Đề cương luận văn đánh giá hiệu quả chế phẩm thực khuẩn thể phòng bệnh xuất huyết trên cá tra

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN ĐỀ LUẬN VĂN

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ
CỦA CHẾ PHẨM THỰC KHUẨN THỂ
KIỂM SOÁT BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

Sinh viên thực hiện

:

Mã số sinh viên

:

Giảng viên hướng dẫn :

TPHCM tháng 1 năm 2021

1


LỜI CẢM ƠN
Đề Cương Luận Văn là một báo cáo mơ tả chi tiết những gì định làm, cách thức
thực hiện (phương pháp, thời gian) và kết quả dự kiến mong muốn đạt được. Đây là “tấm
bảng đồ chỉ đường” đắc lực của mỗi sinh viên cần chuẩn bị chu đáo trước quá trình làm
luận văn. Đề cương luận văn cùng Luận văn tốt nghiệp là những sản phẩm được tạo ra,

đúc kết kiến thức từ quá trình học hỏi suốt hơn 3 năm ngồi trên ghế nhà trường.
Làm đề cương luận văn là một quá trình giúp mỗi sinh viên nhìn nhận lại các kiến
thức mình đã học và ứng dụng để giải quyết các vấn đề thực tế. Bên cạnh đó cũng giúp
sinh viên rèn luyện các kỹ năng như lên kế hoạch, quản lý thời gian, kỹ năng thuyết trình
cũng như phản biện.
Trong suốt quá trình thực hiện đề cương luận văn em đã nhận được nhiều sự giúp
đỡ từ thầy cơ, gia đình và bạn bè. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Đại học Bách
Khoa đã luôn đồng hành hỗ trợ em suốt quá trình thực hiện đề cương.
Nhân đây em cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô thuộc trường Đại Học Bách
Khoa đã ln tận tình chỉ bảo cho chúng em tận tình và những bài học trong cuộc sống,
đặc biệt là quý thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh học. Cảm ơn gia đình đã ln bên con,
u thương con. Cảm ơn bạn bè đã luôn hỗ trợ mình.

MỤC LỤC

2


3


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CFU
LB
MOI
TE
TSA
TSB
PCR

PFU

Colony-forming unit
Lysogeny broth
multiplicity of infection
Tris and EDTA
Tryptone Soya Agar
Tryptic soy broth
Polymerase chain reaction
Plaque-forming unit

4


DANH MỤC HÌNH

5


DANH MỤC BẢNG

6


Chuyên đề luận văn

CHƯƠNG 1. PHẦN MỞ ĐẦU
1.1

Lý do chọn đề tài

Cá tra là một mặt hàng xuất khẩu chủ lực của Việt Nam và cũng là sản phẩm thủy sản

được nhiều thị trường trên thế giới ưa chuộng. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, việc
sản xuất và tiêu thụ cá tra gặp rất nhiều khó khăn do giá cả bấp bênh, thị trường xuất khẩu
không ổn định, việc nuôi với mật số cao làm cho các bệnh trên cá tra thường xuyên xảy ra
hơn. Các bệnh như gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiellla ictaluri và bệnh xuất huyết do
Aeromonas hydrophila là các bệnh gây thiệt hại nhiều nhất về kinh tế cho người nuôi cá
tra, bệnh đã lây lan và có chiều hướng gia tăng.
Kháng sinh là phương pháp điều trị được sử dụng, chi phí đầu tư cho kháng sinh trong
vốn sản xuất đang ngày càng nhiều, cùng với việc sử dụng kháng sinh các chủng vi khuẩn
kháng thuốc phát triển và trở nên rất khó điều trị. Để giải quyết vấn đề này, thực khuẩn
thể là một phương pháp tiềm năng. Thực khuẩn thể có tính đặc hiệu tấn cơng vào vi khuẩn
đích nên khơng làm hại các vi sinh vật có lợi trong mơi trường xung quanh, không gây
bệnh cho con người hay động vật khác; thực khuẩn thể cũng có khả năng đồng tiến hóa
với vi khuẩn nên có thể kiềm hãm sự phát triển của vi khuẩn kháng phage; thực khuẩn thể
có thể được sản xuất bằng cách lên men vi khuẩn trong môi trường giá rẻ và chỉ cần một
lượng nhỏ để bắt đầu . Các nghiên cứu về thực khuẩn thể đang cho những kết quả rất tốt ở
quy mô phịng thí nghiệm. Tuy nhiên ở quy mơ in vivo thì chưa được nhiều.
Nhằm để đánh giá hiệu quả của chế phẩm thực khuẩn thể trong việc kiểm soát bệnh
gan thận mủ trên cá tra ở quy mô in vitro, kết quả sẽ là nền tảng cho các nghiên cứu ở quy
mô lớn hơn và tương lai việc sản xuất các chế phẩm thực khuẩn thể trị bệnh trên thủy sản
nói chung sẽ được phát triển mạnh mẽ, trước là để giảm thiệt hại do dịch bệnh, sau là có
thể đẩy lùi vấn đề nhức nhối hiện nay: “vi khuẩn kháng kháng sinh”.
1.2

