Phát hiện Virus viêm gan B trong huyết thanh người cho máu bằn kỹ thuật PCR pptx

TCNCYH 26 (6) - 2003
Phát hiện virus viêm gan b trong huyết thanh
ngời cho máu bằng kỹ thuật pcr

Văn Đình Hoa, Võ Văn Huy
Đại học Y Hà Nội

Sàng lọc máu, các sản phẩm máu tốt là góp phần hạ thấp tỷ lệ các bệnh lây nhiễm qua
đờng máu: HIV, HBV, HCV ở nhiều nớc tiên tiến, các kỹ thuật sinh học phân tử đã trở
thành xét nghiệm sàng lọc thờng quy đối với các cơ sở sử dụng máu và các sản phẩm
máu.
Với kỹ thuật PCR, chúng tôi phát hiện đợc 1 trong số 73 trờng hợp (HBsAg(-)) đến
khám sức khoẻ cho máu tại Viện Huyết học Truyền máu TW có DNA HBV(+). Số lợng
còn ít nhng phần nào nói lên giá trị của kỹ thuật PCR - một công cụ góp phần nâng cao
sự an toàn truyền máu.

i. Đặt vấn đề
Viêm gan do virus là một trong những
bệnh gây lây nhiễm cao và nguy hiểm cho
sức khoẻ các cộng đồng dân c trên toàn
thế giới. Có nhiều loại virus gây viêm gan
đã đợc phát hiện: HAV, HBV, HCV, HDV,
HEV, HGV. Tỷ lệ mang HBsAg(+) của các
cộng đồng thuộc các châu lục, các vùng
địa lý rất khác nhau: Các nớc châu Âu có
tỷ lệ thấp nhất, trung bình ở các nớc châu
Mỹ, cao ở một số nớc châu á, châu Phi,
rất cao ở thổ dân úc [2]. Sự lây nhiễm
HBV, HCV từ ngời này sang ngời khác,
chủ yếu qua đờng máu. Những ngời bị
nhiễm HBV có thể bị viêm gan cấp, có thể

bị viêm gan mạn dẫn đến hậu hoạ xơ gan,
ung th gan. Những ngời bị viêm gan
mạn có nguy cơ bị ung th gan tiên phát
rất cao, gấp 200 lần những ngời bình
thờng [2,3]. Nớc ta nằm trong khu vực
lu hành dịch địa phơng cao, tỷ lệ ngời
mang HBsAg(+): 10-20% tuỳ theo nghề
nghiệp, đời sống sinh hoạt [3].
Cũng nh các virus khác, HBV có nhiều
loại kháng nguyên khác nhau.
Kháng nguyên bề mặt (HBsAg): là loại
kháng nguyên đợc tổng hợp nhiều nhất
trong số các kháng nguyên của HBV, xuất
hiện sớm ở trong máu ngời bị nhiễm (có
thể sau 6 ngày bị nhiễm), tăng dần và biến
mất sau 4-8 tuần lễ từ khi có triệu chứng
lâm sàng. Nếu sau 6 tháng mà HBsAg vẫn
dơng tính thì có nguy cơ bị nhiễm HBV
mạn tính. Đa số các kỹ thuật xét nghiệm
HBsAg hiện nay thờng chỉ phát hiện đ
ợc
từ tuần lễ thứ 4 đến tuần lễ thứ 8 [2].
Kháng nguyên lõi (HBcAg) có trong
nhân tế bào gan bị nhiễm virus, kháng
nguyên này không xuất hiện trong máu.
Kháng nguyên vỏ (HBeAg) xuất hiện
sau HBsAg. Vừa có HBsAg (+) vừa có
HBeAg (+) là các đối tợng chủ yếu gây
lây nhiễm mạnh nhất vì HBeAg là dấu hiệu
của virus đang nhân lên.

Trong các đờng lây nhiễm HBV thì lây
nhiễm qua truyền máu và các sản phẩm
của máu đã và đang đợc cộng đồng hết
sức quan tâm bởi lẽ nhu cầu về máu và
sản phẩm của máu vừa ngày càng tăng
1
TCNCYH 26 (6) - 2003
cao trong điều trị vừa là môi trờng rất dễ
bị nhiễm virus. An toàn truyền máu càng
cao thì phòng tránh các bệnh lây nhiễm
nói chung và lây nhiễm HBV nói riêng
càng hiệu quả [4,8].
Các kỹ thuật xét nghiệm tiên tiến có độ
chính xác cao nh ELISA, RIA chỉ phát
hiện đợc các kháng nguyên, kháng thể
chống HBV trong máu của ngời nhiễm.
Sau khi xâm nhập, HBV phải có một thời
gian sinh sôi phát triển, phải có một
khoảng thời gian nhất định thì lợng kháng
nguyên phóng thích vào máu mới đủ để
các kỹ thuật tiên tiến ở trên phát hiện đợc.
Mặt khác sau khi bị nhiễm cơ thể cũng
phải có một thời gian mới đáp ứng tạo
đợc một lợng kháng thể nhất định. Giai
đoạn cha có đáp ứng miễn dịch thờng
kéo dài từ 2-26 tuần (gọi là giai đoạn cửa
sổ). Trong giai đoạn cha có triệu chứng
lâm sàng, cha có đáp ứng miễn dịch, việc
phát hiện sự có mặt của HBV rất khó khăn.
Kỹ thuật PCR (polymerase chain

