KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẮM SỢI THUỘC GIỐNG ASPERGILLU, TRICHODERMA VÀ ỨNG DỤNG

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIẸN TRƯỜNG ĐẦI HOC SỪ PHAM TP. Hồ CHÍ MINH
•••

LÊ THỊ HUỆ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG
HỢP ENZYME CHITINASE CUA MỘT
Sổ CHỦNG NẤM SỢI THUỘC GIỐNG
ASPERGILLUs, TRICHODERMA VÀ
ỨNG DỤNG
LUẬN VĂN THẠC sĩ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN:
PGS.TS. ĐỒNG THỊ THANH THU

TP.HCM, 2010


MỞ ĐÀU
Vi sinh vật là nhóm sinh vật có số lượng nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất trong
thiên nhiên mạnh nhất. Hiện nay người ta khai thác nhiều enzyme từ vi sinh vật và được ứng dụng rất
nhiều trong đời sống, sản xuất. So với nguồn khai thác enzyme từ động vật và thực vật, nguồn enzyme
từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ vi sinh vật rất
ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hồn tồn theo qui mô công nghiệp.
Nhiều enzyme được khai thác từ vi sinh vật được tập trung nghiên cứu và có nhiều ứng dụng trong
thời gian qua như protease, amylase, cellulase, pectinase ... Những năm sau này người ta đang chú ý
nhiều hơn về một loại enzyme khác nữa là chitinase, đây là enzyme thủy phân chitin.
Chitin là một polymer sinh học có thể so sánh với polysaccharide như cellulose. Chitin phân bố
rất rộng rãi ở dạng cấu trúc cơ bản trong thành tế bào của nấm và là bộ xương ngoài của tơm cua và
cơn trùng. Đây là một polymer có trọng lượng phân tử cao, không tan trong nước, chứa các đơn phân

là V-acetyl-glucosamine liên kết bởi liên kết 1,4-P-glucoside. Chitin có nhiều cơng dụng ương nhiều
lĩnh vực như y học và cơng nghiệp...
Những enzyme có liên quan đến chuyển hóa và phân giải chitin đang được nghiên cứu nhiều
trong những năm gần đây. Chitin bị phân giải bởi hệ enzyme có tên gọi chung là chitinase. Enzyme
này được sản xuất bởi các tổ chức sống dưới tế bào để phục vụ nhu cầu chức năng sinh lý của chúng.
Sự phân giải chitin dưới tác động enzyme phụ thuộc vào các yếu tố hóa lý (tỉ lệ giữa cơ chất và
enzyme, pH, nhiệt độ...). Trong các nguồn thu nhận chitinase thì chitinase từ vi sinh vật là nguồn quan
trọng. Những nguồn sinh vật để thu nhận enzyme chitinase đáng kể là các chủng vi khuẩn thuộc các
chi Enterobacter và Streptomyces, các chủng nấm sợi thuộc các chi Asperỉllus, Peniciỉỉium, và
Trichoderma, và một số động vật nguyên sinh.
Những năm gần đây có nhiều cơng trình nghiên cứu tập trung vào enzyme chitinase do tiềm
năng ứng dụng to lớn của enzyme này trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong thu nhận tế bào trần
(thể nguyên sinh), sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine và N-acetyl glucosamine, sản xuất
thuốc trừ sâu sinh học, ứng dụng trong y học, trong việc kiểm sốt nấm kí sinh trên cây trồng... V. V...
Vì những ứng dụng rộng rãi của chitinase như hên, mục đích đề tài chúng tơi nhằm nghiên cứu
sinh tổng họp chitinase nhằm thu nhận chế phẩm chitinase từ một số chủng nấm sợi và bước đầu khảo


sát một số ứng dụng của enzyme này. Chúng tôi thực hiện đề tài: Khảo sát khả năng sinh tổng họp
enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trìchoderma và ứng dụng.
Mục tiêu đề tài: Lựa chọn chủng nấm sợi có khả năng tổng họp chitinase cao, thu nhận chế
phẩm chitinase từ canh trường và bước đầu nghiên cứu một số ứng dụng của chitinase.
Nhiệm vụ của đề tài
- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase của một vài chủng nấm sợi thuộc giống
Aspergillus, Trichoderma. Chọn chủng nấm sợi sinh tổng họp chitinase cao để nghiên cứu tiếp.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh tổng họp chitinase của chủng nấm sợi đã
chọn và tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm.
- Thu nhận chế phẩm chitinase.
- Khảo sát các điều kiện hoạt động tối ưu của chế phẩm chitinase: nhiệt độ, pH, nồng độ cơ
chất, thời gian thủy phân cơ chất.

- Bước đầu thử nghiệm một số ứng dụng của chế phẩm chitinase từ nấm sợi.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài
Thời gian : từ tháng 8/2009 - 7/2010


Địa điểm : Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư Phạm
Thành phố Hồ Chí Minh.Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. HỆ ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI
1.1.1.

Khái quát về enzyme

1.1.1.1.

Cẩu trúc [1,23]

Enzyme là một loại phân tử protein được sinh vật tổng họp nên và tham gia xúc tác cho các
phản ứng sinh học.
Enzyme có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, được cấu tạo từ các L-acid amin liên
kết nhau bởi liên kết peptid. Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của
enzyme.
Enzyme gồm hai nhóm: nhóm enzyme một cấu tử gồm những enzyme có thành phần hóa học
duy nhất là protein; nhóm enzyme hai cấu tử gồm những enzyme có hai thành phần: phần protein
thuần gọi là apoenzyme có vai trị xúc tác, phần thứ hai phi protein là coenzyme là những chất hữu cơ
đặc hiệu có vai trị thúc đẩy q trình xúc tác. Ngồi ra có một số kim loại như Zn, Cu, Mn, Fe ... đóng
vai trị liên kết enzyme và cơ chất trong quá trình xúc tác phản ứng, liên kết giữa apoenzyme và
coenzyme, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử.
1.1.1.2.

