ảnh hưởng của sự nhiễm vi khuẩn edwardsiella ictaluri và thuốc trừ sâu cyrus lên sự thay đổi một số chỉ tiêu huyết học cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN







TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO








ẢNH HƯỞNG CỦA SỰ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella
ictaluri VÀ THUỐC TRỪ SÂU CYRUS LÊN SỰ THAY
ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN









2010

i
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN





TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO






ẢNH HƯỞNG CỦA SỰ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella
ictaluri VÀ THUỐC TRỪ SÂU CYRUS LÊN SỰ THAY ĐỔI

MỘT SỐ CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CÁ TRA (Pangasianodon
hypophthalmus)








LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN





CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGs. Ts. ĐỖ THỊ THANH HƯƠNG
Ts. PHẠM MINH ĐỨC






2010


ii

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin trân trọng gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGs. Đỗ Thị Thanh
Hương và Ts. Phạm Minh Đức đã dành nhiều thời gian hướng dẫn, quan tâm,
động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Xin gởi lời cảm ơn đến các bạn Nguyễn Thị Kim Hà, Nguyễn Văn Toàn
đã giúp đỡ và hỗ trợ về trang thiết bị trong suốt quá trình làm việc tại phòng thí
nghiệm.
Xin gởi lời cảm ơn đến các em sinh viên lớp liên thông Nuôi trồng Thủy
sản K34 và K35 đã nhiệt tình giúp đỡ trong thời gian thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn dự án Physcam đã hỗ trợ kinh phí và tạo điều kiện cho
tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, những người thân
và bạn bè đã chia sẽ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và
nghiên cứu tại trường.
Xin chân thành cảm ơn!

iii
TÓM TẮT


Đề tài được thực hiện nhằm tìm hiểu sự nhiễm bệnh và hóa chất lên một
số chỉ tiêu huyết học của cá tra. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với
2 thí nghiệm: thí nghiệm 1 cá nhiễm thuốc trừ sâu với nồng độ cypermethrin
(LC
50
-96 giờ, 1/2 LC
50
-96 giờ) và đối chứng, thí nghiệm 2 cá nhiễm bệnh do vi
khuẩn Edwardsiella icaluri ở mật độ 3,5x10
4
cfu/ml, 3,5x10
2
cfu/ml và đối chứng
tiêm nước muối sinh lý.
Kết quả cho thấy cypermethrin có độ độc cao đối với cá tra (LC
50
-96 giờ
là 0,072 mg/L). Số lượng hồng cầu và tỷ lệ huyết cầu giảm khi cá tiếp xúc thuốc,
sau 6, 9 giờ có dấu hiệu tăng nhẹ và tiếp tục giảm sau đó. Số lương bạch cầu có
dấu hiệu giảm khi cá nhiễm cypermethrin đến 96giờ mới có dấu hiệu tăng nhưng

vẫn thấp hơn so với đối chứng. MCV, MCH, MCHC có biến động nhưng không
đáng kể so với đối chứng. Đối với thí nghiệm cá nhiễm vi khuẩn E. ictaluri kết
quả phân tich một số chỉ tiêu huyết học cho thấy số luợng hồng cầu cá tra ở các
nghiệm thức nhiễm vi khủẩn E. ictaluri dao động từ 1,4-1,51 triệu tế bào/mm
3

giảm có ý nghĩa thống kê so với cá khỏe (1,85 triệu tế bào/mm
3
). Số lượng bạch
cầu dao động từ 14,94-16,02 nghìn tế bào/mm
3
giảm có ý nghĩa thống kê so với
cá khỏe (18,08 nghìn tế bào/mm
3
). Trong đó, tế bào lympho và tiểu cầu giảm
nhưng số bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính tăng. Kết quả nhiên cứu của
đề tài cung cấp thông tin có giá trị làm cơ sở cho nghiên cứu ứng dụng trong
chuẩn đóan và phòng trị bệnh ở cá tra nuôi.

iv
ABSTRACT

The aim of this study was to investigate the effects of pesticide and
bacteria on hematological parameters of Tra fish. There was 2 experiments: the
first experiment was randomly designed with 2 different concentrations of
cypermethrin (LD
50
-96 hours and 1/2 LD
50
-96 hours) and control. The second
experiment were infected with bacteria Edwardsiella ictaluri on Tra fish.
The result showed cypermethrin was highly toxic to Tra fish (LC50-96h is
3,89 mg/L). The erythrocyte quantity and hematocrit value decreased after
administration of cypermethrin. MCV, MCH and MCHC were changed lightly
and non-significant with control. Results from haematological analysis evealed a
significant reduction in total number red blood cell in infected striped catfish
(ranged from 1,4-1,51 milion cells/mm
3
) compared to the healthy one (1,85
milion cells/mm
3
). The number of white blood cell in infectedstriped catfish
ranged from 14,94-16,02 thousand cells/mm
3
which was signficant lower than
the number of white cells in health striped catfish (18,08 thousand cells/mm
3
). Of
these, the number of lymphocyte and thrombocyte decreased but the monocyte

and neutrophil increased. Results from this study provide valuable basic
information for further applied study diagnosis, and effective method for
antibacterial in striped catfish farming.














v
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết, luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả
nghiên cứu của tôi trong khuôn khổ dự án Physcam, các kết quả này chưa dùng
cho bất cứ luận văn cùng cấp nào. Dự án có quyền sử dụng kết quả của luận văn
này để phục vụ cho dự án.

Tác giả luận văn
Trần Thị Phương Thảo

vi
MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i
TÓM TẮT ii
ABSTRACT iii
LỜI CAM ĐOAN iv
MỤC LỤC v
DANH SÁCH BẢNG vii
DANH SÁCH HÌNH vii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii
CHƯƠNG 1: 1
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1 Giới thiệu 1
1.2 Mục tiêu của đề tài 2
1.3 Nội dung của đề tài 2
1.4 Thời gian thực hiện đề tài 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Tổng quan về cá tra 3
2.1.1 Phân lọai 3
2.1.2 Đặc điểm sinh học 3
2.2 Sinh lý máu và huyết học của cá 4
2.2.1 Chức năng của máu 4
2.2.2 Thành phần và đặc tính lý hóa học của máu 4
2.3 Một số nghiên cứu về huyết học ở cá 6
2.4 Tổng quan tình hình bệnh, sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy
sản 7
2.4.1 Tình hình bệnh cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long 7
2.4.2 Tình hình sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản 9
2.5 Tổng quan thuốc trừ sâu Cyrus (chứa hoạt chất cypermethrin) 10
2.5.1 Cypermethrin: 10