reaction) của Karry Mullis là một phát kiến
quan trọng của sinh học phân tử giúp phát
hiện các genom của các virus, có nghĩa là
phát hiện đợc sự có mặt của chúng kể cả
khi chúng không hoặc cha gây hại gì.
Mục tiêu:
- Dùng kỹ thuật PCR để phát hiện
genom virus viêm gan B trong huyết thanh.
- Phát hiện DNA HBV trong huyết
thanh của các đối tợng cho máu
ii. Đối tợng, phơng pháp nghiên
cứu
1. Đối tợng nghiên cứu:
- Hoàn chỉnh kỹ thuật: 30 mẫu huyết
thanh có HBsAg(+) và 30 mẫu huyết thanh
có HBsAg(-) (kỹ thuật ELISA).
- Đối tợng nghiên cứu: 73 mẫu huyết
thanh có HBsAg(-) của các đối tợng cho
máu (HIV-, HBV-, HCV-), trong số 73 mẫu
huyết thanh này có 52 mẫu của các đối
tợng cho máu nhân đạo, 21 mẫu của các
đối tợng đến khám sức khoẻ để cho máu
tại Viện Huyết học Truyền máu trung ơng.
2. Phơng pháp, kỹ thuật nghiên
cứu:
- Lấy máu tách huyết thanh.
- Chiết tách DNA từ huyết thanh bằng
phơng pháp Ethanol/ Chloroform và
Boom.
- Tiến hành phản ứng PCR trên máy

của hãng Perkin Elmer với Primer của
hãng Takara Nhật Bản có trình tự
nucleotid:
C1 sense, 21 mer
5' CCT CCA AGT TGT GCC TTG GG3' (nt 1741-1760)
C2 antisense, 21 mer
3' CGT GAG TCC GTT CGA TAA GA5' (nt 1932-1951)
- Kiểm tra kết quả PCR bằng điện di
trên thạch Agarose 1,5% có Ethilium
bromide. Marker 100, 200, 300, 400 và
500 nm.


iii. Kết quả
Tất cả các mẫu huyết thanh đều tuần tự
tiến hành theo các bớc: chiết tách DNA
kiểm tra lợng DNA của mẫu bằng phơng
2
TCNCYH 26 (6) - 2003
pháp đo mật độ quang (OD) ở bớc sóng
260nm, 280nm, tiến hành phản ứng PCR,
kiểm tra xác định PCR bằng điện di trên
thạch Agarose.
1. Phát hiện DNA HBV ở 30 mẫu
huyết thanh có HBsAg(+)
Bảng 1: PCR phát hiện DNA trong
huyết thanh các đối tợng HBsAg(+)
PCR
n
DNA HBV (+) DNA HBV (-)

30 30 0

Nhận xét: cả 30 trờng hợp HBsAg(+)
đều phát hiện đợc DNA HBV.
2. Phát hiện DNA HBV ở các mẫu
huyết thanh có HBsAg(-)
2.1. Kết quả phát hiện DNA HBV
Bảng 2: PCR phát hiện DNA trong
huyết thanh các đối tợng có HBsAg(-)
PCR
n
DNA HBV (+) DNA HBV (-)
30 1 29

Nhận xét: 30 mẫu huyết thanh này là
của ngời đến khám sức khoẻ tại Viện
Huyết học Truyền máu TW có HBsAg(-)
với ELISA. 01 trờng hợp có DNA HBV (+).
Trờng hợp này đợc kiểm tra lần 2 vẫn
cho kết quả DNA HBV (+) mặc dầu cha
có biểu hiện gì về lâm sàng.
2.2. Kết quả kiểm tra PCR bằng điện di
trên thạnh Agarose


100 nm
200 nm
300 nm
400 nm
500 nm

A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 29 30 M
ảnh 1: Điện di kiểm tra DNA HBV
Chú thích: A: Mẫu chứng âm tính B: Mẫu chứng dơng tính
Mẫu dơng tính: 12.
Mẫu âm tính: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25, 26, 27, 28, 29, 30.
Mẫu M: Marker
3
TCNCYH 26 (6) - 2003
3. Kết quả PCR phát hiện DNA của 73
mẫu huyết thanh nghiên cứu
Bảng 3: Kết quả PCR DNA HBV
DNA HBV
(-)
DNA HBV
(+)
Tổng số
n 72 1 73
Nhận xét: Trong số 73 mẫu huyết thanh
HBsAg(-) với ELISA thì có 72 mẫu cho kết
quả DNA HBV (-), 1 trờng hợp có DNA
HBV (+): 1/73. Trờng hợp có DNA HBV
(+) là một trong số các đối tợng đến khám
sức khoẻ để cho máu. Tất cả các trờng
hợp đến hiến máu nhân đạo (52) đều cho
kết quả DNA HBV (-).
iv. Bàn luận
PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử
có độ chính xác cao để phát hiện genom
của virus HBV, nghĩa là phát hiện đợc sự

