Ảnh hưởng của sự thay đỏi nông độ BA kết hợp với nông độ cổ định NAA lên khả năng nhân nhanh phôi và hình thành PLB từ phôi lan Hỗ Điệp (P amdbilis)

Lời cảm ơn
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các
thầy, cơ, các anh chị, các bạn và gia đình. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Ban giám hiệu trường Đại học Tơn Đức Thắng và các phịng ban đã tạo điều kiện tố t
cho em thực hiện khóa thực tập tốt nghiệp này.
Q Thầy Cơ bộ mơn CNSH trường Đại học Đại Học Tôn Đức Thắng đã truyền đạt cho
em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu.
Thầy, PGS.TS. Dương Tấn Nhựt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến
Thầy, người đã trực tiếp gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn chu đáo, truyền đạt những kinh
nghiệm quý báu, hết lòng giúp em hoàn thành trọn vẹn đề tài này và cũng là người dìu dắt em
trong bước đi đầu tiên để tiếp cận đến với chân trời của khoa học rộng lớn. K hông chỉ là
truyền đạt kiến thức, Thầy còn dạy cho em lối sống, cách làm người. Thầy cũng là một tấm
gương về lòng nhiệt huyết, cống hiến hết mình cho sự nghiệp của khoa học, để chúng em học
hỏi, noi theo.
Em cũng gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn Bá Nam người trực tiếp hướng dẫn,
chỉ bảo tận tình cũng như ln tạo mọi điều kiện cho em trong những ngày đầu tiên thực tập
tại viện và trong śt quá trình tiến hành các thí nghiệm của đề tài.
Ban lãnh đạo Viện Sinh học Tây Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt
thời gian thực hiện luận văn.
Các anh chị trong phòng Sinh học phân tử & Chọn tạo giống cây trồng (viện Sinh học
Tây Nguyên): anh Bình, anh Nam, anh Luận, chị Hiền, chị Thu Ba, chị Phượng, chị Hằng.
Xin cảm ơn các anh chị, các bạn đã hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình làm luận
văn.
Cuối cùng con xin cảm ơn gia đình đã ln ủng hộ và động viên con trong mọi sự lựa
chọn của mình. Đặc biệt là mẹ, người đã luôn tin tưởng, cho con nghị lực và sức mạnh những
khi con gặp khó khăn nhất để vươn lên trong cuộc sống.
Một lần nữa xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người!


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ BA kết hợp với nồng độ cố định NAA lên

khả năng nhân nhanh phơi và hình thành PLB từ phôi lan Hồ Điệp (P. amabilis)
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác nhau lên khả năng tái sinh
chồi từ PLB lan Hồ Điệp (P. ambilis) sau 8 tuần nuôi cấy
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của dịch chiết chuối lên sự sinh trưởng và phát triển của cây con
lan Hồ Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của dịch chiết cà chua lên sự sinh trưởng và phát triển của cây con
lan Hồ Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nước dừa lên sự sinh trưởng và phát triển của cây con lan Hồ
Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của casein hydrolase lên sự sinh trưởng và phát triển của cây con
lan Hồ Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy
Bảng 4.7. So sánh ảnh hưởng của loại dịch chiết khác nhau lên sự sinh trưởng và phát
triển của cây con lan Hồ Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng sống sót của cây con có nguồn gốc từ phơi
vơ tính ở giai đoạn vườn ươm


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Phalaenopsis amabilis
Hình 2.2. Quy trình nhân giống lan Hồ Điệp Phalaenopsis amabilis
Hình 4.1. Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ BA kết hợp với 0,5 mg/l NAA lên khả
năng nhân nhanh phôi và tạo PLB từ phơi lan Hồ Điệp (P. amabilis
Hình 4.2. Ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau lên khả năng tái sinh chồi từ
PLB lan Hồ Điệp (P. ambilis) sau 8 tuần ni cấy
Hình 4.3. Ảnh hưởng của dịch chiết chuối, cà chua lên sự sinh trưởng và phát triển của
cây con lan Hồ Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần ni cấy
Hình 4.4. Ảnh hưởng của nước dừa, casein hydrolase lên sự sinh trưởng và phát triển của
cây con lan Hồ Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần ni cấy
Hình 4.5. Ảnh hưởng của giá thể khác nhau lên khả năng sống sót của cây con có nguồn
gốc từ phơi vơ tính lan Hồ Điệp (P. ambilis) ở giai đoạn vườn ươm

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1. So sánh trọng lượng của mẫu thu được ở nồng độ BA khác nhau
Biểu đồ 4.2. So sánh trọng lượng tươi của mẫu trên các loại môi trường nuôi cấy khác
nhau
Biểu đồ 4.3. So sánh trọng lượng tươi của mẫu trên các loại môi trường nuôi cấy khác
nhau
Biểu đồ 4.4. So sánh ảnh hưởng của loại dịch chiết khác nhau lên sự sinh trưởng và phát
triển của cây con lan Hồ Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy
Biểu đồ 4.5. So sánh ảnh hưởng của các loại giá thể khác nhau lên khả năng sống sót của
cây con có nguồn gốc từ phơi vơ tính ở giai đoạn vườn ươm


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2iP

: N6-(2-isopentyl) adenine

BA

: 6-benzyl aminopurine

NAA

: α-naphthalenacetic acid

IAA

: 3-indol acetic acid

IBA

: 3-indole butyric acid

Kinetin

: 6-furfuryl aminopurine

GA 3

: Gibberellin A 3

ABA

: Abscisic acid

VW

: Vacin-Went (1969)

MS

: Murashige và Skoog (1962)

½ MS

: mơi trường MS có hàm lượng khống đa lượng giảm đi một nửa

PLB

: Protocorm like body

PEDC

: Preembryogenic determined cell

IEDC

: Induced embryonic determined cell

EC

: Embryogenic cell (các cụm tế bào phát triển phôi)

NT

: Nghiệm thức


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Lan Hồ Điệp (P.amabilis) là loại lan rất khó nhân giống hiện nay.Các p hương pháp
nhân giống hiện nay như tạo chồi từ việc nuôi cấy phát hoa, tạo PLB từ nuôi cấy mẫu lá,
nhân nhanh PLB qua ni cấy lát cắt ngang của PLB…. có hệ số nhân giốn g không cao
và mất nhiều thời gian vì đây là cây sinh trưởng chậm. Hiện nay, nhân giống lan Hồ Điệp
ở quy mô thương mại đang được rất nhiều nhà sản xuất quan tâm bởi chúng đem lại lợi
nhuận cao cho người trồng. Khó khăn thường gặp nhất trong sản xuất thương mại là trong
thời gian ngắn tạo ra được một số lượng cây giống có chất lượng tốt với mức chi phí thấp
nhất. Thay thế chất điều hòa tăng trưởng bằng các loại dịch chiết hữu cơ làm từ những
ngun liệu rẻ tiền, dể tìm có sẵn trong tự nhiên dồi dào hàm lượn g vitamin, acid amin,