2.6 Một số nghiên cứu về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 8
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
3.1 Vật liệu nghiên cứu 12
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12
3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 12
3.1.3 Hóa chất 12
3.1.4 Vi khuẩn 13
3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm: 13
3.2.1 Thí Nghiệm 1: Xác định LC
50
của Cypermerthrin 13
3.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của vi khuẩn E. ictaluri lên một số chỉ tiêu
huyết học của cá tra giống 14
3.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của Cypermerthrin lên một số chỉ tiêu chỉ tiêu
huyết học của cá tra giống 15
3.3 Phương pháp thu mẫu 15

vii
3.3.1 Thời gian thu mẫu 15
3.4 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu huyết học 16
3.5 Phương pháp xử lý số liệu 17
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18
4.1 Giá trị LC50 của thuốc trừ sâu Cyrus 25EC chứa hoạt chất cypermethrin lên
cá tra 18
4.2 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Cyrus chứa hoạt chất cypermethrin lên chỉ tiêu
huyết học 19
4.2.1 Số lượng hồng cầu 19
4.2.2 Số lượng bạch cầu 21
4.2.3 Hàm lượng huyết sắc tố (Hemoglobin, mmol/l) 22
4.2.4 Tỷ lệ huyết cầu (%) 23

4.2.5 Thể tích hồng cầu (MCV) 24
4.2.6 Khối lượng trung bình của huyết sắc tố trong hồng cầu (MCH) 25
4.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri lên chỉ tiêu huyết học cá tra 27
4.3.1 Số lượng hồng cầu 28
4.3.2 Số lượng bạch cầu 29
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32
5.1 Kết luận 32
5.2 Đề xuất 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
Phụ lục 1 39
Phụ lục 2 40
Phụ lục 3 42
Phụ lục 4 43
Phụ lục 5 45
Phụ lục 6 54
Phụ lục 7 54
Phụ lục 8 55
Phụ lục 9 55
Phụ lục 10 56
Phụ lục 11 56
Phụ lục 12 57
Phụ lục 13 57

viii
DANH SÁCH BẢNG

Bảng 4.1: Số lượng hồng cầu thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin 31
Bảng 4.2: Số lượng bạch cầu thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin 32
Bảng 4.3: Hàm lượng huyết sắc tố (mmol/l) thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin . 33
Bảng 4.4: Tỷ lệ huyết cầu (%) thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin 34
Bảng 4.5: Thể tích hồng cầu thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin 34
Bảng 4.6: MCH (pg) thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin 35
Bảng 4.7: MCHC (%) thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin 36
Bảng 4.8: Các chỉ tiêu huyết học thí nghiệm cá tiêm vi khuẩn E.ictaluri 37

ix
DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.7: Cấu tạo Cypermethrin 10
Hình 4.1 Cá bệnh mủ gan 27
Hình 4.2 Các loại bạch cầu 30

x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT


ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long
BVTV Bảo vệ thực vật
LC50 lethal concentration 50 (ngưỡng gây chết 50% sinh vật thí nghiệm)
MCV mean cell volume (Thể tích hồng cầu)
MCH mean cell hemoglobin (Khối lượng trung bình của huyết sắc tố
trong hồng cầu)
MCHC mean cell hemoglobin concentration (Nồng độ của huyết sắc tố
trong hồng cầu)

1
CHƯƠNG 1:
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Có thể nói hiện nay trên thế giới có hàng trăm đối tượng thủy hải sản được
gia hóa và sử dụng cho nuôi trồng thủy sản ở cả 3 môi trường: ngọt, lợ và mặn.
Trong nhóm các đối tượng nuôi nước ngọt, cá tra là lòai cá da trơn có giá trị kinh
tế cao. Trong những năm gần đây, cá tra là một trong những đối tượng nuôi
quan trọng của Đồng bằng sông Cửu Long. Tại Cần Thơ, diện tích nuôi đến
tháng 11 là 14.113 ha, bằng 110% so với cùng kỳ năm 2009, trong đó diện tích
nuôi cá tra là 581 ha; sản lượng nuôi đạt 164.579 tấn vượt 8% so với cùng kỳ.
Vĩnh Long diện tích nuôi cá tra là 405,9 ha và sản lượng đạt 108.746 tấn .
Với sự mở rộng nhanh chóng của nghề nuôi, vấn đề suy thoái môi trường và
dịch bệnh đã và đang trở thành một trong những trở ngại lớn cho sự phát triển
bền vững của nuôi trồng thủy sản nước ngọt Việt Nam. Theo Phạm Đình Khôi
(2009) trong vòng 5 năm qua, môi trường ô nhiễm và dịch bệnh đã làm tỷ lệ
sống trung bình của cá nuôi giảm từ 90% xuống còn 80%. Lý Thị Thanh Loan và
ctv. (2006) khi thu và phân lập vi khuẩn gây bệnh trên cá Tra ở ĐBSCL thì bệnh

gan, thận mủ do Clostridium sp. chiếm 69,38%, xuất huyết do Aeromonas sp.
chiếm 44,89% và Pseudomonas sp. chiếm 4,08%.
Song, xu hướng hiện nay việc phòng trị bệnh trên cá nước ngọt ở nước ta vẫn
còn chủ yếu dựa vào việc sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất kể cả những lọai
hóa chất cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, khiến việc xuất khẩu thủy sản
của Việt Nam gặp rất nhiều khó khăn do danh mục các lọai thuốc và hóa chất
cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng.
Các chỉ tiêu huyết học cá đang ngày càng được nghiên cứu nhiều trong quản
lý bệnh thủy sản, và có thể được dùng để chỉ tình trạng sức khỏe của cá cũng như
chất lượng nước, như máu trong mang có liên hệ trực tiếp với môi trường nước
và môi trường thay đổi bất lợi có thể được phản ánh trong hệ thống tuần hòan
(Mulcahy, 1975). Có một vài nghiên cứu khoa học về ảnh hưởng của các loại
thuốc trừ sâu lên chỉ tiêu huyết học cá (Srivastava, 1988; Khattak and Hafeez,
1996; Tavares et al., 1999; Svoboda et al., 2001). Nghiên cứu sự thay đổi các chỉ
tiêu huyết học và chức năng đào thải ở từng giai đoạn và nồng độ thuốc trừ sâu
khác nhau của cá rô phi Orieochromis mossambicus (Sampath et al., 1993). Vấn