Cơ chế hoạt động [16, 23]

Trung tâm hoạt động của enzyme (E) có cấu trúc không gian tương ứng với cơ chất mà chúng
xúc tác, phản ứng hình thành trong quá trình enzyme tiếp xúc với cơ chất như “chìa khóa-ổ khóa“ tạo
phức họp enzyme-cơ chất. Quá trình tác động của enzyme vào cơ chất để tạo sản phẩm trải qua ba giai
đoạn:
Giai đoạn 1: Enzyme (E) tương tác với cơ chất (S) nhờ những liên kết tạo phức E-S Giai đoạn
2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzyme (E), cơ chất sẽ bị thay đổi cấu hình khơng gian và mức độ bền
vững các liên kết, liên kết bị phá vỡ tạo sản phẩm.
Giai đoạn 3: Enzyme tách ra, được giải phóng nguyên vẹn. Sản phẩm (P) tạo thành.
Sơ đồ cơ chế tác động enzyme:


E + s <—> E-S

-> E + p

1.1.13. Phăn loại enzyme [16,23]

Có nhiều cách phân loại enzyme, ở đây chúng tôi đề cập đến cách phân loại dựa vào kiểu xúc
tác của enzyme. Tại Hội nghị Sinh Hóa học năm 1961 họp tại Moscow đã đề ra một bảng phân loại
mới, trong đó enzyme được chia ra làm 6 lớp chính:
- Oxydoreductase (lớp enzyme oxy hóa hồn ngun sinh học)
-

Transferase (lớp enzyme vận chuyển)

-

Hydrolase (lớp enzyme thủy phân)

-

Liase (lớp enzyme phân giải chất không theo con đường thủy phân)

-

Ligase hay Synthetase (lớp enzyme tổng hợp chất)

-

Isomerase hay Mutase (lớp enzyme đồng phân hóa)

1.1.2.

Enzyme chitinase [32]

1.1.2.

L Cẩu trúc

Chitinase [Poly- Beta- 1- 4 - (.2-acetalmỉdo-2-deoxyj - D-glucosỉde glucanohydrola.se] thuộc
nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua
việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa Ci và c4 của hai phân tử N- acetyl Glucosamine
liên tiếp nhau trong chitin. Mã số của enzyme chitinase là EC 3.2.1.14.
3 —*■ Hydrolase
2 —> Glycosylase
1 —> Glycosidase
14 —> Chitinase

Chitinase cịn có các tên gọi khác (tùy theo xuất xứ enzyme) là chitodextrinase, P-poly-Nacetyl glucosamine, ChiAl (Bacỉllus cỉrculans), Chitotriosidase (Homo sapỉens), ChiC (Streptomyces
griceus) ...
Căn cứ vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18 và
Glycohydrolase 19 và Glycohydrolase 20.
> Họ Glycohydrolase 18
Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote,
Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngồi ra cịn có các enzyme khác
như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase.
Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn a/p cuộn
trịn, chúng hoạt động thơng qua một cơ chế kiểm sốt mà trong đó các đoạn p polymer bị phân cắt tạo
ra sản phẩm là p anomer. [32]
Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng họp từ các giống như Aeromonas
hydrophila,

Bacillus

circularỉs,

Trichoderma

harzianum,

Aphanocladỉum

album,

Serratỉa

marcescens...

Hình 1.1. Cấu trúc khơng gỉan của chỉtinase thuộc họ Glycohydrolase 18 [68]
> Họ Glycohydrolase 19
Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vệt, ngoài ra cịn có ở xạ khuẩn
Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae... Chúng có cấu trúc hình cầu với một vịng xoắn
và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển.
Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chỉtinase thuộc nhóm I, n,IV.


Hỉnh 1.2. Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 [69]
> Họ Gỉycohydroỉase 20
Họ Glycohydrolase 20 bao gồm P-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosamỉnỉdase từ vi
khuẩn, Streptomyces và người.
Ngoài ra, dựa vào trình tự đàu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptỉde nhận
biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chỉtínase thành 5 nhóm:
Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác
thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein
có vai trị quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc
tác.
Nhóm E: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ cỗ tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu
cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amỉno acid tương tự chỉtỉnase ở nhỏm I.
Chitinase nhóm n có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn.
Nhóm EI: trình tự amỉno acỉd hồn tồn khác với chỉtỉnase nhóm I và n


Nhóm IV: là nhũng đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình tự amỉno
acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng
kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so vởi chitinase nhóm I.
Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chỉtỉn (vùng giàu
cysteỉn) có thể đã giảm đỉ nhiều lần trong q trình tiến hóa ở thực vệt bậc cao.
1.1.2.2.

Cơ chế hoạt động của enzyme chitinase [11]

Enzyme phân giải chitỉn bao gồm: endochitinase, chỉtin 1-4-p- chitobiosidase, N-acetyl-p - Dgỉucosamỉnidase (exochitinase) và chỉtobiase.
Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chỉtỉn một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn
olygosaccharides, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum
(2 loại endochitỉnase: Mi = 36kDa, pli = 5,3 (± 0,2) và M2 = 40kDa, pỈ2 = 3,9), Gỉiocỉadium vỉrens (M
= 41kDa, pl = 7,8).
Chỉtin 1,4-p - chỉtobỉosidase là enzyme phân cắt chỉtỉn tạo thảnh các sản phẩm chính là các
dimer chỉtobỉose, cụ thể enzyme này được thu từ Trichoderma harzianum (M = 36kDa, pl = 4,4 ± 0,2).
N-acetyỉ - p~ D - gỉucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt chitin từ một đầu cho
sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine.

