Khảo sát khả năng ức chế nấm mốc neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của vi khuẩn bacillus licheniformis d7

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM

HỒ NGUYỄN HOÀNG YẾN

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM MỐC
Neoscytalidium dimidiatum GÂY BỆNH
ĐỐM NÂU TRÊN THANH LONG
CỦA VI KHUẨN Bacillus licheniformis D7

Chun ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC
Mã chun ngành: 52420201

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021


THƠNG TIN CHUNG

Họ và tên sinh viên: Hồ Nguyễn Hồng Yến

MSHV: 17026901

Lớp

: DHSH13A

Khóa: K13 (2017-2021)

Chun ngành

: Cơng nghệ Sinh học

Mã chuyên ngành: 52420101

SĐT

: 0938276298

Email

:

Tên đề tài

: Khảo sát khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum
gây bệnh đốm nâu trên thanh long của vi khuẩn Bacillus
licheniformis D7

Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Diệu Hạnh
SĐT

: 0982695357

Email

:

Cơ quan công tác : Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh

Tp. Hồ Chí Minh, ngày

tháng

năm 2021

Người hướng dẫn
(Ký và ghi rõ họ tên)

Sinh viên
(Ký và ghi rõ họ tên)

Nguyễn Thị Diệu Hạnh

Hồ Nguyễn Hoàng Yến

i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được đề tài nghiên cứu này, em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình
và những lời động viên sâu sắc của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè trong suốt
khoảng thời gian thực hiện đề tài.
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Công
nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, Ban lãnh đạo Viện, Ban quản lý phịng thí nghiệm
và q Thầy Cơ của Viện Cơng nghệ Sinh học và Thực phẩm đã hỗ trợ về cơ sở vật
chất và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Diệu Hạnh đã tận tình hướng
dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm và kiến thức chuyên môn giúp em kịp thời giải

quyết vấn đề, động viên em những lúc khó khăn và ln tạo mọi điều kiện thuận lợi
để em hoàn thành đề tài nghiên cứu này.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Tấn Việt và TS. Nguyễn Ngọc Ẩn đã luôn
quan tâm, chỉ bảo và ln sẵn lịng hỗ trợ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể sinh viên làm việc tại Phịng Thí nghiệm Cơng
nghệ Vi sinh thuộc Viện Cơng nghệ Sinh học và Thực phẩm đã giúp đỡ, san sẻ và
tạo động lực để em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này.
Cảm ơn gia đình đã ln chia sẻ, hỗ trợ và là nguồn động viên to lớn đối với con
trong suốt thời gian qua.
Tuy đã cố gắng rất nhiều nhưng vì vốn kiến thức, kinh nghiệm của bản thân cịn hạn
chế, do đó trong q trình thực hiện và hồn thành đề tài, em khơng tránh khỏi
những thiếu sót nên rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của q Thầy Cơ
để em có thể hồn thiện hơn.
Cuối cùng, em xin kính chúc q Thầy Cơ ln dồi dào sức khỏe và gặt hái được
nhiều thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống. Em xin chân thành cảm
ơn!
ii


TÓM TẮT
Thanh long là loại trái cây giàu dinh dưỡng và có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, từ
những năm 2008-2009, trên thanh long xuất hiện một bệnh mới có tên gọi là bệnh
đốm nâu. Bệnh đốm nâu làm cho thân cây và quả thanh long xuất hiện các đốm cam
hình trịn nhỏ, trũng xuống, đốm đen và thối rữa, làm thiệt hại nghiêm trọng đến
chất lượng cũng như năng suất cây trồng. Chủng nấm mốc Neoscytalidium
dimidiatum được xác định là nguyên nhân chính gây ra bệnh đốm nâu trên thanh
long. Do đó, nhằm tìm ra các đối tượng vi sinh vật có khả năng kiểm sốt hiệu quả
bệnh đốm nâu do N. dimidiatum gây ra và an toàn đối với môi trường, chúng tôi đã
khảo sát khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm N. dimidiatum bởi
chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7. Dịch nuôi cấy của chủng B. licheniformis

D7 có khả năng ức chế sự nảy mầm và làm biến dạng cấu trúc bào tử mốc cũng như
tế bào hệ sợi tơ nấm. Bên cạnh đó, dịch ni cấy vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm
mốc tốt nhất khi ở điều kiện nhiệt độ phịng và tại pH 7.0. Thêm vào đó, dịch ni
cấy của chủng B. licheniformis D7 có khả năng ức chế sự phát triển bệnh đốm nâu
do N. dimidiatum gây ra và làm giảm mức độ bệnh trên quả thanh long. Hơn nữa,
dịch ni cấy vi khuẩn cịn cho thấy có khả năng ngăn ngừa hoàn toàn sự phát triển
bệnh trên thân cây thanh long trong ít nhất 21 ngày gây nhiễm với mốc N.
dimidiatum. Nghiên cứu này cho thấy chủng vi khuẩn B. licheniformis D7 có tiềm
năng trong việc ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học để kiểm soát bệnh do nấm
mốc N. dimidiatum gây ra nhằm phục vụ cho ngành trồng thanh long ở nước ta.