Đối tượng
1.2.1
Cá tra

7

Chuyên đề luận văn

Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá da trơn, nước ngọt, sống chủ yếu
ở đồng bằng Sông Cửu Long, là một trong những mặt hàng xuất khẩu thứ hai, chiếm
23.2% tổng xuất khẩu thủy sản cả nước, tạo ra 8.6 tỷ đô la Mỹ cho nền kinh tế quốc dân
mỗi năm. Tuy nhiên những năm gần đây việc sản xuất và xuất khẩu cá tra đang gặp nhiều
vấn đề khó khăn như giá cả bấp bênh, thị trường xuất khẩu không ổn định đặc biệt là
trong năm 2020 giá cá tra xuống thấp do dịch bệnh COVID-19 và một số bệnh trên cá tra
khiến người nuôi phải chịu lỗ nặng nề.
Ba tác nhận gây bệnh thường xuất hiện trên cá tra là vi khuẩn (Edwardsiellla
ictaluri, Aeromonas hydrophila, Flavobacterium columnare, ...), kí sinh trùng và vi nấm.
Trong đó tác nhân gây thiệt hại to lớn nhất là Edwardsiellla ictaluri gây bệnh gan thận mủ
trên cá tra và Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết [1] . Trong những năm gần đây
dịch bệnh bùng phát và lây lan trên diện rộng vì vậy cần phải tìm ra những phương pháp
có hiệu quả nhanh chóng để đẩy lùi bệnh và giảm thiệt hại cho người nông dân.
1.2.2 Bệnh gan thận mủ
Bệnh gan thận mủ là một trong những bệnh lý thường gặp ở cá tra gây tổn thất nặng
nề cho người nuôi, thường xảy ra vào mùa lũ khoảng tháng 7 đến tháng 9. Bệnh này có
khả năng xuất hiện 3 đến 5 lần trong một chu kì ni, xuất hiện hầu hết ở các giai đoạn
phát triển của cá tra gây thiệt hại nặng nề nhất ở giai đoạn giống từ 10-50% [2].
Khi bệnh cá có biểu hiện bên ngồi không rõ ràng, tách đàn, bơi lờ đờ, bỏ ăn và tỉ lệ
chết cao xuất hiện nhiều đốm trắng đục kích cở 1-3 mm trên gan, thận và tỳ tạng [1].

Hình 1. 1 Nội tạng của cá tra bị gan thận mủ
8


Chuyên đề luận văn

1.2.3

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri – Nguyên nhân gây bệnh gan thận mủ
Vi khuẩn E. ictaluri thuộc giống Edwardsiella, họ Enterbacteriaceae, bộ

Enterobacteriales, lớp Gammaproteobacteria và ngành Proteobacteria [3]. Loài vi khuẩn
E.ictaluri là tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho nhiều loài cá và ảnh hưởng nghiêm trọng
cho ngành ni trồng thủy sản trên tồn thế giới [4]. E.ictaluri thuộc nhóm vi khuẩn
Gram âm, hình que, kích thước biến đổi từ 1.2-1.5x 0.4-0.6 µm [5]. Vi khuẩn E. ictaluri
có khả năng di động yếu, không sinh bào tử, yếm khí tùy tiện, có lên men trong mơi
trường glucose. Chúng phát triển tốt ở 28 oC và tăng trưởng chậm hoặc không tăng trưởng
ở 37 oC [6].
1.2.4

Thực khuẩn thể
Thực khuẩn thể: Bacteriophages (còn được gọi là phage) được định nghĩa là virus

lây nhiễm vi khuẩn. Thực khuẩn thể được phát hiện một cách độc lập bởi Frederick Twort
và Felix d’Hérelle vào đầu thế kỉ XX [7],[8]. Các phage đã được thiết kế trong điều trị,
tuy nhiên do sự phổ biến của kháng sinh lúc bấy giờ nên liệu pháp phage dần trở nên bị
quên lãng, mặc dù nghiên cứu về thực khuẩn thể vẫn được tiếp tục ở Liên Xô cũ ( Georgia
và Nga) và Ba Lan [9].
Dưới kính hiển vi phage có cấu trúc đa dạng và phức tạp. Phần lớn các phage đã biết là
virus có đi thuộc bộ Caudovirales. Chúng được cấu tạo bởi lớp vỏ capsid bao gồm các
protein hoặc lipoprotein bảo vệ vật liệu di truyền là DNA hay RNA cùng với đi. Đi
có thể nhận dạng vật chủ thông qua các thụ thể ở sợi đi (Hình 1.1) [9].

