Định lượng kaempferol và quercetin trong nước tiểu người pptx

TÓM TẮT
Một phương pháp được phát triển để định lượng các flavonoids
quercetin và kaempferol trong nước tiểu người sử dụng chiết pha rắn
theo sắc ký khí. Chất nội chuẩn có dơteri của chất đang phân tích được
thêm vào trong các mẫu trước khi chiết. Giới hạn phát hiện của phương
pháp khoảng: 10 pg trên cột và độ chính xác của phương pháp định
lượng trong mỗi mẫu nước tiểu là ±9,4% với kaempferol và ± 7,34%
với quercetin. Các mẫu nước tiểu được xử lý với β-glucuronidase tăng rõ rệt
mức độ của flavonoid được phát hiện, củng cố thêm quan điểm rằng
kaempferol và quercetin là bài tiết trong nước tiểu như các glucuronide.
1
NỘI DUNG
I. GIỚI THIỆU
Flavonoids là một nhóm lớn của polyphenols tự nhiên với một phạm
vi dược tính rộng [1]. Ví dụ, có khẳng định cho rằng khẩu phần ăn giàu
flavonoid tỉ lệ nghịch với nguy cơ mắc bệnh tim mạch vành [2] và đặc tính
không bị oxy hóa của một số flavonoid có thể bảo vệ chống lại các loại bệnh
ung thư nhất định [3, 4]. Quercetin và kaempferol là flavonoid phổ biến
trong thực phẩm và được đặc biệt quan tâm như chất chống oxy hóa, do
chúng có một nhóm 3-hydroxyl với khả năng oxy hóa tương đối thấp, mà
khi bị oxy hóa vẫn không thay đổi, do vậy tránh được sự lặp lại của sự oxy
hóa – khử [5].
Khi một hàm lượng đáng kể của các flavonoid được tiêu thụ hằng
ngày trong khẩu phần ăn phương Tây, một số nghiên cứu dựa trên sự hấp
phụ, chuyển hóa và bài tiết của các lớp hợp chất trong cơ thể người. Nghiên
cứu sự hấp phụ của flavoniod có sự mâu thuẫn và các tranh luận quanh vấn
đề chúng hấp thụ như các aglycone hay glycosides mặc dù một nghiên cứu
gần đây đã có khả năng chứng minh được các glycoside flavonoid như các
cấu tử bình thường của huyết tương người [6]. Sự chuyển hóa của các
flavonoid theo cơ chế hấp phụ có thể có một ảnh hưởng lớn trên các đặc tính
sinh học của chúng, và gần đây [7], một nghiên cứu đã đồng ý rằng sự

chuyển hóa của kaempferol và quercetin trong con người có thể khác so với
quan sát trong ống nghiệm sử dụng vi lạp thể gan chuột, nơi mà kaempferol
được chuyển hóa thành quercetin bởi phản ứng hydro hóa của vòng B nhưng
các nghiên cứu giống nhau đều không phát hiện được quercetin trong mẫu
nước tiểu. Điều này đã khẳng định rằng sự hydro hóa của kaempferol thành
quercein có thể không xuất hiện trong cơ thể người.
Một phương pháp bán định lượng để đánh giá flavonoid trong nước
tiểu người theo chế độ ăn uống có thuốc Ginkgo bilabo được phát triển gần
đây trong phòng thí nghiệm của chúng tôi [8]. Nghiên cứu gần đây mô tả
một phương pháp nâng cao để định lượng kaempferol và quercetin trong
nước tiểu người cả trước và sau khi dùng thuốc Ginkgo bilabo sử dụng dẫn
xuất có chứa Dơteri của các hợp chất này như chất nội chuẩn và dùng
phương pháp chiết pha rắn để điều chế mẫu.
2
II. THÍ NGHIỆM
2.1. Hóa chất
Hóa chất được chuẩn bị từ các nguồn sau: kaempferol, quercetin,
sulphat (EC 3.1.6.1), β-glucuronidase (EC 3.2.1.31), KH
2
PO
4
, CH
3
COOH,
CH
3
COONa, Na
2
SO
4

