TỔNG QUAN VỀ GLUTAMICUM

Chương 1 TỎNG QUAN TÀI
LIỆU


2

-

-

1.1. CORYNEBACTERINEAE:
Corynebacterineae là nhóm vi khuẩn gram dương bao gồm Corynebacteria, Mycobacteria và
Nocardia. Đặc tính nổi bật của nhóm này là có chứa mycolic acid bao bọc tồn bộ bề mặt tế bào,
chính vì vậy chúng cịn được gọi là nhóm mycolata. Nhóm vi khuấn này được phân bố rộng rãi
trong tự nhiên và có ý nghĩa quan trọng trong nhiều mặt của cuộc sống [33], Hai đại diện quan
trọng nhất và được nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm này là Corynebacterium glutamicum và
Mvcobacterium tuberculosis.

c. glutamicum được phân lập lần đầu tiên từ mẫu đất tại sở thú Ưeno bởi hai nhà khoa học
người Nhật Bản là Ukada và Kinoshita nhằm mục đích tăng cường khẩu vị và chất lượng thực
phẩm. Các nghiên cứu sau này cho thấy rằng c. glutamỉcum chỉ được phân lập từ đất bị nhiễm
phân chim. c. glutamicum tăng trưởng nhanh, thường có hình que, kích thước khoảng từ 0,7-1 X
1-3 |im (Hình 1.1). Hình dạng vi khuẩn phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy. Neu mọc trong mơi
trường lỏng, tế bào sẽ có hình elip và hình que ngắn khi đạt đến pha ổn định. Những tế bào trong
giai đoạn tăng trưởng có khuynh hướng hình thành kiểu sắp xếp chữ V, nguyên nhân là do sự kết
dính một phần giữa hai vách tế bào [16].Với khả năng tiết L-glutamate đã được biết hơn năm
mươi năm qua, kết hợp

với hoạt tính protease

thấp và an tồn cho

việc sản xuất các chất

phụ gia thực phẩm, c.

glutamicum đã trở thành

chủng vi khuẩn được

sử dụng rộng rãi nhất

Hình 1.1: Kết quả quan sát dưới kính hiển vi điện tử của

c. glutamicum

f />

trong công nghiệp với sản lượng mỗi năm hơn một tỉ tấn L-glutamate và 450.000 tấn L-lysín [16],
[17],
Đối với c. glutamicum, màng bao tế bào được xem như một trở ngại chính trong việc vận
chuyến các ion, các đại phân tử và các chất tan nhỏ. Nhiều kênh vận chuyển amino acid hiện diện
trên bề mặt tế bào phục vụ cho việc xuất bào các amino acid (lysine, threonine) và liên quan đến
cơ chế điều hòa tổng lượng amino acid nội bào. Trong trường hợp của glutamate, nó cần phải
vượt qua lớp peptidoglycan- arabinogalactan và hàng rào kị nước của vách tế bào, chính vì vậy để
khởi phát sự tiết glutamate người ta phải tiến hành những xử lí đặc biệt đối với màng tế bào c.
glutamicum, phổ biến nhất là thêm vào môi trường nuôi cấy các chất tẩy hoặc penicillin, điều này
cho thấy màng bao của c. glutamicum cản trở sự tiết L- glutamate. cấu trúc màng bao không chỉ
quan trọng cho cơ chế tiết amino acid mà cịn quyết định các đặc tính sinh lí tế bào như tính kị
nước, sự kết dính và khả năng tạo bọt của tế bào. Chính vì những ngun nhân trên, cấu trúc
màng bao c. glutamicum trở thành mục tiêu quan trọng trong việc cải thiện hiệu suất thu nhận các

sản phẩm công nghệ sinh học [16].
Ngược lại với c. glutamicum, M. tuberculosis là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm đang lan
tràn tại các nước đang phát triển và có khuynh hướng quay trở lại các quốc gia công nghiệp hóa.
Năm 1882, nhà vi sinh người Đức, Robert Koch lần đầu tiên phân lập được M. tuberculosis và
miêu tả nó như là tác nhân gây bệnh lao. M. tuberculosỉs được đặc trưng bởi dạng hình que và
tăng trưởng chậm, chính vì vậy khuẩn lạc chỉ có thể quan sát được sau nhiều ngày đến nhiều tuần
nuôi cấy. Các lipid, acid béo và lịng đỏ trứng thường được thêm vào mơi truờng nuôi cấy để giúp
vi khuẩn tăng trưởng tốt [15].


