LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM









KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP





TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO
KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC
PHÂN TỬ




Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : LƯ NHẬT HUY
MSSV:207111018 Lớp: 08CSH01




TP. Hồ Chí Minh, 2011


i

LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan:
- Tự thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
- Không sao chép khóa luận tốt nghiệp dưới bất cứ hình thức nào.
- Các số trích dẫn trong khóa luận tốt nghiệp là trung thực.
Tôi chịu trách nhiệm hoàn toàn về lời cam ñoan này.

ii

MỤC LỤC
i. Danh mục các từ viết tắt 1
ii. Danh mục các hình 2
iii. Danh mục các bảng, biểu ñồ, sơ ñồ 3
CHƯƠNG MỞ ðẦU 4
1. Tính cấp thiết của ñề tài 5
2. Mục ñích nghiên cứu 5
3. Nhiệm vụ nghiên cứu 5
4. Phương pháp nghiên cứu 5
5. Các kết quả ñạt ñược của ñề tài 6
Chương 1: TỒNG QUAN BỆNH LAO 7
1.1. Bệnh lao 8
1.1.1. Lịch sử bệnh lao 8
1.1.2. Khái niệm về bệnh lao 8
1.2. Tình hình dịch tễ bệnh lao 8
1.2.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới 8
1.2.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam 9

1.3. Phân loại và ñặc ñiểm vi khuẩn lao 10
1.3.1. Phân loại 10
1.3.2. ðặc ñiểm 11
1.3.3. Bộ gen của vi khuẩn lao 12
1.4. Nguồn lây, ñường xâm nhiễm và diễn biến bệnh 13
1.4.1. Nguồn lây 13
1.4.2. ðường xâm nhiễm 13
1.4.3. Diễn biến nhiễm bệnh 13
Chương 2 : BỆNH LAO KHÁNG THUỐC 15
2.1. Lịch sử bệnh lao kháng thuốc 16
2.2. Tình hình bệnh lao kháng thuốc 16
2.2.1. Trên thế giới 16

iii

2.2.2. Ở Việt Nam 18
2.3. Tình hình nghiên cứu bệnh lao kháng thuốc 19
2.4. Vi khuẩn lao kháng thuốc 20
2.4.1 ðặc ñiểm giúp vi khuẩn lao có khả năng kháng thuốc 20
2.4.1 Vi khuẩn lao ñột biến gen kháng thuốc 21
Chương 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BỆNH LAO 25
3.1. Các phương pháp chuẩn ñoán bệnh lao cổ ñiển 26
3.1.1. Chuẩn ñoán lâm sàng 26
3.1.2. Phương pháp nhuộm soi ñàm 26
3.1.3. Phương pháp nuôi cấy tìm vi khuẩn lao 26
3.1.4. Phương pháp X-quang phổi 26
3.1.5. Phương pháp thử phản ứng Tuberculin 27
3.2. Các phương pháp chuẩn ñoán bệnh lao hiện ñại 27
3.2.1 Phương pháp ELISA 27
3.2.2. Phương pháp PCR 29

3.2.3. Phương pháp Real-time PCR 32
Chương 4: QUY TRÌNH PHÁT HIỆN LAO KHÁNG THUỐC BẰNG
PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR 35
4.1. Giới thiệu quy trình 36
4.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất 36
4.2.1. Vật liệu sinh học 36
4.2.2. Mồi và mẫu dò 36
4.2.3. Thiết bị, dụng cụ 38
4.2.4. Hóa chất 39
4.3. Quy trình phát hiện lao kháng thuốc bằng phương pháp real-time PCR
4.3.1. Mẫu 41
4.3.1.1. Thu mẫu 41
4.3.1.2. Xử lý mẫu 41
4.3.2. Tách chiết DNA 41

iv

4.3.3. Thực hiện Real-time PCR 42
4.3.4. ðọc kết quả 46
4.3.5. Nhận xét quy trình 46
Chương 5: KẾT LUẬN 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 1


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AFB : Acid-fast Bacillus
Bp : Base Pair
Ct : Threshod Cycle
dATP : Deoxyadenosine Triphosphate
DNA : Deoxyribonucleic Acid
dNTP : Deoxyribonucleotide Triphosphate
dTTP : Deoxyguanine Triphosphate
ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
EMB : Ethambutol
HIV : Human Immunodeficiency Virus
HRSE : Isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol.
INH : Isoniazid
Kb : Kilo base
KN : Kháng nguyên
KT : Kháng thể
LAM : Lipoarabinomannan
MDR : Multidrugs Resistant
MTB : Mycobacterium Tuberculosis
NALC :

N-acetyl-L-cystein
PCR : Polymerase Chain Reaction
PCR : Polymerase Chain Reaction
RIF : Rifampicin
RNA : Ribonucleic Acid
RMP : Rifampicin
Taq-DNA polymerase: Thermus Aquaticus DNA Polymerase
TB : Tuberculosis
XDR : Extensively Drug-resistant

Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 2


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 : Hình ảnh vi khuẩn lao chụp dưới kính hiển vi 11
Hình 1.2 : Hình ảnh Mycobacterium tuberculosis hiển vi ñiện tử quét 11
Hình 1.3 : Bộ gen của Mycobacterium tuberculosis 12
Hình 2.1 : Tình hình bệnh lao kháng thuốc trên thế giới 17
Hình 2.2 : Tình hình bệnh lao ở Việt Nam 18
Hình 2.3 : Hình ảnh vách tế bào vi khuẩn lao 20
Hình 2.4 : ðột biến trong vùng 81 bp codon 507-533 gen rpoB 21
Hình 2.5 : Vùng khả năng bị ñột biến 22
Hình 2.6 : ðột biến trong codon Ser95 22
Hình 3.1 : Hình ảnh lao chụp x-quang 26
Hình 3.2 : Phương pháp ELISA gián tiếp 27

Hình 3.3 : Các bước trong phương pháp Sandwich ELISA 29
Hình 4.1 : Các thiết bị và dụng cụ trong quy trình 38
Hình 4.2 : Primer thiết kế hướng dẫn của CDS 44

Hình 4.3 : Chu trình nhiệt Phát hiện Mycobacterium tuberculosis (MTB) kháng thuốc
bằng kỹ thuật real-time PCR 45
Hình 4.4 : ðường biểu diễn khuyếch ñại mẫu thử nghiệm 46










Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 3


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỀU ðỒ, SƠ ðỒ
Trang
Bảng 1.1 : Thống kê tình hình bệnh lao trên thế giới năm 2009 9
Bảng 4.1 : Các mồi và mẫu dò ñược sử dụng 37
Biểu ñồ 2.1 : Tỷ lệ kháng thuốc trong các ca ñã trải qua ñiều trị và nhiễm mới 18

Biểu ñồ 3.1 : Biểu ñồ ñường biểu diễn khuếch ñại 34

Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 4

CHƯƠNG MỞ ðẦU










Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 5


1. Tính cấp thiết của ñề tài

Bệnh lao ñã xuất hiện hàng nghìn năm nay và là căn bệnh khó chữa trị. Hiện nay
có khoảng 1/3 dân số trên thế giới ñã nhiễm lao, mỗi năm có khoảng 3 triệu người chết vì
lao. Nguyên nhân gây bệnh lao là vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. ðây là vi khuẩn
hình que, dài từ 3-5µm, rộng từ 0,3 - 0,5µm, không có tiêm mao, hai ñầu tròn, tế bào có
hạt.
Trong những năm 70-80 công tác phòng chống và ñiều trị lao ñã trở nên không
hữu hiệu do có sự xuất hiện của các chủng lao kháng thuốc khó chữa trị và có nguy cơ lây
lan nhanh và ñã làm cho số người mắc bệnh, tử vong tăng cao. Những người mắc chủng
vi khuẩn lao mới này phải ñiều trị trên 2 năm so với ñiều trị 6- 8 tháng như trước kia và
chi phí tăng lên gấp 100 lần. Tổ chức Y tế thế giới ước tính, ñến nay ñã có 2700 ca bệnh
lao kháng thuốc ở 41 quốc gia. Việc ñiều trị cho bệnh nhân lao kháng thuốc hết sức
nghiêm ngặt và cần phải theo dõi liên tục.
Vi khuẩn lao có thời gian sinh sản và tăng trưởng chậm nên các phương pháp như:
nuôi cấy truyền thống, nhuộm soi ñàm mất nhiều thời gian, chậm trễ trong phát hiện và
ñiều trị bệnh lao. Chính vì vậy một phương pháp phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc
nhanh chóng và chính xác là ñiều cần thiết nhất. ðề tài thực hiện nhằm tìm hiểu về quy
trình phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc bằng một số kỹ
thuật sinh học phân tử nhằm cung cấp thêm một số thông tin về vấn ñề này.
2. Mục ñích nghiên cứu
Tìm hiểu về quy trình chẩn ñoán bệnh lao kháng thuốc phương pháp sinh học phân
tử, giúp phát hiện bệnh nhanh chóng và chính xác ñể ñiều trị kịp thời.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
 Tìm hiểu về quy trình phát hiện lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
 ðánh giá ñược ñộ nhạy và chính xác của quy trình.
4. Phương pháp nghiên cứu
 Thu thập tài liệu.
 Tìm hiểu các quy trình phát hiện khuẩn lao.
 Xác ñịnh quy trình về mặt lý thuyết.
 Dự ñoán ñánh giá quy trình ñề xuất.
Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 6


