LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHẢO SÁT MỨC ĐỘ THUỶ PHÂN PHOSPHORUS CỦA DỊCH CHIẾT ENZYME TIÊU HOÁ CÁ TRA KẾT HỢP VỚI ENZYME PHYTASE LÊN THỨC ĂN NUÔI CÁ TRA

Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
Phosphorus là khoáng chất đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng thức ăn vật nuôi.
Phosphorus và cũng như các nguyên tố khoáng cần thiết khác được cung cấp chủ yếu qua con
đường thức ăn. Đa số thức ăn cho gia súc có nguồn gốc từ các hạt thực vật đặc biệt là ngũ cốc
và các loại hạt đều có chứa sẵn Phosphorus. Tuy nhiên, Phosphorus có chứa trong nguyên liệu
hạt này có tới 80% nằm dưới dạng phân tử phytate hoặc axit phytic. Phosphorus tồn tại ở
dạng này rất khó tiêu hoá đối với các loài động vật có dạ dày đơn như gia cầm, lợn, cá …
Axit phytic khi kết hợp với các ion kim loại như Fe
3+
, Mg
2+
, Ca
2+
, Zn
2+
… sẽ ngăn cản
khả năng kết hợp của các ion kim loại này với các axit béo không no làm giảm khả năng tiêu
hoá thức ăn của động vật, gây ra hiệu ứng kháng dinh dưỡng.
Ngoài ra do không hấp thu được lượng Phosphorus có sẵn trong axit phytic nên thức
ăn cho động vật dạ dày đơn (ví dụ: cá, gia cầm, heo…) thường phải bổ sung thêm Phosphorus
dẫn đến lượng Phosphorus thừa không được tiêu hoá bị thải ra ngoài theo phân của chúng đã
làm ô nhiễm môi trường gây nên hiện tượng tảo nở hoa bùng phát, ảnh hưởng đến sự phát
triển của các loài thuỷ sản…
Chính vì vậy, để tận dụng nguồn Phosphorus có sẵn trong thành phần của các nguyên
liệu thực vật, tăng hệ số sử dụng thức ăn của vật nuôi, giảm lượng axit phytic thải ra ngoài
môi trường thì việc các hợp chất Phosphorus ở dạng khó phân giải thành này thành các chất
đơn giản và dễ phân giải hơn là rất quan trọng. Để đạt được điều này, người ta đã sử dụng
phytase để thuỷ phân axit phytic.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành khảo sát mức độ thuỷ phân của dịch
chiết enzyme tiêu hoá cá tra kết hợp với enzyme phytase trên thức ăn nuôi cá tra để nâng cao

hiệu quả sử dụng thức ăn nuôi cá tra. Bằng cách ứng dựng phương pháp nghiên cứu in vitro –
là phương pháp phân tích hiện nay đang được quan tâm đề xuất đánh giá khả năng tiêu hoá
của thức ăn thủy sản là kỹ thuật enzym tiêu hoá in vitro bởi vì kỹ thuật đưa ra ý nghĩa làm
giảm yêu cầu về chi phí và thời gian nhằm đánh giá khả năng tiêu hoá của thức ăn.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 1
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. Vai trò của enzym khi bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi [3, 30]
2.1.1. Cơ chế tác động của enzyme
Enzyme được sử dụng như là thức ăn bổ sung được gọi là enzyme ngoại sinh để phân
biệt với enzyme nội sinh - là những enzyme sinh ra trong cơ thể. Enzyme ngoại sinh làm tăng
tỷ lệ tiêu hoá thức ăn theo hai cơ chế:
- Một là, kết hợp với enzyme nội sinh phân giải các hợp chất thành những chất có kích
thước đủ nhỏ để hấp thụ. Như vậy việc lựa chọn enzyme thức ăn sao cho có tác dụng hỗ trợ
cho enzyme nội sinh trong việc phân giải chất dinh dưỡng của thức ăn là cần thiết.
- Hai là, enzyme thức ăn phải giảm được độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hoá thức
ăn, vì chính độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hoá cản trở sự hấp thu thức ăn. Một vài hợp
chất khi giải phóng khỏi vách tế bào đã hình thành các gel làm tăng độ nhớt trong ruột.
Thường các khẩu phần chứa nhiều polysaccharide không phải tinh bột (non – starch
polysaccharides – NSP) gây ra hiện tượng này. Động vật mới sinh ra, đặc biệt là gia cầm rất
nhạy cảm với sự biến đổi độ nhớt vốn được sinh ra trong quá trình tiêu hoá.
Để tăng cường hai cơ chế trên, enzyme thức ăn thường được sản xuất dưới dạng
những chế phẩm đa enzyme để phân giải đồng thời nhiều hợp chất. Ví dụ: nếu dùng β –
glucanase thì chỉ phá vỡ được vách nội nhũ của hạt đại mạch mà không phân giải được
protein chứa trong tế bào chất, vì vậy để phân giải protein trong lớp tế bào chất này phải cần
thêm cả enzyme cellulase và pentosanase.
2.1.2. Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn của lợn, cá, gia cầm
2.1.2.1. Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn của gia cầm [30]
Gà broiler nhạy cảm đối với các chất kháng dinh dưỡng, do vậy để đáp ứng tốt đối với
việc bổ sung enzyme phù hợp vào khẩu phần (β – glucanase đối với khẩu phần lúa mạch,

pentosanase đối với khẩu phần lúa mì, phytase đối với phytate). Bổ sung đa enzyme có lợi
hơn bổ sung enzyme đơn.
Hàm lượng enzyme bổ sung tuỳ thuộc vào tuổi và thành phần khẩu phần. Theo
Schoner et al., (1993), gà broiler 44 ngày tuổi yêu cầu 570 U phytase để giải phóng 1g
Phosphorus; gà 70 ngày tuổi số lượng enzym yêu cầu là 850 U.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 2
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
Gà mái đẻ có nhu cầu bổ sung phytase kém hơn gà broiler tuy nhiên cũng có những
tác dụng như tăng sản lượng trứng và hiệu quả chuyển hoá thức ăn thì cũng thấy rõ ở gà mái
đẻ [3].
2.1.2.2. Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn lợn
So với gia cầm, hiệu quả của enzyme thức ăn trong khẩu phần lợn giữa các nghiên cứu
không thống nhất [3].
Một tổng kết tập hợp kết quả 23 thí nghiệm bổ sung enzyme cho lợn tiến hành từ 1978
đến 1993 đã thấy rằng chỉ có 4 thí nghiệm trên lợn con là có kết quả rõ rệt (Officer, 1995);
còn đối với lợn sinh trưởng- vỗ béo thì kết quả không rõ rệt (Chu et al., 1998). NSP hoà tan
không làm giảm khả năng tiêu hoá thức ăn của lợn như ở gia cầm. Thacker et al. (1998) cho
biết rằng sự chuyển hoá thức ăn và tăng trọng của lợn 20 kg ăn khẩu phần đại mạch giàu
glucan không có sự khác nhau đáng kể nào khi bổ sung β- glucanase vào khẩu phần thức ăn.
Không giống như gia cầm, pentosanase không làm tăng khả năng hấp thụ thức ăn của lợn con.
Bổ sung pentosanase vào khẩu phần lúa mạch không cải thiện được sự tăng trưởng của lợn
20-25kg (Thacker et al. 1991). Bổ sung β-glucanase cho lợn 80kg làm tăng tỷ lệ tiêu hoá chất
khô và protein nhưng sự cải thiện này quá nhỏ để nâng cao hiệu quả chuyển hoá thức ăn và
tăng trọng.
Tuy nhiên, đối với lợn việc bổ sung phytase thì có hiệu quả rõ rệt, phytase đã làm tăng
tích luỹ khoáng và khả năng hấp thụ thức ăn của lợn, giảm được chi phí thức ăn.
Cần chú ý rằng không có mức tiêu chuẩn bổ sung phytase cho tất cả các khẩu phần,
mức phytase bổ sung phụ thuộc vào loài lợn và loại khẩu phần. Yi et al. (1996) cho thấy rằng
số lượng phytase để giải phóng 1g Phosphorus khác nhau từ 785 U (đối với khẩu phần ngô-đỗ
tương) đến 1146 U (đối với khẩu phần đỗ tương tinh chế). Mặt khác đối với Hoppe et al.