4

-

-

Hình 1.2: Kết quả quan sát dưới kính hiển vỉ điện tử của M. tuberculosis
(www.sudantnbüne.com/IMG ,'arton 1 1330j]jg).
Khi xâm nhiễm vào người, M tuberculosis cư ỨTÍ và phát triển trong phối. Vi khuẩn này có
thể sống sót và nhân lên trong các đại thực bào. Nhiễm trùng cấp tính M. tuberculosis sẽ dẫn đến sự
phá hủy mạnh mẽ mô phối, sự lan truyền VI khuẩn sang các bộ phận khác của cơ thể và dẫn đến tử vong.

Độc tính của M. tuberculosis ni cấy tương ứng với sự hình thành cấu trúc chuỗi dài dạng dây
thừng trên môi trường lỏng hay thạch, nguyên nhân là do lớp lipid bề mặt đặc trưng, glycolipid,
tạo nên sự kết dính giữa các vi khuẩn [15], Theo tính tốn gần đây của WHO, có khoảng tám triệu
người nhiễm lao mỗi năm và gần hai triệu người chết [15], [52], Cùng với sự gia tăng tỉ lệ mắc lao
là sự xuất hiện của các chủng M. tuberculosis kháng thuốc, điều này đang đe dọa rất lớn đến khả
năng kiểm sốt dịch bệnh. Ví dụ, số ca mắc lao kháng thuốc điều trị tại Estonia là 14 %, tỉ lệ này
tại Trung Quốc và Án Độ là 40 % [35], Một trong những yếu tố quan trọng góp phần vào khả năng
kháng thuốc di truyền củaM. tuberculosis là cấu trúc bất thường của màng tế bào.

Một điều đáng quan tâm

là

cả

c. glutamicum, M. tuberculosis và các VI khuẩn khác thuộc

nhóm Corynebacterineae đều có chung một đặc tính là cấu trúc và thành phần màng bao rất khác biệt
so với vi khuan gram dương. Không giống như VI khuẩn gram dương, vách tế bào Corynebacterineae

chứa lớp kị nước rất đặc trưng [34], lớp màng này giữ một vai trị quan trọng trong việc quyết
địrih tính thấm đối với cơ chất và thuốc điều trị. Ngược lại với VI khuẩn gram âm có thành phần của màng
ngồi là các phospholipid và lipopolysacchande thì ở Corynebacterineae lại là các mycolic acid
được ester hóa. Chính những đặc diểm khác biệt này mà rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành
nhằm làm sáng tỏ cấu trúc, thàrih phần và chức năng của màng bao Corynebacterineae.

1.2. CẤU TRÚC MÀNG BAO CỦA c. glutamicum :
Các nghiên cứu về cấu trúc và thành phần hóa học cho thấy rằng màng bao của c. glutamicum
cũng như của các vi khuẩn Corynebacterineae bao gồm Nocardia, Rhodococci và Mycobacteria rất
tương đồng VỚI nhau [4], Quan sát dưới kính hiển VI điện tử, màng bao của c. gỉutamicum cho
thấy bốn lớp nêng biệt (Hình 1.3), bao gồm:
-

Màng sinh chất (PM) có bề dày 6-7 nm.


- Lớp ED (thick electron-dense layer) có bề dày 15-20 nm.
- Lớp ET ( electron-transparent layer) có bề dày 7-8 nm.
- Lớp ngồi cùng (OL: outer layer) có bề dày 30-35 nm.

