Xây dựng phương pháp định lượng lanzoprazol trong huyết tương động vật thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI





VŨ NGỌC THẮNG



XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG LANSOPRAZOL
TRONG HUYẾT TƯƠNG
ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM





LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




VŨ NGỌC THẮNG



XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG LANSOPRAZOL
TRONG HUYẾT TƯƠNG
ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM




LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC- ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410




Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Ngọc Chiến
TS. Trần Nguyên Hà









HÀ NỘI 2013
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc
đến thầy, cô hướng dẫn là TS. Nguyễn Ngọc Chiến và TS. Trần Nguyên Hà-
Trường Đại học Dược Hà Nội, thầy cô đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình ngay từ
khi tôi mới nhận đề tài.
Tôi xin cảm ơn Đảng uỷ, chỉ huy trung tâm Kiểm nghiệm nghiên cứu
Dược Quân đội- Cục Quân y đã quan tâm, tạo thời gian và mọi
điều kiện
thuận lợi nhất để tôi hoàn thành khoá học và luận văn. Xin chân thành cảm ơn

Khoa kiểm nghiệm Hoá học, Khoa kiểm nghiệm Vật lý, Ban kế hoạch Vật tư
thuộc trung tâm Kiểm nghiệm Nghiên cứu Dược Quân đội đã tạo điều kiện về
hoá chất, trang thiết bị để tôi thực hiện luận văn này. Tôi xin cảm ơn viện
công nghệ Dược phẩm Qu
ốc gia, Bộ môn Dược lực- Trường Đại học Dược
Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Lương Quang Anh- Viện bỏng Quốc
gia và gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã ủng hộ, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập và tiến hành luận văn.
Hà Nội, ngày 25 tháng 8 năm 2013
Học viên

Vũ Ngọc Thắng


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1: TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ LANSOPRAZOL 3
1.1.1. Tính chất 3
1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng 3
1.1.3. Các phương pháp định lượng Lansoprasol 5
1.1.3.1. Định lượng trong dịch hòa tan 5
1.1.3.2. Định lượng trong huyết tương 8
1.1.3.3. Một số phương pháp chiết LPZ trong huyết tương khác 11

1.1.4. Một số nghiên cứu về sinh khả dụng của LPZ 12
1.2. YÊU CẦU CƠ BẢN CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MẪU
SINH HỌ
C 15
1.2.1. Tính đặc hiệu 15
1.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 15
1.2.3. Độ đúng và độ chính xác 16
1.2.4. Giới hạn định lượng (LLOQ) 16
1.2.5. Độ ổn định của mẫu thử 17
1.2.6. Tỷ lệ thu hồi 17
1.2.7. Mẫu chuẩn kiểm tra 17


1.2.8. Phân tích mẫu thử 17
1.3. SINH KHẢ DỤNG VÀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG 17
1.3.1. Phân tích dược động học 18
1.3.2. Tính toán sinh khả dụng 19
1.3.2.1. Dùng đơn liều 19
1.3.2.2. Dùng đa liều 19
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU21
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21
2.1.1. Dược phẩm 21
2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất, dung môi 21
2.1.3. Dụng cụ, máy móc 21
2.1.4. Đối tượng nghiên cứu 22
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 22
2.2.2. Dung dị
ch chuẩn và chuẩn nội 23
2.2.3. Phương pháp chiết 24

2.2.4. Thẩm định phương pháp phân tích 24
2.2.4.1. Thẩm định tính đặc hiệu- chọn lọc 24
2.2.4.2. Thẩm định độ tuyến tính 24
2.2.4.3. Thẩm định độ đúng và độ lặp lại 25
2.2.4.4. Giới hạn định lượng (LLOQ) 26
2.2.4.5. Độ ổn định 26
2.2.4.6. Hiệu suất chiết (Tỷ lệ thu hồi) 26


2.2.5. Đánh giá sinh khả dụng của viên nang LPZ 30 mg 27
2.2.5.1. Thiết kế thí nghiệm 27
2.2.2.2. Phương pháp lấy mẫu 28
2.2.2.3. Phương pháp chiết và định lượng LPZ 28
2.2.2.4. Phương pháp xác định một số thông số dược động học 28
2.2.2.5. Phương pháp so sánh các thông số dược động học 29
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu 29
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31
3.1. ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ VÀ TÍNH TƯƠNG THÍCH CỦA HỆ
THỒ
NG 31
3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 31
3.1.2. Tính tương thích của hệ thống 36
3.2. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU 37
3.2.1. Xử lý mẫu bằng cách tủa protein 37
3.2.2. Xử lý mẫu huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng- lỏng 39
3.2.2.1. Chiết bằng hỗn hợp gồm dicloromethan và diethyl ether 39
3.2.2.2. Chiết bằng tert- butyl methyl ether 41
3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LPZ TRONG
HUYẾT TƯƠNG 42
3.3.1. Thẩm định tính chọn lọc, đặ

c hiệu 42
3.3.2. Thẩm định độ tuyến tính 44
3.3.3. Thẩm định độ đúng, độ lặp lại 44
3.3.4. Giới hạn định lượng (LLOQ) 45
3.3.5. Độ ổn định của LPZ 47