iii


MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................ vii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................... ix
MỞ ĐẦU............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN .......................................................................... 5

1.1 Chi Bacillus ............................................................................................... 5
1.1.1 Đặc điểm chung ................................................................................. 5
1.1.2 Bacillus licheniformis ........................................................................ 6
1.1.3 Khả năng sinh tổng hợp các hợp chất kháng mốc của Bacillus
licheniformis .......................................................................................... 8
1.2 Neoscytalidium dimidiatum ...................................................................... 9
1.2.1 Đặc điểm ............................................................................................ 9
1.2.2 Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long ..... 10

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................. 12
1.3.1 Một số nghiên cứu ngoài nước ........................................................ 12
1.3.2 Một số nghiên cứu trong nước ......................................................... 13
1.3.3 Đánh giá kết quả các cơng trình nghiên cứu đã công bố ................ 13
CHƯƠNG 2

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................... 15

2.1 Nguyên vật liệu ....................................................................................... 15
2.2 Các phương pháp nghiên cứu ................................................................. 18
2.2.1 Bố trí thí nghiệm .............................................................................. 18
iv


2.2.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật ........................................ 18
2.2.2.1 Phương pháp bảo quản giống vi khuẩn .................................... 18
2.2.2.2 Phương pháp bảo quản bào tử nấm mốc .................................. 19
2.2.2.3 Phương pháp bảo quản hệ sợi tơ nấm mốc .............................. 19
2.2.3 Phương pháp thu nhận dịch nuôi cấy vi khuẩn ............................... 19
2.2.4 Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch ...................................... 19
2.2.5 Phương pháp xây dựng đường cong tăng trưởng của vi khuẩn ...... 20
2.2.6 Phương pháp khảo sát các thành phần khác nhau của dịch nuôi cấy
vi khuẩn lên hoạt tính ức chế nấm mốc................................................. 20
2.2.7 Phương pháp khảo sát tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên sự
nảy mầm của bào tử nấm mốc .............................................................. 20
2.2.8 Phương pháp khảo sát tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên sự
phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc .......................................................... 21
2.2.9 Phương pháp khảo sát khả năng bền nhiệt, bền pH của dịch ni cấy
vi khuẩn lên hoạt tính ức chế sự phát triển của nấm mốc .................... 21
2.2.10 Phương pháp kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu do nấm

mốc gây ra trên thanh long của dịch nuôi cấy vi khuẩn ....................... 22
2.2.11 Phương pháp xử lí số liệu .............................................................. 23
CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................. 24

3.1 Định danh chủng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum ........................ 24
3.2 Định danh chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 ............................ 26
3.3 Kết quả sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc
Neoscytalidium dimidiatum bởi dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus
licheniformis D7 ........................................................................................ 29
v


3.4 Đường cong tăng trưởng của chủng Bacillus licheniformis D7 ............. 30
3.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt tính ức chế nấm mốc
Neoscytalidium dimidiatum của dịch ni cấy chủng vi khẩn Bacillus
licheniformis D7 ........................................................................................ 31
3.6 Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên sự nảy
mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum ............................ 32
3.7 Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên sự phát
triển của hệ sợi tơ nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum ......................... 36
3.8 Khả năng bền nhiệt và bền pH của dịch ni cấy chủng Bacillus
licheniformis D7 lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytlidium
dimidiatum.................................................................................................38
3.8.1 Khả năng bền nhiệt .......................................................................... 38
3.8.2 Khả năng bền pH ............................................................................. 40
3.9 Hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên thanh long do nấm mốc
Neoscytalidium dimidiatum gây ra của dịch nuôi cấy chủng Bacillus
licheniformis D7 ........................................................................................ 42

CHƯƠNG 4

KẾT LUẬN ............................................................................ 45

4.1 Kết luận ................................................................................................... 45
4.2 Kiến nghị ................................................................................................. 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 47
PHỤ LỤC .......................................................................................................... 54

vi


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hình thái đại thể và vi thể của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis ....... 8
Hình 1.2. Hình thái đại thể và vi thể của nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum ...... 10
Hình 1.3. Các giai đoạn phát triển bệnh thối thân do Neoscytalidium dimidiatum gây
ra trên thanh long ....................................................................................................... 12
Hình 1.4. Bệnh đốm nâu trên thân cây và quả thanh long ......................................... 12
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm .............................................................................. 18
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của nấm mốc HY trong 7 ngày nuôi cấy trên mơi
trường PGA ................................................................................................................ 24
Hình 3.2. Hình thái vi thể của chủng nấm mốc HY ................................................... 25
Hình 3.3. Tỉ lệ tương đồng (gene mã hóa cho 18S-rRNA) của chủng HY với các lồi
lân cận ........................................................................................................................ 25
Hình 3.4. Cây phả hệ của chủng HY với các lồi lân cận ......................................... 26
Hình 3.5. Hình thái khuẩn lạc và khả năng sinh catalase của chủng vi khuẩn Bacillus
sp. D7 ......................................................................................................................... 27
Hình 3.6. Hình thái vi thể của chủng Bacillus sp. D7 khi được nhuộm Gram và
nhuộm bào tử.............................................................................................................. 27
Hình 3.7. Tỉ lệ tương đồng (gene mã hóa cho 16S-rRNA) của chủng Bacillus sp. D7