5. Các kết quả ñạt ñược của ñề tài
 Tìm hiểu thành công về quy trình phát hiện lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh
học phân tử, ñiều quan trọng ở ñây là việc tách chiết và tinh sạch DNA của vi khuẩn lao
ñể tránh trường hợp dương tính giả có thể xảy ra.
 ðánh giá ñược ñộ nhạy và chính xác của quy trình.

Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 7










CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN VỀ BỆNH LAO











Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 8


1.1. Bệnh lao
1.1.1. Lịch sử bệnh lao [4]
Theo phát hiện di tích bộ xương người cổ ñại cho thấy những tổn thương ñặc trưng
của bệnh lao, chứng tỏ bệnh lao xuất hiện cách ñây 4000 năm trước công nguyên. Nhiều
loại thuốc phục vụ cho việc ñiều trị bệnh lao cũng ñã xuất hiện cách ñây 7000 năm ở Ấn
ðộ và 5000 năm ở Trung Quốc.
1.1.2. Khái niệm về bệnh lao [6]
Lao là một bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis gây
nên. Bệnh lao có thể gặp ở tất cả các bộ phận cơ thể, trong ñó lao phổi là thể lao phổ biến
nhất (chiếm 80-85%) và là nguồn lây nhiễm chính.
1.2. Tình hình dịch tễ bệnh lao
1.2.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới
Hiện nay trên thế giới có khoảng 1/3 dân số (hơn 2,2 tỉ người) ñã nhiễm lao. Thống
kê cho thấy cứ 3 người trên thế giới, có một người bị nhiễm vi khuẩn lao. ðến năm 2005,
có 8,8 triệu ca lao mới (tỷ lệ: 140/100000 dân), trong ñó thì 3,9 triệu trường hợp nhiễm
lao mới (62/100000dân). Số người chết do lao khoảng 1,7 triệu (28/100000). [23]
Năm 2008, số người chết ñược thống kê là 1,1-1,2 triệu người, số người mới nhiễm
là 8,9-9,9 triệu người, trung bình mỗi ngày có khoảng 48 nghìn người chết. Tỉ lệ này
chiếm ña số trong các trường hợp tử vong do vi khuẩn lao thuộc các nước ñang phát triển,
ñặc biệt là ở Châu Á (chiếm hơn ½ trong tổng số trường hợp). Tỉ lệ nhiễm lao tính trên
toàn cầu ñang có xu hướng giảm, nhưng rất chậm dưới 1%.
Năm 2009, có 1,7 triệu người chết vì lao, tương ñương với 4700 ca tử vong mỗi
ngày và có 9,4 triệu ca nhiễm lao mới. Tỷ lệ mắc ước tính trên toàn cầu năm 2009 giảm
xuống 137 ca/100000 dân. Tỷ lệ này vẫn ñang giảm nhưng rất chậm. [22]
Hàng năm vùng Tây Thái Bình Dương có 2 triệu ca lao mới. Số trường hợp nhiễm

lao ở vùng này chiếm 1/3 tổng số ca lao trên toàn cầu, trong ñó 70% ca lao ở ñộ tuổi 15 –
54. Năm 2005 vùng này có 990000 ca lao ñược báo cáo, trong ñó 455000 ca là nguồn lây.
9/10 ca lao trong vùng ñược tìm thấy tại 7 quốc gia: Campuchia, Trung Quốc, Lào, Mông
Cổ, Papua New Guinea, Philippines và Việt Nam.

Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 9


Bảng 1.1: Thống kê tình hình bệnh lao trên thế giới năm 2009
“Nguồn: ”
Khu vực Tính trên ngàn dân % của tổng toàn cầu
Châu Phi 2800 30
Châu Mỹ 270 2,9
Châu Âu 420 4,5
ðông Nam Á 3300 35
ðông ðịa Trung Hải 660 7,1
Tây Thái Bình Dương 1900 21
Tổng số toàn cầu 9400 100

1.2.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
Trong giai ñoạn từ 1997 – 2002 phát hiện 530 nghìn bệnh nhân lao các thể, ñã ñiều
trị 260 nghìn bệnh nhân lao phổi với tỷ lệ khỏi là 92%. So với khu vực Tây Thái Bình
Dương, Việt Nam chiếm 12% bệnh nhân nhiễm lao các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi
mới.
Tính ñến thời ñiểm tháng 7 năm 2006, Việt Nam xếp thứ 13 trong 22 nước có số
lượng bệnh nhân lao cao nhất thế giới. Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam
ñứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philippin.

Theo kết quả ñiều tra dịch tễ học toàn quốc năm 2006 - 2007, tình hình bệnh lao ở
nước ta cao hơn ước tính trên thế giới của WHO 1,6 lần. Số bệnh nhân ñược phát hiện
muộn hoặc không ñược phát hiện ngoài cộng ñồng còn chiếm tỷ lệ cao. Thực tế tỷ lệ phát
hiện bệnh nhân mắc lao là khoảng 55%.
ðến năm 2008, Việt Nam có tỷ lệ bệnh nhân tái phát và ñiều trị thất bại tăng (năm
2004 là 6,4%, năm 2008 là 7,7%). ðặc biệt lao ñang có xu hướng giảm ở lứa tuổi già và
có xu hướng tăng ở lứa tuổi trẻ. Ở lứa tuổi 15 -24, tỷ lệ phát hiện lao phổi mới (tính trên
100 nghìn dân), tăng từ 19,5 (2000) lên 37,5 (2008) ñối với nam giới, còn nữ giới là từ
16,9 lên 42,8. Ước tính tử vong do lao ở nước ta là 20000 ca /năm. Tỷ lệ dân số bị nhiễm
Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 10


lao ở nước ta là 44%. Số bệnh nhân lao ước tính mỗi năm. Số mới mắc các thể: 154000
người. Trong ñó bệnh nhân lao phổi 69000 người. [23]
Nhiều nguyên nhân ñã ñược ñưa ra là dịch vụ y tế chăm sóc sức khỏe công cộng
của Việt Nam chưa tốt, ñặc biệt là ở vùng sâu vùng xa, tình trạng tự ñiều trị lao của người
dân, hay ñiều trị chưa triệt ñể ñã làm xuất hiện các thể lao kháng thuốc.
Mục ñích của chương trình chống lao quốc gia tại Việt Nam là giảm tỷ lệ mắc, chết
và lây truyền bệnh trong cộng ñồng, bao gồm cả ảnh hưởng về tâm lý- xã hội gây ra bởi
bệnh lao và phòng ngừa bệnh lao kháng thuốc nhằm góp phần vào chiến lược xóa ñói
giảm nghèo và tăng trưởng của Việt Nam. [25]
1.3. Phân loại và ñặc ñiểm vi khuẩn lao [6]
1.3.1.Phân loại
Giới: Monera
Ngành: Bacteria
Lớp: Actinobacteria
Bộ: Actinomycetales

Họ: Mycobacteriaceae
Chi: Mycobacterium
Loài: Mycobacterium tuberculosis
Phân loại dựa vào ñối tượng gây bệnh cho người và các vật, vi khuẩn lao bao gồm:
- Vi khuẩn lao người - Mycobacterium tuberculosis homonis.
- Vi khuẩn lao bò - Mycobacterium bovis.
- Vi khuẩn lao chim - Mycobacterium avium.
- Vi khuẩn lao chuột - Mycobacterium microti.
Phân loại dựa trên ñoạn gen IS6110 chiều dài 1361 bp nằm trong cấu trúc DNA
của vi khuẩn thì chỉ có ở 4 loài Mycobacteria là M.tuberculosis, M.bovis, M. microti,
M.africanum (gọi chung là M.tuberculosis complex), mà không có ở các Mycobacteria
khác. Tại khoa vi sinh của Bệnh viện Lao- Phổi Trung ương, các nhà nghiên cứu nhận
thấy 71% các chủng vi khuẩn lao hiện nay có từ 5 ñoạn IS6110 trở xuống, trong khi vi
khuẩn cổ ñiển tỷ lệ này là 10%.

Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 11


1.3.2.ðặc ñiểm






Hình 1.1: Hình ảnh vi khuẩn lao chụp dưới kính hiển vi
“Nguồn:

http:/www
.Giangduongykhoa.wordpess.com”


Hình 1.2: Hình ảnh Mycobacterium tuberculosis hiển vi ñiện tử quét (X 15549)
“Nguồn: http:/www.Microbeworld.org”
Vi khuẩn lao là vi khuẩn hình que, dài từ 3-5µm, rộng từ 0,3 - 0,5µm, không có
tiêm mao, hai ñầu tròn, tế bào có hạt, ñứng riêng lẻ hoặc thành ñám trên tiêu bản nhuộm
(Hình 1.1 và 1.2).
Vi khuẩn lao có khả năng tồn tại lâu ở môi trường bên ngoài cơ thể vật chủ. Trong
ñiều kiện tự nhiên, vi khuẩn có thể tồn tại 3-4 tháng, chết sau 1,5h dưới ưới ánh sáng mặt
trời. Vi khuẩn lao ngừng phát triển ở 42
0
C, chết sau 10 phút ở 80
0
C, có thể sống ñược
trong 3 phút với cồn 90 ñộ và sống ñược 1 phút trong acid phenic 5%.
Vi khuẩn phát triển tốt nhất ở pH từ 6,2-7,2 và có thể phát triển tốt nhất ở pH acid
(5,5) hoặc ở pH kiềm (8,0). Trong phòng thí nghiệm, có thể bảo quản vi khuẩn lao trong
nhiều năm. Trong ñàm của bệnh nhân lao ñặt trong phòng tối, ẩm sau 3 tháng vi khuẩn
lao vẫn tồn tại và giữ ñược ñộc lực.
Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 12


Vi khuẩn lao là loại vi khuẩn hiếu khí, khi phát triển vi khuẩn cần ñủ oxy, cũng
chính vì vậy vi khuẩn lao ở phổi là chiếm tỷ lệ lớn nhất.

Vi khuẩn lao sinh sản chậm, trong ñiều kiện bình thường, trung bình 20-24 giờ
sinh sản một lần và có khi hàng tháng chúng mới sinh sản, thậm chí có thể nằm ở vùng
tổn thương rất lâu mà không sinh sản hay hoạt ñộng khi gặp ñiều kiện thuận lợi thì chúng
phát triển trở lại.
1.3.3 Bộ gen của vi khuẩn lao
Bộ gen của vi khuẩn lao ñã ñược giải trình tự vào năm 1998, có chiều dài 4411522
bp trong ñó có 3924 bp trình tự ñược dự ñoán là mã hóa protein, tỷ lệ G + C chiếm ñến
65,6%. Bộ gen của vi khuẩn lao có chứa tới 90,8 % trình tự mã hóa protein và chỉ có 6
gen giả. [20]
Gen IS6110 phân bố rải rác nhiều nơi trong bộ gen. ðây là ñoạn gen có tính bảo
tồn cao. Các phương pháp PCR, real-time PCR phát hiện vi khuẩn Mycobacterium
tuberculosis ñều dựa trên tín hiệu khuếch ñại vùng gen này.


Hình 1.3: Bộ gen của Mycobacterium tuberculosis
“Nguồn: http:/www.Clcbio.com”


Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 13


1.4. Nguồn lây, ñường xâm nhiễm và diễn biến bệnh
1.4.1. Nguồn lây [6]
Tất cả các bệnh nhân lao ñều có thể là nguồn lây, nhưng mức ñộ rất khác nhau.
ðối với các thể lao ngoài phổi (lao màng não, lao màng bụng, xương khớp…) ñược gọi là
các thể lao “kín”, vi khuẩn ít có khả năng lây nhiễm. Ngược lại, lao phổi là thể bệnh dễ
ñưa vi khuẩn ra bên ngoài. Vì vậy lao phổi là nguồn lây quan trọng nhất. Nhưng ngay ñối