khan, C
2
D
4
O
2
(98% Dơteri), DCl (99,5% Dơteri),
C
2
H
6
O (99,5% Dơteri), trifluoroacetic acid (TFA), và dung dịch Dơteri
(99,9% Dơteri) từ Sigma – Aldrich Chemical Co. (Poole, Dorset, UK).
HPLC sử dụng methanol và acetolnitrile từ BDH – Merck (Poole, Dorset,
UK). N-O-(bis)trimetylsilyl acetamide (BSA) từ Fluka Chemical Co. (Poole,
Dorset, UK). Tổng hàm lượng quy định của thuốc Ginkgo biloba là 28,8 mg
flavonoid glycosides và được mua từ Boots (Glasgow, UK).
2.2. Điều chế chất nội chuẩn có Dơteri
Dẫn xuất Dơteri của kaempferol ([
2
H
4
] – kaempferol) và quercetin
([
2
H
5
] – quercetin) được điều chế như sau: 10 mg của quercetin hoặc
kaempferol được hòa tan trong hỗn hợp của 4 ml CH
3

COO
2
H và 4 ml của
dung dịch 1:4 (v/v) của
2
HCl (37% w/w) trong D
2
O. Dung dịch được đun
nóng trong ống nghiệm ở 80
0
C trong 4 ngày. Hỗn hợp phản ứng đã làm
nguội được làm bay hơi dưới điều kiện áp suất thấp bởi một hàm lượng nhỏ
C
2
H
5
O
2
H (3x1 ml). Chất bã (khoảng 8 mg) được chiết với ethyl acetate (2x4
ml); dịch trích ly hỗn hợp hữu cơ được sấy khô khi đi qua một ống pipette
Pasteur với Na
2
SO
4
khan (khoảng 2g) và dung môi bay hơi dưới dòng N
2
.
Thành phần đồng vị của dẫn xuất dơteri kaempferol và quercetin được đánh
giá bởi NICI GC-MS với TMS dùng để kiểm tra ion được chọn. Bảng 1 chỉ
ra các peak đồng vị cho cả chất nội chuẩn và flavonoid không có dơteri. Đối

với trường hợp của quercetin, sự có mặt của năm nguyên tử Si trong cấu trúc
và số lượng lớn carbon M+1 và M+2 là nhiều.
2.3. Phân tích GC – MS
Hệ thống HP5988A GC-MS được sử dụng trong phương pháp ion hóa
ion âm (NICI) với methane như chất khí phản ứng được đưa vào để cung
cấp một nguồn ion tại áp suất 133,3 Pa. Sắc ký khí được gắn với một cột
mao quản Restek RTX – 5 (30 m, 0.32 mm I.D., 0.5 μm) với Heli như một
chất khí mang tại 68,9 Kpa. Nhiệt độ buồng bơm mẫu được điều chỉnh tại
250
0
C và dòng di chuyển GC-MS tại 280
0
C. Bộ phận điều nhiệt có chương
trình điều khiển nhiệt độ như sau: 160
0
C (1 phút), sau đó tại 20
0
C phút
-1
là
290
0
C, và 320
0
C tại 5
0
C phút
-1
.
Ion được chọn sau khi đã kiểm tra được sử dụng cho định lượng.

Kiểm tra các ion này như sau: m/z 662 và 574 (tương ứng với TMS từ dẫn
xuất quercetin và kaempferol), m/z 577 và 578 (tương ứng với dẫn xuất của
3
kaempferol có doteri) , m/z 666 và 667 (tương ứng với dẫn xuất quercetin có
doteri), nhìn hình 1.
2.4. Sự thu thập và điều chế các mẫu nước tiểu
Các mẫu nước tiểu được thu thập từ năm người tình nguyện không có
chế độ ăn kiêng, 6 giờ trước và sau khi uống một viên thuốc Ginkgo biloba.
Các mẫu nước tiểu được giữ trong tủ lạnh (tại -20
0
C). Trước khi phân tích,
dung dich nước tiểu được quay ly tâm (10000 vòng, 5 phút) và lớp trên bề
mặt được đem phân tích. Sự thủy phân enzym với sulfat được thực hiện với
việc đưa trong 1 ml nước tiểu gồm 10 đơn vị sulfat trong 0,25 ml dung dịch
đệm CH
3
COONa 1M (pH =5), mẫu được bảo quản trong 1 giờ tại 37
0
C. Sự
thủy phân với glucuronidase được thực hiện bởi 100 đơn vị glucuronidase
trong 0,25 ml dung dịch đệm K
2
PO
4
(pH=6,8) được đưa vào trong 1 ml nước
tiểu và bảo quản 1 giờ tại 37
0
C. Các mẫu glucuronidase đã xử lý được acid
hóa với 1 ml HCl 1M trước khi đem chiết pha rắn (SPE). Sự thủy phân acid
được thực hiện 0,5 ml HCl 3M được đưa vào trong 1 ml nước tiểu và được

đun nóng ở 80
0
C trong 1 giờ. Các mẫu này được đệm pH=6,8 trước khi chiết
pha rắn bởi đưa vào mẫu 1 ml dung dịch đệm phosphate 1M. Các mẫu
không thủy phân được điều chế cho chiết pha rắn bởi sự thêm vào 0,25 ml
dung dịch đệm CH
3
COONa 1M (pH=5) trong 1 ml dung dịch nước tiểu.
Chất nội chuẩn chứa dơteri (200 ng) được đưa vào trong tất cả các mẫu
trước khi chiết pha rắn.
4
2.5. Chiết pha rắn
Hộp ISOLUTE ENV
+
(100 mg ml
-1
) ( Craw ford Scientific,
Strathaven) được điều ẩm bằng cách nhỏ giọt liện tục 1 ml của methanol và
0,8 ml nước với một tốc độ dòng chảy khoảng 4 ml phút
-1
. Hộp đựng các
mẫu sau khi phân tích được làm sạch bởi không khí và sau đó rửa với 1,5 ml
(3 x 0,5 ml) của dung dịch methanol trong nước 7% (được điều chỉnh đến
pH 3,5 với TFA 0,01M) tại tốc độ dòng chảy khoảng 3,5 ml phút
-1
. Cuối
cùng, các hộp đựng mẫu được ngâm 1 ml (2 x 0,5 ml) dung dịch acetonitrile
trong nước (8:2) tại tốc độ dòng chảy khoảng 3,5 ml phút
-1
. các mẫu được

phụt khí làm khô bởi dòng N
2
và chất bã còn lại được tạo dẫn xuất bởi 0,2
ml của BSA, đun nóng các mẫu trong các ống nghiệm có nắp đậy kín tại 70
0
C trong 3 phút. Các dung dịch mẫu (1μl) được nạp vào GC-MS với một ống
bơm Hamilton 10 μl.
2.6. Sự tái sinh thí nghiệm
Để xác định sự tái sinh của kaempferol và quercetin sử dụng phương
pháp chiết pha rắn, 1 ml của nước cất được thêm với 50 ng của cả quercetin
và kaempferol và chiết tương tự như phương pháp chiết pha rắn sử dụng cho
các mẫu nước tiểu. Để xác định sự tái sinh, 200 ng của chất nội chuẩn doteri
được đưa vào trước hoặc sau khi chiết rắn. Sự tái sinh được tính toán bởi sự
so sánh tỉ lệ diện tích peak chứa chất phân tích có dơteri và không dơteri thu
được khi thêm chất nội chuẩn trước và sau chiết rắn.
2.7. Sự hiệu chuẩn và định lượng
Đường cong hiệu chuẩn được chuẩn bị cho quercetin và kaempferol
bởi hỗn hợp có hàm lượng khác nhau (0 – 200 ng) của quercetin hoặc
kaempferol không có dơteri với hàm lượng không đổi (100 ng mỗi chất) và
sau đó tạo dẫn xuất như mô tả trên. Trong các mẫu, tỉ lệ diện tích giữa các
peak của quercetin và kaempferol không có doteri (tương ứng m/z 662 và
574) và có dơteri (tương ứng m/z 666 + m/z 667 và m/z 577 + m/z 578) được
sử dụng cho định lượng (nhìn hình 1) với sự tham khảo từ các đường cong
hiệu chuẩn.
2.8. Phân tích thống kê
Ý nghĩa giữa các nhóm nghiên cứu được kiểm chứng bằng phương
pháp ghép cặp Student’s t-test.
5
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nghiên cứu gần đây mô tả phương pháp GC-MS định lượng