N-aceiy1-j8^lucosĩtniíriclase

endocKtias

dìítobiosidase
e

sncilysozynie

Polymer XI^MM-Acetyl-D-gỉucosamine
units

Chitobiase là enzyme phân cắt chitobỉose thành hai đơn phân N-acetyl-D-glucosamỉne.
Hình 1.3. Vị trí phân cắt enzyme chitinase [70]


Hoạt tính enzym

r

Các sản phẩm cuối

Endochitìnase phân cắt ngẫu nhiên trong nộỉ mạch của chỉtin và
chỉtoolỉgomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có
trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các
dỉacetylchỉtobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochỉtinase khơng thể
phân cắt thêm được nữa.-aa----( À)

J=.

3

o
_X
cc
'£
3
emlochinna.se (EC 3.2,1.14)

oyi^H-ệ y
(g) chititi 1,4-8-chitobiosídase

AAAAAAA
ũ-/V-acetvìhexosaminÌdase (£C 3.2,1.52)

Oằ~0 .■0.'#,,a.'0v #,~6, ê ■ 0,0,0

..

AAAAAAAAAAAAAAA

® = GlcNAc = NAG = N-acetyl-P-D-glucosarnin

* Vi sợi cbitin o =
A = Vị
r í thúy giải

Đầu khử

t

Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của enzyme chitỉnase ở Trichoderma [11]
Chitìn ỉ,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng
3 [(GlcNAc)n với n > 3] từ đầu khơng khử và chỉ phóng thích dỉãcetylchỉtobiose (GlcNAc)2.


p -N- acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên tục từ đầu
khơng khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc).
Ngồi ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chỉto-olỉgosaccharỉde làm cơ
chất. Các olỉgsaccharỉde thường được thủy phân bên trong trên một vài vị trí xác định hoặc một cách
ngẫu nhiên. Một số enyme chitinase có khả năng thủy phân trỉsaccharỉd, một số khác thỉ khơng. Có hai
dạng chỉtỉnase thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo dỉsaccharỉd và trisaccharid; một
phân cắt bên ngồi tạo các monosaccharid và tetrasaccharid. Tóm lại chitinase thực chất là enzyme cắt
ngẫu nhiên.
Endochỉtỉnase, chỉtobỉosỉdase và (3 -N- acetyỉhexosamỉnidase có thể hoạt động trên cơ chất là
dịch huyền phù chỉtin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chỉtỉn thô thu từ vỏ
tôm. Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp cho endochỉtinase hơn là

chitobiosidase và P-N-acetylhexosaminidase. Chitooligomer (GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi chỉtỉn
đều là cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhưng p-N-acetylhexosamỉnidase thì hoạt động chậm hơn
trong việc làm giảm độ đục của huyền phù chitin. (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của P-Nacetylhexosaminidase nhưng không là cơ chất của endochỉtỉnase hay chỉtobiosỉdase. Chính vì thế có
thể sử dụng để phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, chỉtobỉosidase và p-N- acetylhexosaminỉdase.
Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là N-acetyl glucosamine.


/. 1.2.3. Các đặc tính cơ bản của hệ enzytne chitinase [11]
* Trọng lượng phần tử
Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng
30kDa (kilodalton). Ở các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng cư, thú), một số
chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40-90 kDa hoặc cao hơn cả là khoảng 120kDa. Trọng lượng
phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến đổi rộng, từ 30 đến 120
kDa.
* Điểm đẳng điện, hằng sổ Michaelỉs
Enzyme chitinase có giá trị điểm đẳng điện pl thay đổi rộng, từ 3- 10 ở thực vật bậc cao và
tảo; pl từ 4,7-9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá; pl từ 3,5 - 8,8 ở vi sinh vật. Hằng số
Michaelis : 0,010 - 0,011 (g/lOOml).
* Ảnh hưởng của nhiệt độ [32, 63]
Theo nhiều nghiên cứu, chitinase hoạt động ở giới hạn nhiệt độ từ 20 - 50°c (Frandberg và
Schnure, 1994; Huang và cộng sự, 1996; Bhushan và Hoondal, 1998; Wiwat và cộng sự, 1999; Bendt
và cộng sự, 2001).
Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động là 40°c, ngoại trừ
chitinase của Aspergỉlỉus niger hoạt động trên cơ chất là glycol chitin có nhiệt độ tối thích là 50°c
(Jeuniaux, 1963). Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các enzyme chitinase có thể có những
giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau. Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III và chitinase từ
Bacillus licheniformis phân lập ở suối nước nóng cho thấy khả năng chịu đựng nhiệt độ cao đến 80°c.
Bendt và cộng sự (2001) phát hiện hoạt tính thủy phân chitin mạnh nhất của chitinase từ Vỉbrỉo sp. Từ
30-45°C và chitinase chịu nhiệt từ chủng Bacillus sp. BG-11 hoạt tính cao nhất ở 40-60°C.
Lorito (1998) đã khảo sát hoạt tính enzyme chitinase từ chủng Trichoderma harzianum Rifai

nhận thấy enzyme này có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ rộng từ 25-60°C, nhiệt độ tối ưu
là 40°c.
* Ảnh hưởng của pH [32]
Giá trị pH tối thích (pH0p) của hệ enzyme chitinase từ 4-9 đối với các enzyme chitinase ở thực
vật bậc cao và tảo; hệ enzyme chitinase ở động vật là 4,8- 7,5 và ở vi sinh vật là 3,5- 8,0.