2
đề đặt ra là có sự khác biệt như thế nào về một số chỉ tiêu huyết học của cá tra
khi có sự tác động của tác nhân sinh học và hóa học. Chính vì những lý do trên
mà đề tài: “Ảnh hưởng của sự nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và thuốc trừ
sâu Cyrus lên sự thay đổi một số chỉ tiêu huyết học cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus)” được thực hiện.
1.2 Mục tiêu của đề tài
Xác định một số yếu tố huyết học của cá tra khỏe và cá nhiễm bệnh do vi
khuẩn và hóa chất từ đó đánh giá sự biến đổi một số chỉ tiêu huyết học của cá
nhiễm bệnh và hóa chất nhằm cung cấp dẫn liệu khoa học cho việc chẩn đoán và
đánh giá sức khỏe ở cá nuôi.
1.3 Nội dung của đề tài
- Xác định LC

50
-96 giờ của thuốc trừ sâu Cyrux 25EC (hoạt chất cypermethrin)
trên cá tra giống.
- Ảnh hưởng của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri CT 258 lên một số chỉ tiêu
huyết học (hồng cầu, bạch cầu, hematorite và hemoglobin) của cá tra giống.
- Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Cyrux 25EC lên một số chỉ tiêu chỉ tiêu huyết học
(hồng cầu, bạch cầu, hematorite và hemoglobin) của cá tra giống.
1.4 Thời gian thực hiện đề tài
Từ tháng 8/2009 đến tháng 12/2010


3
CHƯƠNG 2:
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm sinh học cá tra
2.1.1 Phân loại: cá tra là một trong số 11 lòai thuộc họ cá tra (Pangasiidae) đã
được xác định ở sông Cửu Long. Tài liệu phân lọai gần đây nhất của tác giả
Rainboth xếp cá tra nằm trong giống cá tra dầu (Pangasianodon).
Bộ Siluriformes
Họ Pangasiidae
Giống Pangasianodon
Loài Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878)
2.1.2 Đặc điểm sinh học
Cá tra có khả năng sống trong điều kiện môi trường nhiều mùn bã hữu cơ,
nước tù đọng, oxi hòa tan thấp (Dương Nhựt Long, 2003). Cá tra thể hiện tính ăn
rộng, ăn đáy và ăn tạp thiên về động vật nhưng dễ chuyển đổi loại thức ăn, trong
điều kiện ao nuôi cá dễ thích ứng với nhiều loại thức ăn có nguồn gốc động vật
và thực vật (Lê Như Xuân, 2000). Cá tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể
sống được ở vùng nước lợ (nồng độ muối 7-10‰), có thể chịu đựng được nước

phèn với pH =4.5, dễ chết ở nhiệt độ thấp dưới 15
o
C, nhưng chịu nóng tới 39
o
C
(VINAFIS, 2004). Cá tra có số lượng hồng cầu trong máu nhiều hơn các loài cá
khác. Cá có cơ quan hô hấp phụ và cũng có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên
chịu đựng được môi trường nước có oxi hòa tan rất thấp (Lê Như Xuân, 2000).
2.1.3 Hiện trạng nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL
ĐBSCL có tiềm năng và lợi thế tự nhiên đặc biệt cho phát triển nghề nuôi cá tra.
Năng suất nuôi cá tra bình quân đạt tới mức 150-300 tấn/ha, diện tích nuôi cá tra
của ĐBSCL 2007 lên đến 7000 ha đạt sản lượng trên 1 triệu tấn với giá trị xuất
khẩu hơn 1 tỉ USD (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2008). Toàn
vùng có 157 trại giống, năm 2007 và đã sản xuất được 4,1 tỉ cá giống đủ đáp ứng
cho nhu cầu nuôi (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2008).
Ở ĐBSCL phong trào nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh ở khu vực ven sông
Tiền và sông Hậu, nhất là ở tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long và Thành
phố Cần Thơ. Tuy nhiên do phát triển tự phát về diện tích và gia tăng cao mật độ
nuôi 20-30con/m
2
lên 50-70con/m
2
thì ngoài việc tăn sản lượng, thu nhập cho

4
người nuôi nó c
ó dẫn đến môi trường nuôi ở một số nơi có dấu hiệu ô nhiễm và
dịch bệnh xảy ra thường xuyên gây thiệt hại lớn về kinh tế Một số bệnh thường
gặp ở cá tra nuôi như lở loét, đốm đỏ, đốm trắng, hoại tử và xuất huyết các vây,
tuột nhớt, bệnh gan thận mủ.

2.2 Sinh lý máu và huyết học của cá
Ở cá, máu chiếm 2-4% trọng lượng cơ thể, ít hơn những động vật có xương
sống khác (5-8%). Những thông số huyết học của cá liên quan đến tuổi, giới tính,
khẩu phần ăn, lòai, mùa vụ trong năm và nhiệt độ nước (Branson, 1993).
2.2.1 Chức năng của máu
Máu cá tương tự như động vật có xương sống khác bao gồn thể dịch và các
thành phần tế bào (Hibiya, 1982). Máu cá cũng có chức năng vận chuyển (khí,
dinh dưỡng, các sản phẩm của quá trình trao đổi chất), chức năng điều hòa thể
dịch, chức năng bảo vệ, duy trì môi trường bên trong cơ thể (Đỗ Thị Thanh
Hương và Trần Thị Thanh Hiền, 2000).
2.2.2 Thành phần và đặc tính lý hóa học của máu
Tế bào máu gồm có hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu (Đỗ Thị Thanh Hương và
Trần Thị Thanh Hiền, 2000).
Hồng cầu: Theo Supranee et al. (1991), hồng cầu đuợc chia thành 2 nhóm: hồng
cầu trưởng thành và hồng cầu chưa trưởng thành. Ở cá có dạng hình bầu dục, hai
bên lồi, ở giữa có nhân, kích thước biến đổi tùy theo lòai cá, to nhất là cá sụn, cá
miệng tròn rồi đến cá xương. Ở cá tra khoảng 6,16×6,87 µm. Hồng cầu biến
động theo tình trạng sinh lý của cá, theo giống loài, theo chế độ dinh dưỡng, theo
tuổi cũng như sự biến động của các yếu tố môi trường. Hồng cầu là những tế bào
có tính đàn hồi có thể co dãn được và biến đổi hình thể để chui vào các mao
mạch. Thành phần hóa học của hồng cầu gồm nước (60%), chất khô (40%) trong
đó chủ yếu là hemoglobine (90%). Mỗi hồng cầu chứa khỏang 340 triệu phân tử
Hemoglobine. Ngoài ra cũng có protein, lipip, muối vô cơ và enzyme. Lượng
Hemoglobine biến đổi theo sự biến đổi số lượng hồng cầu (Đỗ Thị Thanh Hương
và Trần Thị Thanh Hiền, 2000).
Bạch cầu: Theo Đỗ Thị Thanh Hương và Trần Thị Thanh Hiền (2000) bạch cầu
là loại
tế bào có nhân lớn, kích thước lớn hơn hồng cầu, số lượng bạch cầu biến
đổi tùy loài, sinh lý, tuổi, dinh dưỡng, nhiệt độ, thành thục sinh dục. Chức năng
của bạch cầu là bảo vê cơ thể chống lại sự xâm nhập vào cơ thể bằng phương