chất điều hòa sinh trưởng là một giải pháp khả thi góp phần tiết kiệm chi phí sản xuất
cũng như hạ giá thành cây giống.
Trong đề tài này chúng tơi nghiên cứu sự nhân nhanh phơi, hình thành PLB từ phôi,
tái sinh chồi từ PLB và ảnh hưởng của dịch chiết hữu cơ khác nhau lên sự sự sinh trưởng
và phát triển của cây con lan Hồ Điệp in vitro.
Môi trường tối ưu nhất cho nhân nhanh phôi và tạo PLB từ phơi là mơi trường MS
có bổ sung 1 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA + 30 g/l đường sucrose + 1 g/l than hoạt tính +
20% nước dừa và điều chỉnh pH về 5,7.
Mơi trường thích hợp cho khả năng tái sinh chồi từ PLB lan Hồ Điệp (P. amabilis) là
môi trường Vacin-Went bổ sung 0.5 mg/l NAA và 2 mg/l BA, 30 g/l đường sucrose + 1
g/l than hoạt tính + 20% nước dừa và điều chỉnh pH về 5,3.
Môi trường Vacin-Went bổ sung 50g/l dịch chiết chuối và 30 g/l đường sucrose + 1
g/l than hoạt tính và điều chỉnh pH về 5,3 là mơi trường phù hợp nhất cho sự sinh trưởng
và phát triển của cây con Hồ Điệp in vitro so với môi trường có bổ sung dịch chiết cịn lại
là cà chua, nước dừa, casein hydrolase và đối chứng.Chất lượng cây con in vitro trong
môi trường bổ sung dịch chiết chuối này tốt nhất trong bốn loại dịch chiết khảo sát.


Giá thể dớn trắng là loại giá thể cho tỉ lệ sống của cây con ở giai đoạn vườn ươm
cao nhất (78,5%) so với 2 loại giá thể còn lại là dớn nâu (71,1 %) và dớn nâu kết hợp với
dớn trắng (75,8 %).
Kết quả này là cơ sở cho những nghiên cứu khác của cây lan Hồ Điệp nuôi cấy in
vitro để đáp ứng cho quy mô sản xuất lớn phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu.


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn
Tóm tắt luận văn
Danh mục chữ viết tắt

Danh mục bảng
Danh mục hình
Danh mục biểu đồ
Mục lục
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................................................... 1
1.2. MỤC ĐÍCH ......................................................................................................................... 2
1.3. YÊU CẦU. ........................................................................................................................... 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. KHÁI QUÁT VI NHÂN GIỐNG

2.1.1. Phương pháp nhân giống truyền thống và các trở ngại ................................... 3
2.1.1.1. Phương pháp nhân giống truyền thống ........................................................... 3
2.1.1.2. Các hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống .............................. 3
2.1.2. Vi nhân giống ........................................................................................................ 3
2.2. VAI TRỊ DỊCH CHIẾT HỮU CƠ ĐỐI VỚI NI CẤY MÔ THỰC VẬT ... 5
2.3. SƠ LƯỢC VỀ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TR
Ư ỞNG VÀ VAI TRÒ CỦA
CHÚNG TRONG VI NHÂN GIỐNG........................................................................... 6
2.3.1. Auxin ...................................................................................................................... 6
2.3.2. Cytokinin ............................................................................................................... 7
2.4. GIỚI THIỆU VỀ CÂY LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis spp.) ............................... 8
2.4.1. Vị trí phân loại thực vật ....................................................................................... 8
2.4.2. Nguồn gốc và phân bố .......................................................................................... 8
2.4.3. Đặc điểm thực vật học .......................................................................................... 9
2.4.3.1. Cơ quan sinh dưỡng .......................................................................................... 9
2.4.3.2. Cơ quan sinh sản ............................................................................................... 10
2.4.4. Giá trị kinh tế của lan Hồ Điệp (P. ambilis) ....................................................... 11
2.5. THUẬT NGỮ ........................................................................................................... 12
2.6. NI CẤY PHƠI VƠ TÍNH.................................................................................. 12

2.6.1. Sự phát sinh phơi từ tế bào sinh dưỡng .............................................................. 12


2.6.1.1. Định nghĩa .......................................................................................................... 12
2.6.1.2. Các giai đoạn sinh phôi từ tế bào sinh dưỡng ................................................. 12
2.6.2. Các giai đoạn trong q trình phát sinh phơi vơ tính ....................................... 14
2.7. NHÂN TỐ TÁC ĐỘNG ĐẾN GIA TĂNG SỐ LƯỢNG PHÔI .......................... 14
2.8. CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA PLB LAN HỒ ĐIỆP (P.amabilis) ....... 15
2.9. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT TÁI SINH TỪ CON ĐƯỜNG HÌNH THÀNH PHƠI
VƠ TÍNH ......................................................................................................................... 15
2.10. THUẦN HĨA VÀ CHĂM SĨC CÂY CON NI CẤY MƠ NGOÀI VƯỜN
ƯƠM ................................................................................................................................ 16
2.10.1. Dụng cụ ................................................................................................................ 16
2.10.2. Giá thể trồng lan ................................................................................................. 17
2.10.3. Yêu cầu giá thể trồng lan ................................................................................... 17
2.10.4. Vườn lan .............................................................................................................. 17
2.10.5. Các bước tiến hành ............................................................................................. 18
2.11. CÁC YÊU CẦU VỀ TRỒNG TRỌT VÀ CHĂM SÓC ..................................... 21

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI ............................................ 23

3.1.1 Địa điểm ................................................................................................................ 23
3.1.2. Thời gian ................................................................................................................ 23
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU................................................................................. 23
3.3.

VẬT LIỆU ........................................................................................................... 23

3.3.1. Nguồn mẫu ban đầu ....................................................................................... ....23

3.3.2. Môi trường .......................................................................................................... 23
3.3.3. Điều kiện nuôi cấy ............................................................................................... 23
3.4. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................................................................... 23
3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ BA kết hợp với
nồng độ cố định NAA lên khả năng nhân nhanh phơi và hình thành PLB từ phôi lan
Hồ Điệp (P. amabilis) ...................................................................................................... 23


3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác

nhau lên khả năng tái sinh chồi từ PLB lan Hồ Điệp (P. ambilis) sau 8 tuần ni cấy
.......................................................................................................................................... 24
3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết chuối lên sự sinh trưởng và
phát triển của cây con lan Hồ Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần ni cấy ........ 25
3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết cà chua lên sự sinh trưởng
và phát triển của cây con lan Hồ Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần ni cấy ... 26
3.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên sự sinh trưởng và phát
triển của cây con lan Hồ Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần ni cấy................. 26
3.4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của casein hydrolase lên sự sinh trưởng và
phát triển của cây con lan Hồ Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần ni cấy ........ 27
3.4.7. Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể lên khả năng sống sót của
cây con có nguồn gốc từ phơi vơ tính ở giai đoạn vườn ươm ..................................... 28
3.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU ..................................................................................................... 28
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ BA kết hợp với
nồng độ cố định NAA lên khả năng nhân nhanh phôi và hình thành PLB t ừ phơi lan
Hồ Điệp (P. amabilis) ...................................................................................................... 29
4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác nhau
lên khả năng tái sinh chồi từ PLB lan Hồ Điệp (P. ambilis) sau 8 tuần ni cấy ..... 32
4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết chuối lên sự sinh trưởng và

phát triển của cây con lan Hồ Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy ........ 35
4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết cà chua lên sự sinh trưởng và
phát triển của cây con lan Hồ Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần ni cấy ........ 36
4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên sự sinh trưởng và phát
triển của cây con lan Hồ Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần ni cấy................. 38
4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của casein hydrolase lên sự sinh trưởng và
phát triển của cây con lan Hồ Điệp (P. amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy........ 40
4.7. Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể lên khả năng sống sót của cây
con có nguồn gốc từ phơi vơ tính ở giai đoạn vườn ươm ............................................ 43
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO


SVTH: Nguyễn Minh Nhật

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiều năm qua, loài lan Hồ Điệp Phalaenopsis amabilis (L.) Blume (họ Lan
Orchidaceae) luôn được xem là loại hoa cắt cành và cây hoa trồng chậu quan trọng.
Nhờ vẻ đẹp sang trọng và quyến rũ mà loài hoa này thường được ưu tiên trang trí trong
những dịp lễ hội trang trọng. Giá trị kinh tế của lan hồ điệp rất lớn nhưng hiện nay nhu
cầu về cây giống vẫn chưa được đáp ứng về chất lượng cũng như số lượng. Với mục
tiêu đưa hoa lan nói chung và lan Hồ Điệp nói riêng trở thành cây chủ lực trong cơ cấu
nơng nghiệp trong những năm tới bên cạnh những yếu tố như phát triển diện tích trồng
hoa, giải pháp về giống, khoa học kỹ thuật, thị trường tiêu thụ thì chất lượng là yếu tố
quan trọng góp phần đạt được mục tiêu đề ra. Tuy nhiên, hiện nay hầu hết giống lan
Việt Nam đều phải nhập từ nước ngoài như từ Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan…
Chính vì vậy, chất lượng giống hoàn toàn phụ thuộc vào may rủi hoặc uy tín trong
quan hệ. Nhiều nhà vườn đã điêu đứng do nhập phải giống kém chất lượng, bị nhiễm
bệnh. Thêm vào đó, các cơ sở nhân giống lan bằng phương pháp cấy mô được thành

lập đều sản xuất với quy mô nhỏ, lượng giống không đủ cung ứng cho người trồng.
Xuất phát từ những thực trạng trên, vấn đề nâng cao chất lượng cây giống cũng như
cung cấp một số lượng lớn cây giống có chất lượng cao cho người trồng là những mục
tiêu hàng đầu cần thực hiện.
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp để nâng cao chất lượng cây giống chẳng hạn
như: khảo sát hàm lượng khoáng, chất điều hịa sinh trưởng... Trong số đó, phương
pháp khảo sát các loại dịch chiết hữu cơ ảnh hưởng lên sinh trưởng, phát triển, chất
lượng của cây mang nhiều ưu điểm nổi bật so với các phương pháp khác.
Lan Hồ Điệp được xem như là lồi hoa khó tính, địi hỏi người trồng hoa phải đáp
ứng được các yêu cầu sinh thái khắt khe và nắm vững qui trình canh tác thì mới có thể
trồng thành cơng được. Giai đoạn chuyển cây con ra vườn ươm có vai trị quan trọng
quyết định đến khả năng thành công. Ở giai đoạn này, cây con có tỷ lệ sống khơng cao
mà một trong những ngun nhân chính đó là chất trồng khơng phù hợp.
Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Khảo sát một số yếu tố môi trường ảnh
hưởng đến sinh trưởng, phát triển và chất lượng cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis

1


SVTH: Nguyễn Minh Nhật

amabilis)” nhằm mục tiêu nâng cao chất lượng cũng như tỉ lệ sống của lan Hồ Điệp ở
giai đoạn vườn ươm.
1.2. MỤC ĐÍCH
- Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ BA kết hợp với nồng độ cố định NAA
lên khả năng nhân nhanh phôi lan Hồ Điệp (P. amabilis).
- Khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác nhau lên khả năng tái sinh
chồi từ PLB lan Hồ Điệp (P. ambilis) sau 8 tuần ni cấy.
- Khảo sát mơi trường khống ảnh hưởng lên khả năng phát sinh PLB và tái sinh chồi
từ phơi vơ tính lan Hồ Điệp(P. amabilis).

- Khảo sát ảnh hưởng của các loại dịch chiết khác nhau lên sự sinh trưởng, phát triển
và chất lượng cây lan Hồ Điệp (P. amabilis).
- Khảo sát ảnh hưởng của giá thể lên khả năng sống sót của cây con có nguồn gốc từ
phơi vơ tính ở giai đoạn vườn ươm.
1.3. YÊU CẦU
+ Xác định được nồng độ BA thích hợp cho q trình nhân nhanh phơi và hình thành
PLB từ phôi lan Hồ Điệp (P. amabilis).
+ Xác định môi trường ni cấy thích hợp cho q trình tái sinh chồi từ PLB lan Hồ
Điệp (P. amabilis).
+ Xác định loại và nồng độ dịch chiết hữu cơ thích hợp lên khả năng sinh trưởng, phát
triển và chất lượng cây lan Hồ Điệp in vitro.
+ Xác định loại giá thể thích hợp cho khả năng sống sót cho cây con có nguồn gốc từ
phơi vơ tính ở giai đoạn vườn ươm.

2


SVTH: Nguyễn Minh Nhật

CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN
2.1. KHÁI QUÁT VỀ VI NHÂN GIỐNG
2.1.1. Phương pháp nhân giống truyền thống và các trở ngại
2.1.1.1. Phương pháp nhân giống truyền thống
Trong phương pháp nhân giống truyền thống, việc nhân giống để trồng mới thường
áp dụng hai kỹ thuật nhân giống: nhân giống hữu tính và nhân giống vơ tính.
+ Nhân giống hữu tính: phương pháp gieo hạt, thu hạt đem gieo trên môi trường đất
hoặc môi trường nhân tạo. Nhân giống bằng phương pháp này đòi h ỏi tốn nhiều thời
gian và phụ thuộc vào mùa vụ. Cây con tạo ra không đồng nhất về mặt di truyền và
khả năng sinh trưởng.
+ Nhân giống vơ tính: trong vườn ươm, người ta tiến hành nhân giống vơ tính bằng

các phương pháp: giâm cành, chiết cành, ghép cành, ghép chồi… nhưng phải mất một
quãng thời gian dài để có thể thu được kết quả. Trong nhiều năm qua, các phương
pháp nhân giống vô tính này đóng một vai trị quan trọng trong ngành trồng trọt và đã
có ý nghĩa to lớn trong nhân giống thực vật: có thể duy trì được các đặc tính có lợi của
cây bố mẹ và đồng thời người ta cũng sử dụng phương pháp nhân giống vơ tính này để
tạo ra ngân hàng gene cây trồng.
2.1.1.2. Các hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống
Mặc dù phương pháp nhân giống vơ tính truyền thống là phương pháp hiệu quả.
Nhưng phương pháp này còn b ị giới hạn bởi nhiều yếu tố như: không ổn định về mặt
di truyền, hệ số nhân giống thấp, tốn công sức và thời gian, khả năng sống sót của cây
con ngồi vườn ươm thấp, tính chống chịu kém, phụ thuộc vào mùa vụ, khó thực hiện,
đơi khi đắt tiền, cây con thường nhiễm một số bệnh từ cây mẹ hoặc nhiễm do các tác
nhân gây bệnh có sẵn trong mơi trường, cũng như không thể cung cấp đủ số lượng lớn
cây giống sạch bệnh trồng theo qui mô công nghiệp trong một khoảng thời gian ngắn.
2.1.2. Vi nhân giống
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô tế bào thực vật đều là thuật ngữ mô tả các
phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa mơi trường xác
định ở điều kiện vơ trùng. Mơi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối
khống, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công Kiên, 2002).
Những kiến thức về nhân giống in vitro ngày càng được củng cố và có những bước
tiến rất lớn. Với phương pháp này người ta có thể nhân giống rất nhiều loại cây từ các
3