9

Chun đề luận văn

Hình 1. 2 Mơ phỏng thực khuẩn thể thuộc bộ Caudoviriales
Thực khuẩn thể trong nghiên cứu này có tên G7 được phân lập từ gan cá tra được
thu thập từ các chợ ở thành phố Hồ Chí Minh. Đặc điểm của vịng sinh tan: có tâm trong
và vịng ngồi mờ, vỏ capsid thực khuẩn thể G7 có hình khối đa diện và khơng có đi,
kích thước sấp sỉ 48 nm. Thực khuẩn thể có chu kì xâm nhiễm kéo dài 55 phút với hệ số
nhân 71.7 ± 3.77 [10].

Hình 1. 3 Hình chụp thực khuẩn thể G7 dưới kính hiển vi điện tử.
1.3

Mục tiêu của đề tài
Đề tài: “Đánh giá hiệu quả của chế phẩm thực khuẩn thể kiểm soát bệnh gan thận

mủ trên cá tra với mục tiêu: xác định được những kết quả liên quan đến hiệu quả của chế
phẩm phage để tạo cơ sở cho việc tính tốn liều lượng phage phù hợp trong việc kiểm
10


Chuyên đề luận văn

soát bệnh gan thận mủ trên cá tra : tỷ lệ giữa phage và vi khuẩn mà hiệu quả nhất trong
việc điều trị bệnh gan thận mủ, xác định số lượng phage giải phóng của phage ra môi
trường nước để đánh giá việc phun chế phẩm chứa phage lên viên thức ăn liệu có hiệu quả
khơng.
1.4 Nội dung nghiên cứu của đề tài
Nội dung nghiên cứu của đề tài “Đánh giá hiệu quả của chế phẩm thực khuẩn thể
kiểm soát bệnh gan thận mủ trên cá tra” bao gồm:


Khảo sát sự tương quan giữa mật độ thực khuẩn thể và vi khuẩn (liều lượng
phage) lên hiệu quả điều trị bệnh gan thận mủ trên cá tra đã bị gây nhiễm bệnh
qua việc tính tỷ lệ tử vong tích lũy khi cho cá ăn bằng viên thức ăn có phun

1.5



phage với mật độ xác định.
Khảo sát sự giải phóng phage vào trong nước khi cho cá ăn viên thức ăn có



phun phage
Giải phẩu cá và kiểm tra vi khuẩn gây bệnh bằng phản ứng PCR với cặp mồi

đặc hiệu.
Các nghiên cứu trong và ngoài nước
1.5.1 Các nghiên cứu ngồi nước
Việc nghiên cứu về thực khuẩn thể đã có nhiều chuyển biến tích cực trong những

năm qua . Từ phân lập, đánh giá họat tính, ngày càng tìm được nhiều phage có tính đặc
hiệu, ổn định phù hợp sản xuất quy mô lớn, nghiên cứu về liều lượng , hiệu quả của vi
khuẩn in vivo. Thử nghiệm in vivo chưa được tiến hành nhiều trên quy mô thủy sản.
Năm 2014, tác giả Rói Hammershaimb Christiansen đã tiến hành phát hiện, định
lượng phage tiêu diệt vi khuẩn Flavobacterium psychrophilum gây bệnh trên cá hồi thông
qua đường miệng quy mô in vitro. Trong nghiên cứu nhóm tác giả kiểm tra sự tồn tại của
phage FpV-9 một phage đặc hiệu tiêu diệt vi khuẩn Flavobacterium psychrophilum gây
bệnh trên cá hồi với quy mơ in vivo, thí nghiệm khảo sát ba con đường phân phối phage

vào cơ thể của cá: ngâm, đặt ống qua đường miệng vào dạ dày cá và cho cá ăn bằng thức
ăn được phun chế phẩm phage. Trong đó việc sử dụng viên thức ăn có phun phage đã phát
hiện ra các phage trong ruột, lá lách và thận sau 1 giờ kể từ khi cho ăn với mật độ phage
11