(1993) cũng cho rằng với khẩu phần ngô- lúa mạch-đỗ tương cho lợn con thì để giải phóng 1g
Phosphorus chỉ cần 380U. Ngoài ra các nguồn phytase khác nhau thì hoạt tính enzyme cũng
khác nhau (hoạt tính enzyme phytase vi sinh vật lớn hơn phytase lúa mì và làm tăng khả năng
hấp thụ Phosphorus, sự tích luỹ Canxi, Nitơ và giảm Phosphorus thải tiết ở phân). Hiệu quả
của phytase còn chịu sự chi phối của khẩu phần, số bữa ăn, lượng thức ăn cho ăn cũng như
chức năng sinh lý của lợn (bổ sung cùng một lượng phytase vào một khẩu phần thì hiệu quả
nhất là đối với lợn nái tiết sữa sau đến lợn sinh trưởng-vỗ béo, lợn con và thấp nhất là lợn
chửa giữa kỳ) [3].
SVTH: Võ Thị Tố Nga 3
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
2.1.2.3. Bổ sung enzyme vào thức ăn của cá
Trong những năm gần đây nguồn protein động vật như bột cá ngày càng đắt đỏ cho
nên protein thực vật đã được bổ sung vào trong các khẩu phần của cá. Tuy nhiên các nguồn
protein thực vật thì nhiều xơ và chất kháng dinh dưỡng như axit phytic, chất ức chế trypsin,
lecitins Vì vậy vai trò của enzyme ngoại sinh trong khẩu phần các loài thuỷ sản nuôi ngày
càng quan trọng.
Tuy nhiên nhu cầu bổ sung enzyme của cá khác nhau thì khác nhau. Nghiên cứu của
Carter et al. 1992 với α-amylase trên cá hồi Atlantic (Salmon salar) không thấy có ảnh hưởng
đến hiệu quả chuyển hoá thức ăn. Tương tự Renitz (1983) cũng thấy rằng bổ sung enzyme
phân giải protein trong khẩu phần cá hồi rainbow trout không cải thiện được sự tăng trưởng
và hiệu quả chuyển hoá thức ăn. Tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu trên cá hồi của
Gorskova và Yu- Dvinen (1984) và của Carter et al. (1994) thì lại thấy có những cải thiện về
khả năng tiêu hoá thức ăn của cá khi bổ sung enzyme. Nghiên cứu của Ye et al: bổ sung vào
khẩu phần cá chép một hỗn hợp đa enzyme với liều 5 - 10g/kg đã làm cho tốc độ tăng trưởng
của cá tăng hơn 12,3 - 27,5% so với đối chứng.
Đối với cá cũng như các loài động vật dạ dày đơn, phytate là một chất kháng dinh
dưỡng. Enzyme phytase có tác dụng giải phóng Phosphorus, cải thiện tỷ lệ tiêu hoá của
Phosphorus (1000 U phytase/kg thức ăn của cá hồi rainbow trout làm tăng tỷ lệ tiêu hoá
Phosphorus từ 58,6 lên 68,1% Lunari et al. 1998). Nhu cầu bổ sung phytase cũng phụ thuộc
vào loài cá, khối lượng cá và khẩu phần.

2.1.3. Giảm mùi hôi và cải thiện môi trường chăn nuôi [29]
Chất thải chăn nuôi có khả năng gây ô nhiễm môi trường không khí, đất, nước và đặc
biệt là tầng mặt nước. Ở nước ta, tình trạng này có phần nghiêm trọng do nơi chăn nuôi
thường nằm gần hoặc trong khu dân cư, đặc biệt là khi phần lớn các giếng cung cấp nước sinh
hoạt lại khai thác nước ở tầng nước mặt bị ô nhiễm.
Phosphorus thải ra trong phân của vật nuôi là chất gây ô nhiễm đất và nước ngầm.
Phytase có khả năng làm giảm 30 – 50% lượng phosphorus thải ra môi trường do nó giúp làm
giảm lượng Phosphorus bổ sung và hấp thu tối đa lượng Phosphorus sẵn có trong nguyên liệu.
Phytase cũng giúp giải phóng đạm và axit amin, khiến chúng được tiêu hoá và hấp thu tốt
hơn, qua đó làm giảm lượng thải nitơ và lưu huỳnh nên làm giảm mùi hôi và ô nhiễm nguồn
nước.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 4
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
2.2. Sơ lược về axit phytic và enzym phytase
2.2.1. Sơ lược về axit phytic
2.2.1.1. Định nghĩa
Axit phytic là axit hữu cơ, phân tử của nó có chứa các gốc phosphate, tồn tại chủ yếu
trong hạt của các hạt ngũ cốc, đậu đỗ, hạt có dầu. Người ta đã xác định được rằng axit phytic
giữ vai trò nhất định và có những tác động ảnh hưởng đến tính chất dinh dưỡng của các loại
hạt trên.
Axit phytic công thức phân tử C
6
H
18
O
24
P
6
và phân tử lượng là 660,04. Danh pháp quốc
tế của axit phytic được gọi là myo – inositol 1,2,3,4,5,6 – hexakisdihydrogen phosphate.

Thực tế, axit phytic thường tồn tại dưới dạng muối của các kim loại có hoá trị I, II (thường là
K, Mg, Ca). Các muối kim loại này gọi là phytate và chúng được xem như là kho dự trữ
Phosphorus lớn trong các hạt thực vật.
2.2.1.2. Cấu trúc hoá học của axit phytic
Có nhiều nghiên cứu về mô hình cấu trúc phân tử của axit phytic nhưng các nghiên
cứu này lại đưa đến những kết luận rất khác nhau. Trong số các nghiên cứu đó có hai nghiên
cứu tiêu biểu của hai nhóm chuyên gia khác nhau được biết đến nhiều hơn cả. Đó là nhóm
của Johnson & đtg nghiên cứu cấu trúc axit phytic bằng phương pháp cộng hưởng điện từ từ
hạt nhân
31
P (
31
P – NMR) và nhóm của Blank nghiên cứu bằng phương pháp nhiễu xạ tia X.
Tuy nhiên hai nhóm nghiên cứu này lại đưa ra hai kết luận trái ngược nhau. Theo Jonhson thì
trong cấu trúc của phân tử axit phytic có một gốc phosphate ở vị trí số 2 (gốc phosphate gắn
với nguyên tử C số 2 nằm theo hướng trục thẳng đứng còn các gốc phosphate ở vị trí khác thì
có hướng nghiêng một góc so với phương thẳng đứng). Ngược lại, kết luận của tác giả Blank
lại cho rằng các gốc phosphate 1,3,4,5 và 6 nằm theo hướng trục thẳng đứng còn gốc
phosphate nằm ở vị trí số 2 lại nghiêng theo gốc 1/4. Tuy nhiên, kết luận về cấu trúc phân tử
của axit phytic theo phương pháp Johnson được sự tán đồng hơn.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 5
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
Hình 2.1: Mô hình cấu trúc axit phytic. Hình 2.2: Công thức cấu tạo của phytate
2.2.1.3. Nguồn gốc và sự phân bố của axit phytic trong tự nhiên
Axit phytic thường tồn tại ở dạng muối của các ion kim loại có hoá trị một hay nhiều
hoặc có thể là hỗn hợp của chúng. Chẳng hạn như hỗn hợp muối Kali – Magiê trong gạo, hỗn
hợp Canxi – Magiê – Kali trong các hạt đậu tương. Các muối này thường tập trung ở một số
vùng nhất định trong các hạt thực vật như ngũ cốc, đậu đỗ. Axít phytic được tích luỹ dần
trong hạt từ khi hạt còn non đến khi hạt trưởng thành, trong suốt quá trình chín cùng với các
chất dự trữ khác trong hạt như tinh bột, lipid… Tuy nhiên, mức độ tập trung của axit phytic ở

các hạt thực vật khác nhau là không giống nhau. Ví dụ như trong các loại ngũ cốc, axit
phytic được tích luỹ nhiều trong hạt phấn còn đối với các loại đậu thì axit phytic được tích
luỹ nhiều trong các hạt tinh thể của chúng. Nghiên cứu cho thấy rằng, ở cây một lá mầm như
lúa, lúa mì… thì trong nội nhũ và nhân của hạt hầu như không chứa phytate mà lượng
phytate lại được tìm thấy chủ yếu ở phôi và lớp tế bào hạt phấn. Ngược lại, như Ferguson đã
chứng minh ở cây hai lá mầm thì lượng phytate chủ yếu lại nằm trong thành phần nội nhũ
chiếm 99% và chỉ có khoảng 1% là ở trong phôi hay mầm của hạt. Hàm lượng phytate cao
nhất ở hạt ngũ cốc được tìm thấy ở ngô (0,83-2,22%) và các hạt đậu là (5,92-9,1%).
2.2.1.4. Chức năng sinh lý của axit phytic
Phosphorus là một thành phần cấu tạo nên phân tử axit phytic chính vì vậy axit phytic
và các muối của chúng trong các hạt thực vật là một nguồn dự trữ Phosphorus khá dồi dào có
thể tận dụng nhằm cung cấp khoáng chất cho cơ thể. Ngoài ra axit phytic còn là một nguồn
dự trữ năng lượng, nguồn myo-inositol (thành phần cấu tạo nền vỏ ngoài của thành tế bào).
Đối với các hạt thực vật, axit phytic cũng có những ảnh hưởng nhất định đến đặc tính sinh lý
của hạt. Nó tác động đến trạng thái ngủ nghỉ của hạt do nó chống lại sự oxy hoá tự nhiên
SVTH: Võ Thị Tố Nga 6
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
(chống lại sự hô hấp) trong quá trình ngủ nghỉ của các hạt thực vật, vì vậy làm chậm sự phát
triển và có thể làm mất khả năng nảy mầm của các hạt này.
Vào cuối thập kỷ 80, đầu thập kỷ 90 người ta đã chứng minh được vai trò gián tiếp của
inositol phosphate trong quá trình vận chuyển vật chất trong tế bào, đặc biệt là vai trò của
inositol-triphosphate. Chúng là dấu hiệu của sự di truyền tính trạng và có liên quan rất lớn
đến sự biến đổi chức năng của tế bào đối với cả tế bào động vật và thực vật. Bên cạnh những
tác động sinh lý nêu trên, người ta dự đoán rằng axit phytic còn có thể có những chức năng
chưa biết khác
2.2.1.5. Hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic
Một đặc tính bất lợi nổi bật nhất của axit phytic đối với cơ thể động vật là hiệu ứng
kháng dinh dưỡng. Hiệu ứng này tạo nên do cấu trúc bất thường của axit phytic. Khi phân tử
axit phytic ở dạng phân ly hoàn toàn, 6 nhóm phosphate của chúng sẽ mang tổng điện tích
âm 12. Vì vậy, chúng có nhiều khả năng thích hợp với các ion dương hoá trị I, II, III hoặc