với các lồi lân cận ..................................................................................................... 28
Hình 3.8. Cây phả hệ của chủng Bacillus sp. D7 với các loài lân cận....................... 28
Hình 3.9. Khả năng đối kháng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi
cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 ..................................................................... 29

vii


Hình 3.10. Ảnh hưởng của các thành phần khác nhau của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên
khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc ...................................... 30
Hình 3.11. Đường cong tăng trưởng của chủng Bacillus licheniformis D7 trong mơi
trường LB ................................................................................................................... 31
Hình 3.12. Ảnh hưởng của thời gian ni cấy lên hoạt tính ức chế nấm mốc
Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 .... 32
Hình 3.13. Tác động của dịch ni cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hình thái
và khả năng nảy mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum .................. 34
Hình 3.14. Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên sự sinh
trưởng của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum .......................................... 35
Hình 3.15. Tác động của dịch ni cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hình thái
và sự phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum ........................ 37
Hình 3.16. Phần trăm hoạt tính kháng mốc Neoscytalidium dimidiatum cịn lại của
dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 tại các nhiệt độ khác nhau ở thời gian
30 phút........................................................................................................................ 39
Hình 3.17. Phần trăm hoạt tính kháng mốc Neoscytalidium dimidiatum cịn lại của
dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 tại các giá trị pH khác nhau ở thời
gian 2 giờ.................................................................................................................... 41
Hình 3.18. Hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu do Neoscytalidium dimidiatum gây ra
trên quả thanh long của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 .................. 43
Hình 3.19. Hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu do Neoscytalidium dimidiatum gây ra
trên thân cây thanh long của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 ........... 44

viii


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Một số thiết bị và dụng cụ ......................................................................... 15
Bảng 2.2. Một số hóa chất.......................................................................................... 16
Bảng 2.3. Thành phần một số môi trường sử dụng trong nghiên cứu ....................... 16
Bảng 2.4. Một số nguyên vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu ........................... 17
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7
đối với sự nảy mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum ở các tỉ lệ và
thời gian khác nhau .................................................................................................... 33
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7
đối với sự phát triển của hệ sợi tơ mốc Neoscytalidium dimidiatum ở các tỉ lệ và thời
gian khác nhau ........................................................................................................... 36

ix


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Thanh long là một loại cây ăn quả nhiệt đới và cận nhiệt đới quan trọng. Thanh long
thuộc họ Xương rồng (Cactaceae) và xuất hiện ở các vùng nhiệt đới bản địa của
châu Mỹ Latinh, bao gồm Mexico, Trung và Nam Mỹ. Hiện nay, nó cũng được
trồng rộng khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới, đặc biệt là ở
các nước châu Á, như Malaysia, Việt Nam, Thái Lan, Philippines và Trung Quốc
[1].
Tại Việt Nam, thanh long được trồng chủ yếu ở các tỉnh Bình Thuận, Long An và
Tiền Giang, tổng diện tích sản xuất thanh long khoảng 50.000 ha với giống ruột
trắng (Hylocereus undatus) chiếm hơn 95% sản lượng, tiếp theo là giống ruột đỏ

(Hylocereus polyrhizus) chiếm 4,5% [2]. Trong đó, sản lượng để xuất khẩu lớn hơn
rất nhiều so với tiêu thụ trong nước.
Diện tích trồng thanh long ở Việt Nam tăng nhanh từ 5.512 ha năm 2000 lên đến
35.665 ha năm 2014 với tổng sản lượng đạt khoảng 614.346 tấn [3]. Theo số liệu
ước tính sơ bộ năm 2015, diện tích trồng mới thanh long gần 5.000 ha, sản lượng đạt
khoảng 686.195 tấn [3]. Theo thống kê, sản lượng thanh long ở Việt Nam đạt
khoảng 1,2 triệu tấn vào năm 2019 và dự kiến sẽ đạt 1,7 triệu tấn vào năm 2025, dự
báo tốc độ tăng trưởng đạt 6,0% [2]. Do đó, việc xuất khẩu thanh long mang lại
nguồn thu nhập lớn cho nông dân nước ta.
Tuy nhiên, việc sản xuất thanh long ở Việt Nam đang gặp nhiều khó khăn do tác
động của biến đổi khí hậu và dịch bệnh như bệnh đốm nâu, bệnh nám cành, bệnh
thối nhũn, bệnh thán thư, bệnh nấm bồ hóng,… [4]. Bên cạnh đó, việc mở rộng diện
tích và thâm canh cao đã tạo điều kiện cho nhiều loại sâu bệnh gây hại phát triển. Từ
năm 2008 đến nay, các loại bệnh mới như bệnh đốm trắng, đốm vàng, đốm nâu xuất
hiện làm hư hại, gây loét trên thân và quả thanh long. Trong đó, bệnh đốm nâu do
nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra hậu quả nghiêm trọng nhất [5, 6].