Chuyên đề luận văn

khoảng 104 PFU/mg ruột, 101 PFU/ mg lá lách. Thí nghiệm này chứng minh phage có khả
năng sống sót khi đi qua dạ dày cá và đến ruột, bân cạnh đó cũng cho kết quá được phage
có thể chịu đựng được thời gian dài hút ẩm trên viên thức ăn chăn ni với 60% tỷ lệ sống
sót ở -80 oC và 10% tỷ lệ sống sót ở 5 oC trong 8 tháng [11]. Đây là thí nghiệm có ý nghĩa
cho các nghiên cứu hiệu quả của phage trong kiểm sốt bệnh quy mơ in vitro về sau.
Năm 2015 tác giả Yolanda J. Silv cùng cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của thực
khuẩn thể kiểm soát Aeromonas salmonicid trên cá Solea senegalensis. Mục đích của
nghiên cứu này là để kiểm tra hiệu quả của liệu pháp phage để vơ hiệu hóa vi khuẩn
Aeromonas salmonicida, tác nhân gây bệnh nhọt, một bệnh cá đặc trưng bởi tỷ lệ tử vong
và tỷ lệ mắc bệnh cao. Để đạt được mục tiêu này, một thể thực khuẩn mới đã được phân
lập, xác định đặc điểm và thử nghiệm ở những con non Solea senegalensis bị gây nhiễm
bệnh. Kết quả cho thấy sau 6 giờ xử lý, thể thực khuẩn đã ức chế sự phát triển của A.
salmonicida cả trong môi trường ni cấy và nước biển khi có cá con (≈ 4 và 2,5 Log
PFU mL-1, tương ứng). Sau 72 giờ, cá con được xử lý bằng phage sau khi tiếp xúc với A.
salmonicida khơng có tỷ lệ tử vong, trái ngược với những cá chỉ tiếp xúc với vi khuẩn
này, tỷ lệ tử vong là 36%. Kết quả này chỉ ra rằng việc điều trị phage đã có hiệu quả. Bên
cạnh đó trong nghiên cứu người ta quan sát thấy sự phát triển hạn chế của các tế bào vi
khuẩn kháng thuốc và khơng có sự chuyển đổi lysogeny. Không phát hiện thấy tác động
đáng kể nào của việc cấy thực khuẩn lên các quần xã vi khuẩn tự nhiên trong nước nuôi
trồng thủy sản. Tuy nhiên, cộng đồng vi khuẩn có liên quan đến đường ruột cá bị ảnh
hưởng vừa phải khi bổ sung phage . Có tính đến điều này, nghiên cứu này cung cấp bằng
chứng cho thấy thực khuẩn thể đã được thử nghiệm có thể chống lại bệnh nhọt hiệu quả

và an toàn trong quá trình sản xuất cá con [12].
1.5.2 Các nghiên cứu trong nước
Đối với việc thử nghiệm chế phẩm phage ở quy mơ in vivo cũng có một số nghiên
cứu trên bệnh xuất huyết của cá tra, tuy nhiên chưa có nghiên cứu thử nghiệm nào đối với
việc sử dụng phage điều trị bệnh gan thận mủ trên cá tra.

12


Chuyên đề luận văn

Năm 2017, tác giả Tuấn Sơn Lê đã nghiên cứu hiệu quả kiểm soát của thực khuẩn
thể lên chủng A. hydrophila trên cá tra. Trong nghiên cứu tác giả có khảo sát tỷ lệ tử vong
tích lũy của cá bằng cách tiêm phage. Tổng cộng 360 con cá tra khỏe mạnh (30 g/ con)
được chia thành 12 nhóm trong các bể nhựa 50 L ở 30 ± 1 oC. Tất cả cá xử lý phage đều
được tiêm A. hydrophila ( nồng độ cao nhất : 3.2 x 10 6 CFU/ con), sau đó được tiêm
phage coocktail ( MOI 0.01; 1; 100). Đối chứng dương bao gồm cá tiêm A. hydrophila .
Đối chứng âm tích 1 và 2 là cá không tiêm và cá được tiêm chất lỏng tách ra từ nước dùng
có chứa vi khuẩn và mơi trường tương ứng. Chế phẩm phage bao gồm hỗn hợp 2 phage
Φ2 và Φ5. Tỷ lệ cá chết được ghi lại 12 giờ trong tám ngày. Gan và thận của cá chết và cá
sống đều được nghiên cứu phân lập vi khuẩn. Việc phân lập vi khuẩn cho thấy rằng cá
chết do A.hydrophila.. Kết quả: Đối chứng âm tính 1 (cá khơng bị tiêm thuốc) và đối
chứng âm tính 2 (cá được tiêm môi trường tăng trưởng được lọc để loại bỏ tế bào vi
khuẩn) do thấy cá không bị chết, cho thấy rằng môi trường đối chứng không bị nhiễm tác
nhân nào bất lợi về sức khỏe của cá. Cá da trơn ở đối chứng dương tính ( nhiễm
A.hydrophila) khơng được xử lý bằng phage thì tỷ lệ chết bắt đầu vào ngày thứ 2 với tỷ lệ
tử vong tích lũy 81,67 ± 2,36%. Ngược lại, cá được xử lý với phage cho thấy tỷ lệ tử vong
thấp hơn ở mỗi MOI khác nhau (p <0,01). Trong khi không quan sát thấy tỷ lệ tử vong ở
các nhóm được điều trị bằng MOI 100, tỷ lệ tử vong tích lũy ở các nhóm khác là 45%
(MOI 1) và 68,33 ± 2,36% (MOI 0,01) vào cuối tám ngày thí nghiệm [13].