hỗn hợp của các ion đó, hình thành nên các hợp chất không hoà tan, rất khó tiêu hoá. Sự hình
thành các hợp chất vô cơ không tan trong đường ruột đã ngăn cản sự hấp thụ các khoáng chất
của cơ thể động vật. Bởi vì axit phytic khi kết hợp với các ion kim loại như: Fe
3+
, Mg
2+
, Ca
2+
,
Zn
2+
… sẽ ngăn cản khả năng kết hợp của các ion kim loại này với các axit béo không no làm
giảm khả năng tiêu hoá thức ăn của động vật. Như vậy, yếu tố này làm giảm lượng khoáng
cần thiết được đưa vào cơ thể động vật qua con đường thức ăn mà lẽ ra cơ thể động vật có
thể hấp thu được, do đó làm giảm giá trị dinh dưỡng của nguồn thức ăn.
Chính vì những nguyên nhân trên mà axit phytic được coi là yếu tố kháng dinh dưỡng
ở động vật, đặc biệt là các động vật có dạ dày đơn ngăn như gia cầm, lợn, và cá. Với một số
nguyên tố vi lượng, ví dụ như Zn thì giá trị dinh dưỡng của nó chịu ảnh hưởng rất lớn bởi
axit phytic. Một vài thí nghiệm đã cho thấy việc bổ sung dần dần axit phytic vào trong khẩu
phần thức ăn của vật nuôi đã gây ảnh hưởng đến sự hấp thụ Zn
2+
của cơ thể (cơ thể không
hấp thụ Zn
2+
) và tốc độ tăng trưởng trọng lượng của động vật thí nghiệm một cách rõ rệt.
Axit phytic có khả năng kết hợp với protein tạo thành phức chất phytate – protein
trong một khoảng pH rất rộng. Ở pH rất thấp, axit phytic mang điện tích âm lớn do sự phân
ly của toàn bộ các gốc phosphate trong phân tử. Trong điều kiện này, axit phytic có thể làm
hạn chế khả năng hoà tan của các protein bởi vì có sự liên kết ion giữa các gốc phosphate cơ
bản với các gốc tự do của amino axit (lysine, histidine, arginine). Trong môi trường có tính

SVTH: Võ Thị Tố Nga 7
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
axit, axit phytic liên kết chặt chẽ với các protein thực vật do đó điểm đẳng điện (pI) của các
protein thực vật lúc này nằm trong khoảng pH = 4 – 5, khoảng pH= 6 – 8 cả axit phytic và
protein thực vật đều mang điện tích âm. Tuy nhiên, ở điều kiện này vẫn có thể hình thành
phức chất giữa axit phytic và protein. Cơ chế xảy ra có thể là sự liên kết trực tiếp của axit
phytic với proton của các nhóm cuối cùng α – NH
2
và ε – NH
2
của gốc lysine tự do hoặc liên
kết qua nhân tố trung gian là một cation đa hoá trị. Cũng bởi liên kết với protein thực vật nên
axit phytic làm giảm khả năng hoà tan và khả năng tiêu hoá của các protein này do đó làm
giảm giá trị dinh dưỡng của chúng.
Ngoài việc tạo phức chất với các khoáng chất và các protein, axit phytic còn tác động
đến các enzyme như trypsine, pepsine, α – amylase, β – galactosidase và kết quả là làm giảm
hoạt tính của các enzyme tiêu hoá quan trọng này.
2.2.2. Sơ lược về enzyme phytase [24, 25, 26]
2.2.2.1. Định nghĩa
Phytase là enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân axit phytic (myo – inositol
hexakisphosphate) thành các myo – inositol phosphate phân tử thấp và các monophosphate vô
cơ. Khi phản ứng thuỷ phân xảy ra hoàn toàn sẽ giải phóng toàn bộ các gốc phosphate trong
phân tử axit phytic và tạo thành các myo – inositol tự do.
Phytase có tên gọi đầy đủ, theo quy ước quốc tế là: myo – inositol hexakisphosphat
phosphohydrolase. Uỷ ban danh pháp enzyme thuộc Hội hoá sinh Quốc tế đã chia phytase
thành hai loại là 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC 3.1.3.26). Các định tên này dựa trên
cơ sở nhóm phosphat đầu tiên được giải phóng khi axit phytic (hay hợp chất phytate) bị tấn
công bởi enzyme.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 8
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

2.2.2.2. Đặc điểm cấu tạo của phytase [26]
Hình 2.3: Cấu trúc toàn bộ của phytase từ vi khuẩn B.amyloliquefacience.
Phytase cũng giống như mọi enzyme khác có bản chất là protein. Chúng là những phân
tử có khối lượng 20kDa đến 100kDa. Kích thước phân tử protein của enzyme phytase sản
sinh từ các nguồn khác nhau cũng khác nhau.
Ba ion Canxi Ca1, Ca2 và Ca3 quyết định tính bền nhiệt của enzyme có màu sáng. Ba
ion Caxi Ca4, Ca5 và Ca6 nằm ở phía trên của phân tử có màu đậm. Thêm một ion Canxi Ca7
cò màu đen nằm cạnh Ca4 và Ca6 không có mặt khi vắng mặt ion phosphat.
Các nghiên cứu đã cho thấy rằng hầu hết các phytase thu được từ các chủng nấm mốc và
vi khuẩn như E.coli, K.terrigena, B.subtilis (natto) cho đến nay đều là các enzyme được cấu
tạo chỉ gồm một phần tử. Nhưng phytase ở một số động vật và thực vật thì protein của chúng
lại được cấu tạo bởi nhiều phần nhỏ, các phần đó được gọi là các tiểu đơn vị. Ví dụ phytase
tích luỹ trong các hạt ngô đang nảy mầm là enzyme mà phân tử protein của chúng bao gồm 2
tiểu đơn vị có trọng lượng phân tử bằng nhau là 38 kDa. Còn phytase được tách chiết từ ruột
của một loài chuột lại được cấu tạo bởi 2 tiểu đơn vị là 2 băng protein có khối lượng được xác
định bằng phương pháp điện ly trên gel polyacrylamid (SDS – PAGE) ước tính khoảng 70 và
90 kDa. Tuy nhiên người ta đã xác định được rằng chỉ có tiểu đơn vị có kích thước 90 kDa là
có khả năng thuỷ phân axit phytic vì 2 băng protein này biểu hiện cho 2 loại enzyme khác
nhau tương ứng là phosphatase kiềm và phytase.
Theo tác giả Tambe, có một trường hợp đặc biệt đó là phytase thu được từ chủng vi
khuẩn K.aerogenes lại gồm 2 dạng khác nhau. Dạng thứ nhất có thể coi là dạng enzyme gốc,
có kích thước lớn một cách khác thường (700 kDa). Dạng thứ 2 có thể là một phân tử nhỏ của
SVTH: Võ Thị Tố Nga 9
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
enzyme gốc, có khối lượng phân tử rất thấp chỉ khoảng 10 – 13 kDa nhưng nó lại mang đầy
đủ hoạt tính của enzyme.
Phytase của vi khuẩn nhìn chung có kích thước nhỏ hơn so với phytase của nấm mốc.
Phân tử lượng của phytase từ nấm theo dự đoán khoảng 50 kDa và theo kết quả thí nghiệm
xác định được là 65 – 70 kDa, điều này cho thấy có sự glycosyl hoá rất mạnh mẽ. Phytase
được sinh ra từ chủng nấm mốc A.niger NRRL 3135 có 27% hàm lượng glycosyl, chúng bao

gồm một tỷ lệ nhất định giữa đầu N của chuỗi manose và galactose. Các nghiên cứu đều cho
thấy rằng sự glycosyl hoá của phytase tái tổ hợp rất cao. Ngược với sự glycosyl hoá một
lượng vừa phải trong nấm mốc A.niger, chúng lại xảy ra rất đa dạng và với một lượng rất lớn
trong nấm men Hansenula polymorpha và Saccharomyces cerevisiae. Điều đáng ngạc nhiên
là hàm lượng glycosyl khác nhau không chỉ giữa các hệ được biểu hiện khác nhau mà còn
giữa các nhóm phytase trong cùng một hệ biểu hiện. Khi phân tích mô hình glycosyl của
phytase từ nấm mốc A.niger thì thấy rằng tính không đồng nhất của chúng đã dẫn đến sự thiếu
hụt 2 trong 10 vị trí N-glycosyl.
Nhìn chung hàm lượng glycosyl có thể có một vài tác động đến tính chất của enzyme.
Thứ nhất, nó có thể ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác hoặc tác động đến tính bền của
enzyme.Thứ hai, nó có thể ảnh hưởng đến tính đẳng điện (pI) của protein enzyme. Thứ ba, sự
tổng hợp năng lượng trao đổi chất có thể thấp hơn mức biểu hiện của protein. Nhưng theo
Wyss & đtg, có một điều đáng ngạc nhiên là glycosyl ở các mức độ khác nhau không ảnh
hưởng đến hoạt tính xúc tác, khả năng chịu nhiệt hay khả năng phục hồi của phytase ở loài
A.niger. Từ sự glycosyl hoá cấu trúc và chức năng của phytase đã dẫn đến câu hỏi liệu chỉ có
2 vị trí N-glycosyl hoá là bảo thủ ở phytase của nấm mốc hay còn ở vị trí nào khác. Han &
đtg đã nghiên cứu vai trò của glycosyl trong việc biểu hiện phytase chức năng của nấm mốc
A.niger trong nấm men Pichia pastoris. Các kết quả nghiên cứu trên đã cho thấy sự giống
nhau trong việc thuỷ phân axit phytic và khả năng chịu nhiệt được cải thiện nhưng không
đáng kể ở enzyme được glycosyl khi biểu hiện trong nấm men P. pastoris so với cùng với
enzyme đó nhưng biểu hiện trong nấm mốc A.niger. Việc khử glycosyl của phytase có thể
làm giảm 34 % khả năng chịu nhiệt của enzyme. Sự khử glycosyl bằng tunicamycin trong quá
trình biểu hiện đã dẫn tới kết quả làm giảm đáng kể sự sản sinh phytase, điều này cho thấy
rằng sự glycosyl hoá rất cần cho quá trình sinh tổng hợp của PhyA tái tổ hợp trong nấm P.
pastoris. Tuy nhiên tunicamycin cũng có thể làm hỏng quá trình sản xuất vì chúng không tích
luỹ phytase nội bào. Mặt khác những nghiên cứu của Wyss đã chỉ ra rằng sự glycosyl hoá
SVTH: Võ Thị Tố Nga 10
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
không tác động hoặc chỉ có một tác động nhỏ đến pI của phytase từ nấm mốc được kiểm tra.
Ngoại trừ một trường hợp là phytase được biểu hiện trong nấm men H. polymorpha có sự

thay đổi giá trị pI axit rất rõ rệt. Tất cả các phytase của nấm mốc, vi khuẩn và thực vật đã
được nghiên cứu cho đến nay đều có giá trị pI axit, trừ phytase của nấm A. fumigatus có pI là
bazơ. Phytase của vi khuẩn dường như có tính axít yếu hơn phytase từ nấm mốc, pI của chúng
thường lớn hơn 6 trong khi đó phytase của nấm mốc lại có giá trị pI dưới 5,5.
Phytase của các loại nấm mốc A. fumigatus, emericella. Nidulans, A. terrus, và
Mycelicophthora thermophila có xu hướng bị giảm hoạt tính khi được biểu hiện trong A.
niger và được bảo quản ở 4
0
C dưới dạng dịch nuôi cấy. Theo Powar & đtg hoạt tính của
phytase từ B. subtilis không bị ảnh hưởng bởi các protease như trypsin, papain và elastase
điều đó chứng tỏ sự kháng lại các protease của phytase từ vi khuẩn mạnh hơn các phytase
được sinh ra từ nấm mốc.
2.2.2.3. Sự phân bố của phytase trong tự nhiên [24, 25]
2.3.1. Phytase từ nguồn thực vật
Phytase có mặt phổ biến trong giới thực vật, đặc biệt chúng có thể tách chiết và tinh
chế từ các loại ngũ cốc như lúa (Oryza sativa), lúa mì (Triticum aestivum), ngô (Zea mays) và
các loại đậu xanh, đậu tương, đậu trắng California. Ngoài ra hoạt tính phytase cũng tìm thấy
trong cây mù tạc trắng, khoai tây, củ cải, rau diếp, phấn hoa loa kèn.
2.3.2. Phytase từ nguồn động vật
Phytase được phát hiện ở một số loại chủng vi sinh vật trong dạ cỏ của động vật nhai
lại. Schwanniomyces castellii, một chủng nấm men có khả năng thuỷ phân từ 90% đến 95%
phytate trong cám mì và bột hạt bông.
Yanke & đtg đã quan sát hoạt tính phytase của một số chủng vi sinh vật trong dạ cỏ
như là Selenomonas ruminantium, Megasphaera elsdenii, Prevotella ruminicola, Mitsuokella
multiaccidus, và Treponema spp. Trong đó chủng Selenomonas ruminantium có hoạt tính cao
nhất. Yanke cũng thông báo hoạt tính phytase tăng lên khi lượng thức ăn hạt của bò đực non
tăng. Hầu hết vi sinh vật dạ cỏ sản xuất phytase ở dạng ngoại bào.
Đối với các động vật có dạ dày đơn ngăn như lợn và gia cầm, phytase đã được tìm
thấy trong ruột và dạ dày của chúng. Tuy nhiên theo Williams & đtg, các phytase này gần như
không có ý nghĩa gì đối với việc phân giải phytate có trong thức ăn được đưa vào dạ dày của

động vật.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 11
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
Năm 1997, Craxton đã tách dòng và biểu hiện inositol polyphosphat phosphatase
(MIPP) từ gan chuột thấy có hoạt tính phytase. Dạng ARN thông tin của MIPP có mặt trong
tất cả các mô của các con chuột đem làm thí nghiệm nhưng chủ yếu tập trung nhiều ở thận và
gan của loài động vật này. Một loại enzyme giống phytase cũng được tìm thấy ở loài động vật
nguyên sinh Paramecium.
2.3.3. Phytase từ nguồn vi sinh vật
Chúng ta đã biết rằng enzyme nói chung và phytase nói riêng đều có mặt trong tất cả
các cơ quan, mô của động vật, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật. Nguồn vi sinh vật
lại vô cùng phong phú và đa dạng nên phytase cũng như các loại enzyme khác có thể được
sinh ra từ rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau.
Những nghiên cứu gần đây của một số tác giả đã chỉ ra rằng phytase của vi sinh vật rất
hứa hẹn cho ứng dụng trong công nghệ sinh học. Shich & đtg đã phân lập được trên 2000 loài
vi sinh vật từ đất có khả năng sinh tổng hợp phytase. Người ta đã phát hiện và tách được
phytase ở một số loài vi khuẩn khác nhau như Aerobacter aerogenes, Pseudomonas sp,
Bacillus subtilis. Escherichia coli, Citrobacter braakii, Enterobacter sp 4, Raoultella sp., vi
khuẩn dạ cỏ kị khí Mitsuokella jalaludinii
Các vi khuẩn lactic cũng có khả năng sinh phytase, nhưng hầu hết trong chúng đều có
hoạt tính thấp. Ngoại trừ một chủng Lactobacillus sanfranciscensis phân lập từ bột ủ chua
được xem như chủng có khả năng sản xuất phytase tốt nhất.
Phytase của vi khuẩn hầu hết được tổng hợp nội bào, ngoại trừ B. subtilis,
Lactobacillus amylovorus và Enterobacter sp 4 là những vi khuẩn sinh tổng hợp phytase
ngoại bào. Hầu hết các chủng sản sinh phytase ngoại bào thuộc nấm sợi. Trong 28 chủng
thuộc chi Aspergillus có khả năng sinh tổng hợp phytase ngoại bào phân lập được có 21
chủng thuộc loài Aspergillus niger. Các nghiên cứu khác của các tác giả Howson và Volfova
còn khẳng định rằng chủng A. niger là nguồn thu phytase ngoại bào tốt nhất. Còn với nấm
men, các chủng là Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida … cũng
có khả năng sinh phytase. Phytase ngoại bào được tìm thấy ở các chủng Schwanniomyces

castellii và Aexula adeninivorans. Nakamura & đtg đã sàng lọc được một số loài nấm men có
hoạt tính phytase ngoại bào.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 12
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
Bảng 2.1: Tóm tắt các phytase thu được từ một số nguồn khác nhau
Nguồn gốc Tên chủng Vị trí
Nấm mốc
Aspergillus niger NRRL 3135 Ngoại bào
Aspergillus flavus Ngoại bào
Aspergillus terrus Ngoại bào
Aspergillus carneus Ngoại bào
Aspergillus oryzae Ngoại bào
Aspergillus fumigatus Ngoại bào
Mucor sp. Ngoại bào
Penicillum sp. Ngoại bào
Penicillium caseoicolum Ngoại bào
Rhizopus oligosporus Ngoại bào và nội bào
Nấm men
Saccharomyces cerevisiae Ngoại bào
Schwanniomyces castelii Ngoại bào
Khyveromyces fragilis Ngoại bào
Candida tropicalis Ngoại bào
Torulopsis candida Ngoại bào
Debaryomyces castelii Ngoại bào
Vi khuẩn
Bacillus subtilis Ngoại bào
B. subtilis (natto) Ngoại bào
B. amyloliquefaciens Ngoại bào
Echerichia coli Bào quản
Klebsiella aerogenes Nội bào

K. terrigenes Nội bào
K. oxytoca Nội bào
Pseudomonas sp. Ngoại bào
Enterobacter sp. Ngoại bào
Citrobacter freundii Nội bào
Thực vật
Mầm ngô Nội bào
Hạt đậu tương và các loại đậu Nội bào
Typha latifolia pollen Nội bào
Động vật
Ruột của chuột Nội bào
Gan chuột M ạng lưới nội chất
SVTH: Võ Thị Tố Nga 13
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
2.2.2.4. Các tính chất ảnh hưởng đến hoạt tính của phytase [22,24,25,26]
2.2.2.4.1. Nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động của phytase
Khi thuỷ phân axit phytic, phytase có tác dụng cắt đứt các liên kết trong phân tử axit
phytic. Quá trình cắt đứt này xảy ra nhanh hay chậm và hoàn toàn hay không hoàn toàn phụ
thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ phản ứng, pH phản ứng, lượng cơ chất và lượng enzyme.
Nhìn chung, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác thường tăng lên theo nhiệt độ nhưng
chỉ tăng lên trong một giới hạn xác định, mà ở đó phân tử enzyme vẫn còn bền và chưa bị
biến tính. Nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của mỗi enzyme thường tương đối rộng.
Nhưng nhiệt độ mà ứng với hoạt độ enzyme cao nhất thường chỉ tồn tại một điểm và nhiệt độ
đó gọi là nhiệt độ tối ưu của enzyme. Nhiệt độ tối ưu của phytase thu được từ các nguồn khác
nhau thì cũng rất khác nhau, dải nhiệt độ này rất rộng, từ 45 – 77
0
C. Tuy nhiên nhiệt độ tối
ưu của một enzyme thường không cố định mà thay đổi tuỳ theo cơ chất, pH môi trường, thời
gian phản ứng … Khi nhiệt độ nằm ngoài khoảng thích nghi, enzyme có thể bị vô hoạt tạm
thời hoặc vô hoạt hoàn toàn. Nhiệt độ mà ở đó enzyme bị mất hoạt tính xúc tác hoàn toàn gọi

là nhiệt độ tới hạn. Nhiệt độ này thường vào khoảng trên 70
0
C. Ở nhiệt độ tới hạn, enzyme bị
biến tính, ít có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 0
0
C, hoạt độ của
enzyme tuy bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường.
Tính chịu nhiệt của các phytase khác nhau thường khác nhau. Phytase của một số vi
khuẩn như là B. subtilis, E. coli, K.aerogenes, Enterobacter sp.4, K. oxytoca MO-3 và S.
ruminantium hoạt động tối ưu ở nhiệt độ từ 50 – 60
0
C, trong khi phytase của Aerobacter
aerogenes có nhiệt độ tối ưu chỉ là 25
0
C. Bên cạnh đó vẫn có những phytase có tính chịu nhiệt
cao như là phytase của chủng S. castellii hoạt động tối ưu ở 77
0
C, nó có thể ổn định hoạt tính
trong 1 giờ ở 74
0
C và phytase của chủng A. adeninivoans có hoạt tính phytase tối ưu ở 75
0
C.
Theo tác giả Nakamura, phytase của nấm men P. spartinae có tính chịu nhiệt cao từ 75
– 80
0
C, ngược lại phytase của chủng P. rhodanensis chỉ chịu nhiệt từ 70 – 75
0
C. Phytase của
P. anomala có nhiệt độ tối ưu là 60

0
C. Enzyme này có tính chịu nhiệt và bền với axit. Trong
số các nấm chịu nhiệt, phytase của nấm mốc Thermomycess lanuginosus có hoạt tính tối ưu ở
65
0
C. Ngoài ra người ta còn phân lập được phytase từ chủng nấm mốc Rhizopus oligosporus,
enzyme này có khả năng chịu được nhiệt độ 65
0
C và duy trì được 20% hoạt tính sau khi để ở
80
0
C trong 5 phút.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 14
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
Năm 1998, Wyss & đtg đã nghiên cứu về tính bền nhiệt của phytase bằng phương pháp
quang phổ huỳnh quang và thiết bị xác định hoạt tính của enzyme, họ đã kết luận rằng
phytase từ nấm mốc A. niger không có tính bền nhiệt và cũng không có khả năng phục hồi
hoạt tính trở lại. Khi nhiệt độ mới chỉ ở 50 – 55
0
C, enzyme đã bị biến tính và chúng không
phục hồi lại được cấu hình, do đó enzyme bị mất tới 70 – 80% hoạt tính. Phytase từ nấm mốc
A. fumigatus tuy cũng không có khả năng chịu được nhiệt độ cao nhưng chúng lại có khả
năng phục hồi hoàn toàn hoạt tính khi đưa trở lại nhiệt độ tối ưu. Chúng có thể phục hồi hoàn
toàn hoạt tính sau 20 phút biến tính ở 90
0
C. Còn phytase của nấm A. niger van Teighem lại
hoạt động tốt ở nhiệt độ 50
0
C, và chúng có thể duy trì 90% hoạt tính sau 24 giờ ở 55
0

C . Như
vậy, khi cấu hình của phytase bị thay đổi dưới tác dụng của nhiệt độ cao hay bất kỳ một tác
nhân biến tính mạnh nào thì đều có thể bị vô hoạt hoàn toàn.
Độ bền nhiệt của mỗi enzyme thường tăng lên khi cơ chất, coenzyme, Ca
2+
… Qua
nghiên cứu, người ta thấy phytase từ B. subtilis DS11 có nhiệt độ tối ưu là 70
0
C, cao hơn
nhiệt độ tối ưu của các phytase khác. Chúng có khả năng chịu nhiệt rất tốt khi môi trường có
mặt CaCl
2
(ion Ca
2+
), 100% hoạt tính của enzyme vẫn được bảo toàn sau 10 phút để ở 70
0
C.
Khi không có mặt ion Ca
2+
hoạt tính enzyme bị giảm đi ở nhiệt độ 50
0
C, ngược lại ở nhiệt độ
90
0
C khi có mặt ion Ca
2+
trong 10 phút, hoạt tính phytase vẫn còn khoảng 50% so với hoạt
tính ban đầu. Điều này chứng tỏ ion Ca
2+
có tác dụng bảo vệ enzyme, chống lại sự biến tính

do tác nhân nhiệt độ và làm tăng tính bền của enzyme.
Ngoài ra, muối cũng đã được sử dụng để làm tăng tính chịu nhiệt của enzyme. Rượu làm
từ lúa miến khi bổ sung vào tinh bột cũng làm tăng khả năng chịu nhiệt của phytase. Ứng
dụng kỹ thuật protein để làm tăng tính chịu nhiệt của phytase như là thay thế axit amin prolin
và tạo cầu disulfit. Phytate cũng được báo cáo là tác nhân nâng cao hoạt tính của phytase từ
nấm A. adeninivorans. Sự cố định phytase của E. coli và sự đường hoá của phytase của nấm
A. niger biểu hiện trong nấm men S. cerevisiae đã giúp nâng cao tính chịu nhiệt của sản phẩm
enzyme.
2.2.2.4.2. pH tối ưu cho sự hoạt động của phytase
pH của môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzyme vì nó ảnh hưởng đến mức độ
ion hoá cơ chất, enzyme và độ bền của protein enzyme. Đa số các enzyme bền trong giới hạn
pH từ 5 – 9. Độ bền cả enzyme đối với pH môi trường cũng có thể tăng lên khi có cơ chất,
coenzyme và Ca
2+
… pH tối ưu cho hoạt động của phytase thu được từ các nguồn khác nhau
rất khác nhau. pH thích hợp cho hoạt động của chúng thường vào khoảng 2,2 đến 8. Hầu hết
SVTH: Võ Thị Tố Nga 15
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
các phytase từ vi sinh vật, đặc biệt của nấm mốc thường có pH tối ưu nằm trong khoảng từ
4,5 đến 5,6. Tuy nhiên trái ngược với phytase từ nấm mốc, phytase của nấm A. fumigatus lại
có khoảng pH tối ưu rộng đạt 80% hoạt tính khi ở pH giữa 4 và 7,3. Phytase của một vài vi
khuẩn, đặc biệt của Bacillus có pH tối ưu ở 6,5 đến 7,5, pH tối ưu của phytase từ hạt thực vật
ở phạm vi từ 4,0 đến 7,5 và hầu hết trong số chúng có pH tối ưu giữa 4,0 và 5,6.
Bảng 2.2: Các đặc tính sinh lý, sinh hoá của phytase từ các phytase từ các nguồn khác nhau
Vi sinh v tậ Nhi t t iệ độ ố
uư
pH Km (mM) Tr ng l ngọ ượ
phân tử
Vi khu nẩ
Bacillus sp. DS11 70 7,0 0,55 45

Bacillus subtilis 55 7,0 0,04 36,5
Enterobacter sp. 4 50 7-7,5
Escherichia coli 55 4,5 0,13 42
Klebsiella aerogenes 60 4,5-5,2 0,11 700
Lactobacillus amylovorus 45 4,4
Pseudomonas sp. 40 5,5 0,016
Selenomonas ruminantium 50-55 4-5,5

46
N m m cấ ố
Aspergillus carneus 40 5,6

A. carbonarius 53 4,7

A. niger NRRL 3135 58 2,2 0,04 85-100
A. terreus 70 4,5

214
Rhizopus oligosporus 55 4,5 0,15

N m menấ
Arxula adeninivorans 75-80 4,5 0,25
C. tropicalis 65 4,5
Pichia anomala 60 4 0,20 64
P. rhodanensis 70-75 4,0-4,5 0,25
P. spartinae 75-80 4,5-5,5 0,33
SVTH: Võ Thị Tố Nga 16
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
Thường thì giá trị pH tối ưu của một enzyme cũng không cố định mà phụ thuộc nhiều
vào nhiều yếu tố khác nhau như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ… Qua các nghiên

cứu cho thấy, trong cùng một điều kiện nhất định thì pH tối ưu của phytase ở các chủng được
tìm thấy hầu như chỉ ở một giá trị nhất định, riêng có 2 loại phytase từ A. niger NRRL 3135
và Citrobacter freundii khác với các phytase khác ở điểm là chúng có hai giá trị pH tối ưu
khác nhau. Phytase từ một số vi khuẩn thuộc chi Bacillus có pH tối ưu vào khoảng pH trung
tính (6,5 – 7,5). Còn phytase thu được từ thực vật như hạt đậu và phấn hoa (Hoa Huệ tây) lại
có pH tối ưu cao hơn thường khoảng 8,0.
2.2.2.4.3. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến hoạt tính của phytase [24,25]
Các ion kim loại được coi là các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của phytase. Tuy nhiên
rất khó để xác định được liệu khả năng ức chế của các kim loại này do bám trực tiếp vào
enzyme hay là các ion kim loại tạo phức ít hoà tan với axit phytic và điều này đã làm giảm
nồng độ cơ chất hoạt động. Phytase từ Enterobacter sp.4 bị ức chế bởi các ion kim loại Zn
2+
,
Cd
2+
, Ba
2+
,
Cu
2+
và Al
3+
. Tương tự như vậy phytase của B. subtilis (natto) N-77 cũng bị ức chế
mạnh bởi các ion kim loại như là Zn
2+
, Cd
2+
, Ba
2+
, Cu