3.3.5.1. Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc LPZ 47
3.3.5.2. Độ ổn định của LPZ trong huyết tương 47
3.3.6. Hiệu suất chiết 48
3.3.6.1. Hiệu suất chiết của LPZ 48
3.3.6.2. Hiệu suất chiết của chuẩn nội PPZ 49
3.3.7. Định lượng LPZ trong huyết tương chó được cho uống LPZ 49
3.4. NGHIÊN CỨU SKD VÀ CỦA VIÊN NANG LPZ 30 mg TRÊN
CHÓ 50
3.4.1. Phân tích mẫu huyết tương chó được uống LPZ 50
3.4.2. Phân tích và so sánh các thông số dược động học 53
3.4.2.1. Phân tích và so sánh C
max
55
3.4.2.2. Phân tích và so sánh AUC
0- t
56
3.4.2.3. Phân tích và so sánh AUC
0- ∞
57
3.4.2.4. Phân tích và so sánh T
max
58
Chương 4. BÀN LUẬN 60

4.1. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LPZ TRONG HUYẾT TƯƠNG
60
4.2. ĐÁNH GIÁ SKD CỦA LPZ TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
64
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN : Acetonitril
AUC : area under curve
(Diện tích dưới đường cong)
BP : British Pharmacopoeia
(Dược điển Anh)
C
max
: Nồng độ đỉnh
ĐK : Điều kiện
FDA : Food and Drug Administration
(Cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc Hoa Kỳ)
HPLC : High performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
HPTLC : High performance thin layer chromatography
(Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao)
HT : Huyết tương
LC/MS : Liquid chromatography/Mass spectrometry
(Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ)
LLOQ : Lower limit of quantification
(Giới hạn định lượng dưới)
LPZ : Lanzoprazol

MeOH : Methanol
MP : Mobile phase
(Pha động)
OPZ : Omeprazol
PA : Purity analysis
(Tinh khiết phân tích)
PPI : Proton Pump Inhibitor
(Ức chế bơm proton)
PPZ : Pantoprazol
RP- HPLC : Reverse phase high performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng pha
đảo hiệu năng cao)


RPZ : Rabeprazol
RSD : Relative standard deviation
(Độ lệch chuẩn tương đối)
SKD : Sinh khả dụng
SKĐ : Sắc ký đồ
TBME : Tert- butyl methyl ether
TĐSH : Tương đương sinh học
T
max
: Thời gian đạt nồng độ đỉnh
USP : The United states pharmacopeia
(Dược điển Mỹ)
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2. 1. Dãy nồng độ thẩm định độ tuyến tính 25
Bảng 2. 2. Bố trí thí nghiệm đánh giá SKD của viên nang LPZ 30 mg 27
Bảng 3. 1: Kết quả tính tương thích của hệ thống 37

Bảng 3. 2: Hiệu suất chiết LPZ khỏi HT khi xử lý mẫu bằng phương pháp tủa
protein 39
Bảng 3. 3: Hiệu suất chiết của LPZ khi chiết bằng hỗn hợp diethylether-
dicloromethan 41
Bảng 3. 4: Hiệu suất chiết củ
a PPZ khi chiết bằng hỗn hợp diethylether-
dicloromethan 41
Bảng 3. 5: Kết quả thẩm định độ tuyến tính (n = 6) 44
Bảng 3. 6: Kết quả độ đúng, độ lặp lại trong ngày 45
Bảng 3. 7: Kết quả độ đúng, độ lặp lại khác ngày (3 ngày) 45
Bảng 3. 8: Kết quả nghiên cứu độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc 47
Bảng 3. 9: Kết quả nghiên cứu độ ổn định c
ủa LPZ trong huyết tương 48
Bảng 3. 10: Hiệu suất chiết LPZ trong huyết tương (n = 6) 48
Bảng 3. 11: Hiệu suất chiết của LPZ trong huyết tương 49
Bảng 3. 12: Nồng độ LPZ (ng/ml) trong huyết tương chó sau khi uống viên
đối chiếu 51
Bảng 3. 13: Nồng độ LPZ (ng/ml) trong huyết tương chó sau khi uống viên
thử 52
Bảng 3. 14: Các thông số dược động học của thuốc thử và thuốc đối chiếu . 54
Bảng 3. 15: Kết quả phân tích phương sai C
max
55
Bảng 3. 16: Kết quả phân tích phương sai AUC
0- t
56
Bảng 3. 17: Kết quả phân tích phương sai cho AUC
0-∞
57