Bên cạnh đó gần đây nhóm tác giả Dang T.H. Oanh đã tiến hành khảo sát hiệu quả
của chế phẩm phage lên việc điều trị bệnh xuất huyết trên cá tra qua việc cho cá ăn bằng
thức ăn có phun chế phẩm phage ( 20 mL/kg). Tỷ lệ giải phóng thực khuẩn thể từ viên
thức ăn vào nước là rất thấp, mật độ thực khuẩn thể trong nước xấp xỉ 1,0 PFU / mL hoặc
khơng thể phát hiện được. Thí nghiệm in vivo đánh giá hiệu quả bảo vệ của phage PVN02
đối với bệnh tụ huyết trùng ở cá da trơn sọc dưa được thực hiện với 21 nhóm gồm 1.260
con cá trong bể nhựa 50-L làm ba lần. Cá da trơn được cho ăn hai lần mỗi ngày bằng thức
ăn viên có phun phage. Các mật độ huyền phù vi khuẩn khác nhau được thêm vào bể
trong 24 giờ. Khơng có sự tồn tại của phage, tỷ lệ chết cao nhất là 68,3 ± 2,9% ở mật độ
huyền phù vi khuẩn cao nhất. Ngược lại, tỷ lệ tử vong ở mật độ huyền phù vi khuẩn cao
13


Chuyên đề luận văn

nhất giảm đáng kể xuống còn 8,33 ± 2,9% hoặc 16,67 ± 2,9% ở liều phage log 6,2 ± 0,09
hoặc log 4,2 ± 0,09 PFU / g. Nghiên cứu này cung cấp một phương pháp rất thực tế trong
việc áp dụng liệu pháp phage để ngăn ngừa bệnh tật ở các trại nuôi cá da trơn sọc lớn
[14].

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu
Đề tài: “Đánh giá hiệu quả của chế phẩm thực khuẩn thể kiểm soát bệnh gan thận
mủ trên cá tra” được thực hiện Bố
ở phịng
thí nghiệm khoa Thủy Sản- Đại học Cần Thơ với
trí thí nghiệm
trình tự thực hiện nghiên cứu được thể hiện trong sơ đồ sau:
Cho cá ăn thức ăn bổ sung phage

Lây nhiễm vi khuẩn

cá bể
ăn theo mật độ
phage
sátphóng phage trong nước
Đánh
giákhảo
sự giải
Ghi nhận tỷ lệ tử vong tíchKiểm
lũy của
cá nhiệt độCho
tra pH,
nước

Giải phẫu cá- phân lập vi khuẩn

Kiểm tra vi khuẩn bằng PCR

14

Hình 2. 1 Sơ đồ công việc nghiên cứu của đề tài


Chuyên đề luận văn

2.2 Chuẩn bị thí nghiệm
2.2.1 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong nghiên cứu này được phân lập từ mẫu cá tra
bị bệnh gan thận mủ, lưu trữ và được hoạt hóa trên mơi tường TSA ở 28 oC trong 24 giờ,

sau đó được kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Dịch vi khuẩn với mật độ xác định: 10 3, 104, 105, 106, 107 CFU/mL sẽ được phịng
thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học ở đại học Bách Khoa chuẩn bị.
2.2.2 Thực khuẩn thể G7
Phage G7 được pha loãng trong dung dịch đệm SM [100 mM NaCl, 10 mM
MgSO4, 0,01% gelatin, và 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)] và sẽ được phun lên viên thức ăn ở
20 mL/ 600 g) để đạt được mật độ phage xấp xỉ 104, 105 và 106 (PFU / g). Cùng một thể
tích phage G7 sẽ được đun nóng ở 100 oC trong 5 phút để làm bất hoạt hoàn toàn thực
khuẩn thể và cũng được phun tương tự lên viên thức ăn để thu được hiệu giá phage là 10 0
(PFU/g).
2.2.3 Cá tra
Trong nghiên cứu này, cá tra sẽ được mua ở nhà cung cấp được cấp phép sau đó
được chuyển về phịng thí nghiệm thuộc khoa Thủy Sản, đại học Cần Thơ để thử nghiệm.
Cá tra khỏe mạnh (khoảng 10 g/ trọng lượng cơ thể) khơng có triệu chứng bệnh gan thận
mủ hoặc bất kỳ bệnh nào khác. Cá sẽ được đặt trong một bể cá chứa đầy 500 lít nước máy
đã khử Clo, sục khí sẽ được áp dụng trong suốt q trình thử nghiệm để đảm bảo cung
cấp đủ lượng khí cho cá sinh trưởng. Thời gian thích nghi của cá sẽ kéo dài một tuần.
15