2+
, Fe
2+
và Al
3+
. Cả hai enzyme này cũng
như 2 phytase từ Bacillus đều bị ức chế bởi EDTA và ion Canxi rất cần cho hoạt tính của
chúng.
Wyss & đtg cho rằng ion Cu
2+
đã làm giảm hoạt tính enzyme của phytase từ nấm E.
nidulans và A. terrus và một vài ion loại khác đã ức chế phytase của nấm A.fumigatus.
Hoạt tính phytase của nấm A. fumigatus được tăng lên đến 50% bởi EDTA, và EDTA
không có ảnh hưởng gì đến hoạt tính enzyme của các loại nấm E. nidulans, A. niger và A.
terrus đã được thử nghiệm. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của ion kim loại và ADTA đến hoạt
tính phytase đã chỉ ra rằng phytase của nấm mốc không bị ảnh hưởng bởi các chất này. Kết
luận này đã được chứng minh là do trong cấu trúc tinh thể của phytase từ nấm A. niger thiếu
ion kim loại. Điều này khác biệt rõ ràng với sự phụ thuộc vào ion Ca
2+
và dễ bị ức chế bởi
EDTA của phytase từ Bacillus.
Trong trung tâm hoạt động của phytase C từ Bacillus có 6 ion Canxi, 3 ion Canxi cần
cho sự ổn định của enzyme và 3 ion Canxi tác động đến hoạt tính xúc tác của enzyme.
Enzyme này bị kìm hãm bởi EDTA hoặc các nhân tố kìm hãm khác nhưng có khả năng phục
hồi bởi 42% hoạt tính khi có mặt của ion Canxi. Đặc biệt khả năng chịu nhiệt của phytase phụ
thuộc rất lớn vào sự có mặt của ion Canxi. Phytase C vẫn còn trên 90% hoạt tính khi ủ ở 60
0
C
SVTH: Võ Thị Tố Nga 17
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện

trong 10 phút khi bổ sung thêm 5mM CaCl
2
. Hoạt tính của enzyme không thể phục hồi khi
trong môi trường phản ứng không có mặt của ion Canxi. Tóm lại, phytase của Bacillus và
phytase của một số loại thực vật khác đều cần ion Ca
2+
cho hoạt tính tối ưu của mình.
Các chất khử như là 2-mercaptoethanol, dithiotreitol và glutathione không ảnh hưởng
lớn đến phytase của vi sinh vật. Người ta cho rằng, các enzyme này hoặc là không có các
nhóm sulhydryl tự do, hoặc các nhóm sulhydryl tự do không đóng vai trò đáng kể trong hoạt
tính và cấu trúc của enzyme. Giả thiết này đã được Kostrewa làm sáng tỏ bằng sự thật là hầu
như các phytase hoàn thiện có một số lượng gốc cystein, các gốc này liên kết với nhau bằng
các cầu nối disulfua như trong trường hợp của phytase từ nấm A. niger. Chức năng của liên
kết disulfua trong phytase của nấm A. ficuum được làm sáng tỏ bằng các nghiên cứu duỗi
xoẵn được thực hiện bởi Ullah và Mullaney. Các tác giả này kết luận rằng cầu disulfua rất cần
thiết cho cấu trúc và hoạt tính của enzyme và đóng một vai trò quan trọng trong việc gấp khúc
protein. Phytase hoàn thiện từ Bacillus dường như không có gốc cystein.
Một cấu trúc đồng đẳng của cơ chất là myo-inositol hexasulfate đã được xem như là một
chất ức chế cạnh tranh có hiệu quả của cả hai enzyme PhyA và Phy B từ nấm A.ficuum. Trị số
ức chế Ki đối với các enzyme PhyA và PhyB được ước lượng khoảng 4,6 và 0,2 M, lần lượt
theo thứ tự. Floride cũng được biết như là một chất ức chế của các phytase và phosphatase
khác. Phytase từ nấm đậu tương bị ức chế mạnh mẽ bởi floride, vanadate và phosphate vô cơ.
Còn đối với phytase của vi khuẩn và nấm mốc, phosphat vô cơ lại là nguyên nhân ức chế cạnh
tranh của phytate. Florua cũng ức chế phytase kiềm từ phấn hoa loa kèn và ức chế cạnh tranh
phytase từ K. terrigena. Phytase của K. terrigena cũng bị ức chế bởi phosphate, molybdate và
vanadate. Molybdate và vanadate cũng được biết là chất ức chế phosphatase.
Nồng độ cơ chất khoảng 300µM đã ức chế một enzyme giống phytase tách chiết từ
Paramecium. Phytase của Klebsiella sp.và Rhizopus oligosporus cũng bị ức chế bởi cơ chất
nhưng ở nồng độ cao hơn. Hoạt tính phytase của nấm mốc cũng bị ức chế bởi nồng độ cơ chất
vượt quá 1mM. Theo một số tác giả khác phytase từ rễ ngô và hạt đậu tương bị ức chế ở các

nồng độ cơ chất 300µM và 200mM lần lượt theo thứ tự.
2.2.2.5. Tính đặc hiệu cơ chất và các thông số động học
Phytase có phổ đặc hiệu cơ chất rộng. ADP, ATP, p-nitrophenyl phosphate, phenyl
phosphate, fructoza 1,6-bisphosphate, glucoza 6-phosphate,
α
-,
β
- glycerophosphate và 3-
phosphoglycerat là những chất không tương đồng về mặt cấu trúc với axit phytic nhưng có
SVTH: Võ Thị Tố Nga 18
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
khả năng bị thuỷ phân bởi phytase. Chỉ một vài phytase mới có tính đặc hiệu cơ chất cao đối
với axit phytic như là phytase của B.subtilis và phytase kiềm được phân lập từ phấn hoa lily.
Hầu hết các phytase đã nghiên cứu đều theo phương trình của Michaelis-Menten, ngoại trừ
phytase của M. thermophila và E. nidulans không theo phương trình của Michaelis-Menten.
Điều này đã được chứng minh dưới điều kiện phân tích chuẩn (ví dụ 2mM axit phytic) chỉ tỉ
lệ của phản ứng chuyển hoá myo-inositol hexakisphosphate thành pentakisphosphate mới đo
được. Ullah và Phillippy đã xác định được thông số động học của phytase từ nấm A. ficuum
và 2 axit photphataza đối với myo-inositol hexa-, penta-, tetra và triphosphates. Phytase có giá
trị Km thấp nhất trong 3 enzyme. Họ kết luận rằng cả 2 phytase và phosphatase axit ở pH tối
ưu 2,5 đã thuỷ phân có hiệu quả myo-inositol phosphat thử nghiệm. Sự thuỷ phân yếu các
dạng myoinositol phosphat thử nghiệm bằng axit phosphatase ở pH 6,5 cũng đã được chứng
minh bởi giá trị Vmax và Vcat thấp. Hiệu quả động học của enzyme được xác định bằng giá
trị Kcat/Km của một cơ chất. Giá trị Kcat/Km cao nhất của phytase và phosphatase axit ở pH
tối ưu 2,5 đo được khi cơ chất là axit phytic.
Phytase của E. coli có giá trị Kcat/Km là 4,78
×
10
7
M

-1
S
-1
. Giá trị này là giá trị cao nhất
đã được đưa ra của phytase. Tính đặc hiệu của phytase từ nấm mốc đối với cơ chất là axit
phytic thay đổi gần 10 lần từ 23U/mg đến 198 U/mg đối với nấm A. fumigatus và A. terrus lần
lượt. Theo Wyss &đtg, khuôn mẫu và phạm vi khác của sự glycosil hoá không có ảnh hưởng
đáng kể đến tính đặc hiệu của phytase nấm mốc. Tính đặc hiệu của phytase từ vi khuẩn thay
đổi gần 100 lần từ 8,7 U/mg đến 811 U/mg đối với (B. subtilis và E.coli, lần lượt). Dựa vào
tính đặc hiệu cơ chất, phytase có thể phân chia thành hai lớp: lớp phytase có phổ đặc hiệu cơ
chất rộng như phytase của A. fumigatus, E. nidulans và M. thermophila và lớp phytase với
tính đặc hiệu cơ chất cao hơn đối với axit phytic. Phytase với tính đặc hiệu cơ chất rộng,
nhưng đối với axit phytic lại thể hiện tính đặc hiệu cơ chất thấp (23 đến 43 U/mg). Ngược lại,
phytase với tính đặc hiệu cơ chất hẹp nhưng lại thể hiện tính đặc hiệu cơ chất cao đối với axit
phytic (103 – 811 U/mg). Phytase của Bacillus không nằm trong phân lớp này. Loại phytase
từ vi khuẩn này dường như có tính đặc hiệu thấp đối với axit phytic. Tính đặc hiệu thấp này
đã gây trở ngại cho ứng dụng chúng trong công nghiệp.
2.2.2.6. Trung tâm hoạt động và cơ chế tác dụng
Phosphatase axit thuộc enzyme dạng khác mà có khả năng thuỷ phân ester photphate và
hoạt động tối ưu ở pH thấp. Một số photphatase axit từ tế bào eukaryot và prokaryot đều có
chung 2 vùng trình tự tương đồng, mỗi trình tự quay xung quanh một gốc histidin bảo thủ.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 19
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
Khuôn mẫu thống nhất của 2 vùng được chỉ ra trong cơ sở dữ liệu protein SWISS-PROT là
[LIVM]-X(2)-[LIVMA]-X(2)-[LIVM]-X-R-H-[GN]-X-R-X-[PAS] và [LIVMF]-X-
[LIVMFFAG]-X(2)-[STAGI]-H-D-[STANQ]-X-[LIVM]-X(2)-[LIVMFY]-X(2)-[STA].Khi
so sánh trình tự các sản phẩm của gen pho3 và pho5 trong nấm men, tuyến tiền liệt của người
và phosphatase axit trong lysosom với PhyA và PhyB của nấm mốc A. niger NRRL 3135 cho
thấy vùng 7 axit amin có trình tự RHGXRXP là bảo thủ gần với tận cùng đầu N. Phosphatase
axít chứa trung tâm hoạt động trên được phân vào nhóm histidine axit phosphatase. Trung tâm