Theo các nhà khoa học, pH0p của enzyme chitinase có thể có sự phụ thuộc vào cơ chất được
sử dụng. Đa số các enzyme chitinase đã được nghiên cứu có pH op khoảng 5,0 khi cơ chất là glycol
chitin nằm trong khoảng pH kiềm yếu.Các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng chitinase hoạt động được
trong khoảng pH từ 4,0-8,5 (Morrisey và cộng sự, 1976; Wiwat và cộng sự, 1999; Bendt và cộng sự,
2001). Chitinase của nấm hoạt tính cao nhất ở pH = 5, trong khi ở vi khuẩn pH tối thích là 8,0. Theo
Bhushan và Hoondal (1998), hoạt tính của chitinase từ Bacỉllus sp. BG-11 cao nhất ở pH = 8,5.
1.1.2.4. Các nguồn thu nhận enzyme chitỉnase [11, 27]
Enzyme chitinase hiện diện ở hầu hết các sinh vật.
Enzyme chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn như Chromobacterium, Klebsỉella,
Pseudomonas, Clostrỉdỉum, Vỉbrio, Bacỉllus và đặc biệt ở nhóm Streptomycetes. Vi khuẩn tổng họp
enzyme chitinase nhằm phân giải chitin trong môi trường nhằm sử dụng nguồn cacbon cho sự sinh
trưởng và phát triển.
Chitinase cũng được tạo ra bởi các loài nấm sợi thuộc các chi Trichoderma, Aspergỉllus,
Glỉocladỉum, Calvatia ... và cả ở các nấm lớn như Lycoperdon, Coprỉnus...
Enzyme chitinase được thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại các nấm kí sinh gây bệnh
cho cây trồng. Những thực vật bậc cao có khả năng tạo chitinase như thuốc lá (Nicotiana sp.), cà rốt,
đậu nành (hạt), khoai lang (lá) ... và đặc biệt một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp enzyme
chitinase.
Từ một số động vật nguyên sinh, từ các mơ và tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều
lồi động vật khơng xương như ruột khoang, giun trịn, thân mềm, chân đốt... có thể thu nhận được
enzyme chitinase. Đối với động vật có xương sống, enzyme chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch
dạ dày của các lồi cá, lưỡng cư, bị sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu
bọ.

Ngoài ra, enzyme chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun trịn trong suốt q
trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các lồi chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da. Enzyme
chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngồi (cuticun) của chứng trong q trình biến thái hay lột xác.
1.1.3.

Chitin (cơ chất của chitinase)


1.1.3.1.

Lịch sử nghiên cứu chitin [56]

Chitin được mô tả lần đầu tiên bởi Braconnot vào năm 1811, khi nghiên cứu loài nấm Agaricus
volvaceus và một vài loài nấm khác xử lý với dung dịch kiềm, ông thu được sản phẩm và đặt tên là
chitin (chitin có nguồn gốc từ Hy Lạp là “tunnic” nghĩa là lớp vỏ bọc).


Hai năm sau Odier bắt đầu chú ý đến bản chất, cấu trúc của chitin.Năm 1843, Lassaige chứng
minh rằng trong chitin có sự có mặt của nitrogen.
1.13.2.

Chitin trong tự nhiên [30, 57, 58]

Chitin là một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, là một polyme sinh học được tổng hợp
với số lượng lớn từ sinh vật. Lượng chitin được sản xuất hàng năm trên thế giới chỉ đứng sau cellulose,
chúng được tạo ra trung bình 20g trong 1 năm/lm 2 bề mặt trái đất. Trong tự nhiên chitin tồn tại ở cả
động vật và thực vật.
Trong giới động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong lớp vỏ của một số động
vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong giới thực vật, chitin có
ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophỉceae.

Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, đó là cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối với
nhau bằng các liên kết hydro tạo thành một hệ thống sợi. Trong tự nhiên, chitin hiếm khi tồn tại ở trạng
thái tự do mà gần như luôn luôn liên kết dưới dạng phức họp chitin- protein. Điều này dẫn đến sự đề
kháng với các hóa chất và các enzyme thủy phân, gây nhiều khó khăn cho việc chiết tách, tinh chế
chúng. Tùy thuộc vào các đặc tính cơ thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một lồi
có thể thấy sự thay đổi về lượng và chất của chitin.
Trong động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực, hàm lượng chitin chiếm
khá cao từ 14-35% so với trọng lượng khơ. Vì vậy vỏ tơm, cua ghẹ, mai mực là nguồn nguyên liệu
chính để sản xuất chitin và các sản phẩm từ chúng.
Chitin được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau với hàm lượng khác nhau [45,51]
Bọ cánh cứng
Nhện

38%

Bị cạp
Sâu

20-38%

Nấm

5-20%

Tơm
Cua


1.1.3.3. Cấu trúcMực
phân3-20%

tử và tính chất của chitỉn
Mặc dù chứng được phổ biến rộng rãi nhưng cho đến nay nguồn thu nhận chính của chitin là từ
vỏ cua và tơm. Trong công nghệ chế biến, do chitin tồn tại ở dạng phức hợp với một số chất như:
CaC03, protein, lipid, các chất hữu cơ ... nên việc tách chiết còn khó khăn vì phải đảm bảo cả hai
yếu tố cùng một lúc là vừa loại hết tạp chất đồng thời khơng làm biến đổi tính chất của chitin.


