Nghiên cứu điều kiện chuyển hóa sucrose thành isomaltulose sử dụng vi sinh vật

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
--------------------------------

KHĨA LUẬN TÓT NGHIỆP
ĐÈ TÀI:

“NGHIÊN CỬU ĐIỀU KIỆN CHUYÊN HÓA SUCROSE
THÀNH ISOMALTULOSE sủ'DỤNG VI SINH VẠT”

Giáo viên hưóng dẫn: PGS. TS. Vũ Nguyên Thành
Sinh viên thực hiện: Truong Thị Tú Anh
Lóp: K20- 1302

Hà Nội - 2017


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

LỜI CẢM ON
Với lòng biết ơn sâu sac em xin gứi lời căm ơn chân thành của mình tới

PGS. TS. Vũ Nguyên Thành đã tận tình hướng dẫn, truyền thụ cho em những
kiến thức chuyên môn vô cùng quý báu cũng như lịng nhiệt tình trong suốt q
trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Em cũng xin bày tỏ lịng biết ơn tới Ban Giám hiệu Viện Đại học Mờ Hà

Nội. Ban Chù nhiệm khoa Công nghệ sinh học và các thày cô giáo Bộ môn đã

động viên chi dần. đóng góp ý kiến và tạo điều kiện thuận lợi đế em hoàn thành

luận văn này.
Đồng thời em xin chân thành cảm ơn ThS.Nguyễn Thanh Thủy và ThS.Cao

Xuân Bách và các anh chị làm việc tại Trung tâm Vi sinh vât Cơng nghiệp -

Viện Cơng nghiệp Thực.phâmiđã nhiệt tình hướng dần. giúp, đỡ em trong suốt
quá trình học tập và hồn thành đề tài nghiên cứu của mình..
Cuối cùng, em xin gứi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, những người

đã ln bên cạnh động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập
và nghiên cứu.
Do thời gian và khã năng của bán thân cịn hạn che, vì vậy bài khóa luận
cùa cm khơng tránh khỏi những thiêu sót. Em rất mong nhận được sự chi bảo
cùa thầy cơ và sự đóng góp ý kiến cùa các bạn đế khóa luận cùa em được đầy
đù và hoàn chinh hơn.

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Sinh viên
Trương Thị Tú Anh
Trương Thị Tú Anh - 1302


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học
MỰC LỰC

LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................1

PHẦN 1: TÔNG QUAN..................................................................................... 4
1.1

Đường Isomaltulose................................................................................... 4

1.1.1

Cấu trúc của Isomaltulose........................................................................4

1.1.2

Tính chất của đường Isomaltulose......................................................... 5

1.1.3

Enzyme chuyến hóa sucrose thành isomaltulose................................... 6

1.2

Đặc điêm sinh hóa...................................................................................... 8

1.2.1

Khả năng tiêu hóa..................................................................................... 8

1.2.2

Sự trao đổi chất........................................................................................9

1.2.3

Vai trò và chức năng ciịa đường Isomaltulose

Tnử vĩẹn Viẹn Đặĩ nọc Mo Hà Nối

..................... 11

1.3

Tinh hình sản xuất đường Isomaltulose trên thế giới............................12

1.4

Tinh hình sản xuất Isomaltulose ở Việt Nam........................................ 13

PHÀN 2: VẶT LIỆU VÀ PHUONG PHÁP NGHIÊN cửu..................... 13

Nguyên vật liệu......................................................................................... 13

2.1

2.1.1

Chủng giống............................................................................................14

2.1.2

Hóa chất.................................................................................................. 15

2.1.3

Thành phần các mơi trường dùng trong nghiên cứu............................ 15

2.2

Máy móc. thiết bị...................................................................................... 16

2.3

Các phương pháp nghiên cứu................................................................. 17

2.3.1

Nuôi cấy vi sinh vật................................................................................ 17

Trương Thị Tú Anh - 1302


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

2.3.2

Nhuộm tế bào vi khuẩn Gram............................................................... 17

2.3.3

Điều kiện chuyến hóa sucrose thành isomaltulose.............................. 18

2.3.4

Các yếu tố ành hường đến quá trình chuyến hóa sucrose thành

isomaltulose

....................................................................................................19

Các phương pháp phân tích..................................................................... 22

2.4
2.4.1

Phương pháp xác định đường khử bằng DNS......................................22

2.4.2

Phương pháp sắc ký lóng hiệu năng cao (HPLC)............................... 25

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................ 27

3.1

Tuyển chọn chủng có khả năng sinh enzyme chuyến hóa hiệu suất cao....
........................................................................................................ 27

3.2

Đặc điểm hình thái và phân loại vi khuấn...............................................32

3.3

Điều kiện chuyến hckd'suerbsk thẳìíh htịbiẩìtkííosea..b.1.;34

3.3.1

Thời gian chuyển hóa............................................................................ 35

3.3.2

Ảnh hướng cùa pH trong q trìnhchuyển hóa.................................... 36

3.3.3

Ánh hường của nhiệt độ q trình chuyển hóa.................................... 38

3.3.4

Anh hưởng của nồng độ cơ chất.......................................................... 39

3.4

Quy trình sản xuất isomaltulose trong phịng thí nghiệm..................... 41

PHÀN 4: KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ........................................................ 43