SVTH: Nguyễn Minh Nhật

vùng khí hậu khác nhau trên thế giới mà các phương pháp nhân giống vơ tính truyền
thống không thể thực hiện được (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như: lá, thân,
hoa hoặc rễ.

Phương pháp này có những ưu điểm: hệ số nhân giống cao trong thời gian ngắn,
tạo ra các cây con đồng nhất về mặt di truyền, tạo ra các dòng cây sạch bệnh (loại bỏ
virus, vi khuẩn), giúp cây trẻ hóa, ứng dụng trong nghiên cứu về mặt tế bào, chuyển
gene (Dương Công Kiên, 2002).
Trong các hướng nghiên cứu hiện nay của vi nhân giống thì ni cấy mơ sẹo đóng
vai trị rất quan trọng vì một số loại cây việc cảm ứng phát sinh mô sẹo dễ dàng hơn
phát sinh hình thái trực tiếp từ mẫu cấy, phát sinh mô sẹo cho hệ số nhân giống cao, từ
mơ sẹo có thể tạo nguồn mẫu khởi đầu cho nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy huyền
phù tế bào có nhiều đặc điểm thuận lợi hơn ni cấy trên môi trường rắn. Khi nuôi cấy
trên môi trường rắn chỉ có một phần mơ sẹo được tiếp xúc với bề mặt mơi trường, do
đó giữa các phần của mơ sẹo có thể sẽ phát triển khơng đồng đều do nồng độ dinh
dưỡng giữa các phần mô sẹo khác nhau, việc trao đổi khí và hình thành chất thải giữa
mô sẹo và môi trường nuôi cấy cũng khác nhau. Mơ sẹo có thể bị phân cực do khác
biệt về trọng lực và cường độ ánh sáng làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng. Hơn nữa,
nuôi cấy huyền phù tế bào trên mơi trường lỏng lắc thích hợp tạo được các tế bào đơn,
đây là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho việc tạo các tế bào trần, dung hợp tế bào trần
tạo các thể lai, chuyển gene, nghiên cứu phát sinh hình thái trực tiếp từ tế bào đơn, kỹ
thuật nuôi cấy tế bào đơn cũng là một trong những kỹ thuật ưu việt… Các khối mơ sẹo
này cũng có thể được cấy chuyền sang môi trường phát sinh phôi. Về bản chất phơi vơ
tính chứa chất dinh dưỡng tương tự phơi hữu tính, có mầm chóp rễ và chồi đỉnh nên có
thể nảy mầm trực tiếp thành cây khơng qua giai đoạn phát sinh chồi, rễ. Các mô và tế
bào sinh dưỡng nuôi cấy in vitro tạo ra phôi vơ tính thơng qua một q trình tạo mơ
sẹo trung gian. Tế bào mơ sẹo có thể phân chia theo cấp số nhân, nhờ vậy, chỉ sau một
thời gian ngắn nó có thể tạo được một số lượng phơi đáng kể.
Kỹ thuật phát sinh phơi vơ tính (somatic embryogenesis) in vitro là một trong
những kỹ thuật mang lại những hiệu quả vượt trội về tiềm năng nhân giống hơn hẳn so
với các kỹ thuật khác. Việc nghiên cứu phát sinh phơi vơ tính mang lại những lợi ích
đáng quan tâm, giúp hiểu biết sâu sắc hơn về các con đường phát sinh hình thái thực
4

SVTH: Nguyễn Minh Nhật

vật ở giai đoạn khởi đầu này, một vấn đề rất được quan tâm hiện nay trong nhân giống
vơ tính thực vật. Phát sinh phơi vơ tính thực vật giúp hiểu biết sâu sắc về bản chất của
quá trình phát sinh, biến đổi hình thái thực vật dưới tác động của các yếu tố nội tại
trong bản thân nguồn mẫu, nghiên cứu tác động của các yếu tố ngoại cảnh, các nguồn
dinh dưỡng khoáng, các hợp chất bổ sung, các nguồn carbon khác nhau lên quá trình
phản phân hóa, biệt hóa và tái sinh của mơ thực vật.
2.2. VAI TRỊ DỊCH CHIẾT HỮU CƠ ĐỐI VỚI NI CẤY MƠ THỰC VẬT
Dịch chiết hữu cơ có vai trị quan tr ọng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật giúp tế
bào tăng trưởng, cảm ứng sự ra rễ, phát triển chồi ở một số loại thực vật nuôi cấy in
vitro. Bổ sung dịch chiết hữu cơ vào môi trường nuôi cấy thường mang lại kết quả
thuận lợi cho sự tăng trưởng của mô. Huang và cộng sự (2001) nhận thấy sự tăng
trưởng nhanh chóng của chồi cây P. philippinense × P. Susan Boot khi bổ sung dịch
chiết chuối vào môi trường nuôi cấy. Các dịch chiết hữu cơ thường hay bổ sung chẳng
hạn như dịch chiết khoai tây, casein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết chuối, dịch chiết
cà chua (Meyerm, 1954; Vacin và Went, 1949; Griffith và Link, 1957), dịch chiết gỗ
bulô (Zimmer và Pieper, 1974; 1976), dịch chiết bị, dịch chiết lúa mì, lúa mạch, cà
rốt, nấm men, khoai tây, nấm đảm, peptone và nhiều loại nước trái khác (Knudson,
1922; Lami, 1927; Curtis, 1974; Mariat, 1952; Withner, 1953).
Thành phần của dịch chiết rất đa dạng và phong phú bao gồm acid amin, vitamin,
hormone nội sinh, vi lượng, zeatin góp phần xúc tác q trình biến dưỡng, tăng trưởng
của tế bào. Nước dừa được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật ni cấy mơ thực vật vì
trong thành phần của nước dừa có chứa hormone tăng trưởng cụ thể là IAA
(Agampodi và Jayawardena, 2009), acid amin, myo-inositol kích thích tăng trưởng,
phân chia tế bào do đó thường được sử dụng để nhân sinh khối một số loại lan như
Dendrobium sp., Vanda sanderiana và Grandiflora sp., bằng kỹ thuật nuôi cấy mơ
(Rethinam và Kumar 2001). Bên cạnh đó nước dừa cịn đư ợc sử dụng trong ni cấy
phơi. Từ năm 1941, nước dừa đã đư ợc sử dụng để nuôi phơi của “Datura” và năm