Chuyên đề luận văn

Trước khi thử nghiệm, một số lượng lớn cá tra ( n=10) sẽ được chọn ngẫu nhiên và giải
phẫu để xác nhận khơng có sự có mặt của A. hydrophila, E. ictaluri hoặc bất kỳ ký sinh
trùng nào. Quy trình thực hiện trên cá sẽ tuân thủ nghiêm ngặt theo quy định của bộ y tế
về chăm sóc và thao tác động vật thí nghiệm.
2.3 Bố trí thí nghiệm
1 260 con cá tra khỏe mạnh được chia làm 21 nhóm đặt trong thùng nhựa chứa
nước có dung tích 50 lít ni ở 30 oC, 20 con/ bể. Mỗi nghiệm thức thực hiện 3 lần. Sơ đồ
bố trí thí nghiệm được thể hiện như hình minh họa:

B3P4

B4P4

B5P4

B6P4

B7P4

B3P5

B4P5

B5P5

B6P5

B7P5

1

2

3

1

2

16


Chuyên đề luận văn

3

B3P6

B4P6

B5P6

B6P6

B7P6

B3P0

B4P0

B5P0

B6P0

B7B0

1

2

3

1

2

3

17


Chun đề luận văn
B0P0

1

2

3

Hình 2. 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Ký hiệu B là viết tắt của Bacteria (vi khuẩn), ký hiệu P là viết tắt của Phage, các số
chỉ nồng độ của vi khuẩn hoặc phage được xử lý.
Bảng 2. 1 Bảng thiết kế thí nghiệm
Nhóm
B3P4
B4P4
B5P4
B6P4

B7P4
B3P5
B4P5
B5P5
B6P5
B7P5
B3P6
B4P6
B5P6
B6P6
B7P6
B3P0
B4P0
B5P0
B6P0
B7P0
B0P0

Vi khuẩn (CFU/ mL)
1.1 × 103
1.1 × 104
1.1 × 105
1.1 × 106
1.1 × 107
1.1 × 103
1.1 × 104
1.1 × 105
1.1 × 106
1.1 × 107
1.1 × 103

1.1 × 104
1.1 × 105
1.1 × 106
1.1 × 107
1.1 × 103
1.1 × 104
1.1 × 105
1.1 × 106
1.1 × 107
0

Phage (PFU/ g)
1.6 × 104
1.6 × 104
1.6 × 104
1.6 × 104
1.6 × 104
1.6 × 105
1.6 × 105
1.6 × 105
1.6 × 105
1.6 × 105
1.6 × 106
1.6 × 106
1.6 × 106
1.6 × 106
1.6 × 106
0
0
0

0
0
0

Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng cả chế phẩm thực khuẩn thể lên cá tra được tiến
hành trong vịng 14 ngày. Với cơng việc các ngày như sau:
•

Ngày 1: Cho cá ăn đã cho phun phage theo mật độ đã thiết kế tuy nhiên lúc này
chưa bổ sung vi khuẩn.

18


Chuyên đề luận văn
•

Ngày 2: Cá sẽ được cho lây nhiễm vi khuẩn với các mật độ đã thiết kế: 10 3, 104,
105, 106, 107 CFU/mL trong 24 giờ.

•

Từ ngày 3 đến ngày 14:
Cho cá ăn ngày 2 lần với viên thức ăn có phun phage . Cơng việc bắt đầu
lúc 6h sáng hằng ngày tiến hành thu 1.4 mL mẫu nước từ mỗi bể trong số 63 bể để
xác định sự có mặt của phage trong nước. Sau 1 tiếng bắt đầu kiểm tra nhiệt độ, pH
của nước nuôi cá. Nhiệt độ và pH phải dao động từ: 26 - 28 oC và 7,25 - 7,5. Sau
12 tiếng, tiếp tục cho cá ăn cử 2 trong ngày, trước ghi cho cá ăn cũng ghi lại số liệu
về nhiệt độ, pH. Tỷ lệ tử vong của cá sẽ được ghi lại hằng ngày trước lúc cho ăn
buổi chiều. Lượng nước thêm vào mỗi ngày khoảng 20-30%.