4.1

Kết luận...................................................................................................... 43

4.2

Kiến nghị.................................................................................................. 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................45

Trương Thị Tú Anh - 1302


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

nhũng tù viết tất
PCA

Plate count agar

SPY

Sucrose peptone yeast extract

rpm

Revolutions Per Minute

DNS

Dinitrosalicylic acid

WHO

World Health Organization

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

GI

Glycemic Index

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

Trương Thị Tú Anh - 1302


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học
DANH MỤC BẢNG

Bảng I Danh sách mẫu và các chủng vi khuấn sinh isomaltulose................... 14

Bàng 2 Tỉ lệ pha đệm axit axetic..................................................................... 20
Bảng 3 Ti lệ pha đệm sodium phosphate.........................................................21
Bảng 4 Pha nồng độ đường của đường chuấn................................................. 23

Bàng 5 Hình thái tế bào của các chủng được lựa chọn khảo sát................... 33

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

Trương Thị Tú Anh - 1302


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Sơ đồ chuyền hóa của sucrose dưới tác dụng cùa sucrose.................... 5
Hình 2 Cơng thức cấu tạo cùa Isomaltulose....................................................... 6

Hình 3. Đồ thị đường chuấn Isomaltulose......................................................... 24
Hình 4. Đồ thị đường chuẩn............................................................................... 26

Hình 5 So sánh nồng độ đường khử tống sàn phẩm theo DNS cũa 23 chúng
ISB và CBS......................................................................................................... 28

Hình 6 Kết q phân tích nồng độ glucose, isomaltulose, sucrose cùa 23
chủng 1SB và chùng CBS theo HPLC.............................................................. 29

Hình 7. Sơ đồ cây phân loại các chủng chuyến hóa sucrose thành
isomaltulose......................................................................................................... 31

Hình 8 Hình thái khuấn lạc và te bào cùa các chùng chủng vi khuấn............ 33
Hình 9 Thí nghiệm kháo sát theo thịi gian lấy mẫu tại các thời điếm: Oh, 111.

2h,3h,4h,5h,6h, 12h,24h...................................................................................... 35

Hình 10 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng cùa pH tại pH 3, pH 4, pH 5, pH 6,
pH 7, pH 8........................................................................................................... 37

Hình 11 Thí nghiệm kháo sát ãnh hường của nhiệt độ bao gồm 20°C, 30°C,

40°C, 50°C, 60°C, 70°C.................................................................................... 38

Hình 12 Thí nghiệm khảo sát với các nồng dộ cơ chất bao gồm 10%, 20%,
30%, 40%, 50%, 60%......................................................................................... 39

Hình 13 Hiệu suất chuyển hóa sucrose thành isomaltulose......................... 40

Hình 14 Quy trình công nghệ sản xuất isomaltulose từ sucrose................. 41

Trương Thị Tú Anh - 1302


MỞ ĐÀU
Theo cảnh báo của Tố chức Y tế thế giới (WHO), cho đến nay, có khống

I tỷ trong số gần 7 tỷ người trên thể giới bị thừa cân, trong đó có 400 triệu
người mắc bệnh béo phì. Bên cạnh béo phì do yếu tố di truyền thì lối sống,
những tiện ích của xã hội hiện đại như dành nhiều thời gian xem truyền hình,
chơi video game, sử dụng máy tính liên tục, dành ít thời gian lập the dục

khiến người ta ít vận động thê lực. Bên cạnh đó cịn cả những ngun nhân
như chế độ dinh dưỡng khơng hợp lý. ngày nay mọi người có xu hướng thích
đồ ăn nhanh hay các loại bánh kẹo chứa nhiều chất béo sẽ làm các chất béo

tích tụ trong cơ thế đó là những ngun nhân chính. Tĩ lệ béo phì và thừa cân
đang tăng lên đột ngột tại các quốc gia nghèo hơn, chứ không chỉ tại các nước

giàu và dự báo trước một gánh nặng các bệnh mãn tính như tiếu đường, tim,
huyết áp. ung thư. lỗng xương... Mồi năm. chi phí chữa béo phì chiếm từ 2%

đến 8% ngân sách dành cho yựế cùa mỗi quốc gia này..
Đối với bệnh tiểu đường, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cho là “Cơn sóng

thần tàn phá sức khịe tồn cầu”. Tuy Việt Nam khơng phải là nước có tỉ lệ
mắc bệnh tiếu đường lớn nhất the giới nhưng là nước có bệnh tiếu đường phát

triến nhanh nhất thế giới. Hiện có khoảng 4,8 triệu người mắc bệnh tiểu

đường và con số này sẽ tăng lên 7 đến 8 triệu người vào năm 2025, đó là
khuyến cáo từ Viện nghiên cứu Chiến lược phòng chống bệnh tiếu đường ở
Việt Nam.

Chính từ mối lo ngại đó, trong gần 20 năm qua, các nhà khoa học đã

nghiên cứu, lựa chọn và tìm ra phương pháp sản xuất các loại đường chức
năng có nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe như: chống bệnh tiều đường,
chống béo phì. khơng gây sâu răng, có khă năng kích thích hoạt động của hệ

tiêu hóa... Điển hình là các loại đường chức năng: mannitol, sorbitol, xylitol.