có mặt của virus ở ngời bị nhiễm mặc dầu
lúc đó cha có các kháng nguyên hoặc
kháng thể chống lại HBV trong máu
[1,6,7]. Một số nớc tiên tiến trên thế giới
đã sử dụng kỹ thuật PCR thờng quy trong
sàng lọc HIV, HBV, HCV nh Đức, Mỹ,
Nhật, do đó họ đã hạ thấp đợc tỷ lệ viêm
gan do truyền máu một cách rõ rệt [9].
Các bệnh lây nhiễm qua máu và các
sản phẩm của máu đã đợc nhiều tác giả
nghiên cứu. Công tác sàng lọc để đảm bảo
an toàn truyền máu luôn đợc đặt ra cho
ngành [4].
Hiện nay các trung tâm truyền máu của
nớc ta đã tiến hành sàng lọc máu bằng
kỹ thuật ELISA, chỉ một vài cơ sở sử dụng
kỹ thuật PCR với tính chất nghiên cứu.
Chúng tôi ứng dụng kỹ thuật PCR để phát
hiện DNA HBV ở những ngời cho máu đã
phát hiện đợc 1 trong 73 trờng hợp
HBsAg(-) có DNA HBV (+). Số liệu còn ít:
1/73 mẫu của các đối tợng đến khám sức
khoẻ để cho máu nhng cũng phần nào
nói lên đợc vai trò của kỹ thuật PCR trong
việc phát hiện HBV. Có thể nói PCR là một
công cụ góp phần tăng khả năng sàng lọc,
hạ thấp thêm bệnh viêm gan do truyền
máu. Tuy nhiên, kỹ thuật PCR là kỹ thuật
sinh học phân tử đòi hỏi trang thiết bị kỹ
thuật cao nên giá thành còn đắt hơn so với

ELISA.
v. Kết luận
- PCR là kỹ thuật có giá trị phát hiện
đợc sự có mặt của HBV trong thời kỳ mà
cơ thể cha có đáp ứng miễn dịch.
- Đã phát hiện đợc một trờng hợp có
DNA HBV (+) trong 73 trờng hợp của
những ngời hiến máu nhân đạo và đến
khám sức khỏe để cho máu có HBsAg(-)
Tài liệu tham khảo
1. Vũ Triệu An (1995) Một kỹ thuật y
sinh học hiện đại: phơng pháp PCR
Thông tin Y học: tập 3, số 7: 10-12
2. Nguyễn Thị Kim Liên (2000) ý nghĩa
lâm sàng và tiên lợng viêm gan virus B
dựa vào một số thông số miễn dịch. Luận
án Tiến sĩ Y học - Đại học Y Hà Nội.
3. Nguyễn Thị Nga (1995) Góp phần
nghiên cứu tỷ lệ mang HBsAg trên một số
nhóm ngời, mối liên quan với an toàn
truyền máu và ung th gan. Luận án Tiến
sĩ Y học - Đại học Y Hà Nội.
4. Đỗ Trung Phấn (1995) Cung cấp
máu và an toàn truyền máu: hai nhiệm vụ
khẩn thiết hiện nay. Y học Việt Nam: Số
9, 15-18
5. Carman-WF, Van-Deusen-FJ,
Mimmis-LT (1997) The prevalence of
surface antigen variants of hepatitis B virus
4

TCNCYH 26 (6) - 2003
in Papua New Guine, South Africa and
Sardinia”.
6. Gomes-Sa, Yoshida-CF, Niel-C
(1996) “Detection of hepatitis B virus DNA
in hepatitis B surface antigen conditions”.
Acta-Virol. June, 40(3), 8-133.
7. Huo-TI, et al (1996) “Polemerase
chain reaction analysis for viral nucleic
acids in acute sporadic hepatitis patients
negative for serum hepatitis B surface
antigen and antibodies to hepatitis C
virus”. Chung-Hua-I-Hsueh-Tsa-Chih-
Taipei. December: 58(6): 379-384.
8. Koerner-K, et al (1998) “Estimated
risk of transmission of hepatitis C virus by
blood transfusion”. Vox Sang, 74: 213-216.
9. Shottsted-V, et al (1997) “Routine
PCR screening for HBV, HCV and HIV-I
genome in a large blood donation services:
experiences and initial results”. Beitr-
infusion-Tranfusionmed. 34: 22-27.

Summary
HBV Detection in serum of blood donors by PCR

Well-screening blood and blood products helps reduce the ratio of blood-transmitted
diseases such as HIV, HBV, HCV, etc. In developed countries, molecular biology
techniques have become routine screening tests in laboratories using blood and blood
products.

Using PCR, we have found that one out of 73 cases (HBsAg(-)) having health checks
and donating blood at the National Institute of Hematology and Blood Transfusion has
DNA HBV(+). This number is small but it can still demonstrate the value of PCR, a tool
contributing to enhance blood transfusion safety.

5