thức thực bào (do monocyte và neutrophil leucocyte) và tạo kháng thể (do

5
lymphocyte), góp phần vào quá trình rụng trứng và quá trình tiêu hóa. Dựa vào
các đặc tính bắt màu và thuốc nhuộm mà người ta chia ra làm 2 nhóm: bạch cầu
có hạt và bạch cầu không hạt.
Bạch cầu có hạt: Nguyên sinh chất của bạch cầu có hạt bắt màu và nhân có
nhiều thùy. Tùy loại màu nhuộm mà người ta chia thành bạch cầu ưa acid
(acidophil leucocyte), bạch cầu ưa kiềm (basodophil leucocyte) và bạch cầu
trung tính (neutrophil leucocyte). Bạch cầu trung tính (neutrophil leucocyte) có
số lượng nhiều nhất trong tổng số bạch cầu, chiếm từ 60-70%. Có nhiều trong
máu ngoại vi, giữ vai trò chủ chốt trong phản ứng viêm, có khả năng ăn những tế
bào nhỏ nên được gọi là tiểu thực bào. Do vậy khi cơ thể bị thương, bạch cầu
trung tính kéo đến để thực bào vi khuẩn và các vật lạ. Nhân của bạch cầu này
luôn biến đổi. Lúc còn non nhân có hình que, khi già nhân phân ra các thùy, có
thể từ 2-5 thùy.
Bạch cầu ưa acid (acidophil leucocyte): chiếm từ 2-4% tổng số bạch cầu,
đường kính từ 10-12 micron, các hạt trong nguyên sinh chất bắt màu acid. Hạt
trong nguyên sinh chất của bạch cầu này có kích thước lớn hơn hạt trong nguyên
sinh chất của các loại bạch cầu có hạt khác. Bạch cầu ưa acid tăng số lượng khi
cơ thể bị cảm nhiễm vi khuẩn, cảm nhiễm kí sinh trùng đường ruột và cá trạng
thái dị ứng cũng như tiêm protein lạ vào cơ thể.
Bạch cầu ưa kiềm (basodophil leucocyte): chiếm từ 0,5-1% tổng số bạch cầu.
Đường kính từ 8-10 micron. Các hạt trong nguyên sinh chất bắt màu thuốc
nhuộm kiềm. Ở một số lòai cá không có lọai bạch cầu này. Chức năng của nó
chưa rõ nhưng khi thiếu vitamin A, lọai bạch cầu này tăng lên rõ rệt.
Bạch cầu không hạt: là lọai không hạt bắt màu và nhân không chia thùy, có 2
loại: monocyte (có 1 nhân) và lymphocyte (có nhiều nhân).
Monocyte: có một nhân, liên kết với cá mô của cơ quan đích (thận, tỳ tạng, ống
tiêu hóa, ) để thực hiện chức năng thực bào ngay trong huyết quản, chỉ tồn tại

vài ngày trong tuần hòan máu, tham gia vào quá trình trình diện kháng nguyên.
Lymphocyte: chiếm khỏang 20-25% tổng số bạch cầu, ở các động vật còn non
có thể chiếm đến 50%. Có khả năng thực bào khi ra ngoài mạch máu vào tổ chức
liên kết. Có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch sau khi liên kết với các mô của
cơ quan đích.
Tiểu cầu: có kích thước nhỏ cỡ nhân hồng cấu, hình thoi không ổn định, tồn tại
trong máu từ 5-9 ngày, có nhân to, có một lớp nguyên sinh chất mỏng có vai trò

6
trong quá trình đông máu vì nó dễ tan để giải phóng men Thronbokinaza có tác
dụng biến fibrinogen thành fibrin (Đỗ Thị Thanh Hương và Trần Thị Thanh
Hiền, 2000).
Đặc tính lý hóa học của máu: máu cá có tỉ trọng bình quân 1,032- 1,051 (Đỗ
Thị Thanh Hương và Trần Thị Thanh Hiền, 2000). Độ dẫn điện cá nước ngọt
thấp hơn so với động vật bậc cao và áp suất thẩm thấu biến động tùy lòai (Đỗ Thị
Thanh Hương và Trần Thị Thanh Hiền, 2000).
2.3 Một số nghiên cứu về huyết học ở cá
Benli và Yildiz (2004) đã có nghiên cứu là có sự thay đổi các chỉ tiêu huyết
học của cá rô phi nhiễm Edwardsiella tarda. Theo Ueda et al. (2001) nghiên cứu
thành phần các loại huyết cầu cá rô phi (Oreochromis niloticus) cho biết ở cá rô
phi có các loại huyết cầu tương tự ở người gồm hồng cầu, tiểu cầu và các loại
bạch cầu. Tác giả mô tả chi tiết hình dạng, cấu tạo và chức năng của các loại
huyết cầu cá rô phi. Nghiên cứu về huyết học ở cá trê trắng (Clarias batrachus)
tác giả cho biết có 5 lọai tế bào máu tham gia vào vòng tuần hoàn máu gồm
hồng cầu, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính, tiểu cầu và tế bào lympho
(Chinabut et al., 1991). Trong khi đó, Hrubec et al. (2000) đã đưa ra những số
liệu cụ thể về kích thước và số lượng từng lọai huyết cầu cá rô phi lai
(Oreochromis hybrid). Cá Trắm cỏ bị nhiễm bệnh do Aeromonas hydrophila thì
số lượng hồng cầu giảm, số lượng bạch cầu tăng lên. Kích thước tế bào hồng cầu
cá bệnh nhỏ hơn cá bình thường. So với cá khỏe bình thường, tỷ lệ các bạch cầu