1949 ni mơ của “Daucus”. Ngồi ra, các loại vitamin (Biotin, Vitamin B1, Vitamin
B2, Vitamin C, amino acids (Lysine, Cysteine, Methionine, Arginine), vi lượng (K, P,
Ca) và Fe (Tawaro, 2005; Barnell, 1940; Askar, 1972) có chứa trong chuối góp phần
cảm ứng ra rễ ở Paphiopedilum niveum (Rchb.f) Pfitz (Agampodi và Jayawardena,
2009).
5


SVTH: Nguyễn Minh Nhật

Việc bổ sung dich chiết hữu cơ vào trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
khơng những cải thiện chất lượng cây giống mà cịn tiết kiệm chi phí sản xuất vì dịch
chiết hữu cơ thường được làm từ những nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm do đó có thể ứng
dụng trong nhân giống thương mại.
2.3. SƠ LƯỢC VỀ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TR
Ư ỞNG VÀ VAI TRÒ CỦA
CHÚNG TRONG VI NHÂN GIỐNG
Các chất điều hòa sinh trư ởng thực vật là các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh
trưởng và phát triển của thực vật. Chúng được sản sinh với liều lượng rất nhỏ trong
một bộ phận nào đó của cơ thể thực vật và được chuyển tới các bộ phận khác, ở đó với
liều lượng nhỏ nó có thể thực hiện sự điều khiển hướng hoạt động của tất cả các quá
trình trao đ ổi chất trong tế bào, đồng thời thay đổi cấu trúc tế bào và hoạt tính sinh lý
của tế bào.
Phytohormone là thành phần quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy. Nhờ
những chất này, các nhà nghiên cứu có thể chủ động điều khiển q trình phát sinh
hình thái của thực vật in vitro. Phytohormone gồm có 5 nhóm: auxin, cytokinin,
gibberellin, acid abscisic và ethylene.
Tỷ lệ auxin/cytokinin xác định dạng phân hóa cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy.
Nhiều tác giả đã tổng kết rằng sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác
động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin:

- Tỷ lệ auxin/cytokinin cao: kích thích sự tạo rễ.
- Tỷ lệ auxin/cytokinin thấp: đẩy mạnh biệt hóa chồi.
- Tỷ lệ auxin/cytokinin ở mức trung gian: giúp hình thành mơ sẹo.
Đó là ngun tắc chung, cịn phản ứng của các loại mơ khơng giống nhau. Vì thế
với mỗi loại mô, ở từng giai đoạn sinh trưởng khác nhau tổ hợp giữa auxin và
cytokinin, rất quan trọng. Cả auxin lẫn cytokinin, đều được bổ sung vào môi trường
nuôi cấy để kích thích sự phát sinh hình thái. Tỷ lệ hormone thực vật sử dụng để kích
thích sự tạo chồi hay tạo rễ khơng giống nhau tùy theo giống, lồi thực vật mà nhu cầu
về dạng và nồng độ của auxin và cytokinin rất khác nhau trong sự phát sinh hình thái.
2.3.1. Auxin
Gồm một số loại chính như: IAA (3–indole acetic acid), IBA (3–indole butyric
acid), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid), NAA (α-naphthaleneacetic acid).

6


SVTH: Nguyễn Minh Nhật

+ Đặc tính của auxin: kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Có khả năng
khởi đầu sự phân chia tế bào. Kích thích sự tăng trưởng giãn của tế bào đặc biệt là theo
chiều ngang làm cho tế bào phình ra. Kích thích sự phân chia tế bào vùng tượng tầng.
Kích thích sự tái sinh của liber và mộc. Gây ra hiện tượng ưu thế ngọn. Khi chồi ngọn
hoặc rễ chính sinh trưởng sẽ ức chế sự sinh trưởng của chồi bên và rễ bên. Gây ra tính
hướng động của cây (hướng quang và hướng địa). Kích thích sự hình thành rễ, đặc biệt
là rễ bất định trên cành giâm, cành chiết và trên mơ ni cấy. Kích thích sự sinh
trưởng của quả và tạo quả khơng hạt. Kìm hãm sự rụng lá, hoa và quả. Trì hỗn sự
chín của trái. Thúc đẩy sự ra hoa ở Bromeliads. Kích thích sự tăng trưởng các phần
của hoa. Ảnh hưởng lên sự vận động của chất nguyên sinh, tăng tốc độ lưu động của
chất nguyên sinh, ảnh hưởng lên các quá trình trao đổi chất. Hàm lượng auxin tự nhiên
trong mẫu cấy phụ thuộc vào trạng thái của cây mẹ, tuổi cây mẹ, thời gian thu mẫu

trong năm.
Các loại auxin thường được sử dụng: IAA, IBA, 2,4-D, NAA.
Cơng thức hố học của NAA
CH2 - COOH

NAA

2.3.2. Cytokinin
Gồm một số loại chính như: kinetin (6-furfuryl aminopurine), 2iP (hay IPA), N6(2-isopentyl) adenine, BA (hay BAP, 6-benzyl aminopurine), TDZ (Thidiazuron).
+ Đặc tính của cytokinin: kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ. Ảnh hưởng
lên sự tạo chồi bất định. Ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan
của thực vật, đặc biệt là phân hố chồi. Kìm hãm sự hóa già của cơ quan và của cây
nguyên vẹn, do đó nó được coi là hormone trẻ hóa. Kích thích sự nảy mầm của hạt và
chồi ngủ. Giúp gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein.
Trong thân và rễ, cytokinin có vai trị: cản sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng tế
bào (sự tăng trưởng củ). Kích thích sự gia tăng kích thước tế bào lá trưởng thành. Kích
thích sự hình thành tia củ và sự phình to của củ. Trong mối tương tác với auxin,

7


SVTH: Nguyễn Minh Nhật

cytokinin có ảnh hưởng tới ưu thế ngọn của cây. Cytokinin làm yếu hiện tượng ưu thế
ngọn, làm phân cành nhiều.
Cơng thức hố học của BA
NH - CH2
NH
N
N

N

BA
2.4. GIỚI THIỆU VỀ CÂY LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis spp.)
2.4.1. Vị trí phân loại thực vật
Giới
Ngành
Lớp
Phân lớp
Bộ
Họ
Chi
Lồi

Plantae
Magnoliophyta
Liliopsida
Lilidae
Orchidales
Orchidaceae
Phalaenopsis
Phalaenopsis amabilis

Thực vật
Ngọc lan
Hành
Hành
Lan
Lan

Lan Hồ điệp
Lan Hồ điệp trắng

Hình 2.1. Phalaenopsis amabilis
2.4.2. Nguồn gốc và phân bố
Lan Hồ điệp được tìm thấy vào năm 1750, đầu tiên được Rumphius xác định dưới
tên là Angraecum. Đến năm 1753, Linne đổi lại là Epidendrum. Chi Phalaenopsis do
C. L Blume phát hiện vào năm 1825. Phalaenopsis hay còn gọi là lan Hồ điệp. Tên
Phalaenopsis xuất hiện từ tiếng Hy Lạp: “Phalama” (con bướm đêm) và “opsis”
(trông giống như) nghĩa là lồi hoa có hình dạng như bươm bướm.