Trương Thị Tú Anh - 1302

1

galactose, isomalulose, xylo-oligosacarit, v.v... Trong đó isomaltulose là một
loại đường chức năng đang được nhiều nhà nghiên cứu chú ý bời ưu điếm
chính cùa loại đường này là khơng gây ra những tác dụng phụ như các loại

đường hóa học và có nhiều lợi ích cụ thể cho cơ thể con người cùng với một
số đặc tính ưu việt hơn. Đặc biệt gần đây người ta đã chứng minh rằng

isomaltulose còn tốt cho chức năng cùa não, tăng bộ nhớ.
Hiện nay, isomaltulose đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực

phẩm và dược phẩm. Đi đầu trong sán xuất những sàn phấm này là tập đoàn

Siidzucker của Đức cũng là nhà sán xuất đường lớn nhất cùa châu Âu. Ngoài
ra, Cerestar (thuộc tập đoàn Cargill) và Shin Mitsui (Nhật) cũng là các công

ty lớn sản xuất isomaltulose. Isomaltulose công nghiệp được sản xuất từ
sucrose qua phán ứng đồng phân hố bời enzyme sucrose isomerase. Cơng
nghệ sản xuất isomaltulose phổ biến nhất hiện nay trên thế giới là sử dụng tế

bào cố định của ProtơminobaCter rubturn.

Nhận thấy tính thực tiễn đó, với mong muốn nâng cao hiệu suất chuyển
hóa và giâm chi phí sàn xuất isomaltulose từ đường mía (sucrose) vì Việt
Nam là một trong những quốc gia có nguồn nguyên liệu đường sucrose dồi

dào. Vậy nên trong đề tài này chúng tơi tập trung "Nghiên cún điểu kiện
chuyến hóa sucrose thành isomaltulose nhờ vi sinh vật"

Trương Thị Tú Anh - 1302

2


Nội dung nghiên cứu:

-

Chọn được chúng có hiệu suất chuyển hóa sucrose thành isomaltulose

với hiệu suất 85-90%.

-

Điều kiện chuyến hóa sucrose thành isomaltulose

-

Xây dựng qui trình sàn xuất isomaltulose trong phịng thí nghiệm

Mục tiêu:
Sàn xuất được đường thế hệ mới - Isomaltulose từ đường sucrose (đường

mía) bằng cách sư dụng chế phẩm enzyme sucrose isomerase được sinh từ

chùng vi khuẩn phân lập tại Việt Nam.

Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội

Trương Thị Tú Anh - 1302

3


1
1.1

TƠNG QUAN

Đường Isomaltulose
Isomaltulose cịn được biết đen với tên thương mại Palatinose, giống như

sucrose (đường ăn) nó có the được tiêu hóa thành glucose và fructose. Trong

khi sucrose glucose và fructose được liên kết với một liên kết gọi là a-1,2
glycosidic, trong isomaltulose liên kết là a-1,6 glycosidic nên isomaltulose

được người và động vật tiêu thụ chậm. Khi so sánh với sucrose, isomaltulose

phóng thích glucose vào máu với tốc độ chậm, điều này dần đến cung cấp

năng lượng cân bằng và kéo dài hơn dưới dạng glucose. Isomaltulose có trong
mật ong tự nhiên và chiết xuất mía đường, có vị tương tự như sucrose với độ

ngọt khoảng 42% so với sucrose (2], Isomaltulose có thế được sử dụng trong
đồ uống, các sàn phẩm ngũ cốc, các sán phẩm sữa dựa trên, bánh kẹo, các sản

phẩm bánh, mứt cam. sú^>, nước-sốtQà nìórĩ trẩng miệng Vẳ cịn là một thành
phần trong mỹ phẩm, và thuốc men.

Enzyme và nguồn của isomaltulose đã được phát hiện ở Đức vào năm

1950. Đến năm 1957, nhà sinh hóa Weidenhagen Sudzucker đã đã phát hiện

ra cách sản xuất isomaltulose từ vi khuấn Protaminobacter rubrum và thành
công kết tinh một loại đường đôi được tinh chế tự nhiên từ củ cãi đường |51.

1.1.1 Cẩu trúc của ỉsoinaltulose

Tên hoá học của isomaltulose là 6-O-a-Dglucopyranosyl-D-fructofuranose
(CAS. 13718-94-0), là một đồng phân của sucrose. Isomaltulose được sàn
xuất từ sucrose thông qua chuyến hóa enzyme trong đó liên kết 1,2-glycosid

giữa glucose và fructose được thay the bàng liên kết 1,6-glycosid.

Sucrose (OC1-P2) (không khử)
Trương Thị Tú Anh - 1302

Isomaltulose («!-(,) (đường

4


khử)

Sucrose
isomerase
[glucose]

[fructose]

Hình 1 Sơ đồ chuyến hóa cùa sucrose dưới tác dụng cùa sucrose.

1.1.2 Tính chất của dưànig Isomaltulose
Isomaltulose có tính chất vật lí và căm quan gần giống với sucrose, có giá

trị năng lượng như sucrose. Độ nhớt của cả hai loại dịch đường là tương tự.