■
LiL

■

ỉ
1 l>l
PM

ii ị i

:

au

%

. 1 lí ỉ ;

1 II ỉ r l i n

'j

nn

L II ìi

- '■
* ■ ! ' ' V

1-1


Hình 1.3: Mơ hình câu trúc màng bao của

c. glutamỉcum [39],Màng sinh chất chủ yếu

được hợp thành bởi các phospholipid phân cực với phần thân là mạch acid béo palmitic (Ci6 :o) và
octadecenoic (C :i), cịn phần đầu là nhóm phosphatidylglycerol.diphosphatidylglycerol,
18

phosphatidylinoitol và phosphatidylinositol dimannoside [39],
Lớp ED bao gồm peptidoglycan (PG) và heteropolysaccharide arabinogalactan (AG). PG
được hình thành bởi N-acetylglucosamine và N-actyl muramic acid liên kết với tri- hay
tetrapeptide chẳng hạn như L-Ala-D-Glu-meso- diaminopimelic hay L-Ala-D-Glu-mesodiaminopimelic acid-D-Ala. AG được hợp thành bởi khung sườn Ị3-D-galactofuranosyl liên kết
với a-D-arabinofuranosyl. Mạch khung galactofuranosyl liên kết với PG thông qua liên kết
phosphodiester. Vùng tận cùng của arabinofuranosyl được ester hóa tại vị trí thứ năm bởi mycolic
acid [39],
Lớp ET tương ứng với phần kị nước được hình thành bởi các mycolate và các lipid kết
hợp màng. Mycolic acid được ester hóa với AG cùng với các dẫn xuất mycolic acid hình thành
lớp màng đơi đối xứng ngăn cản sự đi vào của các cơ chất ưa nước [9]. ETL không chỉ chứa các
mycolic acid liên kết cộng hóa trị mà cịn chứa các mycolic acid tự do. Điều này được hồ trợ bởi
bằng chứng: M. tuberculosis chứa lượng mycolic acid liên kết cộng hóa trị gấp mười lần hơn so
với c. glutamicum nhưng chỉ vừa đủ để bao phủ tòan bộ bề mặt tế bào, điều đó cho thấy ngồi
mycolic acid cộng hóa trị, c. glutamicum cần một lượng rất lớn các mycolic acid tự do, bao gồm
trehalose dimycolate (TDM) và trehalose monomycolate (TMM) hiện diện trên ETL [16].
Lớp ngoài cùng được cẩu tạo bởi các lipid tự do hình thành lớp đơn. Các lipid tự do này
chủ yếu bao gồm TDM, TMM và các protein [34], Ngoài ra, lớp tinh thể bề mặt còn được phát
hiện trong nhiều chủng c. glutamỉcum [3]. Lớp tinh thể này được hình thành bởi protein PS2 được

tiết ra trong môi trường nuôi cay, protein này rất kháng đối với protease và chất tẩy. Bởi vì lóp
tinh thể này liên kết rất chặt với
vách tê bào nên nó hoạt động như hàng rào đầu tiên bảo vệ tế bào khỏi các hợp chất gây độc.


-

Hình 1.4: cẩu trúc màng bào

7

-

c. glutamicum CGL2005 dưới kính hiển vi
điện tử [13].

Chính do cấu trúc màng bao đặc trưng này mà c. gỉutamicum và các vi khuan thuộc
họ Corynebacterineae có tính thấm rất thấp. Điều này được thấy rõ nhất ở Mycobacterium
chelonae, màng bao của vi khuẩn này có tính thấm thấp hơn mười lần so với của
Pseudomonas aeruginosa và thấp hơn một nghìn lân so với của E. coll. Nhiều chủng
Mycobacterium cũng chỉ nhạy đối với một số ít kháng sinh. Các nghiên cứu về lý sinh trên
vách tế bào Mycobacteria và Corynebacteria cho thấy chính thành phần mycolate quyết định
tính thấm và tính dịng lỏng của màng bao [30]. Ngồi ra, mycolate cịn liên quan đến rất
nhiều những chức năng sinh học quan trọng khác như các chức năng sinh lý và độc tính của
M. tuberculosis. Bởi những nguyên nhân trên, con đường sinh tổng hợp mycolate giữ vai trò
thiết yếu đối với các vi khuẩn Corynebacterineae.
1.3. SINH TỎNG HỢP MYCOLIC ACID VÀ MYCOLATE:
Mycolic acid là một acid béo a-alkyl-Ị3-hydroxy, đặc trưng cho các vi khuẩn
Corynebacterineae. Mycolic acid có cơng thức chung là Rl-CH(OH)-CH(R2)- COOH, với Rl và
R2 là các mạch alkyl (Hình 1.5). cấu trúc mycolic acid khá đơn giản ừong c. glutamỉcum nhưng

lại rất phức tạp trong M. tuberculosis. Độ dài mạch carbon của mycolic acid phụ thuộc nhóm vi
khuẩn, dài nhất là của Mycobacteria
của Corynebacteria

(C22-C36).