flavonoids trong nước tiểu người sử dụng dẫn xuất dơteri của kaempferol và
quercetin như chất nội chuẩn. Sử dụng chiết pha rắn trước khi phân tích để
cải thiện nghiên cứu trước đó [8]. Sự cải thiện này cho phép định lượng
quercetin và kaempferol tại mức thấp trong các mẫu nước tiểu từ đối tượng
trước khi tiêu thụ thuốc của Gikgo biloba. Vì vậy, nồng độ của kaempferol
và quercetin từ các mẫu này phản ánh sự đóng góp của một chế độ ăn uống
bình thường và không bổ sung.
Hình 1 tương ứng các chất kaempferol và quercetin có doteri. Tất cả
các vị trí proton trong quercetin là kích hoạt để trao đổi với dơteri trong điều
kiện acid và 4 vị trí hoạt hóa trong kaempferol. Từ bảng 1 ta có thể thấy nó
không trao đổi hoàn toàn với các proton do đó, quercetin là hỗn hợp của các
đồng vị
2
H
4
và
2
H
5
, và kaempferol là hỗn hợp của các đồng vị
2
H
3
và
2
H
4
.
Tiềm năng cho nhiễu xạ xuyên âm giữa các hợp chất không dơteri và các
đồng vị dơteri được accessed và được trình bày trong bảng 1. Lượng lớn các

nguyên tử hydro và silicon trong cấu trúc của hợp chất không dơteri trong
các peaks đồng vị M+1 và M+2 có cường độ cao. Tuy nhiên, không có sự
giao thoa đáng kể giữa các ion trong các đồng vị dơteri.
6
Phản ứng của quercetin và kaempferol tuyến tính trên phạm vi tập
trung nghiên cứu. Khả năng lặp lại của phương pháp được đánh giá cho mẫu
xử lý β-glucuronidase được phân tích như 6 ước số riêng biệt và được đưa ra
ở R.S.D ít hơn 10% cho một lượng của kaempferol và quercetin (tương ứng
13.00 ng/ml ± 9.40 % và 4,45 ng /ml ±7.34 %, n = 6)
Chiết pha rắn sử dụng kết hợp C
18
, cation và anion trao đổi có thể sử
dụng để xác định flavonoids trong nước tiểu. Trong nghiên cứu của chúng
tôi, thí nghiệm sơ bộ cho thấy rằng khi sử dụng hộp đựng mẫu C
18
không
cho phép loại bỏ các chất nội sinh khi có chất phân tích. Điều này phù hợp
với kết quả của Ishiiet al., [11], báo cáo của họ sử dụng anion mạnh trao đổi
trong các hộp đựng mẫu cho khai thác naringin và naringenin từ nước tiểu
người thay vì hộp đựng mẫu C
18
, nó không hiệu quả trong việc loại bỏ các
chất ảnh hưởng. Nghiên cứu hiện tại của chúng tôi sử dụng pha polymeric
(hộp đựng Isolute ENV
+
) đưa ra lựa chọn tốt hơn hộp đựng C
18
, mặc dù nó
loại bỏ không hoàn toàn các chất nội sinh. Tuy nhiên, chọn lọc kiểm tra ion
là cơ sở cho độ phân giải của các peak. Việc tái sinh flavomoids sử dụng