Isomaltulose nóng chãy ở nhiệt độ thấp (123-124°C). So với sucrose,
isomaltulose khó'thủy phân hơn phụ thuộc yào pH. Isomaltulose (dung dịch

10%) ốn định trong hơn 30 phút khi ủ ở pH 1.0 ờ 95°c, trong khi đó sucrose
(dung dịch 10%) gần như được thủy phân hoàn toàn trong cùng điều kiện 18].

Ngoài ra, isomaltulose cho thấy caramel hóa ít hơn trong q trình xứ lý nhiệt

hơn sucrose, vì nhiệt độ nóng chảy thấp hơn và sự ốn định cao hơn của liên
kết glycosid [8]. Isomaltulose tham gia vào các phàn ứng màu nâu cùa

Maillard. Giống như sucrose, nó được tiêu hóa hồn tồn và cung cấp cùng

một lượng calo khoảng 4 kcal nhưng với dịng năng lượng kéo dài so với
sucrose (160-185°C). Nhìn chung, tính chất hố lý cùa isomaltulose cho phép

thay the sucrose trong hầu hết thức ăn ngọt [6], Hình 2 biếu diễn công thức
cấu tạo và một số thông số vật lý của isomaltulose.

Trương Thị Tú Anh - 1302

5

Hình 2 Cơng thức cấu tạo của Isomaltulose
Isomaltulose
CAS: 13718-94-0
Cơng thức phân tứ: C12H22O1 | H;O
Khối lượng phân tử: 360.3
Nhiệt độ nóng cháy: 123-124 °C

Biếu hiện bên ngồi: Tinh thê trang

111U V JLV11 V 1V11 Ju/ại live 1V1V liu 1W1
1.1.3 Enzyme chuyển hóa sucrose thành isotnaltulose

Isomaltulose được tạo thành bời sự sắp xếp lại liên kết a-1,2 glycosidic
thành a-1,6 glycosidic dưới sự xúc tác của enzyme sucrose-isomerase 110]

Nhiều enzyme sản xuất isomaltulose vi khuẩn đã được tinh chế và đặc trưng.
Bao gồm các dạng tự nhiên cùa enzyme từ Ervinia rhapontici NX-5, Ervinia
sp. DI2, Serratìaplymuthica ATCC15928, Klebsiella sp., Pseudomonas

mesoacidophila MX-45, và dạng tái tổ hợp các enzyme từ E. rhapontici

NCPPB 1578, dạng tái tố hợp các enzyme từ E. rhapontici DSM 4484
(GenBank accession No. AAK28735. 1), E. rhapontici NX-5(ADJ56407.2),

Enterobacter sp. FMB-l(ACF42098.1), p.mesoacidophila MX-45

(AC005018.1), Protaminobacter rubrum CBS 574.77 (CAF32985.1),
Klebsiella pneumonia NK33-98-8 (AAM96902.1), Pantoea dispersa UQ68J

Trương Thị Tú Anh - 1302

6


(A AP57083.1), Klebsiella planticola UQ14S (AAP57085.1) và Klebsiella
sp. LX3 (AAK82938.1).

Sucrose isomerase của p. rubrum gồm 628 axit amin, khối lượng phân
tử 69,8 kDa. Bời vì sự khác biệt đáng kể trong trình tự và tính chất enzyme,
sucrose isomerase với các tên gọi khác nhau được sử dụng để phân biệt gen

sucrose isomerase trong các vi sinh vật khác nhau: smuA cho p. rubrum, Pali

cho Erwinia, Klebsiella, Enterobacter, sim cho p. dispersa và mutB cho

isomerase sucrose-trehalulose của p. mesoacidophila. Trong thiên nhiên,
isomaltulose có lẽ đóng vai trị giúp vật chù cạnh tranh giành nguồn dinh

dưỡng với các vi sinh vật khác trong môi trường giàu sucrose bời phần lớn vi
sinh vật khơng có khă năng sử dụng isomaltulose. Ngồi ra, isomaltulose cịn

có khả năng ức chế enzyme invertase của nấm men và do vậy hạn chế việc sử
dụng đường sucrose trong mơi trường.

Enzyme sucrose isomeras’e (SI) (EC 5.4.99.11) (cịn gọi là isomaltulose

synthase) chịu trách nhiệm chuyển hóa sucrose thành isomaltulose lần đầu
tiên được tách chiết từ Protaminobacter rubrum bởi Weidenhagen và Lorenz

năm 1957. Isomaltulose tồn tại với số lượng rất nhò trong tự nhiên và rất khó
để được tổng hợp hóa học. Vì vậy Isomaltulose được tạo thành bởi sự sắp xếp

lại liên kết a-1,2 glycosidic thành a-1,6 glycosidic dưới sự xúc tác của enzym
sucrose-isomerase Hiện nay sản xuất isomaltulose công nghiệp vẫn được
thực hiện sử dụng tế bào cố định cùa Protaminobacter rubrum. Sucrose

isomerase ngồi ra cịn được tìm thấy ở nhiều vi sinh vật khác, trong đó có
Serratia plymuthica

NCIB 8285, Erwinia rhapontici NCPPB 1579,

Klebsiella sp. LX3, K. planticola CCRC

19112, Pantoea dispersa,

Agrobacterium radiobacter MX-332 và Pseudomonas mesoacidophila MX45, Enterobacter sp. FMB-1 [11]. Chủng công nghiệp Protaminobacter rubrum

CBS 574.77 (CBS) là vi khuấn Gram âm, yếm khí tùy ý, khơng di chuyến và
Trương Thị Tú Anh - 1302

7


hình que. Isomaltulose đã được các nhà khoa học nước Nhật Bán nghiên cứu
từ những năm 1980 đế xem xét độ an toàn. Đen năm 1985, chúng được kết

luận là sản phấm tiêu dùng an tồn và chính phú đã phê duyệt sử dụng
Isomaltulose vào công nghệ thực phẩm và đồ uống.

1.2

Đặc điểm sinh hóa
Q trình tiêu hóa và trao đối chất trong các nghiên cứu in vitro cho thay

isomaltulose có thể bị thủy phân bởi các enzym đường ruột, nhưng tốc độ

chậm lại đáng kề so với sucrose. Isomaltulose sử dụng niêm mạc ruột non ờ
người như là một nguồn enzyme, việc bơ sung sucrose dẫn đến sự phóng

thích glucose cao gấp sáu lần so với sau khi bổ sung một lượng isomaltulose.

Các thí nghiệm in vivo cho thấy isomaltulose gần như được thủy phân hoàn
toàn và hấp thu vào ruột non [6|.

I -ì 1 m
1.2.1
Kha năng1-hPi.Úện
tiêu hóa

Viện Đại học Mở Hà Nội

Các nghiên cứu in vitro cho thấy disaccharidase đường ruột từ các lồi
khác nhau có thế thúy phân isomaltulose, nhưng tý lệ này chậm so với các
loại đường như sucrose hoặc maltose.

Trong nghiên cứu trên chuột cống [9, 12] Vmax cho sự thủy phân của
isomaltulose bang các màng ngoài cùa màng nhầy là 2- 4% so với Vmax đoi
với maltoza và 11-12% so với sucrose. Enzyme đường ruột đồng nhất từ heo

trưởng thành thủy phân isomaltulose với tỳ lệ 2-5% so với maltose và 10-20%

so với sucrose. Trong các nghiên cứu sử dụng niêm mạc ruột non ở người nhó

như là nguồn enzyme, isomaltulose đã được thủy phân với Vmax = 8 so với
maltose, và 26-45% so với 11% như sucrose |6|.

Các phức hợp sucrose / isomaltase, như đã được làm sạch từ ruột chuột và
người, thấy thủy phân isomaltulose trong ruột với ti lệ gan như đồng nhất.
Trương Thị Tú Anh - 1302

8


Phức hệ glucoamylase / maltase cùa chuột và người không thổ thủy phân
isomaltulose. Ớ lợn, isomaltulose được cắt bàng đường sucrase / isomaltase ớ

ruột cũng như glucoamylase / maltase. Các nghiên cứu tiếp theo chi ra rằng,
trong ruột non ở người, thúy phân isomaltulose được xúc tác bới isomaltase,
vì nhiệt khơng hoạt hóa cùa isomaltase, trong khi hoạt tính sucrose hầu như
khơng bị ảnh hường bời q trình xử lý nhiệt [6].

Các nghiên cứu với liều lặp lại đã được thực hiện ờ lợn với một tố chức tái

tố chức ở cuối ruột cũng như ở heo khơng định tính, đe theo dõi q trình tiêu
hóa enzyme trong ruột non riêng biệt với quá trình lên men ờ ruột già. Mặc dù

liều lượng tương đối cao (20% isomaltulose hoặc sucrose trong khẩu phần)
khơng có sự khác biệt rõ rệt giữa chuyển hóa giữa sucrose và isomaltulose. Ờ
chuột, chì có một lượng nhỏ chất phóng xạ có thể tìm thấy trong phân và nước

tiểu sau khi uống liều uống đơn(lên đến 0,5 g / kg thế trọng) của isomaltulose
|6]. Các nghiên cứu Hỉ yịvo với chuột và lợn đã chi rạ.rằng isomaltulose hầu

như được thủy phân hoàn toàn và hấp thu vào ruột non.

1.2.2 Sự trao đoi chất
Do quá trình thúy phân chậm trong suốt q trình đi tiêu hóa, tăng đường
huyết, fructose và insulin sau khi uống isomaltulose chậm hơn so với sucrose.
Điều này đã được tìm thấy trong cá hai đổi tượng khóe mạnh và bệnh tiếu

đường [6]. Điều này làm cho isomaltulose một đường đầy hứa hẹn cho người
bị tiếu đường và những người bị các chứng bệnh tiền tiếu đường như kháng

insulin hoặc hội chứng chuyến hóa.
Trong các nghiên cứu thứ nghiệm trên động vật và người đã chi ra ràng
isomaltulose được chuyến hóa và bài tiết qua nước tiểu.