1


Neoscytalidium

dimidiatum

thuộc

ngành

nấm

túi

Ascomycota,

lớp

Dothideomycetes, bộ Botrysphaeriales, họ Botrysphaeriaceae, chi Neoscytalidium
[7]. Nó được xác định là tác nhân gây ra các bệnh nhiễm trùng giống bệnh nấm da ở
người [8], xâm nhập và làm viêm phổi dẫn đến cái chết ở cá heo [9], bên cạnh đó,
chủng nấm mốc N. dimidiatum cịn được báo cáo là tác nhân chủ yếu gây bệnh trên
nhiều đối tượng thực vật như: cà chua, cây có múi, thanh long,… [10-12].
Bệnh đốm nâu do nấm mốc N. dimidiatum gây ra làm ảnh hưởng nặng nề tới năng
suất cũng như chất lượng quả thanh long [11]. Điều này gây khó khăn trong việc
tiêu thụ nội địa và xuất khẩu, cũng như ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của người
nông dân và ngành trồng thanh long. Để ngăn chặn bệnh, thuốc diệt nấm hóa học đã
được sử dụng tràn lan trong nơng nghiệp. Việc sử dụng thuốc diệt nấm hóa học
khơng những khơng có hiệu quả trong kiểm sốt bệnh đốm nâu do nấm mốc gây ra
mà còn ảnh hưởng xấu đối với sức khỏe con người, gây ô nhiễm môi trường và làm
tăng khả năng kháng thuốc của nấm bệnh. Hiện nay, xu hướng phát triển của thế
giới là hướng tới một nền nông nghiệp sạch và bền vững. Do đó, việc sử dụng các
biện pháp sinh học như các hợp chất đối kháng có nguồn gốc từ vi sinh vật là một
phương pháp thay thế hiệu quả và thân thiện với mơi trường. Trong đó, các hợp chất
đối kháng nấm mốc có nguồn gốc từ vi khuẩn đã và đang được sử dụng rộng rãi trên
thế giới.
Bacillus licheniformis là vi khuẩn Gram dương, hình que, ưa nhiệt. Trong điều kiện
mơi trường khắc nghiệt, chúng có khả năng hình thành nội bào tử [13]. Những bào
tử này có khả năng chịu nhiệt, lạnh, bức xạ và các áp lực khác của mơi trường.
Thêm vào đó, chủng B. licheniformis cịn có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzyme
có hoạt tính mạnh như amylase, protease, cellulase, chitinase… [13], đồng thời,
chúng cũng có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng ức

chế sự sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, bao gồm cả vi khuẩn Gram
âm lẫn Gram dương và nấm gây bệnh [14, 15].
Xuất phát từ thực trạng trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát
khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên
thanh long của vi khuẩn Bacillus licheniformis D7” với mục đích hướng tới việc
2


sản xuất chế phẩm sinh học hỗ trợ cho sự phát triển bền vững của ngành nơng
nghiệp nói chung và ngành trồng thanh long nói riêng ở nước ta.
2. Mục tiêu của đề tài
Đánh giá được khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm
nâu trên thanh long của vi khuẩn Bacillus licheniformis D7.
Để đạt được mục tiêu này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu với các nội dung sau:
➢ Nội dung 1: Khảo sát sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của
nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum bởi dịch nuôi cấy chủng Bacillus
licheniformis D7
➢ Nội dung 2: Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus
licheniformis D7 lên khả năng nảy mầm của bào tử Neoscytalidium dimidiatum
➢ Nội dung 3: Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus
licheniformis D7 lên sự phát triển của hệ sợi tơ Neoscytalidium dimidiatum
➢ Nội dung 4: Khảo sát khả năng bền nhiệt và bền pH của dịch nuôi cấy chủng
Bacillus licheniformis D7 lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytalidium
dimidiatum
➢ Nội dung 5: Kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên cây và quả thanh
long do Neoscytalidium dimidiatum gây ra của dịch nuôi cấy chủng Bacillus
licheniformis D7
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu:
➢ Chủng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum được phân lập từ thân cây thanh

long bị nhiễm bệnh đốm nâu ở Bình Thuận, được lưu trữ trong bộ sưu tập giống
của Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học và Thực
phẩm, Trường Đại học Cơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
➢ Chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 được phân lập từ đất ở Thành phố Hồ
Chí Minh, được lưu trữ trong bộ sưu tập giống của Phịng thí nghiệm Cơng nghệ
3


Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Cơng Nghiệp
Thành phố Hồ Chí Minh.
Phạm vi nghiên cứu: khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây
bệnh đốm nâu trên thanh long của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7
4. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Đề tài này được tiến hành nhằm xác định khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium
dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của chủng vi khuẩn Bacillus
licheniformis D7, bao gồm sự tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên khả năng nảy
mầm bào tử nấm mốc cũng như sự phát triển của hệ sợi tơ nấm và hiệu quả ngăn
ngừa bệnh đốm nâu do nấm mốc gây ra trên thân cây và quả thanh long. Nghiên cứu
này có ý nghĩa trong việc tạo ra chế phẩm sinh học từ Bacillus licheniformis D7 để
kiểm soát bệnh đốm nâu trên thanh long do nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum
gây ra, ứng dụng cho ngành trồng thanh long trong tương lai.