với bệnh lao phổi thì khả năng lây bệnh cũng khác nhau tùy thuộc vào lượng vi khuẩn
trong ñàm. Những bệnh nhân lao phổi trong ñàm có nhiều vi khuẩn gây bệnh khác nhau
có thể phát hiện bằng phương pháp nhuộm soi trực tiếp thì khả năng lây cho người khác
gấp 2-10 lần các bệnh nhân lao phổi phải nuôi cấy mới phát hiện ñược vi khuẩn. Những
bệnh nhân này ñược xem là nguồn lây nguy hiểm nhất hay là nguồn lây chính. Bệnh lao ở
trẻ em không phải là nguồn lây quan trọng vì có tới 95% trẻ em mắc bệnh thì không tìm
thấy vi khuẩn lao trong các mẫu bệnh phẩm.
1.4.2. ðường xâm nhiễm [6]
Bệnh nhân lao phổi khi ho (hoặc hắt hơi) bắn ra các hạt rất nhỏ lơ lửng trong
không khí, phân tán xung quanh người bệnh, người lành khi hít các hạt này khi thở có thể
bị bệnh. Ngoài ra vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể bằng ñường tiêu hóa gây lao ruột,
ñường da gây lao da, niêm mạc gây lao mắt nhưng ít gặp. Vi khuẩn lao cũng có thể lây
nhiễm sang thai nhi bằng ñường máu qua tĩnh mạch rốn nếu mẹ bị lao cấp tính, hoặc nước
ối khi chuyển dạ. ðường lây quan trọng nhất vẫn là ñường hô hấp.
1.4.3. Diễn biến nhiễm bệnh [6]
Bệnh lao diễn biến qua hai giai ñoạn: nhiễm lao và bệnh lao.
+ Nhiễm lao
Khi vi khuẩn xâm nhập vào phổi ñến phế nang sẽ kích thích các tế bào miễn dịch
của cơ thể - chủ yếu là ñại thực bào vì ñộc lực cao nên sự tương tác giữa vi khuẩn và ñại
thực bào không tiêu diệt ñược tất cả vi khuẩn, vi khuẩn tiếp tục phát triển nhân lên trong
các tế bào này. Sự thay ñổi về hình thể và chức năng của một số tế bào tại vùng bị tổn
thương dần dần hình thành mang lao. Trong ña số trường hợp tổn thương có thể tự khỏi
(có hiện tượng lắng ñọng calci, hình thành nốt vôi) và không có biểu hiện lâm sàng. Phản
Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 14


ứng da với tuberculin bắt ñầu dương tính từ tuần thứ 3, sau khi vi khuẩn xâm nhập vào cơ

thể, nhưng miễn dịch ñầy ñủ của cơ thể chống lại bệnh lao phải sau 2-3 tháng.
Như vậy nhiễm lao là giai ñoạn ñầu tiên khi vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể gây
những tổn thương ñặc hiệu. ða số trường hợp không có biểu hiện lâm sàng, cơ thể hình
thành dị ứng và miễn dịch chống lao.
+ Bệnh lao [6]
ðây là giai ñoạn vi khuẩn ñã vào máu và gây ra tổn thương tại các cơ quan trong
cơ thể. Vi khuẩn lao có thể gián tiếp theo mạch bạch huyết ñến các nốt bạch huyết ở
cuống phổi hoặc vùng trung thất và sau ñó theo hệ thống ống dẫn ở lồng ngực vào trong
dòng máu, hoặc trực tiếp vào dòng máu từ hệ thống mạch máu ở vùng phổi có các u lao.
Khi ñã xâm nhập thành công vào dòng máu, chúng lan tỏa khắp cơ thể, tạo vô số ổ nhiễm,
với biểu hiện là củ lao màu trắng ở mô.
Khi vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể, chúng có thể sống tiềm ẩn, khi sức ñề
kháng của cơ thể suy yếu thì chúng mới phát triển và tấn công gây bệnh. Việc chuyển từ
nhiễm lao sang bệnh lao phụ thuộc vào ba yếu tố chính: số lượng và ñộc tính của vi khuẩn
lao, sức ñề kháng của cơ thể.














Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 15















Chương 2
BỆNH LAO KHÁNG THUỐC

Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 16


2.1. Lịch sử bệnh lao kháng thuốc
Bệnh lao kháng thuốc lần ñầu tiên ñược xác ñịnh trong năm 2006. Bệnh ñược phát
hiện ở 57 quốc qia và gây khó khăn ñiều trị. Bệnh lao kháng thuốc phổ biến ở ðông Âu,
Liên Xô cũ, Trung Quốc và Ấn ðộ và ñang tăng lên ở châu Phi. MDR-TB là viết tắt của
nhiều bệnh lao kháng thuốc, nó kháng với hai trong số các loại thuốc bệnh lao hiệu quả
nhất dòng ñầu tiên. Lao XDR- kháng thuốc diện rộng bệnh lao, mô tả một hình thức cao
gây chết người của bệnh lao kháng thuốc. [32]
2.2. Tình hình bệnh lao kháng thuốc
2.2.1. Trên thế giới
Tổ chức Y tế Thế giới mở cuộc khảo sát dựa vào số liệu của các phòng thí nghiệm
chuẩn trên thế giới. Trong số 17.690 mẫu phân lập ñược từ năm 2000-2004 và từ nhiều
quốc gia có 20% chủng kháng nhiều thuốc (MDR-TB), 2% chủng kháng thuốc diện rộng
(XDR-TB). Lao kháng thuốc diện rộng xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới, nhiều nhất ở
Hàn Quốc là nơi có ñiều tra dịch tễ về ñộ nhạy của vi khuẩn, ðông Âu và Tây Á châu.
Bệnh nhân bị lao kháng thuốc diện rộng có tỉ lệ tử vong cao hơn bệnh nhân khác.
[31]