dạng basophil, neutrophil, bạch cầu monocyt, bạch cầu lymphocyt trong máu đều
thay đổi. Hiện tượng tăng bạch cầu lymphocyt cho thấy vai trò của tế bào
lympho trong hoạt động bảo vệ cơ thể (Lưu Thị Dung, 2000). Khi sử dụng
Basudin ở nồng độ 3,7mg/l đối với cá chép và cá mè vinh và 3,5mg/l đối với cá
rô phi thì tỉ lệ huyết cầu đều tăng so với đối chứng được thí nghiệm trong bể kính
và bể ximăng tại thời điểm 12 giờ, ngòai ra thể tích hồng cầu trung bình của đối
tượng thí nghiệm đều giảm và tỉ lệ với nồng độ thuốc (Đỗ Thị Thanh Hương,
1998). Theo Murty (1988) lượng hồng cầu và bạch cầu trong máu lươn ở các
nghiệm thức thí nghiệm ảnh hưởng của thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ gia tăng cao
hơn nghiệm thức đối chứng, và mức gia tăng vẫn giữ cao thậm chí khi lươn được
thả trở lại môi trường nước không có thuốc (trích dẫn bởi Đỗ Thị Thanh Hương,
1998). Theo Pimpão et al. (2006) thì khi nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc
Deltamthrin lên huyết học và enzime của cá Ancisstrus multipinis ở cả 2 nồng độ
0,1 và 0,3mg/kg đều tăng hồng cầu và bạch cầu. Theo Đỗ Thị Thanh Hương

7
(1998) khi nghiên cứu ảnh hưởng của Basudin lên huyết học của cá chép, cá rô
phi và mè vinh thì thấy số lượng hồng cầu tăng 1,3 lần ở cá chép, 1,5 lần ở cá
rôphi, 1,6 lần ở cá mè vinh sau khi tiếp xúc với thuốc 12 giờ ở nồng độ LC50 96
giờ. Theo Svobodova et al. (1992) cho rằng số lượng hồng cầu và Hemoglobin
của cá chép tăng có ý nghĩa thống kê so với đối chứng khi tiếp xúc với thuốc trừ
sâu có gốc lân hữu cơ, trong khi đó tỉ lệ huyết cầu thì ngược lại (trích dẫn bởi Đỗ
Thị Thanh Hương, 1998). Tổng số lượng hồng cầu, hemoglobin và tỉ lệ huyết sắc
tố của cá Heteropneustes fossilis bị giảm xuống, trong khi đó số lượng bạch cầu
tăng lên và làm chậm quá trình đông máu sau khi cá nhiễm MG (Srivastava et
al., 1996). Nguyễn Thanh Phương và Đỗ Thị Thanh Hương (1997) nghiên cứu
sự thay đổi sinh lý bên ngoài của cá rô phi (Oreochromis niloticus) giống thì
thấy khi đưa thuốc Methyl parathion (MP) vào các bể thí nghiệm thì lô có nồng
độ cao nhất (17 và 24 ppm) cá dần dần bất động và chìm xuống đáy bể sau 2 giờ
tiếp xúc với thuốc. Nghiên cứu của Vosyliense et al. (2003) về ảnh hưởng của

NH
3
lên máu cá hồi (Oncorhynchus mykiss) trương thành trong thời gian 14 ngày
ở các nồng độ 0,09; 0,04; 0,024; 0,012 ppm. Kết quả cho thấy hàm lượng
hemoglobin và số lượng hồng cầu trong máu giảm có ý nghĩa (P<0,05) đồng thời
gia tăng đáng kể các tế bào hồng cầu bị tổn thương. Hồ Thị Thanh Tuyến (2008)
khảo sát sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của cá tra nuôi ở 2 mật độ
khác nhau khi sử dụng kháng sinh Enrofloxacine. Kết quả cho thấy số lượng
bạch cầu và hồng cầu tăng sau khi cho an kháng sinh 7 ngày.
2.4 Tổng quan tình hình bệnh, sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng
thủy sản
2.4.1 Tình hình bệnh cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long
Trong vài năm trở lại đây, phong trào nuôi cá tra xuất khẩu ở ĐBSCL tăng
rất nhanh, đem về cho đất nước một nguồn ngoại tệ rất lớn. Thế nhưng, do phát
triển quá nhanh không theo quy hoạch nên bệnh trên cá tra nuôi hiện nay xảy ra
ngày càng nhiều nhưng việc điều trị lại kém hiệu quả đang là vấn đề quan tâm
hàng đầu của người nuôi cá và cả các nhà chuyên môn. Hàng năm các nguồn
chất thải do nuôi trồng thủy sản ở khu vực ĐBSCL thải ra chưa được xử lý triệt
để vào sông rạch trong khu vực là rất lớn làm mất cân bằng sinh thái trong nuôi
trồng thủy sản mà thể hiện rõ nét ở tình trạng dịch bệnh phát sinh trên diện rộng
do ô nhiễm môi trường đối với đối tượng nuôi này tăng nhanh gây tổn thất kinh
tế trong nghề nuôi cao. Theo Bùi Quang Tề (2001) và Nguyễn Thị Phương Nga
(2004) dịch bệnh trong nghề nuôi cá tra hiện nay xảy ra quanh năm nhưng cao

8
nặng nhất là trong giai đọan giao mùa, thời tiết, nhiệt độ thay đổi đột ngột và vào
mùa mưa, mùa nước đổ. Trên cá Tra bè bệnh do vi khuẩn chủ yếu do
Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila, Pseudomnas sp. và
Flavobacterium columnaris (Nguyễn Quốc Thịnh, 2006). Trên cá Tra nuôi ao,
khảo sát của Truong Thi Ho et al. (2008) cho thấy E. ictaluri hiện diện 87,9%