4


CHƯƠNG 1

1.1

TỔNG QUAN

Chi Bacillus

1.1.1 Đặc điểm chung
Các chủng Bacillus là vi khuẩn Gram dương hình que, hiếu khí hoặc kỵ khí đa dạng,
có khả năng sinh enzyme catalase và hiện diện ở khắp nơi trong tự nhiên [16].
Chúng có khả năng hình thành nội bào tử khi điều kiện mơi trường trở nên bất lợi,
chỉ có một nội bào tử được hình thành trên một tế bào và có thể ở trạng thái không
hoạt động này trong nhiều năm. Nội bào tử của một chủng Bacillus từ vùng
Morocco đã được báo cáo là vẫn sống sót sau khi được xử lí bằng nhiệt khơ với
nhiệt độ lên đến 420℃ và khả năng này được duy trì sau nhiều thế hệ [17]. Do bào
tử của nhiều lồi Bacillus có khả năng chịu nhiệt, bức xạ, chất khử trùng và hút ẩm
nên chúng khó bị loại bỏ khỏi các nguyên liệu y tế, dược phẩm và là nguyên nhân
thường xuyên gây ô nhiễm. Một số loài Bacillus được biết đến như những sinh vật
gây hư hỏng thực phẩm [16].
Bênh cạnh đó, các lồi Bacillus cũng được sử dụng trong nhiều quy trình y tế, dược
phẩm, nông nghiệp và công nghiệp bằng cách tận dụng các đặc điểm sinh lý đa
dạng, khả năng tạo ra nhiều loại enzyme, kháng sinh và các chất chuyển hóa khác
[16]. Ngoại trừ B. anthracis và B. cereus sản sinh độc tố, các chủng Bacillus cịn lại
thường có lợi, an tồn cho thực vật và mơi trường sinh thái [18]. Những đặc tính này
của các lồi Bacillus làm cho chúng trở thành tác nhân kiểm soát sinh học tốt để
thay thế thuốc trừ nấm hóa học tổng hợp. Nhiều chủng Bacillus đã được sử dụng để
kiểm soát các bệnh do nấm mốc gây ra trên thực vật như Botrytis cinerea, các chủng
Aspergillus… [19, 20]. Ngoài ra, bacitracin và polymyxin là hai loại kháng sinh nổi
tiếng được thu nhận từ các loài Bacillus. Một số loài được sử dụng làm tiêu chuẩn
trong các thử nghiệm y tế và dược phẩm [16].
Từ những năm 1990, C. Ash và cộng sự đã cho ra đời hệ thống phân loại Bacillus
dựa trên phân tích trình tự đoạn gene 16S-rRNA [21]. Chúng bao gồm ít nhất 9 lồi
5

là

B. amyloliquefaciens, B. atrophaeus, B. axarquiensis, B. malacitensis, B.

mojavensis, B. sonorensis, B. tequilensis, B. vallismortis và B. subtilis. Các loại
enzyme từ Bacillus như amylase, cellulase, protease và lipase có nhiều đặc tính quý
như khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và bền nhiệt, do đó, các loại enzyme
này đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Bên cạnh đó, các chủng
Bacillus cũng có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại hợp chất kháng sinh như
lipopeptide, peptide, protein,… được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm sinh học
nông nghiệp, sản xuất enzyme công nghiệp, và sản xuất kháng sinh [16]. Nhiều
chủng Bacillus đã được sử dụng để kiểm soát các bệnh ở thực vật, đặc biệt là các
bệnh gây ra bởi nấm như Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, các chủng
Aspergillus và Penicillium… [19, 20].
1.1.2 Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis là một trực khuẩn Gram dương, phân bố rộng rãi trong tự
nhiên. Chủng vi khuẩn này có khả năng hình thành nội bào tử để chống lại các bất
lợi khác nhau của mơi trường [22]. Bên cạnh đó, B. licheniformis còn sinh tổng hợp
các chất kháng khuẩn khác nhau, chẳng hạn như lipopeptide, peptide, phospholipid,
polyenes, amino acid và nucleic acid, có khả năng ức chế các mầm bệnh khác nhau
từ động vật, thực vật và con người. Đồng thời, B. licheniformis cũng có khả năng
sinh tổng hợp nhiều loại enzyme có hoạt tính cao như protease, lipase, amylase,
glucanase và chitinase [23-27]. Chính vì vậy mà B. licheniformis được sử dụng rộng
rãi trong các ứng dụng y tế, thuốc trừ sâu, thực phẩm, chế biến thức ăn chăn nuôi và
làm sạch môi trường.
Bacillus licheniformis là một loại vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật điển hình,
cơ chế tác động của nó bao gồm cạnh tranh dinh dưỡng và khơng gian với mầm
bệnh, sinh tổng hợp các chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng diệt khuẩn, cảm ứng
sự đề kháng của cây trồng và thúc đẩy sự phát triển của cây trồng. Các ví dụ bao