(CÔO-CỌO),

kế đến là của Nocardia (C4 0 -C5 0 ), và ngắn nhất là

Mặc dù có sự biến động về độ dài và cấu trúc của các mycolic acid


giữa các vi khuấn Corynebacterineae, nhưng tất cả đều có chung motif mycolic. Đặc điểm này
cho phép dự đoán một con đường sinh tổng hợp mycolate chung cho tất cả các vi khuẩn thuộc
nhóm này [1 2 ].

R2

Hình 1.5: cẩu trúc hóa học của my colic acỉd của M. tuberculosis và
glutamicum [12],

c.


Mycolic acid là kết quả của phản ứng cô đặc Claisen (Claisen condensation) giữa hai
phân tử palmitic acid. Gần đây, enzyme polyketide synthase Pksl3 được nhận biết là enzyme xúc
tác cho phản ứng này [12]. Các bước tiếp theo của con đường sinh tổng hợp mycolate vẫn còn là
một vấn đề gây tranh luận. Phân tử trehalose được tổng họfp trong bào tương sẽ được vận chuyển
đến màng, tại đây, nó sẽ được phosphoryl hóa tại vị trí số sáu để hình thành trehalose-6 -phosphate

(T-6 -P). T-6 -P kết hợp với mycolic acid vừa mới tổng hợp để hình thành trehalose- 6 - mycolate-6 ’phosphate, sản phẩm này nhanh chóng bị khử phospho tạo nên trehalose monomycolate (TMM).
Ở bước cuối cùng, enzyme mycoloyltransferase xúc tác việc chuyển nhóm mycoloyl từ TMM đến
vị trị số sáu trên phân tử trehalose của một TMM khác để hình thành trehalose dimycolate (TDM)
hoặc mycoloyl sẽ được chuyển đến lớp arabinogalactan để hình thành arabinogalactan mycolate
[1 2 ] (Hình 1.6).
2 Palmitic acid

PỈCSỈ3

1 Mycolic acid

^'''Trehalose-ố-phũsphate

T rehaIose-6-mycolate-6 ’-phosphate

Trehalose moromycolate
Arabinogalactan

Trehalose dimyicolate
Arabinogalactan rnycolate

Hình 1.6: Các bước sinh tổng hợp mycolate trong

c. glutamicum [12].

Những nghiên cứu gần đây cho thấy: sự bất hoạt gene fbpC mã hóa cho fibronectin-binding
protein c (có hoạt tính mycoloyltransferase ) của M. tuberculosis làm giảm 40 % lượng mycolate liên
kết màng, điều này dẫn đến sự thay

-

10

-


-

11

-

đơi đáng kê tính thâm của màng bao [21]. Kết quả tương tự cũng được quan sát trên chủng c.
glutamicum bị đột biến cmytA (tên trước đây là cspl), một gene mã hóa cho mycoloyltransferase
[23]. Đối với Mycobacteria, TDM cịn đóng vai trị quan trọng trong đáp ứng miễn dịch của vật
chủ. Ở một mức độ nào đó, có thể nói rằng sự sổng sót của các vi khuẩn Mycobacteria liên quan
đến khả năng của TDM ức chế quá trình dung họp giữa các túi phospholipid bên trong đại thực
bào của vật chủ, điều này giúp vi khuẩn lẩn tránh các yếu tố miễn dịch và tồn tại bền vững bên
trong các mô của vật chủ. Các bằng chứng trên cho thấy các gene mã hóa cho enzyme
mycoloyltransferase đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sinh lý của Corynebacterineae.

1.4.