❖ Cấu trúc phân tử [58,59]

Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay HC1 đậm đặc thì người ta thấy rằng
chitin là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl-p-D-Glucosamine liên kết với nhau bởi
liên

kết

1-4

glucosỉde.
Hình

1.5.
Cấu
trúc
NHCOCHI
chitin [62]

NHCOCH

NHCQCHj

Chitin có cấu trúc lạp thể gồm 3 dạng như :

(X,

" NHCOCH Ị

p và

Y, sự

khác nhau này thể hiện ở sự sắp xếp

các chuỗi. Các chuỗi a-chitin xếp xuôi, ngược xen kẽ nhau, tuy nhiên, chúng có một cặp xếp cùng
chiều, ở chuỗi p - chitin các chuẫỉ sắp xếp theo một chiều nhất định, còn ở chuỗi Y - chitin có các cặp
chuỗi xếp cùng chiều so le với một chuỗi
ngược chiều ưong cấu trúc.
Hình 1.6. Cấu trúc của alpha-chỉtin [62]
❖ Tính chất của chitin [27,311


1.1.4. Chitin ở thể rắn, có cấu trúc bền vững nhờ các liên kết hydro trong và giữa các mạch. Chitin
không tan trong nước, trong dung dịch acỉd và kiềm lỗng, trong cồn và trong các dung mơi
thơng thường. Nó chỉ tan được trong một số acid vô cơ đặc (HC1, H2SO4, H3PO4...).Các
yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành enzyme của nấm sọ'i trên môi trường lên men bán
rắn [14,35,36]
1.1.4.1

Thành phần môi trường nuôi cấy nấm sợi sinh chitinase [4,11, 29]

♦♦♦ Nguồn dinh dưỡng cacbon

Nấm sợi có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon khác nhau, trong đó nguồn cacbonhydrat
là dễ hấp thu nhất, trong đó glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản ứng trong ba chu
trình chuyển hóa: con đường Embden Meyerh (1930), Pentose và Entner Doudoroff.
Do chitinase vừa là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng nên ừong môi trường nuôi cấy
nấm sợi sinh chitinase, cần có nguồn chitin là chất cảm ứng và là nguồn cacbon nhằm tăng khả năng
sinh tổng hợp enzyme chitinase. Cơ chất dùng để cảm ứng nấm sợi sinh enzyme chitinase là chitin (có
thể dạng huyền phù, dạng bột hay dạng thô) và các dẫn xuất của chitin. Nghiên cứu của Jesús de la
Cruz và cộng sự (1922) chỉ ra rằng Trichoderma harzỉanum chỉ tạo ra chitinase khi có nguồn cacbon từ
chitin chứ khơng từ nguồn khác như cellulose hay chitosan.
❖ Nguồn dinh dưỡng nitơ
Nguồn nitrogen có ý nghĩa lớn đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi. Theo Kapat
và cộng sự (1996), khi loại ure ra khỏi môi trường nuôi cấy sẽ làm tăng khả năng tổng hợp chitinase.
Takashi và cộng sự (2002) nghiên cứu khả năng sinh chitinase từ nấm sợi Aspergillus sp. đã chỉ ra rằng
hoạt tính chitinase cao khi sử dụng nguồn nitơ từ (NH 4)2S04. Theo Nampoothiri và cộng sự (2003), khi
bổ sung 2,0% (w/w) cao nấm men vào môi trường ni cấy bán rắn thì khả năng tạo chitinase ở
Trichoderma harzỉanum tăng đáng kể. Tuy nhiên, theo Kovacs và cộng sự (2003), trong nuôi cấy bán
rắn, nguồn nitrogen bổ sung vào môi trường cám gạo-chitin không ảnh hưởng đến khả năng tạo
chitinase. Suresh và Chandrasekharan (1999) cũng ghi nhận sự gia tăng sản lượng enzyme này khi môi
trường nuôi cấy Trichoderma harzỉanum được cung cấp muối amonium phosphat và cao nấm men. N.
N. Nawani và B. p. Kapadnis trong quá trình nghiên cứu tối ưu hóa bằng phương pháp thiết kế thí
nghiệm dựa trên tốn thống kê cho thấy đối với Streptomyces sp. NK 1057 khi cung cấp nguồn nitơ từ


cả hai nguồn là cao nấm men và (NH 4)2S04 thì sản lượng chitinase tăng từ 4 - 10% so với dùng riêng lể
các nguồn này. [33]
♦♦♦ Nguồn dinh dưỡng khoáng
Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu ... có vai trị quan trọng như tham gia vào q trình
chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào nấm sợi, tham gia thành phần cấu tạo protein, enzyme,
điều hịa pH mơi trường ni cấy nên ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme nói chung,
chitinase nói riêng.

1.1.4.2.
Yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme chitìnase của nấm sợi
- Ảnh hưởng của độ ẩm
Độ ẩm có ý nghĩa trong ni cấy bán rắn. Theo Matsumoto và cộng sự (2001), với độ ẩm 75%,
chủng Vertỉcỉllỉum lecanii ATCC 26854 sinh chitinase có hoạt tính cao nhất. Đối với Trỉchoderma
harzianum, hoạt tính chitinase cao nhất ở độ ẩm môi trường là 65% (Nampoothiri và cộng sự, 2003).
Takashi và cộng sự (2002) chỉ ra rằng nấm sợi Aspergiỉlus sp. tổng họp chitinase có hoạt tính cao ở
điều kiện độ ẩm môi trường 57%.
- Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH môi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng họp chitinase của
các chủng nấm sợi. Tùy thuộc vào từng lồi, từng chủng mà pH mơi trường ban đầu thích hợp là acid,
trung tính hay kiềm. Aspergillus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều kiện pH = 5-6
(Takashi và cộng sự, 2002). Nhiều nghiên cứu trên Trichoderma harzỉanum chỉ ra rằng pH thích họp
cho nấm này sinh trưởng tạo chitinase có hoạt tính cao khoảng pH = 4-6 (Nguyễn Thị Hồng Thương và
các đồng tác giả, 2003).
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của nấm sợi. Nhiệt
độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số nấm sợi từ 28-32°C, tối đa dưới 50°c. Nhiệt độ quá cao hoặc
quá thấp có thể kìm hãm sự sinh trưởng, thậm chí có thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng họp enzyme
sẽ bị ức chế. Aspergỉllus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều kiện nhiệt độ 37°c
(Takashi và cộng sự, 2002)


- Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng
Chitinase có thể là enzyme cảm ứng hoặc enzyme cấu trúc. Tuy nhiên trong các môi trường
nuôi cấy vi sinh vật người ta đều bổ sung thêm cơ chất chitin nhằm tăng khả năng tạo chitinase. Nhìn
chung sự hiện diện của chitin trong mơi trường ni cấy hữu ích cho việc tạo chitinase (Monreal và
Reese, 1969; Ulhoa và Peberdy, 1993). Trong số các cơ chất, chitin huyền phù có khả năng kích thích
tạo chitinase cao nhất (Bhushan, 2000; Nampoothiri và cộng sự, 2003). Trong hầu hết các trường hợp,
khi nồng độ chitin khoảng 1-1,5% là vi sinh vật có khả năng tạo chitinase (Felse và Panda, 2000).