gồm B. licheniformis NJWGYH 833051, có thể xâm nhập vào lá và thân rễ của cà
chua, đóng một vai trị trong kiểm sốt sinh học [28]; B. licheniformis GZ-3, được
phát hiện bởi Ma và cộng sự không chỉ cho thấy khả năng đối kháng tốt với Botrytis
cinerea và Fusarium oxysporum mà cịn có hoạt tính ức chế chống lại nhiều loại
6


nấm gây bệnh đã được thử nghiệm khác [29]; một loài B. licheniformis được phân
lập từ ngũ cốc lên men và có hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn Gram dương khác
nhau [30]. Bên cạnh đó, khi xử lý rễ cây dưa chuột bằng B. licheniformis TG116 có
thể làm tăng hoạt động của các enzyme bảo vệ như peroxidase (POD), polyphenol
oxidase (PPO), và phenylalanine amoniac-lyase (PAL) trong lá, đồng thời làm giảm
nhẹ hàm lượng malondialdehyde (MDA) về trạng thái cân bằng mới và gây ra sức
đề kháng trên toàn thân cây [31]. Ansari và cộng sự đã phát hiện ra rằng B.
licheniformis B642 và Pseudomonas fluorescens FAP2 có thể tương tác trong màng
sinh học, do đó làm tăng sự phát triển và quang hợp của thực vật [32].
Với những đặc tính hữu ích trên mà chủng B. licheniformis chỉ đứng sau
Escherichia coli về mức độ chi tiết đã được nghiên cứu [33]. Trình tự bộ gen được
chú thích của B. licheniformis trước đây đã được phân tích để đánh giá tầm quan
trọng về công nghệ sinh học của sinh vật [34].
Theo phân loại của (Weigmann 1898) Chester vào năm 1901 [13], Bacillus
licheniformis thuộc:
Giới:

Bacteria

Ngành:

Firmicutes

Lớp:

Bacilli

Bộ:

Bacillales

Họ:

Bacillaceae

Chi:

Bacillus

Loài:

Bacillus licheniformis

7


a

b

Hình 1.1. Hình thái đại thể (a) và vi thể (b) của chủng vi khuẩn Bacillus
licheniformis [13, 35]
1.1.3 Khả năng sinh tổng hợp các hợp chất kháng mốc của Bacillus

licheniformis
Bacillus licheniformis là một chủng Bacillus tiềm năng với khả năng tổng hợp
phong phú các chất chống nấm ngoại bào, bao gồm glucanase, chitinase, protein
kháng nấm, peptide, lipopeptide [36]. Một vài hợp chất có khả năng kháng mốc của
B. licheniformis đã được nghiên cứu và công bố như Fungicin M4, Protein F2,
Surfactin, benzoic acid [37-40]…
Chủng B. licheniformis M4 sản xuất một peptide ưa nước 3.4 kDa với hoạt tính
kháng nấm, được đặt tên là Fungicin M4. Hợp chất này có phổ ức chế hẹp chỉ ức
chế được các loài như Microsporum canis CECT 2797, Mucor mucedo CECT 2653,
Mucor plumbeus CCM F 443, Sporothrix schenckii CECT 2799 [37].
Một loại protein chống nấm được tạo ra bởi chủng B. licheniformis BS-3 đã được
tinh chế bằng kết tủa ammonium sulfate, sắc ký cột DEAE-52 và sắc ký cột
Sephadex G-75. Protein tinh khiết được gọi là protein F2, có khả năng ức chế sự
phát triển của Aspergillus niger, Magnaporthe oryzae và Rhizoctonia solani. Protein
F2 là một monomer có trọng lượng phân tử xấp xỉ 31 kDa [38].

8


Hợp chất kháng nấm được tổng hợp từ B. licheniformis BC98 có hoạt tính kháng
mạnh nhất đối với nấm đạo ơn Magnaporthe grisea. Ngồi ra, hợp chất này cịn ức
chế sự phát triển của các loại nấm gây bệnh khác như Curvularia lunata và
Rhizoctonia bataticola. Sau khi tiến hành phân tích HPLC mơ tả cấu trúc chi tiết và
phân tích 500 MHz 1H NMR thì lipopeptide đối kháng được tiết ra bởi B.
licheniformis BC98 có khối lượng phân tử xấp xỉ 1 kDa và được xác định là
Surfactin [39].
Chất chuyển hóa của B. licheniformis MH48 cho hoạt tính ức chế mạnh đối với nấm
Rhizoctonia solani và Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh trên cây trồng. Sau
khi tiến hành chạy HPLC để xác nhận độ tinh khiết của hợp chất kháng nấm, phân
tích 600 MHz 1H NMR 1H để xác định cấu trúc hóa học và chạy GC/MS để xác