Bảng 3. 18: Kết quả phân tích T
max
58
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1: Cấu trúc phân tử của lansoprazol 3
Hình 1. 2: Đường cong nồng độ thuốc trung bình theo thời gian giữa
Lansor và Lanfast 14
Hình 3. 1: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với điều kiện sắc ký 1 31
Hình 3. 2: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với điều kiện sắc ký 2 32
Hình 3. 3: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với điều kiện sắc ký 3 33
Hình 3. 4: SKĐ dung dịch chuẩn hỗ
n hợp với ĐK đệm phosphat 0,01M, pH
7,0: ACN (60: 40, tt/tt) 33
Hình 3. 5: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với ĐK đệm phosphat pH 7,3: ACN
(60: 40) 34
Hình 3. 6: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với ĐK đệm phosphat pH 7,6 :
ACN (60: 40, tt/tt) 34
Hình 3. 7: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với ĐK đệm phosphat pH 8,0 :
ACN (60: 40, tt/tt) 35
Hình 3. 8: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với ĐK đệm phosphat pH 8,0: ACN
(70: 30, tt/tt) 35
Hình 3. 9: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với Đ
K đệm phosphat pH 8,0 :
ACN (65: 35, tt/tt) 36
Hình 3. 10: SKĐ mẫu HT trắng xử lý bằng phương pháp tủa protein 38
Hình 3. 11: SKĐ mẫu HT xử lý bằng phương pháp tủa protein 38
Hình 3. 12: SKĐ mẫu HT trắng được chiết bằng hỗn hợp diethylether-
dicloromethan (70: 30) 40
Hình 3. 13: SKĐ mẫu HT được chiết bằng hỗn hợp diethylether-

dicloromethan (70: 30) 40
Hình 3. 14: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng 42
Hình 3. 15: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có thêm chuẩn nộ
i PPZ 43


Hình 3. 16: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có thêm PPZ và LPZ 43
Hình 3. 17: SKĐ mẫu HT ở nồng độ 0,05 µg/ml 46
Hình 3. 18: SKĐ mẫu HT trắng 46
Hình 3. 19: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó uống LPZ 50
Hình 3. 20: Đường cong nồng độ thuốc trung bình theo thời gian của thuốc
thử và thuốc đối chiếu 53



1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển của công nghiệp dược phẩm, các biệt dược lưu
hành trên thị trường thuốc ngày càng phong phú và đa dạng. Số lượng thuốc
generic gia tăng vượt trội so với thuốc phát minh do chi phí đầu tư để phát
triển một thuốc mới vô cùng tốn kém. Thị trường thuốc generic toàn cầu đạt
106,12 tỷ USD năm 2008, tăng trưởng 12,56% so với năm trước và tỷ lệ
tăng
trưởng cao gấp 5 lần so với tăng trưởng thuốc phát minh. Năm 2010, thuốc
generic chiếm tỷ lệ 74% số lượng dược phẩm toàn cầu và sẽ đạt 80% vào năm
2015. Thị trường thuốc generic kê đơn năm 2004 đạt 50 tỷ USD nhưng năm
2010 đã tăng gần gấp đôi đạt 96,4 tỷ USD. Nếu mở rộng định nghĩa generic,
thị trường có thể đạt 150 tỷ USD mỗ
i năm [5]. Không thể phủ nhận lợi ích to

lớn của thuốc generic đối với bệnh nhân tuy nhiên vấn đề đặt ra là hiệu quả
điều trị của thuốc generic có giống như thuốc phát minh hay không và đánh
giá bằng tiêu chí nào.
Các nhà lâm sàng thường dựa vào theo dõi tác dụng lâm sàng để so
sánh hiệu quả của thuốc, tuy nhiên phương pháp này nhiều khi rất khó để đo
lường và kiểm soát. Ngày nay, nhiều quốc gia đã áp dụng tiêu chí đánh giá
tương
đương sinh học để đảm bảo tác dụng điều trị của thuốc generic so với
thuốc phát minh tương ứng. Đây là nghiên cứu bắt buộc đối với tất cả các
thuốc generic trước khi lưu hành ở các nước phát triển như Mỹ, Úc, Cộng
đồng Châu Âu…
Tại Việt Nam, theo thống kê của Cục Quản lý dược, tính đến 31 tháng
12 năm 2008 thuốc sản xuất trong nước có 491 hoạt chất thì có 9727 số
đăng
ký, thuốc nước ngoài có 909 hoạt chất với 10339 số đăng ký [6]. Việc kiểm
tra đánh giá chất lượng thuốc chủ yếu vẫn dựa trên sự kiểm tra các tính chất
lý hóa theo tiêu chuẩn định sẵn. Tuy nhiên việc đánh giá in vitro này không
phản ánh thực sự hiệu quả trị liệu của một thuốc trong cơ thể vì mức độ hấp


2
thu dược chất từ các chế phẩm dùng đường uống hoặc dùng tại chỗ có thể bị
ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố. Để đảm bảo tính an toàn và hiệu quả trong việc
sử dụng thuốc cho người bệnh, Bộ Y tế đã đưa ra các qui định liên quan đến
đánh giá tương đương sinh học của các chế phẩm thuốc. Trong đó phương
pháp định lượng thuốc trong dịch sinh h
ọc là công cụ quan trọng trong đánh
giá sinh khả dụng và tương đương sinh học các chế phẩm bào chế.
Để góp phần nghiên cứu sinh khả dụng và đánh giá tương đương sinh
học của các chế phẩm chứa Lansoprazol, đề tài: "Xây dựng phương pháp

định lượng Lansoprazol trong huyết tương động vật thực nghiệm" được
thực hiện với mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượ
ng Lansoprazol trong
huyết tương chó bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
2. Ứng dụng vào đánh giá sinh khả dụng của Lansoprazol trên chó.





3
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ LANSOPRAZOL
Lansoprazol (LPZ): 2-[[[3-methyl-4-(2,2,2-trifluoroethoxy)-2-pyridyl]-
methyl]sulfinyl]benzimidazole [2], [35].
Công thức: C
16
H
14
F
3
N
3
O
2
S
Khối lượng phân tử: 369,36
Cấu trúc:

Hình 1. 1: Cấu trúc phân tử của lansoprazol
LPZ là một thuốc trong nhóm ức chế bơm proton (Proton Pump
Inhibitors- PPIs) (H
+
/K
+
- ATPase), là dẫn chất benzimidazol có tác dụng
chống tiết acid dạ dày [2], [4], [39].
1.1.1. Tính chất
LPZ là bột kết tinh màu trắng hay hơi nâu, nhiệt độ nóng chảy khoảng
166
0
C. Rất dễ tan trong dimethylformamid, tan trong methanol, hơi tan trong
ethanol, khó tan trong ethyl acetat, dicloromethan, rất khó tan trong ether,
thực tế không tan trong hexan và nước.
LPZ bị phân huỷ trong dung dịch nước. Tốc độ phân hủy trong môi
trường nước tăng lên khi pH giảm. Nửa đời phân hủy trong môi trường nước
ở 25
0
C là khoảng 0,5 giờ tại pH 5,0 và là khoảng 18 giờ tại pH 7,0 [2], [35],
[39].
1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng


4
Do không bền trong môi trường acid nên LPZ được bào chế dưới dạng
viên nang kiểm soát giải phóng chứa các pellet LPZ được bao tan trong ruột.
Sự hấp thu LPZ chỉ bắt đầu sau khi pellet qua dạ dày. LPZ được hấp thu
nhanh, trung bình nồng độ LPZ đạt đỉnh trong máu sau khoảng 1,7 giờ. Sau
khi uống một liều đơn LPZ từ 15 mg đến 60 mg, nồng độ đỉnh trong máu

(C
max
) và diện tích dưới đường cong (AUC) của LPZ tỷ lệ thuận với liều
uống. LPZ không được tích lũy và dược động học không thay đổi khi uống
nhiều liều [2]
, [4], [39].
LPZ liên kết không thuận nghịch với H
+
/K
+
ATPase, một hệ thống
enzym có trên bề mặt tế bào thành dạ dày, do đó LPZ ức chế sự chuyển vận
cuối cùng các ion H
+
vào trong dạ dày. LPZ ức chế dạ dày tiết acid cơ bản và
khi bị kích thích do bất kỳ tác nhân kích thích nào. Vì vậy, LPZ được dùng
điều trị ngắn ngày chứng loét dạ dày - tá tràng và điều trị dài ngày các chứng
tăng tiết dịch tiêu hóa bệnh lý (hội chứng Zollinger - Ellison, u đa tuyến nội
tiết, tăng dưỡng bào hệ thống).
Mức độ tiết acid dạ dày phụ thuộc vào liều dùng và thời gian điều trị,
như
ng LPZ ức chế tiết acid tốt hơn các chất đối kháng thụ thể H
2
.
LPZ có thể ngăn chặn Helicobacter pylori ở người bị loét dạ dày - tá
tràng bị nhiễm xoắn khuẩn này. Khi dùng phối hợp với một hoặc nhiều thuốc
kháng sinh (amoxicilin, clarithromycin, metronidazol…), LPZ có hiệu quả
trong diệt H. pylori trong loét dạ dày - tá tràng do H. pylori [2], [4], [39].
Hấp thu:
LPZ được hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa, C

max
đạt được sau khi
uống khoảng 1,7 giờ và sinh khả dụng đạt trên 80%. Ở người khỏe mạnh,
trung bình (± SD) nửa đời trong máu là 1,5 (± 1) giờ. Cả C
max
và AUC đều
giảm khoảng 50% đến 70% nếu LPZ được dùng 30 phút sau ăn, LPZ không
bị tác động bởi thức ăn khi dùng trước bữa ăn [2], [4], [39].
Phân bố:


5
Có 97% LPZ liên kết với protein huyết tương. Sự liên kết này là cố
định trên khoảng nồng độ LPZ từ 0,05 đến 5 µg/ml [2], [4], [39].
Chuyển hóa:
LPZ được chuyển hóa mạnh ở gan. Hai chất chuyển hóa chính được
tìm thấy trong huyết tương là dẫn chất hydroxy sulfinyl và sulfon của LPZ.
Các dạng chất chuyển hóa có rất ít hoặc không có tác dụng chống tiết acid.
Nửa đời thải trừ trong huyết tương của LPZ ít hơn 2 giờ, tuy nhiên tác dụng
chống tiết acid kéo dài trên 24 gi
ờ. Vì vậy, nửa đời thải trừ trong huyết tương
của LPZ không phản ánh thời gian của sự chống tiết acid dịch vị [2], [4], [39].
Thải trừ:
Trong một nghiên cứu, sau khi uống một liều đơn LPZ có gắn C14,
khoảng 1/3 liều uống được thải trừ qua nước tiểu và 2/3 được thải trừ qua
phân. Thải trừ LPZ bị kéo dài ở người bị bệnh gan nặng, nhưng không thay
đổi ở ng
ười suy thận nặng, do vậy cần giảm liều đối với người bị bệnh gan
nặng [2], [4], [39].
Tương tác thuốc:

LPZ có thể cản trở việc hấp thu của các thuốc khác mà pH dạ dày là
yếu tố quan trọng đối với sinh khả dụng của thuốc đó (ví dụ: Ketoconazol, các
ester của ampicilin, các muối sắt, digoxin).
LPZ được chuyển hóa qua hệ cytochrom P
450
, đặc biệt là qua CYP3A4
và CYP2C19, nên tương tác với các thuốc khác được chuyển hóa bởi cùng hệ
enzym này. Do vậy, không nên dùng LPZ cùng với các thuốc khác cũng được
chuyển hóa bởi cytochrom P
450
.
Sucrafat làm chậm và giảm hấp thu LPZ (khoảng 30%) [2], [4], [39].
1.1.3. Các phương pháp định lượng Lansoprasol
Nhiều phương pháp khác nhau định lượng LPZ trong dịch hòa tan và
trong huyết tương đã được công bố.
1.1.3.1. Định lượng trong dịch hòa tan


6
• Phương pháp điện di mao quản: Yi-Hui Lin và Shou-Mei Wu đã nghiên
cứu định lượng LPZ trong viên nang LPZ 30 mg bằng phương pháp điện di
mao quản. Phương pháp có khoảng tuyến tính từ 5 - 100 mM với hệ số tương
quan r = 0,9990. Độ đúng của phương pháp lớn hơn 95%. Phương pháp có
giới hạn phát hiện là 20 µM [24].
• Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC):
M. Vijey Aanandhi và cộng sự đã nghiên cứu định lượng LPZ và
domperidon bằng phươ
ng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao. Phương pháp
cho phép xác định nồng độ LPZ và domperidon từ 100 - 500 ng/vết, dung môi
khai triển là hỗn hợp của toluen – isopropanol – cloroform - ACN (4 : 3 : 6 :

2), giá trị R
f
của LPZ và domperidon lần lượt là 0,22 và 0,76 [7].
• Phương pháp HPLC
- Dược điển Mỹ 32 (USP 32) định lượng LPZ bằng phương pháp HPLC
với điều kiện như sau: Pha động là hỗn hợp gồm nước : ACN : triethylamin
(60 : 40 : 1) đã điều chỉnh pH về 7,0 bằng acid phosphoric; Detector UV đặt ở
285 nm; Cột sắc ký C18 25 cm x 4,6 mm, 5 µm. Dung dịch chuẩn, dung dịch
thử và dung dịch chuẩn nội (4’- ethoxyacetophenon) được chuẩn bị trong hỗn
hợp gồ
m: nước - ACN - triethylamin (60 : 40 : 1), được điều chỉnh pH về 10,0
bằng acid phosphoric [35].
- Zeinab Abdelaziz El-Sherif và cộng sự đã định lượng LPZ trong các
chế phẩm bằng RP - HPLC, phát hiện bằng detector UV ở 280 nm với pha
động là hỗn hợp dung dịch kali dihydrophosphat 0,05 M : MeOH : ACN (5 :
3 : 2), điều chỉnh pH về 7,0 bằng dung dịch KOH 1 M; tốc độ dòng 1,5
ml/phút; khoảng tuyến tính là 2 - 20 µg/ml, độ đúng của phương pháp là
100,61%, giới hạn định lượng là 0,55 µg/ml [15].
- Prasanna Reddy và cộng sự đã đưa ra phương pháp định lượng LPZ và
PPZ trong viên nén chứa LPZ và PPZ bằng phương pháp HPLC với cột C18,
150 x 4,6 mm, 5 µm; pha động là hỗn hợp gồm ACN - đệm phosphat (60 : 40)


7
điều chỉnh pH về 7,0; tốc độ dòng 1,0 ml/phút; detector UV ở bước sóng 260
nm. Phương pháp có giới hạn phát hiện là 2,5 ng/ml với PPZ và 2,7 ng/ml với
LPZ. Giới hạn định lượng là 8,2 ng/ml với PPZ và 9,8 ng/ml với LPZ [31] .
- S.Muthu Kumar