Năm 2003, Binod và cộng sự đã sử dụng nhiều cơ chất khác nhau (như vách tế bào nấm, vỏ
tôm, cua ...) để tạo chitinase từ nấm sợi nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Việc tận dụng phế liệu này
vừa đem lại hiệu quả kinh tế, vừa góp phần giảm thiểu ơ nhiễm mơi trường.
Nghiên cứu của Đinh Minh Hiệp và các đồng tác giả (2003) chỉ ra rằng hệ enzym chitinase của
Trỉchoderma sp. có thể được cảm ứng bởi vách tế bào vi nấm (Curvuỉaria oryzae, Phytophthora
primulae), vách tế bào nấm lớn (Schizophyllum commune, Trametes versỉcolor) hoặc chitin vỏ tơm,
trong đó vách tế bào nấm cảm ứng quá trình sinh tổng họp hệ enzyme chitinase của Trìchoderma tốt
hơn chitin vỏ tơm.
1.1.5.

Những ứng dụng của enzyme chỉtinase [30,33]

1.1.5.1.

ứng dụng trong việc thu nhận tế bào trần (thể nguyên sinh)

Thể nguyên sinh của tế bào nấm đã đuợc sử dụng như một cơng cụ thí nghiệm có hiệu quả
trong việc nghiên cứu quá trình hình thành thành tế bào, quá trình tổng họp enzyme, quá trình bài tiết
chất cũng như việc cải tiến các chủng nấm ứng dụng trong công nghệ sinh học. Do trong thảnh tế bào
nấm có chứa chitin, hệ enzyme thủy phân chitin là một trong những nhân tố có thể sử dụng để phá vỡ
thành tế bào, tạo tế bào trần từ tế bào nấm.
Dahiya và cộng sự (2005) đã mô tả hiệu quả của enzyme chitinase thu nhận từ chủng
Enterobacter sp. NRG 4 trong việc tạo tế bào trần từ nấm Trichoderma reesei, Aspergilllus niger,
Pleutotus florida...
Mizuno và cộng sự (1997) tách tế bào trần từ Schizophyllum commune bằng cách sử dụng dịch
lọc môi trường nuôi Baciỉỉus circulans KH - 304. Phức họp enzyme từ Baciỉỉus circulans WL - 12 với
hoạt tính chitinase cao đã rất hiệu quả trong việc thu nhận tế bào trần từ Phafjìa rhozyme Ợohnson và
cộng sự, 1979).

1.1.5.2.
ứng dụng trong việc sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine và N- acetyl
glucosamine
Chitooligosaccharides, glucosamine và N- acetyl glucosamine là chất có tiềm năng rộng lớn
trong y dược. Chitooligosaccharides' có lợi ích tiềm năng đối với sản xuất thuốc cho người. Ví dụ,
chitohexaose và chitoheptaose được phát hiện có tính kháng các khối u.
Chitinase thu nhận từ Vibrio alginoỉyticus đã được sử dụng để sản xuất chitopentaose và
chitotriose từ cơ chất chitin huyền phù (Murao và cộng sự, 1992).
Sự kết họp giữa các enzyme thủy phân chitin cần thiết để thu nhận những oligomer có chiều
dài chuỗi mong muốn. Ví dụ, để tạo chitooligosaccharides cần tỉ lệ endochitinase, tỉ lệ thấp N-acetyl
glucosamindase và exochitinase; trong khi để tạo N- acetyl glucosamine thì cần tỉ lệ cao exochitinase
và N-acetyl glucosamindase. (Aloise và cộng sự, 1996) nhận thấy khi ủ enzyme chitinase với tetramer
hoặc pentamer thu nhận từ Nocardỉa orỉtentalỉs thì thấy có sự hình thành các hexamer.
Sashiwa và cộng sự (2002) đã sản xuất N- acetyl glucosamine từ a-chitin bằng cách sử dụng
dịch enzym thô từ Aeromonas hydrophỉla H-2330.
1.1.5.3.
ứng dụng trong việc nghiên cứu thuốc trừ sâu sinh học
Chitin có mặt trong lớp vỏ ngồi và ống tiêu hóa của cơn trùng. Villagomez-Castro và LopezRomero (1996) đã chỉ ra rằng các sự sự kiện thuộc về hình thái học ở nấm ln có sự tham gia của
enzyme chitinase. Allosamidin, một chất ức chế mạnh của enzyme chitinase, được nhận thấy có khả
năng kìm hãm sự sinh trưởng của các loài như ve bét, ấu trùng nhặng sau khi chúng ăn vào (Sakuda và
cộng sự, 1987).
1.1.5.4.

ứng dụng trong việc ước tính sinh khối nấm

Các nhà nghiên cứu đã mô tả một loại phương pháp khác để ước tính lượng nấm có trong đất.
Kỹ thuật bao gồm việc quan sát dưới kính hiển vi và ly trích những chất chỉ thị đặc trưng cho nấm như
glucosamine ergosterol.
Có sự liên quan chặt chẽ giữa hoạt tính của chitinase và lượng nấm có trong đất. Sự liên quan
như thế không thấy xuất hiện với vi khuẩn và xạ khuẩn. Chính vì thế, chitinase trở thành yếu tố chỉ thị

thích họp cho mức sinh trưởng của nấm trong đất (Miller và cộng sự, 1998). Tương tự, chitinase và
protein gắn kết với chitin có thể được sử dụng để dự báo sự lây nhiễm nấm trên con người (Laine và
Lo, 1996).