trong số 58mẫu phân lập từ 65 mẫu cá bệnh, A. hydrophila là 3,03% trong 2 mẫu
phân lập và 9,07% trong 6 mẫu phân lập là thuộc các vi khuẩn khác. Nguyễn
Chính (2005) khảo sát các hộ nuôi cá tra ao ở An Giang và Cần Thơ bệnh xuất
huyết dưới da xuất hiện ở 100% hộ điều tra, bệnh xuất huyết ở gốc vây, hốc mắt
chiếm 29%, bệnh xuất huyết đường ruột chiếm 12%. Bệnh xuất huyết dưới da
xảy ra nhiều nhất là thời điểm giao mùa và người dân cho rằng nếu không điều
trị kịp thời cá thương phẩm có thể chết 30%. Tại Trà Vinh, Châu Hồng Thúy
(2008) báo cáo tỷ lệ cá Tra nhiễm bệnh xuất rất cao chiếm 85,4%, thấp hơn bệnh
mủ gan (96%) nhưng lớn hơn rất nhiều so với bệnh trắng gan trắng mang
(28,2%), bệnh phù đầu (18,8%) và bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ (4,2%). Theo nghiên cứu
của Lê Thanh Hùng và ctv. (2000), Từ Thanh Dung (2003) hiện tượng chết hàng
loạt trong quá trình ương cá Tra bột có liên quan tới việc cá bị sốc, cá cắn và ăn
lẫn nhau tạo điều kiện cho vi khuẩn A. hydrophila tấn công và làm chết cá.
Một số nghiên cứu về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.
E. ictaluri là vi khuẩn kị khí không bắt buộc, hình que, Gram âm, kích thước
biến đổi, không di động, lên men, không bị oxi hóa, phân bố rộng (Từ Thanh
Dung và ctv, 2004). Các chỉ tiêu sinh hóa của E. ictaluri đều âm tính, riêng
lysine và glocose cho phản ứng dương tính (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Theo
thí nghiệm của Newton et al. (1989), cá nheo (channel catfish) được ngâm trong
dung dịch có lượng ki khuẩn 5×10
8
cfu/ml có 93% cá nheo bị nhiễm bệnh.
Plumb and Hilge

(2007)

xác định LD
50
của E. ictaluri trong thí nghiệm với cá da
trơn Châu Âu là 5,6×106 và LD

50
của E. ictaluri trong thí nghiệm cảm nhiễm với
cá nheo (Ictalurus punctatus) là 10
4
. Lương Trần Thục Đoan (2006) khi gây cảm
nhiễm bằng phương pháp tiêm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra ở nhiệt độ 26
0
C –
28
0
C đưa ra kết luận mật độ vi khuẩn 1×10
6
cfu/ml và 1×10
5
cfu/ml có độc lực
đủ mạnh để gây chết cá. Hùynh Chí Thanh (2007) cho biết LD
50
là 3,16×106
cfu/ml khi tiến hành phân lập vi khuẩn ở ngòai tự nhiên (cá tra bệnh mủ gan ở
An Giang). Vi khuẩn E. ictaluri đã được phân lập trên cá trê sông nâu (Ictalurus
nebulosus) và vi khuẩn này cũng được phát hiện trên cá nheo Mỹ (channel
catfish) (Hawke, 1979). Ngòai ra Crumlish (2001) và Bùi Quang Tề (2003) vi

9
khuẩn này cũng được phân lập trên cá tra nuôi (Pangasius hypophthalmus) (trích
dẫn của Bùi Quang Tề, 2005). Rahman and Kawai (2000) thí nghiệm gây cảm
nhiễm Aeromonas hydrophila cá vàng bằng 4 cách gây cảm nhiễm là tiêm ở
bụng (3×10
8
- 3×10

4
cfu/ml), ở cơ (8×10
8
– 8×10
4
cfu/ml), ở da (8,5×10
8
–
8,5×10
4
cfu/ml) và ngâm cá trong vi khuẩn (4,6×10
8
– 4,6×10
4
cfu/ml). So sánh
kết quả cho thấy tiêm dưới da có biểu hiện độc lực cao nhất với LD50 là 10
6,4

cfu/ml.
2.4.2 Tình hình sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản
Việc sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản rất khó kiểm sóat.
Theo Nguyễn Xuân Lý và Nguyễn Chu Hồi (2003) trong ao nuôi thủy sản đều có
sử dụng thuốc và hóa chất. Theo Nguyễn Thị Phương Nga (2004) trong 40 lọai
hóa chất được sử dụng trong mô hình nuôi thâm canh và bán thâm canh chủ yếu
với mục đích diệt tạp và xử lý nước và kháng sinh được người nuôi sử dụng
trong quá trình nuôi thường ở dạng kháng sinh đơn lẻ chủ yếu. Cách sử dụng
thuốc thì chủ yếu người nuôi dựa vào kinh nghiệm và tự pha trộn. Theo trích dẫn
của Hồ Thị Thanh Tuyền (2008) người nuôi dùng thuốc theo chỉ dẫn của người
bán hoặc theo nhãn thuốc (64%), theo kinh nghiệm bản thân (59%), rất ít người
theo chỉ dẫn của cán bộ khuyến ngư (3%). Mặt khác người nuôi biết rõ về danh

mục các lọai thuốc cấm nhưng một số người vẫn còn sử dụng mà chưa hiểu rõ về
các nguy cơ của việc sử dụng thuốc, hóa chất trong phòng trị bệnh cá (Nguyễn
Chính, 2005).
Theo kết quả kiểm sóat dư lượng các chất độc hại trong sản phẩm thủy sản
nuôi tháng 12/2007 của Bộ Thủy sản cập nhật ngày 29/1/2008 tại Cao Lãnh -
Đồng Tháp phát hiện một mẫu cá tra nhiễm Chloramphenicol (0,43 ppb), phát
hiện dư lượng kháng sinh hạn chế sử dụng thuộc nhóm Fluoroquinolones trong
05 mẫu cá tra, trong đó có 04 mẫu nhiễm Enrofloxacin/Ciprofloxacin (03 mẫu tại
Châu Đốc, Long Xuyên, Chợ Mới – An Giang; 01 mẫu tại Thốt Nốt, Cần Thơ,
giá trị phát hiện từ 2,33 – 70,7 ppb) và 01 mẫu nhiễm Sarafloxacin (tại Thốt Nốt-
Cần Thơ với mức phát hiện là 10,1 ppb) nhưng đều ở dưới mức giới hạn tối đa
cho phép. Theo báo cáo 05 mẫu cá tra có dư lượng flofeniclo (tại Châu Đốc- An
Giang; Thốt Nốt, Ô Môn-Cần Thơ, Phụng Hiệp-Hậu Giang, Tx. Vĩnh Long-Vĩnh
Long, mỗi địa phương 01 mẫu) nhưng đều thấp hơn nhiều so với mức giới hạn
tối đa cho phép (giá trị phát hiện từ 0,2 đến 210,69 ppb). Tại Đồng Tháp,
Nguyễn Quốc Thịnh (2006) nhận thấy rằng, có 48 loại thuốc kháng sinh trị bệnh
thì Encrofloxacine chiếm 83,3% và Encrofloxacine chiếm 69,6%. Châu Hồng

10
Thúy (2008) trên cá Tra nuôi thì kháng sinh cấm sử dụng có thành phần
Norfloxacine, Enrofloxacine vẫn có người nuôi cá sử dụng với quan niệm kháng
sinh trên vẫn được sử dụng khi cá còn nhỏ.
2.5 Tổng quan thuốc trừ sâu Cyrus (chứa hoạt chất cypermethrin)
2.5.1 Cypermethrin:
Đại cương về Cypermethrin:

Hình 2.7: Cấu tạo Cypermethrin
(Nguồn:
Công thức Cypermethrin: C
22

H
19
Cl
2
NO
3

Khối lượng phân tử: 416.30 g/mol
Tên hóa học: Cyclopropanecarboxylic acid, 3-(2,2-dichloroethenyl)-2,2-
dimethyl-, cyano(3-phenoxyphenyl)methyl ester
Tên thương mại: bao gồm Ammo, Arrivo, Barricade, Basathrin, CCN52,
Cymbush, Cymperator, Cynoff, Cypercopal, Cyperguard 25EC, Cyperhard Tech,
Cyperkill, Cypermar, Demon, Flectron, Fligene CI, Folcord, Kafil Super, NRDC
149, Polytrin, PP 383, Ripcord, Siperin, Stockade, Super, Cyrux 25EC
Một vài tính chất của Cyrux 25EC:
Cyrux 25EC (Cypermethrin 25%, Phụ gia 75%) là thuốc trừ sâu thế hệ mới,
thuộc nhóm Cúc tổng hợp, có tính tiếp xúc và vị độc, diệt trừ nhiều loại sâu gây
hại như: cắn phá, chích hút, đục hoa, đục quả. Cypermethrin có dạng nhũ dầu (ở
60
0
C chuyển thành dạng dung dịch lỏng), hầu như không tan trong nước, tan
nhiều trong dung môi hữu cơ, tương đối bền trong môi trường trung tính và acid
nhẹ, thủy phân trong môi trường kiềm, quang giải yếu. Cypermethrin là một hợp
chất tổng hợp, chủ yếu được sử dụng như một loại thuốc trừ sâu để kiểm soát
nhiều loại sâu bệnh (Casida, 1980). Cypermethrin là loại thuốc trừ sâu thuộc
nhóm độc II và chỉ có tính độc trung bình đối với động vật máu nóng nhưng lại
có độc tính cao đối với cá, ong và các lòai côn trùng.
Một số nghiên cứu về Cypermethrin:

11

Cypermethrin thực tế không gây độc cho loài chim (Yilmaz, 2005).
Cypermethrin hòa tan trong nước rất thấp từ 5-10 µg/L (Stephenson, 1982) trích
dẫn bởi Suchismita Saha (2008). Bradbury and Coats (1989) đã báo cáo độc tính
của pyrethroid đối với những động vật hữu nhũ, các loài chim, cá và đưa ra giá
trị LC
50
-96h của cypermethrin là 2,2µg/L trên cá Tilapia nilotica, 0,9 – 1,1 µg/L
trên cá chép (Cyprinus carpio), 1,2 µg/L trên cá brown trout (Salmo trutta), 0,5
µg/L trên cá rainbow trout (Salmo gairdneri) và 0,4 µg/L trên cá Scardinius
erthropthalmus. Theo Polat et al. (2002) đã tìm giá trị LC
50
-48h của beta-
cypermethrin trên nhóm guppies 21,4 µg/L. Theo Stephenson (1983) đã cho kết
quả nghiên cứu LC
50
của cypermethrin trên cá loài cá như: 2,8 µg/L trên cá
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), 1,2 µg/L trên cá fathead minnow và 0,93
µg/L trên Pimephales promelas. Trên nghiên cứu khác của Stephenson (1982)
cũng nghiên cứu ảnh hưởng của cypermethrin trên một số lòai cá như Cyprinus
carpio, Scardinius erythrophthalmus, Salmo gairdneri, Salmo trutta và Tilapia
nilotica và tìm ra giá trị LC
50
ở khỏang giữa 0,4 – 2,2 µg/L.
Theo Suchismita Saha (2008) đã tìm được giá trị LC
50
96h của cypermethrin
từ 0,03 µg/L trên giáp xác đến 9,0 µg/L trên nòng nọc. Là loại thuốc trừ sâu có
tác dụng độc lên một số chỉ tiêu sinh hóa của cá đã được báo cáo (Oluah et
al,2001; Omoregie et al, 1990). Ở Việt Nam, cypermethrin là loại thuốc trừ sâu
phổ biến do đó có khả năng rằng nó có thể làm ô nhiễm nguồn nước trong lĩnh

vực ứng dụng. Ngoài ra, đôi khi thuốc trừ sâu được sử dụng để kiểm sóat bệnh
cá, hiện nay, (pyrethroid tổng hợp) cypermethrin với liều rất thấp đang được sử
dụng rộng rãi để kiểm soát bệnh argulus và tiêu diệt ấu trùng các loài cá tạp
trong quá trình cải tạo ao.




12
CHƯƠNG 3:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Cá tra giống có kích cỡ từ 25-30g được mua từ trại sản xuất giống hay ương
cá tại Cần thơ. Cá mua về sẽ được thuần dưỡng trong bể có thể tích 2-3 m
3
ít
nhất 7 ngày cho cá ổn định và quen với điều kiện sống trong bể trước khi bố trí
thí nghiệm. Cá được cho ăn 2 lần/ngày bằng thức ăn Cargill. Cá chọn thí nghiệm
có kích cỡ đồng điều, khỏe và hoạt động mạnh.
3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm
Xô nhựa, cân tiểu li, thước đo chiều dài,dụng cụ tiểu phẩu, kính hiển vi quang
học, buồng đếm hồng cầu Naubauer, hay nhuộm mẫu, pipet, ống đong, máy li
tâm, máy so màu quang phổ, dụng cụ, thiết bị thí nghiệm được dùng tại phòng
thí nghiệm Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.3 Hóa chất
Thuốc trừ sâu trong thí nghiệm: Cyrus 25EC (hoạt chất cypermethrin) là thuốc
trừ sâu thuộc gốc cúc tổng hợp và có nồng độ hoạt chất là 250 g/L. Cyrus 25EC
do Công ty CP BVTV An Giang sản xuất.