định trọng lượng phân tử của hợp chất kháng nấm, chất kháng nấm do B.
licheniformis MH48 tiết ra được xác định là benzoic acid [40].
1.2

Neoscytalidium dimidiatum

1.2.1 Đặc điểm
Neoscytalidium dimidiatum được nhà nấm học người Anh, tiến sĩ Rolland Marshall
Nattrass mô tả lần đầu tiên vào năm 1933 với tên gọi Hendersonula toruloidea từ
những cây ăn quả bị bệnh ở Ai Cập. Nhiều thập kỷ sau, nó được xác định là tác nhân
gây ra các bệnh nhiễm trùng giống bệnh nấm da ở người [8].
Neoscytalidium

dimidiatum

thuộc

ngành

nấm

túi

Ascomycota,

lớp

Dothideomycetes, bộ Botrysphaeriales, họ Botrysphaeriaceae, chi Neoscytalidium
[7]. Sợi nấm N. dimidiatum phân nhánh, có vách ngăn, màu nâu và có khả năng
phân cắt thành các bào tử đốt. Bào tử có hình dạng ellipse, hình trụ hoặc trịn, chứa

một hoặc hai nhân, màu sắc từ trong suốt đến nâu tối, thành bào tử dày, có 0-1 vách
[7].
Một đĩa sợi nấm đường kính 6mm được cấy vào trung tâm của đĩa thạch PGA
(đường kính 90mm), ủ ở 25℃. Hình thái khuẩn lạc và sắc tố được đánh giá sau 7
ngày nuôi cấy, trong khi tốc độ tăng trưởng được đo mỗi ngày cho đến khi lan đầy
đĩa (3 ngày) [41]. Khuẩn lạc nấm N. dimidiatum dạng sợi, có màu xám đen đến nâu
9


đen ở mặt trên, mặt dưới có màu đen, khơng có vịng đồng tâm. Sợi nấm phân
nhánh, vươn cao như bơng gịn trên bề mặt mơi trường PGA (Hình 1.2).
Neoscytalidium dimidiatum được biết đến như một mầm bệnh có thể gây bệnh trên
cả con người, động vật và thực vật. Ở người, N. dimiditum đã gây ra bệnh viêm mũi
với các triệu chứng như đau ở trán và thái dương, chảy nước mũi, nghẹt mũi, ho và
khó thở [42]. Ở động vật, theo báo cáo của Daniel Elad và cộng sự năm 2011, N.
dimiditum xâm nhập và làm viêm phổi dẫn đến cái chết ở cá heo [9]. Ở thực vật,
mốc N. dimiditum gây bệnh trên nhiều đối tượng hơn như: cà chua, cây có múi,
thanh long,… làm giảm năng suất cũng như chất lượng quả, gây thiệt hại nặng nề về
mặt kinh tế [10-12].

Hình 1.2. Hình thái đại thể (A) và vi thể (B) của nấm mốc Neoscytalidium
dimidiatum [43]
1.2.2 Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long
Bệnh đốm nâu do nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên cây thanh long là
một bệnh cực kỳ nghiêm trọng, rất khó kiểm soát trong mùa mưa. Bệnh dễ dàng lây
lan trong mơi trường nóng và ẩm, hiện tại khơng có phương pháp kiểm soát hiệu
quả. Bệnh gây thiệt hại cho thân cây, làm ảnh hưởng đến năng suất quả. Ngoài ra,
bệnh đốm nâu cũng ảnh hưởng đến sự ra quả. Kết quả là mất lợi ích kinh tế trong
xuất khẩu.
Sau khi bị nhiễm bệnh, chuỗi các biểu hiện triệu chứng sẽ xuất hiện như sau (Hình

1.3) [34]:
10


1. Xuất hiện các điểm tổn thương có vệt đỏ ở tâm
2. Các điểm sau đó dần chuyển sang màu xám
3. Các điểm tổn thương lan rộng dần ra xung quanh và tâm tạo thành lớp vảy
nâu cứng
4. Hình thành quần sáng màu vàng dễ thấy xung quanh hoặc một bên của vảy
và vùng tổn thương dần lan rộng ra
5. Giai đoạn mở rộng liên tiếp dẫn đến các tổn thương lớn, màu xám, từng
cụm, giống như ghẻ
6. Các vùng tổn thương bị phân rã và rơi ra tạo thành một lỗ trống
Ở nước ta, dịch đốm nâu trên cây thanh long được phát hiện đầu tiên ở tỉnh Bình
Thuận vào năm 2008 và bệnh bắt đầu lan rộng trên cả nước vào năm 2009. Đến năm
2012, bệnh lan mạnh với diện tích gần 1.000 ha, bệnh có mặt khắp các vùng trồng
thanh long lớn trên cả nước như Bình Thuận, Tiền Giang, Long An. Đến tháng
6/2013 diện tích bệnh đốm nâu đã tăng lên 3.000 ha. Bệnh làm giảm khả năng sinh
trưởng, phát triển và chất lượng quả thanh long, gây thiệt hại lớn cho nông dân trồng
thanh long trên cả nước [44].