phương pháp hiện nay ảnh hưởng bởi nhu cầu di chuyển của các hợp chất
giao thoa. Do đó, sự tái sinh thu được sự tương ứng giữa các chất phân tích
và loại bỏ các chất ảnh hưởng. Tuy nhiên, xét sự tái sinh của phenol cho hộp
đựng C
18
là khoảng 50% (công nghệ HPLC, chứng nhận phân tích) chiết
xuất polyphenol tái sinh thu được là hợp lý và phù hợp với yêu cầu cao hơn
cho pha polymeric ENV
+
so với pha C
18
. Khả năng tái sinh của kaempferol
và quercetin là tương tự (giữa S.D., n = 6) 76.6 ± 10.5 % và 73.0 ± 9.8 %).
Hình 2 và 3 đưa ra lựa chọn ion điển hình cho cùng mẫu nước tiểu
trước và sau khi xử lý với β-glucuronidase. Các vết cho thấy các mẫu không
được xử lý của quercetin và kaempferol ở mức thấp, và kết quả với các peak
nền lớn. Trong tất cả các trường hợp, giải quyết cơ bản cho các peak cần
quan tâm từ các chất ảnh hưởng được cải thiện.
7
8
Hình 4 cho thấy mức độ flavonoids trong mẫu nước tiểu trước và sau
khi tiêu thụ thuốc của Ginkgo biloba. Mức flavonoids trước khi tiêu thụ
thuốc cho tín hiệu thấp hơn các mẫu sau khi tiêu thụ, nhưng lượng
unconjugated của flavonoids lại cao hơn (đặc biệt là quercetin) được phát
hiện so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi [8]. Các mức được tìm thấy
trước khi tiêu thụ thuốc chủ yếu phản ánh từ chế độ ăn uống, sự biến đổi
giữa các cá nhân là được kỳ vọng. Trong thực tế, nghiên cứu gần đây của
Hollman [12] chỉ ra rằng khả năng tích lũy sinh học của quercetin từ một số
loại thực phẩm rất khác nhau, chỉ có một lượng nhỏ được tiêu thụ. Trong
cùng một nghiên cứu, khả năng tích lũy sinh học đạt cực đại là 1.39% của

lượng đã tiêu thụ. Các mẫu xử lý bằng β-glucuronidase cho tín hiệu (P<
0.05) giảm đối với kaempferol và quercetin (hình 4B), cho thấy flavonoids
được bài tiết như glucuronides. Lượng kaempferol và quercetin bài tiết trong
nước tiểu chỉ là một phần nhỏ so với lượng tiêu thụ, điều đó là phù hợp với
kết quả [13]. Trên thực tế, một nghiên cứu gần đây [7] đã sử dụng HPLC và
LC-MS thì không phát hiện quercetin trong acid thủy phân trong nước tiểu
người sau khi tiêu thụ bông cải xanh và có một lượng nhỏ kaempferol. Mặc
dù , sulphatase-xử lý mẫu cho thấy lượng lớn kaempferol và quercetin so với
mẫu không được xử lý, sự khác nhau này là không có ý nghĩa thống kê trên
5 mẫu. Tuy nhiên, 2 trong số các mẫu trước khi uống thuốc cho thấy
quercetin tăng rõ rệt sau khi xử lý sulphatase, điều đó cho thấy sulphatase đã
tham gia quá trình trao đổi chất. Mẫu acid thủy phân (hình 4 B) cho thấy
quercetin có hàm lượng cao đáng kể (P<0.05, n = 5), còn kaempferol thì
không có. Tuy nhiên, điều kiện xử lý mẫu aicd thủy phân không được tối ưu
hóa về thời gian và nồng độ. Hơn thế nữa acid thủy phân sẽ làm mất chất
phân tích khi vòng pyran dễ bị thủy phân dưới các điều kiện khác nhau.
9
Lượng flavonoids được chiết xuất từ Ginkgo biloba chuẩn (e.g.EGb
761) thường được biểu diễn là “ Ginkgo flavone” glycoside. Đo tương quan
tổng hàm lượng của aglycones (quercetin, kaempferol, và isorhamnetin)
được xác định sau khi thủy phân chất trích ly tổng hàm lượng glycoside
flavonoid. Điều này được thực hiện bằng sự chuyển hóa các yếu tố được đưa
vào để tính toán khối lượng phân tử của ester glycoside flavonol coumaroyl.
Haslert [14] chỉ ra rằng chiết xuất Gonkgo biloba chuẩn chứa trung bình
khoảng 0,39% (w/w) của kaempferol và 0,5% (w/w) của quercetin. Điều này
cũng được gọi là làm giàu chiết xuất với khoảng 24 – 27% (w/w) của
glycoside “Ginkgo flavone”. Các thuốc được sử dụng trong nghiên cứu chứa
một hàm lượng 28,8 mg tổng glycoside flavonoid trên mỗi viên, và do đó
ước lượng một hàm lượng của riêng kaempferol là 0,44 mg và quercetin là
0,50 mg như là các aglycones tự do trong mỗi viên thuốc. Kết quả của chúng