1.1.5.5.

ứng dụng trong việc kiểm sốt muỗi

Chitinase đóng vai trị quan trọng đối với hình thái nấm men, cơn trùng. Kuranda và Robbins
(1991) chỉ ra vai trò của chitinase trong sự phân chia tế bào trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm
men Sacharomyces cerevỉsỉae.
Người ta chỉ ra rằng ấu trùng muỗi Aedes aegypti có thể bị giết trong vịng 48 giờ với sự tác
động của chế phẩm thô từ nấm Myrothecium verrucaria. Nấm gây bệnh côn trùng như Beauverỉa
bassỉana có thể gây nhiễm trứng của muỗi Aedes aegypti. Điều này mở ra tiềm năng trong việc sản
xuất chất kiểm sốt cơn trùng truyền bệnh như muỗi.
1.1.5.6.

ứng dụng trong y học

Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu sử dụng enzyme chitinase trong việc chẩn đoán
các bệnh truyền nhiễm do nấm gây ra. Chitin hiện diện trong vách hầu hết các nấm gây bệnh, ít nhất là
một giai đoạn trong chu trình sống của nấm. Hay ở nấm men thì chitin hiện diện bong những vết chồi.
Do đó có thể dùng phương pháp nhuộm chitin đặc hiệu cho nấm, tạo cơ sở xây dựng một phương pháp
chẩn đoán nhanh các loài nấm gây bệnh. Các nhà khoa học đã đề xuất một phương pháp chẩn đoán
bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng chitinase đã được phân lập tạo dòng từ Vibrio
parahemolytỉcus (đặt tên chitinase VP1), enzyme này kết họp chặt chẽ với chitin và có thể sử dụng như
một mẫu dị trong việc chẩn đốn với độ nhạy cao để nhận diện một cách đặc hiệu các vách tế bào nấm
hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mơ bệnh. [32]
Ngồi ra, chitinase có tiềm năng trong việc sản xuất các loại kem hay thuốc bơi ngồi da chứa

chất chống nấm bệnh thường xảy ra các nước vùng nhiệt đới bởi khả năng phân hủy vách tế bào vi
nấm của chúng.
1.1.5.7.

ứng dụng trong việc kiểm sốt nấm gây bệnh trên cây trồng

Nhiều lồi cơn trùng và nấm mốc có hại cho cây trồng và vật nuôi do gây ra nhiều loại dịch
bệnh, ảnh hưởng trực tiếp đến sản xuất nơng nghiệp. Vì chitin khơng phải là thành phần phổ biến ở
thực vật và động vật có xương nên người ta sử dụng các tác nhân kìm hãm sự sinh tổng hợp chitin
trong các nấm và côn trùng như l-(2,6-dichlorobenzoyl)-3-(3,4-dichlorophenol), nikkomycin, polyoxin
D ...Khi áp dụng trên cây cảnh, cây lương thực và trên động vật, những tác nhân trên chứng tỏ có nhiều
ưu thế trong việc tiêu diệt nấm mốc, cơn trùng có hại mà không gây hại đáng kể cho thực vật hoặc
động vật có xương sống.


Theo Hữohi Ihui, enzyme chitinase ln có mặt trong cơ thể thực vật mặc dù trong cây không
chứa chitin. Chitinase và P-l,3-glucanase được tạo ra trong mô thực vật khi tế bào bị kích thích bởi
nấm gây bệnh chứa chitin, xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển của bệnh.
Chitinase sản xuất bởi Enterobacter sp. NRG4 có hoạt tính cao đối với Fusarium moniỉỉỷorme,
Aspergỉllus nỉger, Mucor rouxii và Rhizopus nỉgricans (Dahiya và cộng sự, 2005). Bhushan và Hoodal
(1998) nghiên cứu về tính tương thích của những chitinase chịu nhiệt từ Bacỉllus sp. BG-11 với thuốc
diệt côn trùng và thuốc diệt nấm thường được sử dụng. Chitinase từ Baciỉỉus cereus YQ308 ức chế sự
phát triển của nấm bệnh thực vật như Fusarỉum oxyporum, F. Solanỉ, Penicillium ultỉmum (Change và
cộng sự, 2003). CHIT42, CHIT40 và CHIT72 từ Trichoderma hanỉanum P1 và Trỉchoderma vỉrens 41
có thể tác động trên sự nảy mầm và sự kéo dài của sợi nấm của nhiều nấm gây bệnh thực vật như
Fusarỉum spp., Altemarỉa spp., Ustilago avenae, ... khi chứng được ủ với dịch enzyme.
1.1.5.8.

ửng dụng trong sản xuất protein đơn bào

Chất thải rắn từ q trình chế biến tơm chứa chủ yếu là chitin, CaC0 3 và protein. RevahMoiseev và Carrod (1981) đã đề nghị sử dụng loại chất thải này để chuyển đổi bằng phương pháp sinh
học chitin thành protein đơn bào nhờ sử dụng enzyme thủy phân chitin. Họ sử dụng enzyme chitinase
thu nhận từ Saccharomyces marcescens để thủy phân chitin và sau đó ni Pichia Kudriavazevii để sản
xuất protein đơn bào (với 45% protein và 8-11% acid nucleic). Những nấm thường được dùng để sản
xuất protein đơn bào là Hansenula polymorpha, Candỉda tropicalis, Sacharomỵces cerevisiae và
Myrothecỉum verrucaria.
Vyas và Deshpande (1991) đã dùng enzyme thủy phân chitin thu nhận từ Myrothecium
verrucaria và dùng Sacharomyces cerevisiae để sản xuất protein đơn bào từ chất thải chứa chitin. Tổng
hàm lượng protein thu được là 61%, với tỉ lệ rất thấp acid nucleic (3,1%). Các nghiên cứu chỉ ra rằng
Sacharomyces cerevisỉae là chủng tốt nhất để sản xuất protein đơn bào (60% protein và chỉ 1-3% acid
nucleic).