Ở Hoa kỳ trong 169654 trường hợp lao từ năm 1993 ñến 2004 có 1.6% vi khuẩn
kháng nhiều thuốc, 0,04% là kháng thuốc diện rộng. Tuy bệnh lao ở Hoa kỳ giảm, số lao
kháng nhiều thuốc tăng từ 113 trong năm 2003 lên 128 trong năm 2004. Tuy các con số

ghi nhận ñược chưa thực sự phản ảnh tình hình lao kháng thuốc diện rộng vì các phòng
thí nghiệm. Tại các quốc gia (trừ Hoa Kỳ, Hàn Quốc và Latvia) không thường xuyên xét
nghiệm ñộ nhạy của vi khuẩn ñối với tất cả các thuốc trị lao loại 2, các phương pháp xét
nghiệm lại khác nhau.
[31]


Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 17



Hình 2.1: Tình hình bệnh lao kháng thuốc trên thế giới năm 2007
“Nguồn: www.thefullwiki.org”
Năm 2007 có 289000 ca lao kháng thuốc trong những ca nhiễm mới (chiếm 3.1%
tổng số ca nhiễm lao mới) và 221000 ca lao kháng thuốc ñã từng ñiều trị trước ñó (chiếm
19% tổng số ca qua ñiều trị).
Riêng ở khu vực Tây Thái Bình Dương tỷ lệ kháng ña thuốc trong số những bệnh
nhân nhiễm lao mới dao ñộng trong khoảng 0% ñến 10.8%.
ðối với bệnh lao kháng thuốc thì người ta phân làm 2 nhóm: nhóm nhiễm mới, trải
qua ñiều trị,
♦ Tỷ lệ kháng thuốc trong các ca nhiễm mới: kháng bất kỳ thuốc nào 17%, kháng
isoniazid là 10.3% và MDR là 2.9%.
♦ Tỷ lệ kháng thuốc trong các ca ñã trải qua ñiều trị: kháng bất kỳ thuốc nào 35%,
kháng isoniazid là 27.7% và MDR là 15.3%.

Ước tính trung bình
trên

100000 dân

Chưa thống kê
Khố luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 18


35%
27.70%
15.30%
17%
10.30%
2.90%
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
kháng bất kỳ kháng isoniazid MDR
qua điều trò
nhiễm mới

Biểu đồ 2.1: Tỷ lệ kháng thuốc trong các ca đã trải qua điều trị và nhiễm mới

“Nguồn: www.thefullwiki.org”
2.2.2. Ở Việt Nam

Hình 2.2: Tình hình bệnh lao kháng thuốc ở Việt Nam năm 2007
“Nguồn: www.thefullwiki.org”
Năm 2007, Việt Nam ước tính có 150 ca nhiễm lao mới/nghìn dân và tỷ lệ mắc
bệnh là 192 ca/nghìn dân. Tỷ lệ lao đa kháng thuốc trong tổng số ca nhiễm lao mới là
2,7%, lao đa kháng thuốc trong tổng số ca đã qua điều trị là 19%.
100% cho 100000 dân

Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 19


Theo số liệu bệnh nhân lao ñăng ký ñiều trị lao tại TP. HCM năm 2008, với tỷ lệ
kháng ña thuốc (kháng ít nhất với Rifampicin và Isoniazid) vào khoảng 3.8% trong số
bệnh nhân mới và trên 22% ở bệnh nhân lao tái ñiều trị.
2.3. Tình hình nghiên cứu bệnh lao kháng thuốc

► Nghiên cứu thành công bộ kit ña mồi phát hiện lao kháng thuốc:
[28]


Trên thế giới ñã có một số kít thương phẩm chẩn ñoán nhanh vi khuẩn lao kháng
thuốc do nước ngoài sản xuất nhưng vì chưa có dữ liệu nào về ñặc ñiểm phân tử của vi
khuẩn lao kháng ña thuốc ở Việt Nam nên không có cơ sở ñể sử dụng. Hơn nữa, các bộ
kít do nước ngoài sản xuất hiện giá thành khá cao. Do ñó, việc nghiên cứu và phát triển
kít chẩn ñoán lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử là nhu cầu cấp thiết. Tại