8


SVTH: Nguyễn Minh Nhật

Giống Phalaenopsis gồm 21 loài lan phát sinh, ưa nóng, sống ở bán đảo Mã Lai,
Indonesia, Philippin, các tỉnh ở phía đơng Ấn Độ và Châu Úc. Chúng sống trên cây
hoặc trên đá, nơi có khí hậu nóng ẩm, độ cao trên 2000m (Dương Cơng Kiên, 2006).
Ở Việt Nam có khoảng 5 - 6 lồi Hồ điệp thuần chủng bao gồm: Phalaenopsis
gibbosa Sweet, Phalaenopsis mannii Rchob.f, Phalaenopsis braceana (Hook.f),
Christenson, Phalaenopsis. Lobbii (Rchob.)f, Phalaenopsis. fuscata Rchob.f. Hầu hết
đều có hoa nhỏ nhưng màu sắc sặc sỡ và hương thơm độc đáo. Bên cạnh những loài
lan Hồ điệp thuần chủng, những người u thích lồi hoa này khơng ngừng sưu tầm,
nhập và thuần dưỡng các giống ngoại khiến chủng loại, màu sắc của lan Hồ điệp ở
nước ta ngày càng đa dạng.
2.4.3. Đặc điểm thực vật học
2.4.3.1. Cơ quan sinh dưỡng
 Thân
Cây đơn thân, khơng có giả hành. Các đốt thân rất ngắn và thường được bao bọc

bởi hai hàng bẹ lá xếp dọc chiều dài thân.
 Lá
Lá đơn ngun dày, mọng nước, khơng cuống và có bẹ ơm lấy thân. Lá có hình
elip thn hay hình lưỡi mác. Lá mang đặc tính của thực vật CAM.
 Rễ
Rễ bất định, khí sinh, mọc từ gốc thân xuyên qua bẹ lá. Rễ phát triển mạnh, màu
lục, xung quanh rễ có một màng xốp bao bọc (velamen). Lớp mô xốp này dễ dàng hút
nước, muối khoáng và các chất dinh dưỡng cho cây đồng thời đóng vai trị đ ặc biệt
quan trọng trong việc giữ nước. Số lượng rễ khá nhiều, rễ to và hơi dẹp.
2.4.3.2. Cơ quan sinh sản
 Hoa
Phát hoa hình thành ở nách lá (thường là một phát hoa). Hoa mọc thành cụm, lưỡng
tính, đối xứng hai bên. Bao hoa dạng cánh, rời nhau, xếp thành hai vòng: ba mảnh
vịng ngồi và hai mảnh vịng trong bé ơ
hn, m ảnh thứ ba có hình dạng và màu sắc
khác hẳn gọi là cánh môi.
Gốc cánh môi thường kéo dài ra, chứa tuyến mật. Nhị và nhụy dính liền thành một cột
nhị nhụy. Hạt phấn thường dính lại thành khối phấn, có chi và gót nằm ở phía dưới.

9


SVTH: Nguyễn Minh Nhật

Hai khối phấn ngăn cách nhau bởi trung đới. Bộ nhụy gồm ba lá nỗn dính nhau thành
bầu dưới, mang nhiều nỗn (Hồng Thị Sản, 2003).
 Quả
Quả của lan Hồ điệp thuộc loại quả nang, mở bằng các khe nứt dọc theo hai bên
đường của gió nỗn. Quả lan chứa rất nhiều hạt, số lượng tùy vào từng loài. Theo
Bernard (1909), hạt lan muốn nảy mầm phải nhiễm nấm Rhizoctonia vì loại nấm này

có tác dụng khởi phát sự tái lập phân bào.
 Keiki
Keiki theo tiếng Indonesia có nghĩa là “bé co n” là một cây con mọc ra từ một mắt
trên thân hay cuống hoa. Hiện tượng này được Williams mô tả đầu tiên vào năm 1894.
Các cây Phalaenopsis dưới điều kiện nuôi trồng không thuận lợi sẽ tạo ra keiki trên
cuống hoa, đặc biệt khi đỉnh đã bị cắt bỏ.
Người ta có thể tách cây con này để nhân giống và cho tỷ lệ sống sót rất cao.
2.4.4. Giá trị kinh tế của lan Hồ Điệp (P.ambilis)
Hồ điệp không chỉ phổ biến ở Nam Mĩ, trong những năm gần đây, Hồ Điệp trở
thành loại hoa trồng chậu có giá trị nhất trong ngành cơng nghiệp trồng hoa ở Hà Lan.
Chúng cịn là những món q xa xỉ ở các nước Châu Á đặc biệt là Nhật Bản. Ngoài ra
các loài hoa đẹp, xa xỉ cũng được nhập vào Mỹ để trang trí chậu hoặc dưới dạng quà
tặng cao cấp.
Ngày nay, hoa lan cắm chậu đã trở nên khá phổ biến ở hầu hết các nước trên thế
giới, có thể thấy Hồ Điệp xuất hiện ở mọi nơi, trên truyền hình, trong nhà, trong vườn,
tạp chí. Lan Hồ điệp, là một lồi lan có độ bền bơng cao trong điều kiện thích hợp,
cũng là một lồi cây rất thích hợp để trồng trong nhà, dễ ra hoa. Hơn nữa, trong vài
thập kỉ gần đây nền công nghệ trồng lan phát triển mạnh giúp giảm giá thành đáng kể
đối với loại lan này nên giá cả phù hợp với những người sưu tầm hay người mới tập
trồng lan.
Trước đây, Hồ Điệp có giá khá cao, nên được xem là một loại hàng hoá cao cấp
trên thị trường. Trong 20 năm trở lại đây, công nghệ hiện đại và các nghiên cứu đã
giúp cho loại sản phẩm này trở nên phổ biến với người tiêu dùng, đặc biệt là trong các
dịp lễ, tết. Thêm vào đó, cơng nghệ lại tạo giống ngày càng tạo nên nhiều chủng loại
giống mới, nổi bật về màu sắc, kích thước hoa. Lan Hồ Điệp được trồng ở mọi nơi trên
thế giới, hầu hết là ở Đức, Nhật bản, Phần Lan, Đài Loan và Mỹ . Cây con được nuôi
10


SVTH: Nguyễn Minh Nhật

cấy mô ở các nước Phần Lan, Thái Lan, Đài Loan sau đó chúng lại được xuất khầu cho
các nước khác. Hàng ngàn các giống được lai và tạo dịng rất có giá trị trên thị trường.
Các nghiên cứu gần đây đã tạo ra được rất nhiều giống Hồ Điệp có chất lượng cao đa
dạng về màu sắc, chủng loại. Cuộc chạy đua diễn ra hầu hết tại Đài Loan, điều này dẫn
đến một hệ quả là các giống có giá trị hiện nay có thể khơng còn giá trị chỉ trong vài
năm nữa. Màu sắc hoa tập trung ở các màu chủ đạo như: trắng, vàng, xanh, màu mơ
chín, hồng, đỏ tươi hay nâu sẫm. Hoa có thể chỉ có một màu hay sự pha trộn giữa các
màu này với nhau, chủ yếu là khác nhau ở vùng giữa, hay mép cánh hoa với nhiều cấu
trúc khác nhau như chấm hay sọc trên từng cánh bông. Loại hoa mới được lai tạo gần
đây nhất là Harlequin, có màu trắng hay vàng với các mép cánh bơng được điểm xuyết
bởi các chấm trịn ngẫu nhiên có giá rất cao trên thị trường hiện nay.
2.5. THUẬT NGỮ
Protocorm là thuật ngữ được đặt ra đầu tiên bởi nhà quản lý Melchoior Treb của
vườn bách thảo Bogor Indonesia (hiện nay là vườn Kebun Raya). Ông dùng thuật ngữ
này để chỉ ra một giai đoạn phát triển của rêu (Treub, 1890). Sau đó, Noel Bernard
dùng protocorm cho các cây họ lan vào những năm 1899 – 1910. Hiện nay, protocorm
dùng để mơ tả những cấu trúc hình cầu nhỏ của lan hình thành từ hạt. Các thể có cấu
trúc tương tự hình thành từ các mẫu cấy in vitro khơng được gọi là protocorm.
Protocorm – like body (PLB) là thuật ngữ dùng để chỉ các thể có cấu trúc tương tự
như protocorm được hình thành từ mơ ni cấy hoặc mơ sẹo in vitro. Thuật ngữ này
được ông Georges Morel sử dụng đầu tiên trong một bài báo tiếng Anh về nuôi cấy
chồi đỉnh.
Pre – embryogenic determined cell (PEDC) là thuật ngữ dùng để chỉ những tế bào
tiền phơi có khả năng hình thành phơi vơ tính trực tiếp.
Induced embryogenic determined cell (IEDC) là thuật ngữ dùng để chỉ những tế
bào có khả năng phát sinh phơi do cảm ứng nghĩa là phải được kích thích thì mới hình
thành phơi (Dương Tấn Nhựt, 2006).
2.6. NI CẤY PHƠI VƠ TÍNH
2.6.1. Sự phát sinh phôi từ tế bào sinh dưỡng

2.6.1.1. Định nghĩa: sự sinh phôi từ tế bào sinh dưỡng là một quá trình, quađó m ột
hay vài tế bào sinh dưỡng trong các điều kiện thực nghiệm (sử dụng các chất điều hòa

11


SVTH: Nguyễn Minh Nhật

sinh trưởng thực vật), bước vào phân chia theo một trật tự nhất định để cho một phôi,
theo kiểu giống hay gần giống như kiểu sinh phôi từ hợp tử (Bùi Trang Việt, 1994).
2.6.1.2. Các giai đoạn sinh phôi từ tế bào sinh dưỡng
Sự sinh phôi từ tế bào sinh dưỡng phải trải qua hai giai đoạn:
+ Giai đoạn 1: mơ ni cấy trong mơi trường có auxin sẽ tăng sinh nhanh, các tế bào
trong môi trường này sẽ phản phân hóa và mất tính hữu cực.
+ Giai đoạn 2: mô sẹo từ giai đoạn 1 sẽ được chuyển sang mơi trường có ít hoặc khơng
có auxin, trong mơi trường này tính hữu cực và sự sinh phơi được cảm ứng với trạng
thái phơi từ hình cầu đến trạng thái hình tim và trạng thái hình cá đuối.
Các phân tích về q trình phát triển phơi cho thấy sự hình thành phơi của thực vật
gồm hai giai đoạn chính: sự phân đoạn và sự sinh cơ quan phôi
- Sự phân đoạn
Đặc trưng của sự phân đoạn là mức độ chính xác cao và sự kiểm sốt chặt chẽ
hướng của các mạng lưới nguyên phân mà các cơ chế còn chưa biết rõ. Sự phân chia
đầu tiên trong sự phát triển của phôi hợp tử là theo hướng ngang. Hướng phân chia
tiếp theo từ hai tế bào có thể thay đổi tùy theo đối tượng khảo sát. Thông thường các tế
bào ở phía lỗ nỗn, gọi là tế bào gần, phân chia theo hướng ngang; tế bào kia gọi là tế
bào xa, có thể phân chia theo hướng ngang, dọc hay nghiêng. Do các hướng phân chia
như vậy, phơi ở giai đoạn 4 tế bào có thể xuất hiện như một chuỗi tế bào kéo dài có 4
tầng. Các phân chia sau đó thường khơng như nhau và theo các hướng khác nhau trong
các tầng của phôi 4 tế bào, tạo một phôi theo nghĩa hẹp là một cơ thể chính và một dây
treo. Phơi ở giai đoạn này là một cơ thể có thể tích tương đối lớn, còn dây treo giống

như một chuỗi các tế bào có chiều dài thay đổi. Trước sự phân hóa của cơ thể chính và
dây treo, phơi non đơi khi ịn
c g ọi là tiền phôi. Sự phân đoạn này được coi là hồn
thành ở giai đoạn phơi hình cầu với biểu bì sơ kh ởi. Người ta nói phơi được “biểu bì
hóa”.
- Sự sinh cơ quan phơi
Sự sinh cơ quan phôi của cây hai lá mầm được xem là bắt đầu ngay trạng thái phơi
hình cầu, với sự xuất hiện của các vùng mô phân sinh chồi và rễ. Các vùng này giữ
khả năng tạo các cơ quan chồi và rễ trong suốt đời sống thực vật. Phôi trưởng thành
bao gồm trục hạ diệp, rễ, các mô phân sinh rễ và chồi ở hai cực đối nhau với một hoặc
hai lá mầm. Hệ thống tiền tượng tầng liên tục suốt trục hạ diệp, thường đã phân hóa
12


SVTH: Nguyễn Minh Nhật

trong phơi. Tóm lại, sự hình thành tính hữu cực là bước đầu tiên trong sự sinh phôi.
Riêng sự tạo phôi từ tế bào sinh dưỡng, giai đoạn tạo mơ sẹo là giai đoạn mất tính hữu
cực của tế bào, sau đó là giai đoạn tiến hóa của phơi khởi đầu bằng sự tiến hóa của tính
hữu cực.
2.6.2. Các giai đoạn trong q trình phát sinh phơi vơ tính
Trong q trình phát sinh phơi vơ tính của huyền phù Cà rốt ghi nhận được 4 giai đoạn
(Fujimura and Komamine, 1980):
+ Giai đoạn 1: bắt đầu khi những tế bào đơn hình thành những cụm tế bào có khả
năng sinh phôi trên môi trường bổ sung auxin.
+ Giai đoạn 2: xảy ra khi những cụm tế bào có khả năng sinh phôi này được cấy
chuyền sang môi trường khơng có auxin. Trong giai đoạn này, các tế bào tăng sinh
chậm và dường như khơng biệt hóa.
+ Giai đoạn 3: có sự phân bào nhanh xảy ra ở một số cụm tế bào, dẫn đến việc hình
thành những phơi hình cầu.