và cộng sự đã sử dụng pha động là: Đệm dinatri

hydrophosphat điều chỉnh đến pH 3,0 bằng dung dịch acid phosphoric 0,5%
và ACN với tỷ lệ 30 : 70; sử dụng cột Phenomenex Luna C8, (5 µm, 250 mm
x 4,6 mm) với tốc độ dòng 1,0 ml/phút; detector UV ở 285 nm; khoảng tuyến
tính với nồng độ LPZ từ 40 - 60 µg/ml [23].
- Các tác giả: Vaithiyanathan Sree Janardhanan và cộng sự đã phát triển
phương pháp định lượng PPZ, Rabeprazol (RPZ), LPZ và domperidon trong
chế phẩm bằng một quy trình HPLC, phương pháp sử dụng cột Phenomenex
Gemini C18 (150 mm x 4,6 mm; 5µm); pha động là hỗn hợp: MeOH - ACN -
Dung dịch dikali hydrophosphat 20 mM điều chỉnh pH đến 7,0 bằng acid
phosphoric (20 : 33 : 47); tốc độ dòng 1,1 ml/phút; bước sóng phát hiện ở 280
nm, thể tích tiêm 20 µl. Với LPZ, khoảng tuyến tính từ 0,75 µg/ml đến 7,5
µg/ml với R
2
> 0,999; giới hạn phát hiện là 1,76 ng/ml, giới hạn định lượng là
5,36 ng/ml [19].
- Prasanna Reddy.Battu và Venkateswara Reddy đã nghiên cứu định
lượng LPZ trong chế phẩm và trong huyết tương bằng HPLC, với điều kiện
sắc ký như sau: Cột C18, 150 mm x 4,6 mm; 5 µm. Pha động là hỗn hợp
ACN - Đệm phosphat (70 : 30, điều chỉnh pH đến 7,0); tốc độ dòng 1,0
ml/phút; detector UV ở 260 nm.
Độ đúng của phương pháp là từ 99,15 - 101,85%, độ lặp lại trong ngày
là 0,13 - 1,56% và giữa các ngày là 0,30 - 1,60%. Khoảng tuyến tính từ
0,1 -
30 µg/ml với R
2
= 0,999. Giới hạn phát hiện trong huyết tương là 1,80 ng/ml,
giới hạn định lượng là 5,60 ng/ml [11].
Các phương pháp định lượng LPZ trong dịch hoà tan trên đều có giới
hạn phát hiện (LLOD) và giới hạn định lượng (LLOQ) thấp (LLOD khoảng

8
từ 1,5 đến 3 ng/ml, LLOQ từ 5 đến 10 ng/ml) là do nền mẫu đơn giản, ít yếu
tố ảnh hưởng đến sự tách LPZ qua cột sắc ký.
Ngoài ra, LPZ cũng được định lượng bằng một số phương pháp khác:
Phương pháp UV - VIS [21], [22], phương pháp cực phổ [12], phương pháp
đo động học phản ứng [29].
1.1.3.2. Định lượng trong huyết tương
- Maryam Noubarani và cộng sự đã nghiên cứu phương pháp định lượng
các PPIs: Omeprazol (OPZ), PPZ, LPZ và RPZ trong huy
ết tương bằng
HPLC với cột C18, 150 mm x 4,6 mm; 5 µm; pha động là hỗn hợp gồm đệm
phosphat (Kali dihydrophosphat) 10mM và ACN (53: 47) đã điều chỉnh pH
đến 7,3 bằng triethylamin; với tốc độ dòng là 1 ml/phút. Phát hiện bằng
detector UV ở 290 nm với PPZ và 285 nm với LPZ; thể tích tiêm mẫu là 50
µl; thời gian phân tích cho một quy trình là 10 phút.
+ Định lượng OPZ và LPZ thì PPZ được sử dụng làm chuẩn nội, trong
định lượng PPZ và RPZ thì LPZ được dùng làm chuẩn nội.
+ Phương pháp có khoảng tuyến tính với PPZ là 20- 4000 ng/ml và 20-
3000 ng/ml với LPZ. Ph
ần trăm tìm lại là ≥ 80%, giới hạn định lượng dưới là
20 ng/ml với cả PPZ và LPZ. Sai số trong các ngày và trong một ngày nhỏ
hơn 9,2%.
+ Phương pháp chiết:
Lấy 1ml mẫu huyết tương vào ống thủy tinh 15 ml, thêm 50 µl dung
dịch chuẩn nội và 4 ml tert-butyl methyl ether, lắc trong 3 phút sau đó ly tâm
3000 vòng/phút trong 3 phút. Lớp dung môi hữu cơ được chuyển vào ống
thủy tinh 6 ml và bốc hơi ở 37
0
C dưới dòng khí nitơ

, cắn được hòa tan trong
200 µl pha động, tiêm 50 µl dung dịch này vào hệ thống sắc ký [27].
- H.A. Dugger và cộng sự đã đánh giá tương đương sinh học giữa
Lanfast
®
và Lansor
®
, sử dụng phương pháp định lượng LPZ trong huyết
tương bằng phương pháp HPLC với chuẩn nội là megesterol acetat, chiết LPZ


9
từ huyết tương bằng cách thêm vào 1 ml huyết tương 6 ml dung dịch chuẩn
nội megesterol acetat 0,13 µg/ml trong tert- butyl methyl ether, ly tâm, lấy lớp
dung môi hữu cơ, bốc hơi đến khô dưới dòng khí nitơ, cắn thu được hòa tan
trong 100 µl MeOH rồi tiêm sắc ký với điều kiện: Pha động gồm ACN và
đệm kali dihydrophosphat pH 4,5 (46: 54); tốc độ dòng 1,5 ml/phút; bước
sóng phát hiện ở 285 nm; giới hạn định lượng của phương pháp là 20 ng/ml
[14].
- A. Avgerinos và cộng sự nghiên cứu định lượng LPZ trong dịch sinh
học và trong chế phẩm bằng phương pháp HPLC, sử dụng acid niflumic làm
chuẩn nội. Với điều kiện sắc ký là cột pha đảo C18, 25 cm x 4,6 mm, 5 µm có
tiền cột 100 mm x 2,0 mm; nhiệt độ đặt ở 40
0
C; pha động là hỗn hợp ACN-
dung dịch natri acetat 0,1 M (40: 60), điều chỉnh pH đến 3,3 bằng acid acetic;
detector UV ở 230 nm; tốc độ dòng 1,5 ml/phút; thể tích tiêm mẫu là 100 µl.
Với điều kiện sắc ký trên, thời gian lưu là 5,2 phút với acid niflumic và 6,7
phút đối với LPZ.