1.2.

ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI NGHIÊN cứu

1.2.1.

Các chủng thuộc chi nấm Aspergillus [7, 8, 61]

1.2.1.

L Vị trí phân loại
Giới: Nấm Ngành:
Ascomycota

Lớp:

Eurotỉomycetes Bộ:

Eurotỉales

Họ:

Trỉchocomaceae
Giống: Aspergillus
1.2.1.2.

Đặc điểm hình thái

Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, không màu, màu nhạt, một số trường hợp trở nên nâu hay
màu sẫm khác ở một vùng nhất định của khuẩn lạc.
Aspergỉllus nỉger khi nuôi cấy trên môi trường thạch-khoai tây-dextrose ở 25°c cho khuẩn lạc
ban đầu màu trắng, sau nhanh chóng chuyển sang màu đen với việc tạo vơ số bào tử đính, mặt trái
khuẩn lạc màu hơi vàng nhạt và khi trưởng thành có thể tạo đường rãnh phóng xạ trên bề mặt thạch.
Aspergillus awamori khi ni cấy trên mơi trường Czapek cho khuẩn lạc đạt kích thước 4,5- 5,0cm sau
7 ngày ở nhiệt độ 25°c, còn trên mơi trường MEA (cao malt) cho kích thước khuẩn lạc lớn hơn. Khuẩn
lạc có màu nâu nhạt, dần chuyển sang đậm. Hệ sợi ừắng dần ngả vàng sậm.
Cuống mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn, các chuổi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi
hướng. Bào tử trần khơng có vách ngăn, khác nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc ... ở các lồi
khác nhau.
Theo Bùi Xn Đồng, Aspergỉllus nỉger có bào tử đính trưởng thành hình cầu, phần lớn 4,05,0pm, xù xì khơng đều với những gờ rõ và gai không sắp xếp thành vạch kẻ dọc theo chiều dài.
Aspergilỉus awamori có bơng mau chóng chuyển màu nâu hơỉ đỏ, mặt trái khuẩn lạc màu tương tự,
cuống bào tử đính phàn lớn phát triển dài l,0~l,5mm, bào tử đính phần lớn đường kính 4,0 đến 4,5


Hình 1.7. Hình tháỉ nấm Aspergillus niger [63, 64]
(A): bào tử, (B): Khuẩn lạc trên mơi trường PGA

Hình 1.8. Hình tháỉ nấm Aspergillus awamori [64]
(A): Khuẩn lạc trên MT Czapek; (B): Khuẩn lạc trên MT MBA
(C), (D), (E): hình thái bào tử
1.2.1.3.

Đặc điểm sinh lý, hóa sinh

Nấm Aspergillus có mặt khắp nơỉ trong tự nhiên, chúng phân bố rộng rãỉ và dễ thích nghỉ vì
chúng có thể hình thành khuẩn lạc trên nhiều nguồn cơ chất khác nhau.
Nghiên cứu của Andrea Astoreca và cộng sự cho thấy nhiệt độ thích hợp cho sụ sinh trưởng
của Aspergillus niger; Aspergillus awamori khoảng 25 - 30°c. Theo Takashi và cộng sự (2002), nhiệt độ
thích hợp để Aspergiỉlus sp. tổng hợp chỉtỉnase có hoạt tính cao nhất là 37°c.


Wainwright và cộng sự đã chỉ ra rằng, pH thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm Aspergillus
awamori là khoảng 5.0-7.0. Độ pH quá acid (khoảng 2-3) sẽ ngăn cản sự tạo thành bào tử, dẫn đến hệ
sợi bị phân tán khi ni cấy chìm.
Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về enzyme của nấm Aspergillus niger, gồm amylase,
amyloglucosidase, cellulase, lactase, invertase, pectinase ... Ngoài ra chitinase của nấm này cũng được
đề cập đến trong Hội nghị Quốc tế về Aspergillus tại Nertheland vào tháng 3 năm 2010 [61].
Vấn đề độc tố của Aspergillus niger cũng được đề cập đến, phần lớn chúng khơng có hại,
nhưng một số có thể tạo độc tố gây hại đến động vật và con người. Sự an toàn của Aspergỉllus niger
được đề cập đến trong nhiều bài báo của các tác giả Schuster và cộng sự (2002), Van DỊịck và cộng sự
(2003), Blumenthal (2004), Olemspka-Beer và cộng sự (2006) [41]. Theo thơng tin tóm tắt từ những
bài báo của các tác giả này, khoảng 3-10% các chủng Aspergillus nỉger có khả năng sinh ra độc tố
trong những điều kiện nuôi cấy xác định như ochratoxin A.

1.2.2.

Trichoderma hariianum [5,12, 55]

1.2.2.1.

Vị trí phân loại

Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong phân loại do các đặc
điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn còn chưa được biết đầy đủ.
Theo Rifai (1969), Bamett và Hunter (1972), Trìchoderma thuộc lớp nấm, nấm bất tồn
Deuteromycetes (Fungi imperíect), chúng được phân loại như sau:

Giới: Nấm
Nghành: Ascomycota
Lớp: Deuteromycetes
Bộ: Monỉlỉales Họ:
Monỉliceae

Giống:

Trỉchoderma
Một số tài liệu phân loại giống Trichoderma thuộc họ Moniliacae, bộ Moniliales, lớp nấm,
nấm bất toàn (Fungi imperíecti).