Gan thận của cá chết sẽ được sử dụng để phân lập vi khuẩn trên mơi trường TSA

sau đó sẽ được PCR với cặp mồi đặc hiệu để xác định một lần nữa về chủng vi khuẩn gây
bệnh [14].
2.4 Thời gian dự kiến thực hiện đề tài
Từ 18/1 đến 3/2 : Tiến hành khảo sát tất cả các thí nghiệm ở phịng thí nghiệm
khoa Thủy sản thuộc Đại học Cần Thơ. Sau đó báo cáo kết quả với giáo viên hướng dẫn
và viết báo cáo luận văn hoàn chỉnh.

19


Chuyên đề luận văn

CHƯƠNG 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1

Tính tốn tỷ lệ tử vong tích lũy hằng ngày của cá
Hằng ngày ghi lại số lượng cá chết theo bảng minh họa nghiệm thức xử lý phage
với nồng độ 1.6 × 104 PFU/mg và tính tốn tỷ lệ tử vong tích lũy.

Bảng 3 1 Bảng ghi lại số liệu cá chết
Nghiệm thức
Ngày
1
2
3
4
5
6

7
8
9
10
11
12
13
14

B3P4
1
2

3

B4P4
1
2

B5P4
1
2

3

3

B6P4
1
2

3

B7P4
1
2

3

Tỷ lệ tử vong tích lũy trong mỗi bể được tính bằng cơng thức:

Có tổng cộng 3 bể cho một nghiệm thức nên sau khi tính tốn ở mỗi bể ta chia 3 để
lấy giá trị trung bình.
Vẽ đồ thị so sánh tỷ lệ tử vong tích lũy sau 14 ngày của các nghiệm thức : không
xử lý phage , xử lý phage với mật độ 1.6 × 104 , 1.6 × 105, 1.6 × 106
Mục đích của thí nghiệm này để đánh giá hiệu quả của chế phẩm thực khuẩn thể
trong điều trị bệnh gan thận mủ. Trong mơi trường nếu có sự có mặt của vi khuẩn mà
khơng có phage, tỷ lệ tử vong tích lũy của cá ngày càng cao, nếu có phage thì tỷ lệ tử
vong sẽ giảm xuống chứng minh hiệu quả của chế phẩm phage, đồng thời giúp ta lựa
chọn được mật độ thực khuẩn thể hiệu quả nhất trong điều trị.
3.2

Xác định mật độ của thực khuẩn thể trong nước
20


Chuyên đề luận văn

Mục đích: để kiểm tra liệu thực khuẩn khi phun vào viên thức ăn phần lớn có bám lên
được viên thức ăn hay không, hay là đã giải phóng ra mơi trường nước

1.4 mL mẫu nước hằng ngày được lấy từ mỗi bể trong số 63 bể trước khi cho cá ăn
bữa sáng khoảng 1 giờ. Ly tâm 1000 vòng/ phút ở 4 oC trong 5 phút, lấy dịch nổi pha
lỗng và chuẩn độ theo trình tự bằng phương pháp Plaque assay để xác định mật độ
phage trong nước. Plaque assay: là một phương pháp phổ biến thường được sử dụng để
định lượng thực khuẩn thể.
100 µL dịch lọc và 200 µL vi khuẩn ni qua đêm vào ống nghiệm chứa TSB 0.5%
agar (đã nấu chảy và giữ ở 37 oC) sau đó votex và đổ hỗn hợp lên đĩa thạch LB 1.5% agar.
Ủ qua đêm tại 30 oC đếm số vịng sinh tan hình thành trên đĩa thạch thì xác định được
PFU/mL dịch lọc.
3.3

Giải phẫu cá- Phân lập vi khuẩn
Cá sau khi chết sẽ được giải phẫu lấy gan, thận để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn.

Tiến hành lấy dịch từ các nốt mủ trên gan, thận trải lên môi trường TSA ủ 28 oC trong 24
giờ. Các khuẩn lạc sẽ được lấy để kiểm tra bằng phản ứng PCR
3.4
3.4.1

Phản ứng PCR
Chiết tách Acid nucleic
Vi khuẩn được nuôi tăng sinh (24 giờ) trong ống nghiệm chứa 5 mL môi trường

LB. Chuyển 1.5 mL dung dịch vi khuẩn sang ống eppendorf và thêm vào 100 µL dung
dịch TE (10nM Tris HCl và 1mM EDTA). Đun ở 95 oC trong 15 phút. Làm lạnh trong
nước đá. Ly tâm 14 000 vòng/ phút trong 2 phút. Rút phần dung dịch ở trên và đo xác
định hàm lượng DNA bằng máy so mày quan phổ ở bước sóng 260 nM theo cơng thức :
Hàm lượng DNA (µg/mL) = Giá trị đo ỏ 260 nm x 50 x độ pha loãng
3.4.2