hoạt động này được bảo thủ hoàn toàn ở tất cả phytase của nấm mốc và nó cũng có mặt trong
phytase của E. coli. So sánh trình phytase của nấm mốc và phytase từ vi khuẩn E. coli đã
khám phá ra một trình tự HD bảo thủ gần đầu C. Dựa trên dữ liệu protein đã khám phá ra 2
trình tự RHG và HD cũng có mặt trong một số phosphatase axit. Tóm lại, hai phân lớp
phosphatase axit có khả năng nhận dạng bằng trọng lượng phân tử: dạng trong phân tử thấp
thiếu cả hai trình tự trên và dạng có trọng lượng phân tử cao được phân chia thành 2 dưới
phân lớp; một phân lớp chứa trình RHG hoặc HD và phân lớp kia chứa cả hai trình tự trên.
Ullah & đtg đã sử dụng tác nhân biến đổi gốc axit amin đặc hiệu để tìm ra trung tâm hoạt
động của nấm mốc. Các kết quả đưa ra đã chứng minh rõ ràng vai trò quan trọng của gốc
histidine và arginin đối với sự hoạt động của phytase. Ullah và Dischinger đã chỉ ra rằng một
số gốc triptophan cũng có thể liên quan đến sự thuỷ phân axit phytic.
2.2.2.7. Động học và sản phẩm cuối cùng của quá trình thuỷ phân axit phytic
Axit phytic chứa 6 nhóm phosphate có thể bị giải phóng bởi phytase ở các tỷ lệ và các vị
trí khác nhau. Wyss & đtg đã khảo sát động học của quá trình giải phóng phosphate và động
học của quá trình tích luỹ của phản ứng trung gian cũng như sản phẩm cuối cùng của quá
trình thuỷ phân axit phytic bằng các phytase khác nhau. Họ đã kết luận rằng tất cả các phytase
của nguồn gốc từ nấm mốc đều giải phóng năm trong sáu phosphate và sản phẩm cuối cùng là
myo-inositol 2 monophosphate trong trường hợp lượng phytase thừa. Điều này chỉ ra rằng tất
cả các enzyme nói trên đều có tính đặc hiệu và ưu tiên cao cho nhóm phosphate tương đương.
Ngược lại chúng có khả năng cắt nhóm phosphate nằm trên trục đối xứng. Phytase của nấm
A. fumigatus có dễ dàng thuỷ phân axit phytic thành myo-inositol 2-monophosphate và myo-
inositol bisphosphate (chất đồng phân chưa được biết rõ) được tích luỹ trong một vài trường
hợp. Ngược lại phytase cả nấm A. niger và A. terrus phải cần một lượng lớn hơn để có thể
thuỷ phân axit phytic thành myo-inositol 2 monophosphate và tạo ra một lượng đáng kể myo-
inositol tris-, bisphosphat trong quá trình khử axit phytic. Khi phytase của E. coli được sử
SVTH: Võ Thị Tố Nga 20
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
dụng ở mức độ cao, sản phẩm được tạo thành trong quá trình thuỷ phân axit phytic là myo-
inositol tetrakisphosphate. Myo-inositol bis- và triphosphate chiếm hơn 90% sản phẩm cuối
cùng sau 90 phút phản ứng ở điều kiện thừa phytase và hầu như không có lượng myo-inositol

monophosphate nào được tạo thành.
Trên thực tế, sản phẩm cuối cùng của quá trình thuỷ phân axit phytic bởi các phytase
khác nhau không nhất thiết phải giống nhau mặc dù con đường thuỷ phân axit phytic là giống
nhau. Nhóm 3 – phytase bắt đầu thuỷ phân liên kết phosphate ở vị trí D-3 giải phóng ra D-
Ins-(1,2,4,5,6)P
5
như là sản phẩm trung gian đầu tiên. Nhóm 6-phytase bắt đầu thuỷ phân ở vị
trí l-6 hoặc D-4 và sản phẩm trung gian đầu tiên tạo ra là L-Ins(1,2,3,4,5)P
5
. Powar &đtg đã
cho biết myo-inositol monophosphate (vị trí của phosphat chưa được xác định) là sản phẩm
cuối cùng của phản ứng thuỷ phân axit phytic bằng phytase của B. subtilis. Động lực học,
phản ứng trung gian và con đường khử axit phytic bởi phytase từ B. subtilis chưa được biết và
cũng chưa xác định được chúng thuộc nhóm 3-phytase hay 6-phytase . Theo Barrientos, một
loại phytase kiềm được tách từ phấn hoa lily đã thuỷ phân axit phytic ở vị trí D5 bằng 2 bước
loại bỏ phosphat để tạo thành sản phẩm cuối cùng là Ins(1,2,3) P
3
. Inositol triphosphat cũng là
sản phẩm của quá trình thuỷ phân axit phytic bằng phytase của phấn hoa Typha latifolia.
Kerovue đã chứng minh rằng PhyC giải phóng 3 trong 6 nhóm phosphat của axit phytic.
Axit phytic (InsP
6
) bị thuỷ phân theo kiểu bậc thang bởi Phytase C để nhanh chóng bị thuỷ
phân thành myo-inositol pentaphosphate (InsP
5
) và sau đó thành myo-inositol tetraphosphate
(InsP
4
) cuối cùng thành myo-inositol triphosphate (InsP
3

). Quá trình chuyển dần dần từ InsP
5
thành InsP
4
rồi sau đó thành InsP
3
chỉ ra rằng các myo-inositol phosphate thấp hơn này là cơ
chất kém đặc hiệu đối với enzyme so với axit phytic. Sau 30 phút phản ứng, hơn 50% sản
phẩm của phản ứng là dạng InsP
4
, ngược lại chỉ có 10% ở dạng InsP
3
. Nhưng sau 60 phút tất
cả các cơ chất được tiêu thụ hết và phản ứng trung gian được chuyển hết thành InsP
3
. Sau đó
tiếp tục kéo dài thời gian phản ứng với lượng enzyme dư thừa không thấy xuất hiện inositol
phosphate thấp hơn. Vì vậy, có thể kết luận rằng InsP
3
là sản phẩm cuối cùng của quá trình
thuỷ phân axit phytic bằng Phytase C. Điều này cũng giống với trường hợp của Wyss khi
nghiên cứu thuỷ phân axit phytic bằng phytase A.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 21
Lun vn tt nghip GVHD: ThS. Nguyn Vn Nguyn
2.2.2.8. ng dng ca enzym phytase [9]
2.2.2.8.1. Trong cụng nghip thc n gia sỳc
Thc n gia sỳc thng cú ngun gc thc vt. Khong 2/3 hm lng phospho trong
thc n gia sỳc cú ngun gc thc vt l axit phytic hin din di dng phytate. Do ú,
phospho trong phytate hu nh khụng cú giỏ tr dinh dng trong thc n gia sỳc. Hn na,
phytate bt gi cỏc ion cú giỏ tr dinh dng cao vỡ th hn ch giỏ tr dinh dng ca cỏc ion

ny. ng vt nhai li tiờu hoỏ phytate thụng qua hot ng ca enzym phytase tit ra t h vi
sinh vt trong d c. Phosphate vụ c c gii phúng t phytate bi phytase c c h vi
sinh vt d c v ng vt ch s dng. Tuy nhiờn, cỏc hot ng cú d dy mt ngn nh
ln, gia cm v cỏ li khụng th bin dng axit phytic v chỳng thiu phytase h rut v d
dy. Do ú, ngi ta thờm phosphate vụ c, bt u nnh v cỏc loi bt cú hm lng
phospho tng cao vo thc n gia sỳc ỏp ng yờu cu phosphate ca c th ng vt. Vic
ny lm tng chi phớ cho cỏc nh chn nuụi gia sỳc v tng ụ nhim phospho cho mụi trng.
Cỏc vn ny cú th c gii quyt bng cỏch b sung phytase vi sinh vt vo thc n gia
sỳc hoc dựng cỏc loi ng cc cú hm lng phytase cao lm thc n gia sỳc.
SVTH: Vừ Th T Nga 22
phytic
acid
D/L-Ins(1,2,4,5,6)P
5
D/L-Ins(2,3,4,5,6)P
5
D/L-Ins(1,2,3,4,5)P
5
D/L-Ins(1,2,3,5,6)P
5
Ins(2,4,5,6)P
4
Ins(2,4,6)P
3
Ins(1,2,3,5)P
4
Ins(1,3,5)P
3
OH
OH

OH
OH
OH
OH
OH
HO
HO
HO
HO
HO
HO
HO
4/6
5/5
6/4
3/1
2/2
1/3
Con đừờng thứ nhất
Con đừờng thứ hai
1 phosphat đựợc
loại bỏ, sản phẩm
trung gian là IP5
2 phosphat đựợc
loại bỏ, sản phẩm
trung gian là IP4
3 phosphat đựợc
loại bỏ, sản phẩm
cuối cùng là IP3
Hỡnh 2.4: Cỏc con ng thu phõn axit phytic bi phytase

Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
2.2.2.8.2. Trong công nghiệp thực phẩm
Ngũ cốc, hạt có dầu và các loại đậu là các loại nguyên liệu phổ biến trong chế biến thực
phẩm. Điều này dẫn đến một lượng phytate lớn được tiêu thụ vào trong cơ thể con người.
Phytate trong hệ ruột không được tiêu hoá sẽ tác động xấu đến sự hấp thụ Kẽm, Canxi,
Magiê, Sắt. Hơn nữa, nó còn ức chế hoạt động của các enzym tiêu hoá. Do đó, việc bổ sung
phytase vào nguyên liệu trước khi chế biến có ý nghiã lớn. Phytase đã được bổ sung vào quá
trình chế biến bột mì để làm giảm lượng axit phytic trong các loại bánh dùng bột mì (trong
bánh mì , axit phytic chiếm 0,29 – 1,05%) phytase thích hợp cho quá trình này cần có pH tối
ưu ở 4,5 – 5, nhiệt độ tối ưu 30
0
C và không phụ thuộc vào ion Ca
2+
.
2.2.2.8.3. Trong tổng hợp myo – inositol phosphate
Các dẫn xuất myo – inositol phosphate dùng trong sản xuất inositol phosphate và
phospholipid cần cho quá trình vận chuyển các tín hiệu qua màng tế bào và vận chuyển Canxi
từ các nguồn dự trữ nội bào. Phytase chuyển đổi axit phytic thành các dẫn xuất myo – inositol
phosphate nhỏ hơn myo – inositol tự do và phosphate vô cơ, do đó có thể dùng phytase trong
công nghiệp sản xuất inositol hoặc inositol phosphate.
2.2.2.8.4. Trong nghành nuôi trồng thuỷ sản [9]
Trong nuôi trồng thuỷ sản, protein thức ăn đóng vai trò quyết định cho sự tăng trưởng và
phát triển vật nuôi. Thông thường, nguồn protein thức ăn dựa vào vào nguồn cá tạp hay bột cá
sẵn có. Tuy nhiên, ngày nay khuynh hướng giảm tỉ lệ sử dụng bột cá trong thức ăn thuỷ sản
và chăn nuôi ngày càng mạnh mẽ. Ngoài tác động do giá cả còn do tiến độ khoa học trong
dinh dưỡng cho phép thay thế bột cá bằng các protein thực vật sẵn có, rẻ tiền nhưng không
làm thay đổi sức tăng trưởng của vật nuôi. Tuy nhiên bên cạnh sự phát trưởng protein thực vật
trong thức ăn thuỷ sản, vấn đề trở ngại lớn nhất là khả năng tiêu hoá và hấp thụ các chất dinh
dưỡng trong thức ăn chứa nhiều protein thực vật.
Các protein thực vật như bã đậu nành, bã đậu phộng có chứa một số chất kháng dinh

dưỡng ức chế enzyme trypsin…ngăn cản hoạt động tiêu hoá của động vật. Đặc biệt là
Phosphorus ở dạng phytic acid có nhiều trong thực vật liên kết chặt chẽ với Zn
2+
tạo phức hợp
phytinate-Zn gây bệnh lý thiếu kẽm trên vật nuôi. Ngoài kẽm, phytic acid còn liên kết với các
ion hoá trị II như Fe
2+
hay liên kết với các amino acid và các chuỗi carbon trong
carbohydrates tạo ra một phức hệ phytate khó tiêu hoá và hấp thụ cho động vật.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 23
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
Để bù đắp sự thiếu hụt Phosphorus trong thức ăn do khả năng tiêu hoá thấp Phosphorus
trong protein thực vật, các nhà máy thức ăn thường bổ sung 1 - 2% Dicalci phosphate (DCP).
Hậu quả là hàm lượng Phosphorus trong thức ăn rất cao lên đến 2 - 3 lần nhu cầu Phosphorus
của vật nuôi. Điều này dẫn đến Phosphorus thải ra trong phân tăng cao đưa đến làm gia tăng
hàm lượng Phosphorus trong môi trường nước. Hiện tượng nở hoa của tảo có tác nhân từ sự
phú dưỡng Phosphorus trong môi trường nước. Đây là một dạng ô nhiễm môi trường trong
nước.
Để giảm sự phú dưỡng môi trường nước và đảm bảo nhu cầu Phosphorus của vật nuôi
thì phải gia tăng độ hữu dụng của Phosphorus trong thức ăn thông qua sử dụng các enzyme
tiêu hoá là một giải pháp khả thi. Phytase là một enzyme có khả năng thuỷ phân phytate giải
phóng Phosphorus khỏi phức hệ phytate gia tăng độ hữu dụng Phosphorus thức ăn. Một số thí
nghiệm đã chứng minh rằng việc bổ sung phytase trong thức ăn đã có một ảnh hưởng tích cực
đến sự tăng trọng, hiệu quả sử dụng thức ăn cũng như khả năng sử dụng protein, Phosphorus,
Calcium, Magnesium và Kẽm trên cá hồi (Vielma và ctv, 1998). Hơn nữa, sử dụng phytase
làm giảm lượng Phosphorus bài tiết vào phân từ đó làm giảm lượng Phosphorus đưa vào môi
trường nước từ khẩu phần thức ăn, dẫn đến phần nào giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường nước
(Vielma và ctv, 1998). Do đó, để nghành nuôi trồng thuỷ sản phát triển bền vững và làm giảm
ảnh hưởng xấu đến môi trường nước, việc thay thế bột cá bằng nguồn protein thực vật có bổ
sung phytase là một xu thế tất yếu.

2.3. Sơ lược về cá Tra [1, 2, 4, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 21,24]
2.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tiêu hóa [4]
- Khối lượng thức ăn: lượng thức ăn càng nhiều thì sự tiêu hóa càng chậm trễ, mức sử
dụng thức ăn càng thấp. Khi lượng thức ăn nhỏ, tốc độ tiêu hóa nhanh hơn, triệt để hơn và
enzym tiêu hóa ngấm vào thức ăn nhanh hơn.
- Chất lượng thức ăn: khả năng tiêu hóa phụ thuộc vào loại thức ăn (thức ăn chứa đạm,
đường, xơ…)
- Nhiệt độ: mức độ tiêu hóa thức ăn ở những nhiệt độ khác nhau là khác nhau.
- Tuổi: trong thời kỳ tăng trưởng của cá, sự tiêu hóa thức ăn tăng lên theo mức độ
trưởng thành. Sự phụ thuộc của quá trình tiêu hóa vào tuổi cá rất phức tạp do nhiều
nguyên nhân, trước hết là do sự hoàn thiện hóa cơ quan tiêu hóa và hệ enzym tiêu hóa.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 24
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện
2.3.2. Nhu cầu phosphorus trong khẩu phần thức ăn của cá [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19,
21]
Ngược lại với Canxi, Phosphorus có rất ít trong nước và phải được bổ sung vào khẩu
phần thức ăn để đáp ứng nhu cầu trao đổi chất của thuỷ sinh. Khoảng 80% phosphorus trong
cơ thể cá thì liên quan những phần mô cứng [19]. Phosphorus cũng là một thành phần của
dạng muối phospho hữu cơ như nucleotic, phospholipid, coenzyme, axit deoxyribonucleotic,
axit ribonucleotic. Muối phospho vô cơ cũng được dùng như là một chất đệm quan trọng để
duy trì pH ổn định của dung dịch nội bào và ngoại bào [19].
Những thông tin liên quan đến sự hấp thụ phosphorus của cá và các loài giáp xác thì khá
hạn chế. Sự hấp thụ phosphorus qua môi trường nước của cá đã được xác định [18] mặc dù số
lượng phosphorus đáng kể không được hấp thụ theo cách này bởi vì trong nước biển và nước
ngọt hàm lượng phosphorus thấp. Nhìn chung nồng độ phosphorus trong nước còn thấp bởi vì
sự hấp thu phosphorus thông qua thức ăn ở ruột thì rất là cần thiết để thoả mãn nhu cầu trao
đổi chất. Sự dự trữ và thu nhận thức ăn có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố mà điều đó có
thể điều khiển sự hấp thụ Canxi. Phosphorus chủ yếu được bài tiết ra khỏi cơ thể thông qua
nước tiểu mặc dù số lượng lớn phosphorus không hấp thụ được từ thức ăn bị mất trong phân
[18].

Do phosphorus trong khẩu phần thức ăn rất quan trọng trong việc đáp ứng nhu cầu của
cơ thể cá, dấu hiệu của sự thiếu hụt phosphorus nhìn chung dễ dàng nhận thấy và đã nghiên
cứu ở một số loài cá [21]. Một vài biểu hiện của sự thiếu hụt nổi bật nhất bao gồm: chậm phát
triển, giảm sự khoáng hoá ở tế bào vảy và xương. Rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để
xác định nhu cầu phosphorus trong khẩu phần thức ăn đối với rất nhiều loài cá khác nhau. Các
giá trị về nhu cầu phosphorus thay đổi khá rộng rãi từ 0,3 – 0,9% [trong khẩu phần thức ăn]
[21]. Một số báo cáo cho thấy rằng nhu cầu phosphorus trong khẩu phần thức ăn của một số
loài giáp xác có phạm vi rộng hơn. Chẳng hạn như nhu cầu phosphorus trong khẩu phần thức
ăn thấp nhất ở 0,34% [12] và cao nhất ở 1% [17], 1- 2% [16] và 2% đối với tôm thẻ [13]. Một
vài yếu tố ảnh hưởng đến nhu cầu phosphorus đã được xác định trong một số nghiên cứu
khác. Một số yếu tố này là hàm lượng canxi trong khẩu phần thức ăn ở những mức giới hạn
tương ứng với lượng phosphorus hấp thu được, dạng phosphorus trong khẩu phần thức ăn,
dạng phosphorus có thể hấp thu được đối với vi sinh vật và một số tác nhân khác như là kích
thước và điều kiện dinh dưỡng của vi sinh vật và tiêu chuẩn đánh giá nhu cầu phosphorus.
SVTH: Võ Thị Tố Nga 25