CÁC GENE MYCOLOYLTRANSFERASE (
13032:
Năm 1992, Joliff và cs phát hiện protein tiết PS1 (X66078) của

c. glutamicum ATCC 17965

[23]. cấu trúc protein này gồm hai vùng chức năng với hoạt tính mycoloyltransferase. PS1 được
mã hóa bởi gene cspl. Chủng c. glutamicum 2005 bị đột biến cmytA (cspl) gây tích lũy TMM và
sự giảm đồng thời lượng TDM [13]. Điều này chứng minh vai trò xúc tác của mycoloyltransferase
trong phản ứng ester hóa TMM thành TDM. Nghiên cứu các dạng protein PS1 bị gây đột biến chỉ
ra hoạt tính mycoloyltransferase là do vùng đầu N quyết định.
Suốt một thời gian dài, chỉ duy nhất gene cspl được biết có hoạt tính này. Gần đây, khi phương
pháp Western blotting được sử dụng để phân tích phân đoạn protein màng bao của c. diphterỉae
và c. xerosis, các protein khác có cùng chung epitope với PS1 mới được phát hiện [38], điều này
dẫn đến khả năng về sự tồn tại của nhiều gene khác PS1 nhưng có cùng hoạt tính
mycoloyltransferase.


12

-

-

Dựa trên bộ gene của c. gutamicum đã được giải trình tự hồn tồn, các phân tích in silico và
sinh học phân tử được tiến hành nhằm tìm kiếm những gene giống cspl, kêt quả cho thây có tơng
cộng sáu gene mycoloyltransíerase hiện diện trong
cũng hiện diện trong

c. gỉuíamicum, bốn trong số sáu gene này

c. diphtheriae [13],[46],

Trong c. glutamỉcum ATCC 13032, protein cMytA (PS1) (gene cmytA: AY266353) có 657
amino acid, gồm hai vùng, vùng đầu N chịu trách nhiệm cho hoạt tính mycoloyltransferase, vùng

đầu c vẫn chưa biết rõ chức năng [38]. Năm gene mới được phát hiện mã hóa cho các protein có
vùng đầu N tương tự như của cMytA (PS1), tương ứng với vùng có hoạt tính
mycoloyltransferase. Dựa trên sự tương đồng này, các gene lần lượt được gọi tên là cmytB
(AY266355), cmytC (AY266354), cmyỉD (AY266358), cmytE (AY266356) và cmytF
(AY266357), tương ứng với các protein là cMytB, cMytC, cMytD, cMytE và cMytF. Phân tích in
silico cho thấy tất cả năm protein này đều thuộc họ esterase và chứa ba amino acid bảo tồn (Ser,
His, Glu) thiết yếu cho hoạt tính mycoloyltransíerase, điều này chứng tỏ tất cả những protein mới
được phát hiện này đều là những protein chức năng. Ngoài ra, cMytA và tất cả các cMyt protein
khác đều có vùng tín hiệu tiết (signal peptide) cần thiết cho việc vận chuyển những protein này
xuyên qua màng sinh chất, điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây khi cho rằng
mycoloyltransferase hoạt động tại màng bao của

c. glutamicum.

Các protein cMyt khác biệt với cMytA bởi độ dài của chúng với kích thước lần lượt là 341,
365, 411, 483 và 486 amino acid. Các cMyt không chứa vùng đầu c như cMytA [46]. So sánh
trình tự amino acid giữa các cMyt protein cho thấy mức độ tương đồng trong khoảng từ 26-42 %.
Điều đáng lưu ý là protein cMytE và cMytF có mức độ tương đồng amino acid lên đến 96.9 %,
chúng chỉ khác nhau 13 amino
u M . K H . Ti /
Phân tích cách tổ chức của các cmyt trênKbộ
! gene
6 ĩ t của

N
c. glutamicum
ATCC 13032 cho

T Hthể,
ƯchỉVcóỉ ícmytA

\ và cmytB nằm gần nhau,
thấy sự phân bố của chúng trên toàn bộ nhiễm sắc
no 1282

hai genẹjoàỵ_CỈỦ~Câeb.iihau bởi khung đọc mở (ORJF) Cg3ỉ85.

“

Các cmyỉ hiện diện như các đơn vị phiên mã đơn gene (monocistronic transcription), ngoại trừ
cmytA hợp với các ORF Cg3ỉ8ỉ và Cg3180 hình thành một operon [46].