Trương Thị Tú Anh - 1302

9


Sau khi truyền tĩnh mạch cho chó (2 g / con), bài tiết isomaltulose qua

đường tiếu (83% liều dùng) và sucrose (76%), cho thấy ràng chi có một phan
nhơ các đường này được chuyến hóa. Isomaltulose tiêm tĩnh mạch (tiêm bắp,
0.5 g / kg thể trọng trên 90 phút) làm tăng glucose trong máu và nồng độ
insulin trong bệnh tiểu đường streptozotocin nhẹ và bình thường, ơ chuột và

chó,isomaltulose trong ruột ít nhất một phan bị thúy phân. Sau khi truyền tĩnh
mạch isomaltulose ờ chó (5,5 mg / kg thế trọng / phút trong 90 phút), nồng độ

đường huyết và insulin trong huyết tương tăng trong vòng 15 phút sau khi

truyền bắt đầu. Mức isomaltulose tiếp tục gia tăng cho đến khi kết thúc truyền
dịch, và song song với sự tăng lên của isomaltulose và fructose trong nước

tiếu, trong khi fructose trong huyết tương không bị ành hưởng. Theo dõi đến
120 phút sau khi bắt đầu, vẫn ở mức cơ bàn khơng có dấu hiệu tăng

triglycerid máu [6].

Từ những kết quá trên có thê thấy rằng ỡ một chuột .và chó isomaltulose bị
thúy phân. Sau khi dùng isomaltulose cho người (0,5g), hơn 88% liều được
tìm thấy là disaccharide cịn ngun vẹn trong nước tiêu, cho thấy hầu như

khơng có hệ thống nào có sự trao đối chất, 65% liều được bài tiết trong vịng
2,5 giờ sau khi dùng [6].
Vì isomaltulose cho thấy cung cấp glucose máu ổn định ở mức đường

huyết thấp và tương ứng với cấu hình insulin, việc uống isomaltulose có liên
quan đen sự oxy hóa chất béo được cài thiện so với các carbohydrate thực

phấm thông thường. Như vậy, isomaltulose có thể làm tăng lượng chất béo
được sử dụng như năng lượng và do đó giúp ngăn ngừa tăng cân và sức đề

kháng [6].

Trương Thị Tú Anh - 1302

10


Ngoài ra, trái ngược với sucrose, isomaltulose được lên men và ức chế

hiệu q sự hình thành glucans khơng hịa tan trong nước, cho thấy nó đặc

biệt thích hợp để dùng thay the sucrose [6],
Một nghiên cứu in vitro và in vivo sinh hóa và độc tính ở nhiều lồi khác

nhau, trong đó cà con người, đã được tiến hành đồ đánh giá sự an toàn của

isomaltulose đế sử dụng như một đường không gây ung thư. Ket quà nghiên

cứu in vivo và ìn vitro cho thấy isomaltulose dần dần được tiêu hóa hồn tồn
trong ruột non. Glucose và đường fructose được hấp thụ và chuyến hóa. Do

sự phân húy và hấp thu hoàn toàn, ngay cả liều cao đường uống cùa
isomaltulose khơng gây khó chịu đường tiêu hóa. Đường glucose trong máu

và đáp ứng insulin chậm hơn có thế đặc biệt thuận lợi cho những bệnh tiếu

đường và tình trạng tiền tiều đường 16],
Các nghiên cứu về độc tính và con người không tiết lộ các tác dụng phụ. Vì
vậy các nhà khoa học đã kết lùậụ rằng việc sử dụng isomãltulose như một loại

đường khác có thế khơng gây nguy hiềm cho sức khoẻ [61.

1.2.3 Vai trò và chức năng của dường Isomaltulose

Isomaltulose đóng vai trị dự trữ carbohydrate hoặc cung cấp năng lượng

cho p. rubrum. Isomaltulose được đánh giá là một sự thay thế hợp lí cho
sucrose bời rất nhiều ưu điểm:

- Không gây hại cho răng vì các vi khuấn răng miệng khơng thế phân
hủy được loại đường này

-

Không gây ãnh hưởng đáng kề tới nồng độ đường và insulin trong máu,

giúp ồn định đường huyết
-

Isomaltulose là loại đường “chậm” có chi số đường huyết thấp (GI:32,

thấp tương đương với đậu nành, sữa chua trái cây).
Trương Thị Tú Anh - 1302

11


-

Duy trì độ ngọt trong thực phẩm lên men và đồ uống

Không hút ầm như sucrose và lactose, do vậy thực phẩm chứa

isomaltulose bền và ổn định hơn.

-

Kích thích sự phát triển của Bifidobacteria có ích trong hệ vi sinh vật

của ruột người.

- Có lợi cho sức khóe con người, tốt cho chức năng não và làm chậm quá
trình lão hóa.

1.3

Tình hình sản xuất đường Isomaltulose trên thế giới
Hiện nay nhu cầu thay thế việc sử dụng sucrose bang một loại đường khác

ngày càng gia tăng do những ảnh hướng khơng tốt của nó tới sức khoẻ con

người. Đường isomaltulose được ứng dụng rộng rãi trong sân xuất thực phấm
và dược phấm. Nhu cầu sư dụng isomaltuỊose ước tính khoảng 3.000 tấn/năm.

Tĩiĩr Viện vieriI Đại 110c lyiaTia 1NỌĨ

Tại các nước Châu Âu, đi đầu trong sàn xuất những sàn phâm này là tập
đoàn Siidzucker cùa Đức cũng là nhà sàn xuất đường lớn nhất của châu Âu,
với thương hiệu Palatinose do Beneo-Palatinit, với 2 sản phấm là Palatinose™
(kẹo cao su. nước tăng lực, bột dinh dưỡng, bánh quy, chocolate, kem...) và

galenlQ™ (dược).
Cơ quan Quán lý Thực phẩm và Dược phấm Hịa Kỳ (FDA) đã cơng

nhận an tồn và phê chuẩn sử dụng sàn phẩm Palatinose (Isomaltulose) vào

tháng 3/2006. Sau đó FDA còn tài trợ đế phát triền việc dùng đường
Isomaltulose thay đường mía trong sán xuất chế biến một số thực phấm.