+ Giai đoạn 4: cây con in vitro phát triển từ phơi hình cầu, qua giai đoạn phơi hình
tim và phơi hình cá đuối.
2.7. NHÂN TỐ TÁC ĐỘNG ĐẾN GIA TĂNG SỐ LƯỢNG PHÔI
Cho dù nguồn gốc của các tế bào sinh phơi là IEDC hay PEDC thì chức năng của
các tế bào này là như nhau. Tế bào từ cả hai nguồn gốc này đều có thể phát triển thành
phơi vơ tính hoặc tham gia vào một chu kỳ mới nhằm sản sinh ra ngày càng nhiều các
tế bào sinh phôi (MeCoy, 1987).
Sự gia tăng các tế bào phơi có nhiều kiểu khác nhau và chịu ảnh hưởng bởi nhiều
nhân tố, một vài nhân tố có thể điều khiển được trong q trình ni cấy và một số
khác thì khơng. Những nhân tố được nghiên cứu trong việc tăng sinh các tế bào sinh
phơi thì tương tự như những nhân tố tác động trong cảm ứng tạo phôi. Chẳng hạn như
các chất điều hòa sinh trư ởng, hàm lượng nitơ, loài thực vật và kiểu gen của mẫu cấy.
Trong trường hợp tăng sinh các tế bào sinh phôi, các nhân tố này không chỉ quyết định
khả năng duy trì và tiếp tục trạng thái sinh phơi mà cịn ảnh hưởng đến đặc điểm của
chu trình sinh phơi lặp lại. Do đó, các nhân tố này chịu trách nhiệm kiểm soát những
biến đổi trong giai đoạn phát triển của phơi vơ tính để thúc đẩy việc gia tăng các tế bào
sinh phơi hoặc kiểm sốt những vị trí hay vùng trên phơi sơ cấp có thể sinh ra các phôi
mới (Mekle và cộng sự, 1995).
13


SVTH: Nguyễn Minh Nhật

2.8. CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA PLB LAN HỒ ĐIỆP (P.amabilis)
Intuwong và Sagawa (1974) tiến hành nuôi cấy chồi đỉnh cùa Phalaenopsis và mô
tả sự phát triển của PLB. Sau một tháng nuôi cấy, PLB màu vàng nhạt được tạo ra từ
mẫu chồi ngủ và chồi nách. Ban đầu các PLB có đường kính dưới 0,5 mm, trịn và
nhăn. Sau đó, khi đường kính là 0,5 – 1 mm thì các PLB chuyển sang màu vàng và
phát triển nhiều cụm lông ở nửa dưới. Khi đạt đến đường kính 1-3 mm thì chúng
chuyển sang màu xanh thẩm (màu xanh lá mầm xuất hiện sau đó), lúc này các cụm

lơng vẫn tồn tại. Sau đó lá và rễ xuất hiện ở phần đáy khi PLB dài 4 mm. Đường kính
chúng khơng đổi khi các lá lớn thêm, rễ kéo dài khi chúng phát triển màng bao
(velamen), quá trình này cần khoảng 3 tháng để phát triển.
2.9. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT TÁI SINH TỪ CON ĐƯỜNG HÌNH THÀNH
PHƠI VƠ TÍNH
Mặc dù rõ ràng là hệ thống tạo phơi có khả năng sản xuất ra một số lượng đáng kể
các thể nhân giống ở một vài loài thực vật có giá trị thương mại quan trọng, cơng việc
kiểm tra sự biểu hiện của phơi từ phơi vơ tính ex vitro vẫn cịn đư ợc tìm hiểu kỹ. Về
ngun tắc phơi vơ tính khơng giống như phơi hữu tính là nó khơng trải qua q trình
trao đổi chéo và tái tổ hợp của DNA, do đó phơi vơ tính vẫn biểu hiện cho hệ thống
nhân giống vơ tính mà trong đó cây con tạo thành vẫn duy trì đặc tính của cây mẹ. Nếu
có sinh ra đột biến thì đó là đ ột biến sinh ra trong q trình ni cấy in vitro.Tuy
nhiên, tần số tạo đột biến từ phôi vơ tính thấp hơn hệ thống tái sinh cây từ mơ sẹo, vì
phơi vơ tính phát triển nhanh tạo thành cá thể hồn chỉnh nên đặc tính chống chịu với
đột biến và những biến đổi cá thể thấp hơn sự nuôi cấy cơ quan. Điều này rất quan
trọng trong nhân giống cây trồng vì phải duy trì tính đồng nhất của các cây nhân
giống.
Trong phân tích các cây con tái sinh từ phơi vơ tính người ta nhận thấy các cây này
có sức sống cao, dễ sống khi chuyển sang đất và sinh trưởng và trưởng thành tốt nhờ
nó có các trục rễ và chồi mạnh. Có lẽ một trong những đặc điểm của cây từ phơi là nó
khơng xuất hiện những bất thường về hình thái trong tự nhiên và khơng có những thay
đổi nào vềdi truyền và tế bào. Điều này có thể do nguồn gốc một tế bào của phôi và do
sự chọn lọc nghiêm ngặt trong suốt q trình phát triển thành phơi (Krishnara và Vasil,
1995).

14


SVTH: Nguyễn Minh Nhật

Thực tế, hơn 1200 cây Vân Sam tái sinh từ phơi vơ tính khi kiểm tra ngồi vườn
ươm thì đều có những biểu hiện về tốc độ tăng trưởng, về hình thái chồi và rễ tương tự
như cây con ngoài tự nhiên. Sự xuất hiện đột biến về kiểu hình hầu như khơng có. Có
vài ý kiến cho rằng khoảng thời gian ni cấy có ảnh hưởng đến sự xuất hiện của đột
biến, tuy nhiên sau này người ta nhận thấy khơng có mối liên quan gì giữa thời gian
trong ống nghiệm và tỷ lệ bất thường xuất hiện. Ngoài ra, những báo cáo trên một số
loài thực vật có nguồn gốc từ phơi vơ tính như ở một vài loài Citrus, cây Liễu (Salix
sp. và cây Chà Là (Phoenix dactulifera) cho thấy chúng có bộ gen ổn định trong khía
cạnh hình thái học và sinh lý học (Kobayashi và cộng sự, 1984; Vardi và cộng sự
1982; Akhtar và cộng sự, 2000).
Nhân giống từ phơi vơ tính đã đư ợc thực hiện thành công trên cây Cọ Dừa (Elaeis
guineenis), và từ năm 1983, trên 280 ha Cọ Dầu ở bờ biển Ngà được trồng từ phương
pháp này. Tuy có một số bất thường về hình thái hoa nhưng khơng ảnh hưởng gì đ ến
năng suất.
2.10. THUẦN HĨA VÀ CHĂM SĨC CÂY CON NI CẤY MƠ NGỒI VƯỜN
ƯƠM
Cây lan cấy mô được nuôi dưỡng trong các chai cấy, hộp nhựa. Sau khi cây lan con
đã phát triển hoàn chỉnh, có chiều cao khoảng 3 – 4 cm, có bộ rễ cân đối với lá, có thể
mang cây ra vườn ươm để trồng.
2.10.1. Dụng cụ
Thau dùng chứa nước rửa cây lan con sạch môi trường nuôi cấy
Khay đựng cây cho ráo nước, chậu nhỏ hoặc khay nhựa có lỗ để trồng cây

Vỉ trồng lan

15