-

13

-

Phân tích hàm lượng TMM và TDM của các chủng c. glutamỉcum CGL 2005 bị đột biến
từng gene cmyt cho thấy ngoại trừ protein cMytC, tất cả các protein còn lại đều là những protein
có hoạt tính và đều tham gia xúc tác phản ứng ester hóa TMM thành TDM, tuy nhiên mức độ
đóng góp vào hoạt tính mycoloyltransíerase khơng tương đồng giữa các protein cMyt này. Hai
protein cMytA và B đóng góp nhiều nhất cho hoạt tính mycoloyltransferase, đột biến đồng thời
hai gene này sẽ làm giảm đáng kể sức sống của tế bào [13].
Hiện tượng dư thừa các gene mycoloyltransferase khơng chỉ bắt gặp ơ c. glutamicum mà
cịn ở cả M. tuberculosis và nhiều vi khuẩn Corynebacterineae khác. Trong M. tuberculosỉs, các
kháng thể 85A, 85B và 85C, còn được gọi là phức hợp kháng thể 85, có chung 68-80 % sự tương
đồng ở mức độ amino acid và cho thấy khả năng kết hợp với íĩbronectin cũng vì điều này chúng
cịn được gọi là protein kết hợp íibronectin (Fibronectin-binding protein A (FbpA), -B (FbpB) và
-C (FbpC)) [11]. Phân tích thể đột biến các gene fbpA, fbpB và fbpC cho thấy các protein FbpA,

FbpB và FbpC được dịch mã từ những gene này đều có hoạt tính mycoloyltransferase tương tự
như của cmyt. Tất cả ba gene này không chỉ hiện diện trong bộ gene của M. tuberculosis mà còn
của M. leprae, M. avium và nhiều Mycobacteria khác. Gần đây, sau khi bộ gene của M.
tubercuỉosis được giải trình tự, một gene thứ tư, được gọi là fbpD mã hóa cho protein MPT51
được nhận dạng, cấu trúc ban đầu của protein này rất tương đồng với kháng nguyên 85 [10].
Sự tồn tại đồng thời của sáu gene cmyt trong

c. glutamicum và bốn gene fbp trong M.

tubercuỉosis cho thấy sự dư thừa về mặt chức năng. Điều này có thể giải thích bởi tầm quan trọng
của các gene mycoloyltransferase đối với chức năng sinh lí của nhóm vi khuẩn này, đặc biệt là
tính thấm của màng bao và khả năng gây bệnh của chúng. Mặc dù nhiều nghiên cứu đã được tiến
hành nhằm làm rõ các bước quan trọng trong con đường sinh tổng họp mycolic acid nhưng sự
hiểu biết đầy đủ và chi tiết về tồn bộ q trình này vẫn chưa hồn tất. c. glutamicum được xem
như một mơ hình phù hợp để nghiên cứu màng bao của các vi khuẩn thuộc nhóm
Corynebacterineae bởi vì chúng có cấu trúc màng đơn giản nhưng lại rất tương đồng về cấu trúc
và chức năng với các Mycobacteria. Nhiều nghiên cứu cho thấy các tính chất về tính thấm của
màng bao Mycobacterium cũng tương tự như của c. glutamicum. Ngoài ra, c. glutamicum tăng
trưởng nhanh, khơng hình thành cụm tế bào, khơng gây bệnh trên người và được chứng minh là
hiệu quả cho sự biểu hiện các kháng nguyên của Mycobacteria. Chính do những ưu điếm trên, c.


-

14

-

glutamicum được xem là một mơ hình lí tưởng để nghiên cứu các đặc tính của màng bao
Corynebacterineae.

Góp phần gia tăng hiểu biết về con đường sinh tổng hợp mycolate nhằm phục vụ cho sản
xuất công nghiệp và điều trị bệnh lao, trong luận văn này, chúng tôi sử dụng mơ hình

c.

glutamicum ATCC 13032 để nghiên cứu cơ chế điều hòa, vai trò và sự hoạt động của sáu gene
cmyỉ thông qua hoạt động của sáu promoter cmyt tương ứng. Bước kế tiếp, chúng tôi phân lập và
định danh các protein gắn trên promoter cmyt nhằm tìm kiếm protein điều hòa của các gene này.