Ớ các nước Châu Á, Cerestar (thuộc tập đoàn Cargill) và Shin Mitsui

(Nhật) cũng là các công ty lớn săn xuất các chế phẩm của isomaltulose.
Ngoài ra, tại Hàn Quốc các nhà khoa học đã nghiên cứu chùng
Enterobacter sp. FMB-1 có khă năng chuyên hóa sucrose thành isomaltulose
Trương Thị Tú Anh - 1302

12


với hiệu suất trên 90%. Chủng Klebsiella sp. LX3 có khá năng chuyến hóa

trên 99% sucrose thành sàn phâm chứa trên 87% isomaltulose. Tại Malaysia:

Đại học Y khoa Putra Malaysia đã nghiên cứu về vai trò của isomaltulose trên
trẻ em. Họ cho nhóm trẻ tham gia nghiên cứu uống sữa tăng cường loại đường

này. Ket quà nhận được là tré em gia tăng nhận thức và tập trung học tập một
cách dáng kê. Vì vậy các nhà nghiên cứu nước này khuyến khích người dân
dùng đường isomaltulose trong các sàn phấm đế giúp trẻ tăng nhận thức. Tại

Trung Quốc, các nhà nghiên cứu đã khắng định lợi ích chống sâu răng của

isomaltulose. Hệ thống quy định trong luật cúa Trung Quốc cho thấy chất
ngọt trong thực phấm có chứa từ 70% isomaltulose trở lên sẽ đủ điều kiện ghi

trên nhãn mác dịng chữ “khơng gây sâu răng".

1.4

lình hình sản xuất Isomaltulose ở Việt Nam
Isomaltulose mới xuất .Hiện ỜỈỶÍệt Nám ttong vài năm gần đây nhưng thực

tế nhiều người dân đã biết đến loại đường này. Một số công ty kinh doanh

thực phẩm đang giới thiệu chào hàng sản phẩm này với mục đích ăn kiêng

giám cân, phịng ngừa tiêu đường, hồ trợ trẻ em phát triền trí não...Phố biến
nhất là các công ty sân xuất sữa họ đã nam bat cư hội đê phát triền như nhãn
hàng Dutch Lady thuộc cơng ty FrieslandCampina Việt Nam đưa ra dịng săn
phầm Dutch Lady Gold có bổ sung isomaltulose giúp cung cấp năng lượng

dài lâu cho não.
Đường isomaltulose đã được nghiên cứu ờ Viện Cơng nghiệp Thực phấm,

hiệu suất chuyến hóa sucrose thành hồn hợp isomaltulose đạt xấp xi 80%.

2 VẬT LIỆU VÀ PHUONG PHÁP NGHIÊN củu
2.1 Nguyên vật liệu
Trương Thị Tú Anh - 1302

13


2.1.1

Ch ling giống

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các chủng bao gồm 23 chủng vi

khuấn có khả năng chuyển hóa sucrose thành isomaltulose trong bộ sưu tập

giống cùa Viện Công nghiệp Thực phàm và 01 chúng tiếp nhận từ sưu tập
giống CBS (Hà Lan).
Bảng 1 Danh sách mẫu và các chùng vi khuấn sinh isomaltulose

Stt

Địa điềm lấy mẫu

Loại mẫu

Chủng

phân

lập

đưọc
1

Táo thối

Chợ Long Biên

ISB1

2

Quýt thối

Chợ Long Biên

ISB4

3

Đào thối

Chợ Long Biên

ISB5, ISB6

4

Đất đùn

Hồ Mễ Trì, Thanh ISB7
học Mơ Hà Nọi
Xuân

Thư viện Việ iBai
5

Đất đùn

Hồ Mễ Trì, Thanh ISB8

Xuân
6

Phân sâu đục nõn Lát Hoa Ba Vì, Hà Tây
(Cây

chủ

1SB9, ISB10,1SB12,
ISB13, ISB15,

Chukrasia

tabularis A. Juss, sâu hại:

ISB16

Hipsipila robusta)

7

Hoa dại

Thanh Xuân,

Hà 1SB11

Nội
8

Phân giun, rác, hoa thối

Công
Thảo

viên

Bách ISB17, ISB18,

ISB19, ISB21JSB
23, ISB 24,1SB25,

Trương Thị Tú Anh - 1302

14


Địa điểm lấy mẫu

Loại mẫu

Stt

Chủng

phân

lập

được

ISB26, ISB27,

ISB28, ISB29,
ISB30, ISB31

Phân sâu đục thân cây Vên Trạm lâm nghiệp ISB33, ISB36,

9

Vên (Cây chú Anisoptera Bầu Bàn, Bốn Cát, ISB38, ISB39,
costata Korth, Sâu hại: Bình Dương.