Phương pháp chiết: Thêm 1ml dung dịch chuẩn nội pha trong MeOH
vào 0,5 ml huyết tương, trộn đều trong 30 giây, ly tâm 2100 vòng trong 10
phút, tiêm 100 µl lớp dịch phía trên vào hệ thống sắc ký [9].
Phương pháp trên sử dụng pH của pha động là 3,3, trong khi LPZ dễ bị
phân hủ
y khi ở pH thấp, do vậy sử dụng pH của pha động bằng 3,3 là chưa
hợp lý.
- K. Borner cùng cộng sự cũng đã nghiên cứu định lượng LPZ trong
huyết tương bằng phương pháp HPLC. Phương pháp sử dụng dung dịch p-
hydroxybenzoic acid n-butyl ester có nồng độ 10 mg/l trong nước làm chuẩn
nội. Dung dịch gốc LPZ được pha trong dung dịch dinatri carbonat 0,1 M.
Các dung dịch huyết tương chuẩn và thử được pha loãng từ dung dịch gốc
LPZ và huyết tương trắ
ng. Các dung dịch trên được bảo quản ở -27
0
C và rã
đông ngay trước khi sử dụng.


10
+ Điều kiện sắc ký được sử dụng là: Cột pha đảo C 18 5µm, 25 cm x 4,0
mm; nhiệt độ cột ở nhiệt độ phòng. Pha động là hỗn hợp gồm 400 ml ACN,
600 ml nước và 1 ml n-octylamine, điều chỉnh đến pH 7,0 bằng khoảng 0,3
ml acid phosphoric đặc; detector UV ở 283nm; tốc độ dòng 0,9 ml/phút; thể
tích tiêm 40 µl, nhiệt độ buồng bơm mẫu đặt ở 10
0
C.
Với điều kiện trên, thời gian lưu của LPZ là 9,8 phút và 18,0 phút với
chuẩn nội, thời gian phân tích cho một quy trình là 25 phút.
+ Phương pháp chiết: 500 µl huyết tương được trộn đều với 100 µl dung

dịch chuẩn nội trong ống plastic. Thêm 6000 µl tert- butyl methyl ether, chiết
trong 10 phút, sau đó ly tâm 2600 vòng trong 10 phút ở 4
0
C. Lấy 5000 µl dịch
nổi, chuyển vào ống thủy tinh có sẵn 500 µl 1,2-propanediol (0,5%, tt/tt)
trong tert- butyl methyl ether. Bốc hơi hết dung môi (không đun nóng). Cắn
được hòa tan trong pha động và tiêm sắc ký.
Phương pháp có khoảng tuyến tính là 0,2 – 2,0 mg/l; giới hạn phát
hiện: 0,012 mg/l; độ đúng của phương pháp từ 98% đến 106% [13].
Phương pháp trên sử dụng chuẩn nội khó kiếm, quy trình chiết lỏng-
lỏng dễ thực hiện tuy nhiên lượng dung môi chiết lớn và thời gian phân tích
cho một mẫu dài (25 phút) nên chưa phả
i là điều kiện tối ưu.
- Các tác giả: M.D. Karol và cộng sự đưa ra phương pháp định lượng
LPZ và các chất chuyển hóa của LPZ trong huyết tương bằng HPLC với chất
chuẩn nội là OPZ với điều kiện: cột thép không gỉ C18, 150 hoặc 250 mm x
4,6 mm; 5 µm, nhiệt độ cột đặt ở 40
0
C; bước sóng phát hiện ở 285 nm; pha
động gồm ACN- nước (35: 65), có chứa 1 ml/l của n- octylamin và N-
acetohydroxamic acid (NAHA), được điều chỉnh pH về 7,0 bằng acid
phosphoric 85%.
Chạy gradient tốc độ dòng: 1,0 ml/phút trong 15 phút đầu và 2,5
ml/phút trong thời gian còn lại. Thời gian phân tích là 30 phút.
+ Phương pháp chiết:


11
Thêm 150 µl dung dịch chuẩn nội OPZ có nồng độ 4 µg/ml vào 0,5 ml
huyết tương, thêm 5 ml hỗn hợp gồm diethyl ether- methylen clorid (7: 3,

tt/tt), lắc trong 5 phút, sau đó ly tâm 2000 vòng ở 6
0
C trong 10 phút. Lấy 4ml
lớp dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi đến khô dưới áp suất giảm tại nhiệt
độ môi trường. Cắn được hòa tan trong 500 µl pha động và tiêm 100 µl vào
hệ thống sắc ký [20].
Phương pháp này có nhược điểm là sử dụng hệ pha động và cách tiến
hành phức tạp (chạy gradient tốc độ dòng), hóa chất khó kiếm. Chạy với tốc
độ dòng cao (2,5 ml/phút), thời gian lưu của LPZ dài (13,2 phút), thời gian
phân tích cho một mẫu dài (30 phút).
- Đ
iều kiện sắc ký khác định lượng LPZ trong huyết tương:
Cột pha đảo, 250mm x 4,6 mm.
Pha động: Dung dịch NaClO
4
0,5 M- ACN- MeOH (6: 3: 1, tt/tt/tt). Sử
dụng OPZ làm chuẩn nội [25].
- LPZ cũng có thể định lượng trong huyết tương bằng phương pháp
LC/MS, LC/MS/MS [10], [32], [38].
1.1.3.3. Một số phương pháp chiết LPZ trong huyết tương khác
- Tủa protein bằng ACN [11], sau đó ly tâm 15000 vòng trong 10 phút ở
5
0
C, lấy lớp dịch trong để tiêm sắc ký [32].
- Thêm 100 µl dung dịch ethyl p- hydroxylbenzoat trong methylen clorid
(chuẩn nội) và 5 ml hỗn hợp diethyl ether- methylen clorid (6: 4, tt/tt) vào 1ml
mẫu huyết tương. Chiết bằng cách lắc trong 5 phút, sau đó ly tâm 3000 vòng
trong 10 phút. Lấy 4 ml lớp dung môi hữu cơ, chuyển vào ống thủy tinh và
bốc hơi đến khô ở 40
0

C dưới dòng khí N
2
. Cắn được hòa tan trong 200 µl pha
động rồi tiêm sắc ký [28].
- Thêm 100 µl dung dịch chuẩn nội (OPZ nồng độ 2,5 µg/ml trong
MeOH) và 0,5 ml dung dịch NaOH 0,001 M vào 1 ml huyết tương. Lắc xoáy
trong 10 giây, thêm 5 ml dung môi chiết là hỗn hợp diethyl ether-


12
dicloromethan (70: 30, tt/tt). Sau khi lắc 10 phút, hỗn hợp được ly tâm 1700
vòng trong 10 phút ở 4
0
C, lớp dung môi hữu cơ được bốc hơi tới khô trong
chân không ở 60
0
C. Cắn thu được hòa tan trong pha động rồi tiêm sắc ký [37].
- Chiết pha rắn: Sử dụng cột chiết pha rắn Oasis HLB- Waters [26], [27].
Thêm vào 100 µl huyết tương 10 µl dung dịch chuẩn nội OPZ có nồng
độ 2 µg/ml trong MeOH. Sau đó, pha loãng bằng 1 ml nước, lắc bằng máy lắc
vortex trong 30 giây. Cột được hoạt hóa, cân bằng bởi 1 ml MeOH sau đó là 1
ml nước. Đưa hỗn hợp mẫu lên cột, rửa loại tạp bằng 1 ml nước rồi sau đó là
1 ml MeOH 40% trong nước. Rửa giả
i bằng 1 ml MeOH 80% trong nước.
Bốc hơi dịch rửa giải ở 60
0
C trong chân không. Cắn được hòa tan trong 50 µl
MeOH, thêm 50 µl pha động rồi tiêm sắc ký [26].
1.1.4. Một số nghiên cứu về sinh khả dụng của LPZ
Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về sinh khả dụng (SKD) của LPZ

được công bố. Trên thế giới, có một số nghiên cứu về SKD và tương đương
sinh học (TĐSH) của LPZ được công bố như sau:
- Noubarani và cộng sự đã nghiên cứu SKD của viên nang chứa LPZ, lựa
chọn nam giới tình nguyện tuổi t
ừ 20- 45, cân nặng từ 54- 83 kg cho nghiên
cứu. Người tình nguyện đều khoẻ mạnh và không dùng bất kỳ thuốc nào khác
trong quá trình thử nghiệm, nghiên cứu được thông qua hội đồng y đức. Các
mẫu máu được lấy đến 12h sau khi uống một liều đơn LPZ 30 mg (với tên
thương mại Zoton FasTab
®
). Mẫu máu được tách lấy phần huyết tương, bảo
quản ở - 80
0
C tới khi phân tích. Kết quả các thông số dược động học thu được
như sau: với n = 8, T
max
là 1,76 ± 0,71 giờ; C
max
là 1132 ± 340 ng/ml và
AUC
0- ∞
là 2326 ± 1153 (ng.h/ml) [27].
- Một nghiên cứu đánh giá TĐSH giữa Lanfast
®
(thuốc đối chiếu) và
Lansor
®
(thuốc thử), thiết kế nghiên cứu như sau: 26 nam giới tình nguyện,
khoẻ mạnh, độ tuổi từ 18- 45, độ tuổi trung bình 25,1 ± 7,2, cân nặng trung
bình là 76,7 ± 10,9 kg với khoảng cân nặng từ 56,6- 97,4 kg. Tất cả người