tôi phù hợp, vì vậy sự hấp phụ quercetin và kaempferol bằng đường uống là
có thể, như đã chỉ ra trước đây [6].
10
Khi thực hiện cùng nhau, các kết quả đều khẳng định rằng khả năng
tác dụng sinh học của kaempferol và quercetin là thấp, và con đường chính
của sự trao đổi chất là thông qua việc bổ sung các acid glucuronic. Xét
quang phổ của các hoạt tính sinh học được đưa ra bởi flavonoid và chế độ ăn
uống rộng rãi của nó có một nhu cầu cho một sự hiểu biết đầy đủ hơn về sự
hấp phụ, trao đổi chất và bài tiết của nhóm hợp chất này. Uống một viên
thuốc chứa 28 mg flavonoid có một ảnh hưởng rõ rệt trên mức độ cơ sở của
kaempferol và quercetin trong nước tiểu, chỉ ra rằng mức độ cao của các hợp
chất này là không hấp thụ từ một chế độ ăn uống bình thường. Phương pháp
GC – MS hiện đại nên có độ nhạy đủ để cho phép xác định các hợp chất này
trong huyết tương.
11
LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi một học bổng nghiên cứu nước ngoài
(ORS) được cấp từ CVCP (UK).
12
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] E.Middlecton Jr., Int. J. Phamacongn. 34 (1996) 344.
[2] M.G.L. Hertog, E.J.M. Feskens, P.C.H. Hollman, M.B. Katan, D.
Kromhout, Lancet 342 (1993) 1007.
[3] M.G.L. Hertog et al., Arch. Intern. Med. 155 (1995) 381.
[4] S.M. Kuo, Crit. Rev. Oncog. 8 (1) (1997) 47.
[5] H.P. Hendrickson, A.D. Kaufman, C.E. Lunte, J. Pharm.Biomed. Anal.
12 (3) (1994) 325.
[6] C.A. Rice-Evans, N.J. Miller, G. Paganga, Free Radic. Biol. Med. 20
(1996) 933.
[7] S.E. Nielsen, M. Kall, U. Justesen, A. Schou, L.O. Dragsted, Cancer

Lett. 144 (1997) 173.
[8] D.G. Watson, A.R. Pitt, Rapid Commun. Mass Spectrom. 112 (1998)
153.
[9] C. Bannwart, T. Fotsis, R. Heikkinen, H.Adlercreutz, Clin. Chim. Acta
136 (1984) 165.
[10] H. Adlercreutz, T. Fotsis, C. Bannwart, K. Wahala, G. Brunow, T.
Hase, Clin. Chim. Acta 199 (1991) 263.
[11] K. Ishii, T. Furuta, Y. Kasuya, J. Chromatogr. B 704 (1997) 299.
[12] P.C.H. Hollman, J.M.P van Trijp, M.N.C.P Buysman, M.S.v.d. Gaag,
M.J.B. Mengelers, J.H.M. de Vries, M.B. Katan, FEBS Lett. 418 (1997)
152.
[13] P.G. Pietta, C. Gardana, P.L. Mauri, J. Chromatogr. B 693 (1997) 249.
[14] A. Hasler, O. Sticher, J. Chromatogr. 605 (1992) 41.
[15] O. Sticher, A. Hasler, B. Meier, Dtsch. Apoth. Ztg. 131 (1991) 1827.
13