ISB41

Xén tóc vàng Colosterna
pollinosa

sulphưrea

Heller) và sâu đục thân
cây Dầu Rái (Cây chủ
Dipterocarpus
alatus
D' .
Thự viên Vie lì
Roxb, Sâu hại: Xén tóc

Đại học Mờ Hà Nội

vàng)

2.1.2

Hóa chất

Hóa chất dùng trong mơi trường phân lập, nuôi cấy và lên men

Sucrose; yeast extract; agar; peptone; CHjCOOH; CHjCOONa;
NaH2PO4.lH2O; Na2HPO4.12H2O.
Hóa chat dùng đê xác định hình thái tế bào, dạng Gram

Crystal violet; ethanol 95%; Ammonium oxalate; Iodine; KI; Acetone;
Safranin o.

2.1.3

Thành phần các môi trường dùng trong nghiên cứu

Trương Thị Tú Anh - 1302

15


Môi trường sinh tông hợp enzyme (SPY)

Sucrose 40 g

Peptone 10 g

Yeast extracts 4 g
Đệm phosphate pH 7,0 (0.1M) 1000 ml

Môi trường được hấp thanh trùng ở nhiệt độ 115°c trong 15 phút.
Mơi trường chun hóa sucrose

Sucrose 200 g
Đệm phosphate pH 7,0 (0.1M) 1000 ml
Môi trường được hấp thanh trùng ở nhiệt độ 115°c trong 15 phút.

2.2

Máy móc, thiết bị

_,

Thư viện

Box cây

Viên,Đại học Mở Hà Nội

Cân điện tứ

BioblockScientific, Phầp

Prccisa, Thụy Điển

Kính hiến vi quang học

Eclipse E600, Nikon. Nhật

Lị vi sóng

LG, Hàn Quốc

Máy đo pH
Máy lắc ổn nhiệt

Toledo, Anh
Eppendorf, Đức

Máy ly tâm cao tốc

Heraeus - Sepatech

Nồi hấp thanh trùng

Himayatoko, Nhật

Tú lạnh giữ giống

Electrolux. Thụy Điển

Tủ nuôi cấy

Sanyo. Nhật

Tù sấy

Sanyo, Nhật

Trương Thị Tú Anh - 1302

16


Đĩa petri, ống nghiệm có nắp, ống Eppcndorf, ống Falcon, Pipctman, đầu
côn các loại, que cay các loại...

2.3

Các phương pháp nghiên cúu

2.3.1

Nuôi cay vi sinh vật

Giống vi khuẩn được nuôi trên thạch đĩa PCA, sau 2411 ở 3()°c. Chọn
khuẩn lạc riêng rẽ, trịn đều cấy sang thạch nghiêng PCA ni 24h ở 30°C

2.3.2 Nhuộm tế bào vi khuẩn Gram
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhàm phân biệt các lồi vi
khn thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hố lý
của thành tế bào.
•Hóa chất

-

Dung dịch tím kết tinh (crystal violet - G2SN3H50CI)

-

Dung dịch lod (lodline)

-

Dung dịch tẩy màu: ethanol 95%

-

Dung dịch nhuộm bồ sung: Safranin o

•

Các bước tiến hành

-

Bước 1: Làm vết bơi và cố định tiêu bản

Dùng que cất vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng
hịa vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khơ trong khơng khí,

hơ nhanh viết bơi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lan đế gán chặt vi khuấn
vào phiến kính.
Cố định vết bôi bằng cách nhỏ lên trên vết bôi 1-2 giọt cồn 95°. Đốt

cháy và dập tắt ngay khoáng 10 giây, cố định vết bồi nhàm 3 mục

Trương Thị Tú Anh - 1302

17


địch: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuấn vào phiến kính và làm vết

bơi bát màu tốt hơn

-

Bước 2: Nhuộm màu
1.

Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 30 giây đến 1 phút, rửa
nước.

2.

Nhuộm thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rứa nước.

3.

Nhở dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đen khi vừa thấy mất
màu), rứa nước.

4. Nhuộm tiếp bàng dung dịch safranin hoặc fuchsin trong 1 phút,
rửa nước, để khô. Lần nhuộm này cà 2 nhóm vi khuẩn đều bắt giữ

thuốc nhuộm, nhưng vi khuân Gram dương không bị thay đồi màu

nhiều, trong khi vi khuan Gram âm trở nê đỏ vàng (nhuộm
safranin) hay đó tía (nhuộm fuchsin).

Thư viện Viện Đại học MỜ Hà Nội
2.3.3

-

Diều kiện chuyển hóa sucrose thành isomaltulose
Giống vi khn dược ni trên thạch đĩa PCA. sau 24h ờ 30°C, chọn

khuân lạc riêng rẽ, tròn đều cấy sang thạch nghiêng PCA.

-

Sau 24h ớ 30°C, cấy 2 vịng qua cấy vào 20ml mơi trường SPY

-

Nuôi qua đêm ở 30°C chế độ lắc 150 rpm.

-

Ly tâm 5000 rpm trong 30 phút ờ 10°C.

-

Sinh khối được rửa 2 lần, đầu tiên rửa bằng nước muối sinh lý sau đó tiếp

tục rửa bằng đệm phosphate pH 7 (0,1 M)
Chuyển toàn bộ sinh khối đã rứa vào dung dịch sucrose 20%. lượng tế bào
sẽ chuyến hóa dung dịch sucrose trong 24h ớ 40°C.

Trương Thị Tú Anh - 1302

18