Khuyếch đại DNA

21


Chuyên đề luận văn

Thành phần hóa học thực hiện phản ứng PCR gồm: 10 X PCR buffer, 1,5 mM
MgCl2, 0,2 μM dNTPs, 5U Taq DNA polymerase, 0.4 μM mồi EiFd-1, 0.4 μM mồi EiRs1, 20 ng DNA mẫu và nước.
Chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng là 95 oC trong 4 phút, 90 oC trong 30 giây, 53 oC trong
45 giây, 72 oC trong 30 giây. Lặp lại chu kỳ trên 30 lần, 72 oC trong 10 phút [15].
3.5

Điện di
Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0.5X và bản thạch chứa 1.5%

agarose. Đọc kết quả dựa vào thang DNA 1kb plus để xác định trọng lượng phân tử.
Trọng lượng phân tử DNA của vi khuẩn E. ictaluri cần phát hiện là 407 bp.
3.6 Xử lý số liệu
Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS Statistics 20. ANOVA được áp dụng
để xác định sự khác biệt đáng kể trong khả năng sống sót của cá nhiễm E. ictaluri sau khi
nhận hoặc không nhận liệu pháp phage. Trong tất cả các phân tích, giá trị xác suất nhỏ
hơn 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê (p <0,05). Độ lệch chuẩn được tính tốn cho tất
cả các thí nghiệm.

22


Chuyên đề luận văn

CHƯƠNG 4. DỰ KIẾN NỘI DUNG LUẬN VĂN
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1
1.1.1
1.1.2
1.2
1.3
1.4

Cá tra
Đặc điểm hình thái
Các bệnh trên cá tra
Vi khuẩn
Thực khuẩn thể
Các nghiên cứu trong và ngoài nước

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
2.2 Sơ đồ nội dung nghiên cứu
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1
Phương pháp tính tỷ lệ tử vong tích lũy
2.3.2
Phương pháp phân lập vi khuẩn
2.3.3
PCR
2.3.4
Điện di
2.3.5

Phương pháp xử lý số liệu
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ chết tích lũy của cá sau 14 ngày với việc điều trị
phage bằng mật độ khác nhau
3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ, pH của nước nuôi cá
3.3 Kết quả giải phẫu cá
3.4 Kết quả PCR- điện di
3.5 Sự có mặt của phage ở trong nước
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 Kết luận
4.2 Kiến nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

23


Chuyên đề luận văn

24


Chuyên đề luận văn

TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]

T. Dung and K. Th, “VÀ QU Ả N LÝ D Ị CH B Ệ NH TRONG NUÔI T ừ Thanh
Dung , Khoa Th ủ y s ản , Trườ ng Đạ i h ọ c C ần Thơ.”

[2]

H. W. Ferguson, J. F. Turnbull, A. Shinn, K. Thompson, T. T. Dung, and M.
Crumlish, “Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from
the Mekong Delta, Vietnam,” J. Fish Dis., vol. 24, no. 9, pp. 509–513, 2001, doi:
10.1046/j.1365-2761.2001.00308.x.

[3]

S. L. Abbott and J. M. Janda, “The Genus Edwardsiella,” The Prokaryotes, pp. 72–
89, 2006, doi: 10.1007/0-387-30746-x_4.

[4]

N. N. Phuoc, R. Richards, and M. Crumlish, “Environmental conditions influence
susceptibility of striped catfish Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage) to
Edwardsiella ictaluri,” Aquaculture, vol. 523, no. May 2019, p. 735226, 2020, doi:
10.1016/j.aquaculture.2020.735226.

[5]

E. B. Shotts, V. S. Blazer, and W. D. Waltman, “Pathogenesis o f Experiment
rdsieIh icta nfectisns in,” Can. J. Fish. Aquat. Sci., vol. 43, pp. 36–42, 1986.

[6]

J. P. Hawke, A. C. McWhorter, A. G. Steigerwalt, and D. J. Brenner, “Edwardsiella
ictaluri sp. nov., the causative agent of enteric septicemia of catfish,” Int. J. Syst.
Bacteriol., vol. 31, no. 4, pp. 396–400, 1981, doi: 10.1099/00207713-31-4-396.

[7]

F. W. Twort, “an Investigation on the Nature of Ultra-Microscopic Viruses.,”
Lancet, vol. 186, no. 4814, pp. 1241–1243, 1915, doi: 10.1016/S01406736(01)20383-3.

[8]

F. Terms, “On an invisible microbe antagonistic to dysentery bacilli . Note by M. F.
d’Herelle, presented by M. Roux. Comptes Rendus Academie des Sciences 1917;
165:373–5

,”

Bacteriophage,

vol.

10.4161/bact.1.1.14941.

25

1,

no.

1,

pp.

3–5,

2011,

doi: