027.6200 (Thụy Sĩ): máy chấm sắc ký bản
mỏng bán tự động, máy triển khai sắc ký, buồng chụp ảnh sắc ký, phần mềm xử
lý kết quả WinCATs.
-

Máy lắc xoáy Vortex ZX3-Ý
Máy siêu âm DAIHAN WUC-A22H-Hàn Quốc
Tủ sấy MEMMERT ULM 500-Đức

-

Các dụng cụ thủy tinh: các bình định mức 25ml, 20ml; pipet chính xác 5ml; pipet
pasteur; micropipet 1000 µl, 100µl; cốc thủy tinh 50ml, 100ml,…

2.1.2. Ngun liệu, hóa chất và dung mơi
Các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích, bao gồm:
- Chuẩn làm việc fenofibrat hàm lượng 99,8% cung cấp bởi Viện công nghệ Dược
-

phẩm Quốc gia, Trường Đại học Dược Hà Nội.
Methanol, cloroform, toluen, ethanol 96%, nước cất 1 lần, acetone nitril, acid
phosphoric.
Bản mỏng TLC silical gel 60 GF254 của Merck- Đức.

2.1.3. Đối tượng nghiên cứu
- Cốm bào chế viên nén
- Viên nén bào chế : Đánh số mẫu 01 và mẫu 02
+ Mẫu 01: dùng trong thẩm định phương pháp

+ Mẫu 02: bào chế từ cốm
- Mẫu placebo : có thành phần giống như viên nén nhưng khơng có hoạt chất
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị các dung dịch
- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 25 mg fenofibrat vào bình định mức
25ml. Hịa tan và pha lỗng đến vừa đủ thể tích bằng methanol. Hút 5ml dung
dịch trên cho vào bình định mức 25 ml và thêm methanol đến vạch, khi đó ta
được dung dịch chuẩn fenofibrat có nồng độ 200µg/ml.
-

Dung dịch thử: Tham khảo các công bố [4], [10], [19], [24], [26], tiến hành chuẩn
bị mẫu thử như sau:

16


Hình 2. 1. Quy trình xử lý mẫu thử fenofibrat
2.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký
- Pha tĩnh : bản mỏng TLC silical gel 60 GF254 với chiều triển khai 10 cm
- Pha động: dựa vào các tài liệu đã công bố [20], [17], [13], [25], [26] ta khảo sát
các hệ pha động sau:
a. Toluen : Cloroform : Methanol = 3 : 5 : 1
b. Toluen : Cloroform : Acid acetic băng = 5 : 3 : 0,8
c. Toluen : Cloroform : Methanol : Acid acetic băng = 3 : 6 : 0,5 : 0,15
d. Toluen : Cloroform : Ethyl acetat = 4 : 9 : 0,8
e. Toluen : Cloroform = 4 : 7
f. Toluen : Cloroform : Methanol : Ethyl acetate (4,6 : 3 : 1,4 : 0,1)

17