NGUYÊN TẮC VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN

NGUYÊN TẮC VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA
CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN
TS.BS. Hoàng Anh Vũ
Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 03 năm 2011
1
Nội dung:
1. Các kỹ thuật khảo sát nhiễm sắc thể
2. Các kỹ thuật khảo sát nucleic acid
3. Các kỹ thuật khảo sát protein
2
Mục tiêu:
1. Nhận diện đƣợc kỹ thuật tƣơng ứng mức độ phân tử
2. Nêu đƣợc cơ chế phân tử và cách phát hiện bất thƣờng
3. Liệt kê ứng dụng của PCR và giải trình tự DNA
NỘI DUNG – MC TIÊU
Cơ thể người
Cơ quan/hệ thống
Mô
Tế bào
Các phân tử sinh học
(nucleic acid, protein)
3
Nhiễm sắc thể
Deoxyribonucleic acid (DNA)
(+ Histone)
Ribonucleic acid (RNA)
Protein
Nhiễm sắc thể đồ
FISH
Southern blot (DNA)

Northern blot (RNA)
PCR
DNA sequencing
Hóa mô miễn dịch
Western blot
4
 Bản đồ của bộ nhiễm sắc thể của một cá thể
 Nam bình thường: 46,XY
 Nữ bình thường: 46,XX
5
NHIM SẮC TH ĐỒ (KARYOTYPE)
Cấy tế bào
Thu hoạch
Thu hoạch tế bào
0.075 M KCl
Cố định
(Acid acetic: methanol)
Cytokines (tủy: 1 – 2 ngày,
máu: 2 -3, ối: 5 -7)
Chuẩn bị slide
Nhuộm băng
• G-banding
• Q-banding
• (R, C, T, NOR)
Phân tích
20- 30 metaphase
6
NST ĐỒ: QUY TRNH K THUẬT
7
BT THƢỜNG SỐ LƢNG NST:

HỘI CHNG DOWN
8
t(9:22): chuyển vị
nhiễm sắc thể 9 và 22
BT THƢỜNG CU TRÖC NST:
BNH BCH CU MN DÕNG TY (CML)
 Chỉ khảo sát đƣợc khi nuôi cấy bệnh phẩm thành
công
 Không phát hiện đƣợc những bất thƣờng nhỏ (độ
phân giải thấp)
 Tốn nhiều thời gian và nhân lực
9
HN CH CA NST ĐỒ
 Lai tại chỗ gắn huỳnh quang: lai phân tử thực
hiện ngay trong tế bào mà không cần tách chiết
nucleic acid ra khỏi tế bào
 Cung cấp thông tin chính xác về vị trí và phân bố
của đoạn DNA quan tâm trên NST nhờ một mẫu dò
(probe) chuyên biệt
10
FISH (fluorescence in situ hybridization)
 Probe: Chuỗi DNA đã đƣợc đánh dấu
 Denature (biến tính): Chuỗi đôi DNA
tách rời thành chuỗi đơn
 Hybridize (lai hóa): Các chuỗi đơn
DNA đặc hiệu sẽ bắt cặp đƣợc với nhau
ở điều kiện thích hợp
Phát hiện đƣợc các chuỗi đặc hiệu
nhờ các probe
11

FISH: NGUYÊN TẮC K THUẬT

Bình thƣờng:
2 tín hiệu màu đỏ
Ung thƣ vú:
nhiều tín hiệu đỏ
Herceptin
NST 17
HER2/neu
12
HNH NH TĂNG BIU HIN GEN HER2/NEU
TRONG UNG THƢ VÖ
nl(9)
nl(9)
nl(22)
nl(22)
nl(9)
der(9)
Ph
nl(22)
Ph(-)
Ph(+)
Nhạy Imatinib
Kháng Imatinib
13
HNH NH CHUYN V NST PHILADELPHIA
TRONG CML
14
SOUTHERN BLOT: NGUYÊN TẮC K THUẬT
15

SOUTHERN BLOT: QUY TRNH K THUẬT
• Phát hiện những thay đổi về cấu trúc của DNA
(mất đoạn, thêm đoạn)
• Có thể phát hiện đột biến điểm nếu đột biến làm
thay đổi điểm cắt của men cắt hạn chế (restriction
enzyme)
16
SOUTHERN BLOT: NG DNG
Probe: C4 Probe: CYP21
17
MT ĐON GEN CYP21 V C4B
TRONG BNH THIU 21-HYDROXYLASE
18
ĐỘT BIN T BO HNH LIM
• Cần lƣợng lớn DNA (microgram)
• Kỹ thuật phức tạp, tốn nhiều thời gian
• Phần lớn các ứng dụng đã đƣợc thay thế bởi PCR
19
HN CH CA SOUTHERN BLOT
 ng dụng chính: Khảo sát biểu
hiện gen (RNA) trong mô
 Kỹ thuật phức tạp, tốn thời gian
20
NORTHERN BLOT
21
PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION):
NGUYÊN TẮC K THUẬT
22
PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION):
NGUYÊN TẮC K THUẬT

23
1. Khuôn mẫu (template DNA): đoạn gen mục tiêu đƣợc
khuếch đại (beta-globin: 1,6 kb/3.300 Mb = 1/2.000.000)
2. Cặp mồi (primer): khoảng 18 – 25 bp
3. Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs): Nguyên liệu cho
tổng hợp chuỗi DNA
4. Polymerase chịu nhiệt: Xúc tác phản ứng
5. Buffer: Tạo môi trƣờng cho polymerase hoạt động (ổn định
pH, nồng độ HCl và Mg
++
phù hợp)
CC THNH PHN QUAN TRỌNG CA PCR
mRNA
cDNA
RT-PCR
reverse transcriptase
Genomic DNA
Genomic PCR
24
KHUÔN MẪU (TEMPLATE)
25
GENOMIC PCR V RT-PCR