Phương pháp pha nồng độ thuốc: thuốc được pha thành 2 bước, bước 1 pha
dung dịch thuốc mẹ từ thuốc ban đầu và bước 2 là pha nồng độ thuốc cho các bể
thí nghiệm. Cả 2 dung dịch pha (dung dịch mẹ và dung dịch thí nghiệm) đều dựa
vào công thức tính nồng độ sau: C
1
xV
1
= C
2
xV
2
Trong đó:
C
1
là nồng độ thuốc dung dịch mẹ
V
1
là thể tích dung dịch mẹ cần cho vào bể thí nghiệm
C
2
là nồng độ thuốc cần cho thí nghiệm
V
2
là thể tích dung dịch thuốc trong thí nghiệm
Hóa chất phân tích mẫu:
Dung dịch nhuộm hồng cầu: Dung dịch Natt-Herrick

13
Dung dịch nhuộm bạch cầu: Dung dịch Methanol 100%, Wright, Giemsa, dung
dịch pH 6,2; pH 6,8; nước cất, nước muối sinh lí.

3.1.4 Vi khuẩn
Nguồn vi khuẩn thuần chủng CT258 trữ trong tủ -80
0
C của Bộ môn Sinh
học và Bệnh thủy sản, Khoa thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.
Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn:
Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường TSA ở 28
0
C. Sau 24-48h quan sát
hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm Gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn.
Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm:
Nuôi tăng sinh vi khuẩn: sau khi có được đĩa vi khuẩn thuần, dùng que cấy
tiệt trùng lấy khỏang 2-3 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30ml NB đã tiệt
trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24h. Sau 24h chuyển vi khuẩn sang
ống falcol 50ml tiệt trùng, đem li tâm 4000 vòng/phút ở 4
0
C trong 15 phút. Sau
khi li tâm lọai bỏ dung dịch phía trên và dùng nước muối sinh lí tiệt trùng để rửa
vi khuẩn (2-3 lần). Lần li tâm cuối cùng, lọai bỏ phần dung dịch phía trên và cho
vào khỏang 25ml dung dịch nước muối sinh lí tiệt trùng, sau đó trộn đều mẫu
bằng máy vortex.
Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn được xác định bằng máy so màu quang phổ
với bước sóng 610nm (OD= 1 ± 0,1≈10
9
cfu/ml) sau đó dung dịch vi khuẩn được
pha loãng 10 lần (1ml dung dịch vi khuẩn 10
9
cfu/ml + 9ml nước muối sinh lý)
để lần lược được các mật độ 10
8

, 10
7
, 10
6
, 10
5
, 10
4
, 10
3
, 10
2
cfu/ml. Mật độ vi
khuẩn cũng được xác định bằng cách nhỏ 20µl (lặp lại 6 lần) dung dịch vi khuẩn
đã điều chỉnh mật độ lên đĩa TSA và ủ ở 28-30
o
C rồi đếm số khuẩn lạc trung
bình sau 24-48 giờ.
3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm:
3.2.2 Thí Nghiệm 1: Xác định LC
50
của Cypermerthrin
Xác định LC
50
của Cypermerthrin :
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp nước tĩnh (APHA, 2001) và không
thay nước trong thời gian 96 giờ. Thí nghiệm được tiến hành qua hai bước.
Bước 1: Thí nghiệm xác định khoảng gây độc (thí nghiệm thăm dò)
Thí nghiệm sẽ được tiến hành trong bể kính 60 L có thể tích nước là 50 lít.
Mỗi bể thả 10 cá với kích cỡ là 20- 25 g/con. Thí nghiệm được tiến hành với 8

mức nồng độ gồm 0,01; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25 và 0,3 mg/L. Cá cho vào bể và

14
không cho ăn 2 ngày trước khi thí nghiệm để tránh phân cá làm ảnh hưởng đến
thí nghiệm. Nước được cho vào bể nhựa lót nilon 60L chứa 50L nước và sục khí
liên tục trong 1-2 ngày để khử chlor trước khi thí nghiệm.
Trong thời gian thí nghiệm, bể được sục khí nhẹ nhằm đảm bảo đủ oxy cho
cá. Cá chết được ghi nhận vào các khoảng thời gian sau thí nghiệm như 6, 9, 12,
24, 48 và 96 giờ. Khi xuất hiện cá chết sẽ được loại ra khỏi bể thí nghiệm để hạn
chế ảnh hưởng đến chất lượng nước.
Thí nghiệm nhằm xác định nồng độ cao nhất gây chết không quá 10% cá sau
96 giờ và nồng độ thấp nhất gây chết khoảng 90% cá sau 1-2 giờ. Khoảng nồng
độ này cơ sở cho bố trí thí nghiệm xác định LC
50
.
Bước 2: Thí nghiệm xác định giá trị LC
50

Thí nghiệm này được dựa vào kết quả của thí nghiệm xác định khỏang gây
chết. Trong giới hạn nồng độ thuốc gây chết sẽ được chia thành 6 mức nồng độ
và 1 đối chứng. Các nghiệm thức được bố trì hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lập
lại cho mỗi nghiệm thức. Thí nghiệm được bố trí trong bể kính hình chữ nhật
chứa 50 L dung dịch. Mỗi bể thả 10 cá, cá được thả vào bể 2-3 ngày trước khi
cho thuốc vào. Trước khi cho thuốc cần vệ sinh sạch bể, trong thời gian thí
nghiệm các bể được sục khí nhẹ và liên tục và không thay nước.
Theo dõi và ghi nhận số cá chết sau 3, 6, 9, 12, 24, 48, 72 và 96 giờ sau thí
nghiệm. Khi phát hiện cá chết sẽ được loại ra khỏi bể thí nghiệm để hạn chế ảnh
hưởng đến kết quả thí nghiệm.
Giá trị LC50 được xác định dựa vào phương pháp Probit (Finey, 1971).
3.2.3 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của vi khuẩn E. ictaluri lên một số chỉ tiêu

huyết học của cá tra giống
Thí nghiệm xác định LD
50
: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6
nghiệm thức và nghiệm thức đối chứng không tiêm, mỗi nghiệm thức lặp lại 3
lần với mật độ 10 con/bể. Cá thí nghiệm được tiêm (0,1ml vi khuẩn/cá) tại gốc vi
ngực. mật độ vi khuẩn E. ictaluri tiêm cho cá thí nghiệm được trình bày như
sau :
Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục trong 14 ngày. Những cá có
dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt được thu để giải phẩu quan sát dấu hiệu
bệnh mủ gan và tái phân lập vi khuẩn từ gan, thận tỳ tạng. Nồng độ vi khuẩn gây
chết 50% cá thí nghiệm (LD
50
) được xác định theo công thức của Reed and
Muench (1938) :
LogLD
50
= LogA +(50%-d%)/(%t-%d)xLog10