Việt Nam trải qua một thời gian dài nghiên cứu, vào tháng 5 năm 2011, PGS-TS Nguyễn
Thái Sơn, chủ nhiệm Bộ môn Vi sinh Y học Bệnh viện 103 (Học viện Quân y - Bộ Quốc
Phòng) và các cộng sự ñã nghiên cứu thành công bộ kít ña mồi có tên mPCR, giúp nâng
cao hiệu quả chẩn ñoán vi khuẩn lao. Bộ kít ña mồi có chứa các cặp mồi dùng phát hiện 3
gen ñặc hiệu (IS6110, IS1081, 23S rDNA) của vi khuẩn lao trong cùng một phản ứng,
trong khi kít nhập ngoại chỉ phát hiện một gen (IS6110). Do ñó, kít ña mồi không bỏ sót
chẩn ñoán, ñồng nghĩa với việc hạn chế nguy cơ lây nhiễm vi khuẩn lao ra cộng ñồng, hạn
chế biến chứng ở người bệnh và giúp kiểm soát bệnh lao ñược tốt hơn. Mặt khác giá
thành dự kiến của bộ kit này chỉ bằng 1/2 so với kit nhập ngoại. Với bộ kit này, các cơ sở
y tế có thể phát hiện vi khuẩn lao trong vòng 24 giờ vì chúng ñạt ñộ nhạy, ñộ ñặc hiệu ñến
trên 90%.
► Xét nghiệm bệnh lao phổi trong vòng 100 phút: [29]
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) ñã ñưa vào sử dụng trên toàn cầu thiết bị xét nghiệm
mới cho phép chẩn ñoán và phát hiện nhanh, chính xác bệnh lao phổi trong vòng 100
phút. Giá thành thiết bị này sẽ ñược giảm 75% cho 116 nước thu nhập trung bình và thấp
trên thế giới, mở ra triển vọng ñiều trị và kiểm soát bệnh lao phổi hiệu quả ở cả những
nước nghèo và chậm phát triển nhất thế giới.
Xét nghiệm mới này ñược gọi là "xét nghiệm khuếch ñại axít nucleic" (Nucleic
acid amplification tests) ñược thử nghiệm lâm sàng trong 18 tháng ñã chứng tỏ hiệu quả
Khoá luận tốt nghiệp

SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 20


chính xác trong chẩn ñoán phát hiện sớm bệnh lao phổi, bệnh lao kháng nhiều thuốc
(MDR-TB) và bệnh lao bội nhiễm HIV rất khó phát hiện.
Phương pháp xét nghiệm mới có hiệu quả cao gấp 3 lần so với xét nghiệm hiện
hành, ñặc biệt ñối với các bệnh lao kháng thuốc và gấp 2 lần ñối với bệnh lao bội nhiễm
HIV. Xét nghiệm Nucleic acid amplification tests kết hợp với công nghệ DNA hiện ñại

hoàn toàn tự ñộng và dễ sử dụng nên có thể sử dụng bên ngoài các phòng xét nghiệm
thông thường.
2.4. Vi khuẩn lao kháng thuốc

2.4.1 ðặc ñiểm giúp vi khuẩn lao có khả năng kháng thuốc



Hình 2.3: Hình ảnh vách tế bào vi khuẩn lao
“Nguồn: ”
Vi khuẩn lao có cấu trúc vỏ khá hoàn hảo, giúp chống chịu tốt với nhiều ñiều kiện
bất lợi. Thành tế bào gồm các mycolic acid, chất sáp và các glycolipid chuỗi ñơn. Các
mycolic acid có cấu tạo mạch nhánh rất dài (C60 ñến C90) gắn với các muramic acid của
lớp peptidoglycan bằng những liên kết phosphodiester và liên kết với arabinogalactan bởi
các nối glycolpid. Mycolic acid ñem lại nhiều chức năng cho vi khuẩn lao, giúp vi khuẩn
có sức chịu ñựng cao, làm tăng kháng thuốc do làm hư hại các hoá chất, khử nước và
ngăn chặn hiệu quả hoạt ñộng của kháng sinh. Nó làm cho vi khuẩn phát triển ñược bên
trong ñại thực bào và ẩn tránh hệ thống miễn dịch của chủ thể. Hai thành phần quan trọng
Lipid
P
olysaccharides

Phosphatidylino
sitol

mannoside

M
àng

plasma

P
eptidoglycan

M
ycolic

Lipoarabinomanna
Thành tế bào
xương