11


Hình 1.3. Các giai đoạn phát triển bệnh thối thân do Neoscytalidium dimidiatum
gây ra trên thanh long [34]

Hình 1.4. Bệnh đốm nâu trên thân cây và quả thanh long [44]
1.3

Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước

1.3.1 Một số nghiên cứu ngồi nước
Trên thế giới đã có một số nghiên cứu về ứng dụng vi sinh vật trong kiểm soát
bệnh ở cây trồng do mốc N. dimidiatum gây ra và đã đạt được nhiều kết quả
tích cực. Tại Trung Quốc, Lan và các cộng sự (2012) đã đưa ra báo cáo đầu
12


tiên mơ tả đặc tính của mầm bệnh, hình thái và đặc điểm phân tử của mốc N.
dimidiatum gây bệnh trên thanh long (Hylocereus undatus) [5].
Montiel và các cộng sự (2018) đã phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn
Stenotrophomonas rhizophila có khả năng ức chế nấm mốc N. dimidiatum lên
tới 98% [45].
Gần đây, nghiên cứu của Alwan và các cộng sự (2019) về khả năng đối kháng
nấm bệnh N. dimidiatum của vi khuẩn cũng cho kết quả rất khả quan. Hai
chủng vi khuẩn Lactobacillus rhamnosus và Azotobacter chroococcum đã được
chứng minh có khả năng ức chế sự phát triển của mốc N. dimidiatum xuống
còn 44% và 75% [46].
1.3.2 Một số nghiên cứu trong nước
Trong nước cũng có nhiều nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn để tạo các hợp chất
kháng mốc ứng dụng trong nông nghiệp trồng trọt. Năm 2014, Võ Thị Thu
Oanh và các cộng sự đã phân lập, mơ tả hình thái và đặc điểm phân tử của
chủng nấm mốc N. dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thân cây và quả thanh
long ở tỉnh Bình Thuận [47].
Năm 2016, Hà Thị Thúy và các cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn
Bacillus polyfermenticus có khả năng ức chế nấm mốc N. dimidiatum và đảm
bảo an toàn sinh học khi được phóng thích ra mơi trường [48].
Gần đây, vào năm 2019, Nguyễn Như Nhứt và các cộng sự đã phân lập, kiểm
tra hình thái, bệnh học in vitro, in vivo và sinh học phân tử hai chủng N.

dimidiatum. Bên cạnh đó, các tác giả cịn kiểm tra hiệu quả đối kháng in vitro
đối với 2 chủng nấm mốc N. dimidiatum của 20 chủng Bacillus spp. và 75%
các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng đối kháng với nấm mốc
[49].
1.3.3 Đánh giá kết quả các cơng trình nghiên cứu đã cơng bố
Các cơng trình nghiên cứu đã công bố trên thế giới hầu hết đã xác định được
Neoscytalidium dimidiatum là nguyên nhân gây ra bệnh đốm nâu trên nhiều
13


loại cây trồng, đặc biệt là trên thanh long và cũng đã khảo sát được khả năng
đối kháng nấm mốc của các chủng vi khuẩn. Tuy nhiên vẫn chưa có giải pháp
hiệu quả để kiểm soát nấm mốc N. dimidiatum gây bệnh trên thực vật, đặc biệt
là trên cây thanh long.
Các chủng vi khuẩn là đối tượng có tiềm năng trong việc kiểm soát nấm mốc
N. dimidiatum gây bệnh trên thực vật. Do đó, chúng tơi đã nghiên cứu khả năng
ức chế nấm mốc N. dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của chủng vi
khuẩn B. licheniformis D7 nhằm hướng tới việc sản xuất chế phẩm sinh học
ứng dụng trong ngành trồng thanh long ở nước ta.

14


CHƯƠNG 2
2.1

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguyên vật liệu

Một số thiết bị và dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày trong
Bảng 2.1
Bảng 2.1. Một số thiết bị và dụng cụ
Tên thiết bị

Xuất xứ

Tên dụng cụ

Xuất xứ

Autoclave

Nga

Erlen 500, 250 mL

Đức

Tủ cấy

Việt Nam

Que cấy

Trung Quốc

Đức

Micropipette

Việt Nam

Mỹ

Becher

Đức

Tủ sấy MEMMERT Model;
UNB400
Tủ ấm SHELLAB, Model:
1330 FX

Buồng đếm hồng

Tủ mát ALASKA

Nhật Bản

Máy vortex SCILOGEX

Mỹ

Đũa thủy tinh

Việt Nam

Đức

Ống nhỏ giọt

Việt Nam

Đức

Lam kính

Việt Nam

Lị viba Sanyo 23L

Việt Nam

Lamel

Việt Nam

Kính hiển vi quang học

Ý

Đĩa Petri

Đức

Máy đo pH

Đức

Que trải thủy tinh

Việt Nam

Máy lắc ngang IKA,
Model: HS 260 basic

cầu

Đức

Cân phân tích
SARTORIUS, Model: CP
224S

15