Bài 1 định danh vi sinh vật sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử

Bài 1: Định danh vi sinh vật sử dụng các kỹ thuật sinh học
phân tử

Trung tâm Xét nghiệm, Đại học Y tế công công


Chuẩn đầu ra

1.
2.
3.

Mô tả cấu tạo vật chất di truyền của vi sinh vật
Diễn giải các phương pháp định danh vi sinh vật
Giải thích nguyên lý của kỹ thuật tách DNA/RNA, PCR, RT-PCR, Realtime PCR, giải trình tự
gen và những yếu tố ảnh hưởng, gây nhiễu đến các phản ứng PCR và kết quả xét nghiệm.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Vật chất di truyền của vi sinh vật

•
•
•

Bản chất chung: axit nucleic
Vi khuẩn: một phân tử ADN dạng vịng kín
Vi-rut: 1 phân tử ADN hoặc ARN; đơn hoặc kép

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Vật chất di truyền của vi khuẩn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Vật chất di truyền của vi khuẩn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Vật chất di truyền của vi rút

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Vật chất di truyền của vi rút

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Định danh VSV bằng phương pháp
truyền thống

Thu thập bệnh phẩm
 
 Xử lý bệnh phẩm
 
 Xác định vi sinh vật
  
Xác định các tính chất khác (mức độ nhạy cảm kháng sinh, gen độc lực…)
 
Trả kết quả
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

8


9

Nuôi cấy phân lập

-

Tách biệt vi khuẩn gây bệnh từ bệnh phẩm

-

Sử dụng các loại mơi trường ni cấy: có chất ức chế hoặc khơng có chất ức chế

-

Tùy bệnh phẩm và kết quả nhuộm soi mà chọn môi trường ni cấy phù hợp

-

Đánh giá tính chất khuẩn lạc: kích thước, màu sắc, hình thái để định hướng cho định danh

-

Nhuộm soi lại khuẩn lạc nghi ngờ

-

Tăng sinh (nếu cần)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


10

PHÂN LOẠI MƠI TRƯỜNG NI CẤY VSV

Trạng thái:

-

Mơi trường rắn (2% agar)

Thành phần, chức năng:

-

Môi trường lỏng (0% agar)
Môi trường nửa rắn (0.5% agar)

Môi trường cơ bản
Môi trường vận chuyển (Venkat-Ramakrishnan (VR) cho V.
cholerae)

-

Môi trường chọn lọc (TCBS cho V. cholerae) ,
Môi trường phân biệt định danh,
Môi trường tăng sinh,
Môi trường dinh dưỡng tối thiểu,….

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


11

Định danh thông thường

Môi trường chọn lọc, Môi trường giám biệt 

1

4

2

Tính chất SVHH

3

Tính chất KN (KHT đặc hiệu)

Tính chất ly giải bởi phage
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


12

Các tính chất SVHH
-

-

Thử nghiệm Catalase
Thử nghiệm Oxidase
Thử nghiệm đơng huyết tương
Thử nghiệm Indol
Thử nghiệm Urease

Thử nghiệm Citrat
Thử nghiệm trên môi trường thạch KIA
Thử nghiệm vệ tinh
Thử nghiệm sinh Pyr
Thử nghiệm yếu tố CAMP

Thử nghiệm sinh H2S
Thử nghiệm lên men đường
Thử nghiệm Bacitracin
Thử nghiệm Optochin
Khả năng di động, khả năng làm tan máu…
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Nhuộm soi, thử nghiệm các thử nghiệm sinh vật hóa học đơn giản và định danh bằng
các bộ sinh vật hóa học (bộ API, BIS 14 …)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

13


Định danh VSV bằng phương pháp SHPT

•

Định danh bằng phương pháp phân tích acid nucleic

•

Định danh bằng phương pháp lai DNA

•

Định danh bằng PCR, Realtime PCR

•

Định danh bằng giải trình tự gen, giải trình tự thế hệ mới

•

Định danh bằng phương pháp phân tích protein

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

14


Phân tích Acid nucleic

•

Vi khuẩn đã được ni cấy lần đầu tiên hoặc có nồng độ cao trong mẫu bệnh phẩm

VD: viêm họng do Streptococcus nhóm A, trong nhiễm trùng sinh dục gây ra bởi Chlamydia
trachomatis hoặc Neisseria gonorrhoeae)

•

DNA vi khuẩn được tách từ mẫu bệnh phẩm/ mẫu tăng sinh và được phân tích trực tiếp khơng qua các
phản ứng khuếch đại

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Tách DNA/RNA
Ngun lý:

•

Phá màng: nghiền tế bào, mơ trong dung dịch chất tẩy (SDS) và proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải
phóng DNA ra mơi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.

•

Loại bỏ protein: sử dụng hỗn hợp Phenol/Chloroform. Phenol-Chloroform có khả năng làm biến tính protein, làm
protein bị tủa

•

Tủa và thu DNA: Sử dụng Ethanol hoặc Isopropanol để tủa DNA trong dung dịch

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Phương pháp lai DNA/RNA

Là KT sử dụng các sợi đơn acid nucleic,
được gọi là đoạn dò (probe), bắt cặp bổ

sung với một sợi đơn acid nucleic khác,
được gọi là phân tử đích (target).

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


SOUTHERN&NORTHERN BLOT HYBRIDIZATION

Dr.Sarookhani


2 đặc điểm quan trọng của quá trình lai là:

(1) đoạn dị chỉ gắn với trình tự đích;
(2) đoạn dị có thể tìm thấy phân tử đích trong hàng triệu phân
tử liên quan.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


NGUYÊN LÝ

–Nhiệt độ nóng chảy (Tm ): là điểm nhiệt mà tại đó, 50% phân tử DNA trong dung dịch phân tách thành sợi đơn.
–Nhiệt độ bắt cặp (Th) được tính tốn từ Tm
–Tm và Th bị ảnh hưởng bởi: chiều dài, cấu trúc, % GC trong đoạn dò và phân tử đích, nồng độ muối trong dung dịch …
8/17/20

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Đầu dị (Probe)

•

Là một đoạn phân tử DNA/RNA (20 bp - < 20 kb) liên kết bổ sung với phân tử đích

•

Có thể ở dạng sợi đơn hoặc đơi, nhưng sẽ chuyển thành dạng sợi đơn khi tham gia phản ứng lai

•

Được đánh dấu để nhận diện:

✔
✔
✔

Đồng vị phóng xạ (

32 35
P, S) -> KT phóng xạ tự ghi

Biotine/Streptavidine -> KT so màu
Chất phát quang sinh học -> KT đo quang phổ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

SOUTHERN
BLOTTING


Quy trình

1.Phân cắt DNA/RNA đích bằng enzym cắt hạn chế phù hợp.
2.Điện di sản phẩm trên gel agarose.
SOUTHERN

3.Phân tách phân tử DNA sợi đôi thành sợi đơn.
BLOTTING

4.Chuyển DNA sợi đơn lên màng nylon hoặc nitrocellulose bằng phương pháp thẩm thấu.
5.Cho các đoạn dị bắt cặp với DNA đích trên màng.
6.Hiển thị kết quả bang KT phóng xạ tự ghi.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


PCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP


Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

1X

30-35X

1X

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP