Nghiên cứu nhân giống cây hoa Dạ Yến Thảo (Petunia Hybrida) in vitro

ĐẠI HOC
NGUYỄN TẤT THÀNH
NGUYEN TAT THANH

THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TÓT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HOA

DẠ YẾN THẢO (Petunia hybridà) IN VITRO

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Thu Thủy

MSSV

:1711547297

GVHD

: ThS. ĐỒ Tiến Vinh

ThS. Mai Thị Phương Hoa

TP. HCM, 2020

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ i

MỤC LỤC..................................................................................................................... ii
TÓM TẮT.................................................................................................................... iv

SUMMARY................................................................................................................... V
DANH MỤC
• CÁC HÌNH ẢNH.................................................................................. vi
DANH MỤC BẢNG BIẾU........................................................................................ vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. viii

ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................... ix
CHƯƠNG 1. TÓNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................... 1
1.1

Tổng quan cây Dạ Yen Thảo......................................................................................... 1

1.1.1 Phân loại.........................................................................................................................1

1.1.2 Đặc điểm hình thái........................................................................................................ 1
1.1.3 Đặc điêm phân bơ........................................................................................................ 2

1.1.4 Giá trị kinh tế................................................................................................................ 2

1.2 Phương pháp nhân giong................................................................................................3
1.2.1 Kỳ thuật nhân giong truyền thống.............................................................................. 3

1.2.2 Kỳ thuật nhân giong in vitro....................................................................................... 4

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy............................................................................. 5

1.3.1 Yeu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro................................................................ 5
1.3.2 Chất điều hòa sinh trưởng......................................................................................... 11

1.4 Các cơng trình nghiên cứu trong nước và ngồi nước............................................. 13
1.4.1 Các cơng trình nghiên cứu trên thế giới................................................................. 13
1.4.2 Các cơng trình nghiên cứu ở Việt Nam.................................................................. 15

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu........................... 17
ii


2.1 Nơi thực hiện.................................................................................................................17
2.2 Nội dung nghiên cứu....................................................................................................17
2.3 Phương pháp nghiên cứu............................................................................................. 17

2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần mơi trường khống đến sự

sinh trưởng và phát triển của cây Dạ Yen Thảo................................................................. 18
2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng

tạo chồi của cây Dạ Yen Thảo.............................................................................................. 19

2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến quá trình hình
thành rề của Dạ Yen Thảo.................................................................................................... 20
2.4 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu....................................................................... 21
2.4.1 Phương pháp thu thập số liệu................................................................................... 21

2.4.2 Xử lý số liệu............................................................................................................... 21

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 22
3.1 Ket quả thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần mơi trường khống đến
sự sinh trưởng và phát trien của cây Dạ Yen Thảo...........................................................22
3.2 Ket quả thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả

năng tạo chồi của cây Dạ Yen Thảo....................................................................................24
3.3 Ket quả thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến quá trình hình

thành rễ của Dạ Yen Thảo....................................................................................................27

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................................ 30
1. Kết luận.............................................................................................................................30

2. Đe nghị............................................................................................................................. 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 31
PHỤ LỤC

33

iii


TÓM TẤT
Đe tài: “Nghiên cứu nhân giống cây hoa Dạ Yến Thảo (Petunia hybrida) in

vitro” được thực hiện từ tháng 06/2020 đến tháng 09/2020 tại Phịng thí nghiệm ni
cấy mơ thực vật khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nguyễn Tất Thành với

mục tiêu xác định được thành phần khống và chất điều hịa sinh trưởng thích họp để

nhân giống cây hoa Dạ Yen Thảo (Petunia hybridà) in vitro
Đe tài có ba nội dung: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần mơi trường khống
đến sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa Dạ yến Thảo. Khảo sát ảnh hưởng nồng
độ của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo choi của cây hoa Dạ Yen Thảo.

Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến quá trình hình thành rễ cùa cây hoa Dạ
Yến Thảo. Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hồn tồn ngầu nhiên

Ket quả đạt được:
1. Mơi trường MS thích họp đe nhân giống cây hoa Dạ Yen Thảo in vitro

2. Mơi trường thích họp đe tạo chồi của cây hoa Dạ Yen Thảo: MS bo sung BA
0,25 mg/1, đường 30 g/1, agar 8 g/1
3. Mơi trường thích hợp cho sự hình thành rễ cùa cây Dạ Yen Thảo: MS bo sung
NAA 1 mg/1, đường 30 g/1, agar 8 g/1

IV


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Hoa Dạ Yến Thảo................................................................................................... 1
Hình 2.1: Sơ đồ tổng quan nội dung nghiên cứu...............................................................18
Hình 3.1 Chồi cây hoa Dạ Yen Thảo sau 20 ngày ni cấy trên các mơi trường khống
................................................................................................................................................ 23

Hình 3.2 Chồi Dạ Yen Thảo sau 20 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
BA, kinetin............................................................................................................................ 26

Hình 3.3 Chồi cây Dạ Yen Thảo sau 20 ngày nuôi cấy trên môi trường MS
có bổ sung auxin...............................................................................................................29

vi


DANH MỤC BANG BIÊU
Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thành phần mơi trường khống đến sự sinh trưởng
và phát triển của cây Dạ Yến Thảo..................................................................................... 19

Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo chồi của
cây Dạ yến Thảo.................................................................................................................. 20

Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến quá trình hình thành rề của
cây Dạ Yen Thảo.................................................................................................................. 21

Bảng 3.1 Ket quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng đến sự sinh
trưởng và phát trien của cây Dạ Yen Thảo.........................................................................22

Bảng 3.2 Ket quả khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo
chồi cùa cây Dạ Yen Thảo.................................................................................................... 25

Bảng 3.3 Ket quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến quá trình hình thành
rễ của cây Dạ Yến Thảo....................................................................................................... 28

vii


DANH MỤC
• CHỮ VIÉT TẮT

BA

Benzylaminopurin benzyl adenin

IAA

P-indol - acetic acid

IBA

indol - 3 - acetic acid

NAA

a - Naphthaleneacetic acid

SAS

Statistical Analysis Systems

MS

Môi trường Murashige & Skoog - 1926

NT

Nghiệm thức

MT

Môi trường

viii


ĐẶT VÁN ĐÈ
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hoa Dạ Yen Thảo (Petunia hybrida) hay còn gọi là Dã Yên Thảo, thuộc họ Cà
(Solanaceae). Là loài cây bản địa của các nước có khí hậu nhiệt đới ở khu vực miền

nam Châu Mỹ. Đây là loại cây thân thảo chịu nhiệt, hoa nở liên tục đợt này đến đợt
khác, hoa có nhiều màu sắc và kiểu dáng cây phong phú. Dạ Yen Thảo thường được

trồng trong các chậu trang trí trong khuôn viên ngôi nhà làm cho căn nhà thêm rực rõ

với ưu điếm màu sắc hoa phong phú Dạ Yen Thảo mang lại rất nhiều sự lựa chọn cho

người tiêu dùng.
Hiện nay Dạ Yen Thảo được trồng từ hạt. Tuy nhiên giá bán hạt giống cây hoa từ

1.000 - 3.000 đ/hạt tùy loại hoa đơn, kép hay khảm. Mặc khác, tỉ lệ nảy mầm của hạt

tương đối thấp chỉ khoảng 60%. Ngồi ra, Dạ Yen Thảo cịn có the nhân giống bằng

phương pháp giâm cành. Tuy nhiên, cây giâm cành có sức sống yếu hơn cây gieo bằng
hạt và nhanh tàn.

Nuôi cấy mô là phương pháp áp dụng nhân giống khá phổ biến. Nhân giống
bằng kĩ thuật nuôi cấy mơ có thể tăng số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn,
chất lượng cây con đồng đều và giữ được đặc tính ưu việt của cây mẹ, giá thành cây

con thấp, kiểm soát được mầm bệnh. Phương pháp nhân giống cây trồng bằng nuôi

cấy mô in vitro được xem là một trong những phương pháp hữu ích nhất đế giảm chi
phí sản xuất, nâng cao năng suất cây trồng chủ động nguồn giống không phụ thuộc

điều kiện tự nhiên. Đe quả trình ni cấy mơ diễn ra thuận lợi thì vai trị của yếu tố
tham gia điều khiến q trình tạo chồi và ra rễ ở cây Dạ Yen Thảo như chất điều hòa

sinh trưởng như đa lượng, vi lượng trong môi trường nuôi cấy mô cần được nghiên
cứu và làm rõ. Vì vậy, quá trình nhân giống cây hoa Dạ Yen Thảo có ý nghĩa

thiết thực.
Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn trên tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu nhân giống cây hoa Dạ Yen Thảo (Petunia hybrìda) in vitro”.

2. Mục tiêu của đề tài
Xác định được thành phần khống và chất điều hịa sinh trưởng thích hợp đe

nhân giống cây hoa Dạ Yen Thảo (Petunia hybridà) in vitro.
IX


Chương 1. Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TÓNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan cây Dạ Yen Thảo

1.1.1 Phân loại

Giới

: Thực vật

Ngành : Magnoliophyta

Bộ

: Solanales

Họ

: Solanaceae

Chi

: Petunia

Lồi

: Petunia Hybrida

Hình 1.1 Hoa Dạ Yen Thảo

Dạ Yen Thảo là cây thân mềm, là loại cây dề trồng, nở nhiều hoa và rất phong
phú về màu sắc. Cây phù hợp trồng trong chậu treo trang trí trước thềm nhà hoặc trồng
trong các bồn hoa trong sân. Thuộc lồi thực vật có hoa trong họ Cà (Solanaceằ), có

nguồn gốc từ các nước miền Nam Châu Mỹ, hiện nay Dạ Yen Thảo đà phố biến khắp
thế giới với hàng trăm giống lai '. Là loài cây chịu nhiệt, ưa sáng, hoa này sẽ điểm tô

cho ban công nhà thêm tươi tắn, đặc sắc nhất là thân cây và hoa có một lóp lơng tơ bao

phủ thật mềm mại, ấn tượng và tao nhã.

1.1.2 Đặc điểm hình thái
Cây hoa Dạ Yen Thảo là cây thân cỏ, sống hằng năm, cây cao 15-30 cm. Thân

mềm phủ đầy lông dính, nhánh cây được phân ra từ các nách lá, một nách lá có thế
phân nhiều nhánh. Lá đơn, mọc cách mặt trên và mặt dưới của lá có lớp lơng phủ mịn,

mép ngun khơng răng cưa, màu xanh bóng. Hoa nhỏ, đơn độc mọc ở nách lá, trên
một cọng dài 2 - 3 cm, đài hoa cao 1 - 2,5 cm. Hoa lưỡng tính gồm 5 tiểu nhụy gắn ở
phần dưới của ống vành. Cánh đài họp ở gốc, còn lải ở quả, cánh tràng họp thành ống

loe rộng ở đỉnh, noi rõ các gân thùy. Quả nang hai mảnh, nhiều hạt2.

Tốc độ sinh trưởng của hoa Dạ Yen Thảo nhanh. Hoa có dạng hình phễu, nhưng
các dạng hoa Dạ Yen Thảo lai có hình dáng đa dạng và phong phú hơn nhiều. Ví dụ

như hoa cánh đơn, hoa kép với mép có viền và sợn sóng, mép nhúng hình cung nhọn ở
giữa. Hoa có thế có sọc, đom, hoặc viền quanh cánh với nhiều màu sắc khác nhau như
1


Chương 1. Tổng quan tài liệu

đỏ tía, màu hoa cà, màu oải hương, hồng, đỏ, trắng, vàng, cam. Dạ Yen Thảo rũ hồng
đậm có mùi thơm dịu dàng, khi chạm lá cuống hoa sè thấy hơi dính.

Là lồi cây nhất niên thường nở hoa vào mùa hè. Dạ Yen Thảo ưa sáng, sẽ trở

nên mảnh khảnh và ít hoa nếu trồng trong tối. Cây thích hợp với điều kiện độ ẩm vừa
phải, có the sống trong điều kiện hơi khơ nhưng khơng thích ứng với điều kiện ngập

úng. Cây thích hợp với khí hậu nóng và ẩm, khơng chịu được nhiệt độ quá lạnh hay
quá nóng. Dạ Yen Thảo trồng được trên hầu hết các loại đất, nhưng tốt nhất là đất

màu mỡ, đất có pH từ 6,0 - 7,0.
Dạ Yen Thảo thường bị chết vì úng nước, vì vậy cần tưới nước đúng liều lượng,

không tưới nước lên lá và nụ tránh làm thối lá và nụ, cải thiện điều kiện vệ sinh và duy
trì ẩm độ thích hợp. Ngoài ra, Dạ Yen Thảo thường bị héo rũ do nấm, bị thối nhũn do
vi khuẩn cũng như sâu, sên, rệp cắn phá. Một số bệnh virus cũng ảnh hưởng nhiều đến
cây như làm biến dạng lá, cây chậm phát triển, hoa khơng có màu và hình dạng thay
đoi, thân tàn lụi liên tục, thối đỉnh, lá có những sọc xanh sáng, bị lốm đốm và héo, có
khi kết dính thành cụm 3.

1.1.3 Đặc điểm phân bố
Hoa Dạ Yen Thảo thuộc chi 35 của một lồi thực vật có hoa, liên quan chặt chẽ
với cây thuốc lá, cà chua, khoai tây và ớt thuộc họ cà {Solanaceae}. Cây hoa Dạ Yen
Thảo có nguồn gốc từ các miền Nam Châu Mỹ, hiện nay được trồng rộng rãi ở các bãi
cỏ, các khu đất rộng, vườn hoa khắp nước ta. ổ miền Bắc, hoa nở vào hè dịp thu, còn

ở miền Nam, hoa nở vào dịp Tet. Cây có nhiều tên gọi khác nhau, theo Phạm Hồng
Hộ (2000) cây có tên Dã Yên Thảo theo Trần Họp (2000) có tên là cây Hoa Cà. Đây là
một loại cây lai mà tổ tiên có từ nhiều lồi khác của chi Petunia, ví như p. axillaris

BSP {Large White Petunia} hoa dạng ong dẹp, màu trắng hoặc p. virolace Lindl.
{Viloỉet - flowered Petunia} hoa dạng ống dài, thùy rộng, màu tím. Ngày nay, các nhà

vườn từ lồi lai này cịn cho ra các dạng hoa kép hay cánh hoa xịe ngón rất đẹp 4’5.

1.1.4 Giá trị kinh tế
Những năm gần đây, cùng với sự tăng lên về đời sống vật chất, nhu cầu về tinh
thần cũng được người dân quan tâm chú ý, do đó mà ngành hoa kiểng đã dần phát

2


Chương 1. Tổng quan tài liệu
trien đe đáp ứng lại nhu cầu cùa người tiêu dùng. Ngoài những giống hoa trong nước,

người trồng hoa kiểng cũng đã nhập ngoại nhiều loại hoa đẹp trong đó có các giống
hoa lại rất đa dạng về màu sắc, hình dạng phù họp với người tiêu dùng, trong đó có
hoa Dạ Yen Thảo.

Dạ Yen Thảo là loài hoa được rất nhiều người ưa chuộng. Vì hoa tượng trưng
cho sự ấm áp, bình n, khích lệ và được mệnh danh là hoàng hậu của các loài hoa.
Hoa từ vườn anh Quốc hiện được rất nhiều người mua về trang trí ở ban cơng nhà, các

khu resort, biệt thự, nhà hàng, trưng bày tại các sự kiện, hội nghị,... Ngồi ra, cịn

cung cấp cho các đại lý hoa tươi trên địa bàn Đà Nằng, Quảng Nam và một số tỉnh
lân cận.
Hiện nay, Dạ Yen Thảo được trồng khắp cả nước ta và giờ đây thú chơi hoa

khơng cịn là thú chơi có phần xa xỉ của những người có điều kiện nữa. ó hầu hết các

chợ hoa ở miền Bắc cũng như miền Nam đều có bán Dạ Yen Thảo với đủ loại màu sắc
hình dạng (hoa cánh đơn, hoa cánh kép, hoa khảm,...)
Tuy được trong khá phổ biến nhưng những nhà vườn cho biết họ trong Dạ Yen

Thảo từ hạt giong là chính, giá bán hạt giống thì khá cao, từ 2.000 - 4.000 đ/hạt, tùy

loại hoa đơn, kép hay khảm, tỷ lệ hạt nảy mầm của hạt cũng chưa đều, chỉ khoảng

60%. Do đó mà giá bán Dạ Yen Thảo chậu chênh lệch cũng khá cao giữa chậu hoa

đơn và chậu hoa kép (hoa đơn giá trung bình 60.000 đ/chậu, hoa kép hay hoa khảm giá
trung bình 120.000 đ/chậu) 6.

1.2 Phương pháp nhân giống

1.2.1 Kỹ thuật nhân giống truyền thống
Nhân giống bằng hạt là phương pháp đơn giản, dề làm và được áp dụng phổ biến
khi cần nhân so lượng cây con nhiều. Ưu diêm của phương pháp gieo hạt là không tốn

kém về thời gian và cơng sức, giá thành hạ, thích nghi tốt, hệ số kỳ thuật cao. Ngược
lại, phương pháp này khó đánh giá được chất lượng giống.

Nhân giống giâm cành là một phương pháp nhân giống pho biến, được nhiều

người áp dụng trong sản xuất. Nhân giong bằng phương pháp này không những tận

dụng được chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ, dề áp dụng trong sản xuất mà còn rút
3


Chương 1. Tổng quan tài liệu

ngắn thời gian sinh trưởng của cầy so với nhân giống từ hạt, nuôi cấy mơ tế bào.

Ngồi ra, người trồng có the chủ động được nguồn giống chất lượng. Nhưng phương

giâm cành không đảm bảo cây sạch bệnh vì bệnh có thể được truyền từ cây mẹ sang.

1.2.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là vận dụng những phương pháp, kỳ thuật đế đưa

mẫu thực vật vào điều kiện vơ trùng, duy trì và phát triển chúng bằng mơi trường thích
hợp. Kỳ thuật này đem lại lợi ích rất nhiều như tạo ra so lượng nhân bản lớn, có the

thúc đẩy q trình ra hoa và lai tạo trong ống nghiệm với thời gian nhanh hơn, kiếm

soát được hồn tồn q trình sinh trưởng phát triển của thực vật, tạo ra cây giống
đồng đều và sạch bệnh, quan trọng là nhờ kỳ thuật nuôi cấy mô mà ta có thể chuyển

gene vào cây nhằm tạo ra giống vượt trội hơn. Ví dụ như có khả năng chịu hạn, chịu
rét, chịu mặn, hoặc giống cây giàu dinh dưỡng hơn, to hơn, phát triển nhanh hơn,...

Mở ra hướng phát triển mới, chuyển nên nông nghiệp truyền thống trở thành nền nơng
nhiệp cơng nghệ cao tiên tiến. Nhân giống vơ tính cây trồng in vitro hay vi nhân

giống là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong cơng nghệ nuôi cấy mô tế

bào thực vật.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những phương pháp được sử dụng để
duy trì và ni cấy các cơ quan thực vật như: hạt, thân, lá, rễ,... trên môi trường dinh

dưỡng nhân tạo, trong điều kiện nuôi cấy vô trùng và nhiệt độ thích hợp. Sự thành

cơng của việc ni cấy mô thực vật chủ yếu phụ thuộc vào các yếu tố như: môi trường
nuôi cấy, thành phần dinh dưỡng cần thiết, sự vơ trùng, nhiệt độ, ánh sáng,... Ngồi ra

việc chọn mầu ban đầu là rất quan trọng chúng quyết định sự thành cơng ban đầu cho

cả q trình ni cấy.
Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của cơng nghệ tế bào

thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất. Kỳ thuật nhân nhanh in vitro nhằm

duy trì các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo giống. Nhân nhanh các

cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương

thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân thảo.
Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong

nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gồ. Nhân nhanh ở điều kiện vô
4


Chương 1. Tổng quan tài liệu

trùng và cách ly tái nhiễm kết họp với làm sạch virus. Bảo quản các tập đồn giống

nhân vơ tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen.
Nhân giống in vitro là hình thức sử dụng chồi đỉnh, lá, hoa, cuống lá, đoạn thân

non nuôi dưỡng trong các điều kiện đặc biệt để hình thành một cơ thể mới hồn chỉnh.

Uu điểm của nhân giống in vitro là hệ số nhân giống cao, đồng đều, sạch bệnh, chủ
động trong việc sản xuất cây con phục vụ cho công tác giống.

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy

1.3.1 Yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro.
Bên cạnh các chất cung cấp dinh dường cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc
nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin, gibberellin là rất cần thiết de

kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho
mơ cây. Đồng thời có the chủ động điều chỉnh các yeu tố vật lý (quang kỳ, cưòưg độ
chiếu sáng, nhiệt độ, ấm độ, pH môi trường nuôi cấy,...), các yếu tố hoá học (các chất
khoáng, vitamin,...) và đặc biệt là việc bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng.

Điều kiện nuôi cấy: Ánh sáng bao gom cường độ, thời gian và chất lượng ánh

sáng. Neu nuôi cấy ở 10 - 15 w/m2 (khoảng 2000 - 3000 lux). Trong thực tế ở phần lớn
các phịng thí nghiệm thời gian chiếu sáng 16 - 18h/ngày được coi là tốt nhất cho nuôi

cấy mô. Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ đến q trình sinh trưởng
của mơ ni cấy và có liên quan đến sự thay đổi nồng độ hoocmon nội sinh. Các cơng
trình nghiên cứu của Seibert (1975) chứng tỏ trên mơ sẹo cây thuốc lá thì ánh sáng

xanh lơ hoặc tím kích thích việc tạo chồi và ánh sáng đỏ cảm ứng việc phát sinh rề.
Các kết quả này cùng với các kết quả nghiên cứu khác cho thấy quá trình tạo hình thể
của thực vật được điều chỉnh bởi các sac tố nhận ánh sáng: chất phytochrom và các
chất khác 7.

Nhiệt độ: Điều kiện nhiệt độ đóng vai trị quan trọng quyết định sự phân bố hình
thái, sự sinh trưởng phát triển và ra hoa của mồi loại thực vật. Vậy nên trên thế giới

được chia ra các khu vực khí hậu khác nhau cùng các loại thực vật đặc trưng của từng
vùng. Nhiệt độ quá thấp làm tăng độ keo trong tế bào làm cây sinh trưởng phát triến

chậm, nếu nhiệt độ quá cao thì làm cho cây bị chết đi, mặc khác có một số cây muốn

5


Chương 1. Tổng quan tài liệu

nảy mầm và ra hoa được thì cần có sự chuyển đổi nhiệt độ từ âm 2 - 4°c sang nhiệt độ

24 - 32°c. Tuy nhiên, đối với một so trường hợp như nơi sống khắc nghiệt hay sự

chuyển đổi mơi trường sống mới thì cây sẽ có sự biến đổi để thích nghi khác nhau.

Theo nghiên cứu của Murashige vào năm 1947, nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phân

chia tế bào và quá trình trao đoi chất trong mô cấy, ảnh hưởng đến sự phát triển của
từng tế bào riêng lẻ và khả năng tạo các cơ quan của mô nuôi cấy. Nhiệt độ thích hợp

sẽ ảnh hưởng tích cực đến q trình sinh trưởng của đa số các loại thực vật nuôi cấy.
Nhiệt độ rất thấp còn được sử dụng làm chậm hay ngừng sinh trưởng hẳn cùa mầm

ni cấy nhằm mục đích bảo quản giống ở điều kiện in vitro. Trong thực tế nhiệt độ
của phịng ni cấy thường được điều chỉnh ổn định 25°c ± l°c , điều này là do nhiệt
độ thật của các mơ ni cấy trong bình ni cấy có the cao hơn 2 - 4°c so với nhiệt độ

của phịng. Thơng thường người ta điều chỉnh nhiệt độ phịng ni cấy trung bình. Các

loại cây sống ở vùng ôn đới thường quen với nhiệt độ thấp hơn là cây nhiệt đới, chính
vì vậy mà người ta sè có lợi hơn khi có những phịng ni cấy có nhiệt độ 20°C ± l°c

dành cho cây nhiệt đới8.
Đối với thực vật, nhiệt độ có ảnh hưởng đến hình thái, chức năng sinh lý và khả

năng sinh sản. về hình thái của cây: Tùy theo nơi sống có nhiệt độ cao hay thấp mà
cây hình thành nên những bộ phận bảo vệ, cây mọc ở nơi trống trãi, cường độ ánh

sáng mạnh, nhiệt độ cao thì cây có vỏ dày, màu nhạt, tầng bần phát triển nhiều lớp có
tác dụng cách nhiệt, lá nhỏ, có tang cutin dày hạn chế sự bốc hơi nước. Trong quá
trình sống thực vật: Trong những giai đoạn phát triển cá thể khác nhau, nhu cầu nhiệt
độ cũng khác nhau. Chang hạn như ở giai đoạn nảy mầm, hạt cần nhiệt độ thấp hơn

thời kỳ nở hoa, vào thời kỳ quả chín địi hỏi nhiệt độ cao hơn cả. Nhiệt độ chủ yếu tác

động đến cây qua con đường quang hợp theo chiều tăng của của nhiệt độ, như nhiệt độ
của môi trường tăng 10°C thì the cường độ quang hợp tăng hai lần. Tuy nhiên, mồi

loại cây đều có nhiệt độ tối cao hoặc tối thấp thích hợp khác nhau và khả năng chịu

đựng nhiệt độ bất lợi ở các bộ phận của thực vật cũng không giống nhau. Điều kiện
nhiệt độ thấp làm giảm sự sinh trưởng của cây, mất sự hô hấp và thúc đẩy sự phân giải

tinh bột và các chất dự trừ khác có thể cải thiện trực tiếp sự đồng hóa cung cấp cho
đỉnh chồi và thúc đay quá trình theo hướng sinh sản, lá là cơ quan tiếp xúc nhiều và

trực tiếp với khơng khí, do đó chịu đựng được sự thay đối về nhiệt độ thấp.
6

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Đồng thời nhiệt độ có the ảnh hưởng riêng đến sự sinh trưởng của cây thơng qua
sự xn hố, hay cảm ứng về sự nở hoa bời nhiệt độ lạnh. Sự xuân hóa chỉ được dùng

để kích thích hoặc thúc đẩy sự ra hoa bởi việc xử lý nhiệt độ thấp. Như là một nguyên
tắc, sự khởi phát hoa xuất hiện trong thời kỳ xuân hóa nhưng hoa chỉ xuất hiện ở điều

kiện nhiệt độ thích họp cho sự sinh trưởng. Ví dụ, cây Aconitum carmichaeli Debx (0
đầu) yêu cầu sự xuân hoá cho việc nở hoa. ớ một số lồi khác, như hoa hình nón (cúc
Echinacea purpurea) thì lại khơng u cầu q trình xn hố, nhưng sau khi xử lý qua
q trình xn hoá lại làm cho quá trinh ra hoa nhanh hơn và tăng chất lượng hoa. Rất

nhiều loài hoa lâu năm u cầu q trình xn hố cho việc sản xuất nhanh và hiệu
quả kinh tế, trong đó sử dụng phương pháp xử lý lạnh đối với hạt đe tăng khả năng nảy

mầm là một ví dụ điển hình trong việc xn hố hạt giống hoa, nhất là các lồi hoa có

nguồn gốc ơn đới. Đối với một số lồi hoa, người ta làm giảm nhiệt độ xuống vài độ
so với nhiệt độ tối thích trong vịng khoảng 1 đến vài tuần trước khi thu hoạch để làm

tăng chất lượng hoa và kéo dài thời gian thu hoạch9

pH: Te bào và mơ thực vật địi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong

nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị mơi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần
thiết của thí nghiệm, mơi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định pH môi trường

là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào, pH của mơi trường ni cấy thích họp
dao động 5,6 - 6,0 cho các loại cây trồng.

Than hoạt tính : bổ sung thêm than hoạt tính vào mơi trường có tác dụng khử độc.
Than hoạt tính cho vào mơi trường để hấp thụ các chất màu, các chat phenol,...trong

trường họp các yếu tố đó gây ức chế sinh trưởng của mầu nghiên cứu. Than hoạt tính

làm thay đối mơi trường ánh sáng do mơi trường trở nên tối hơn vì thấy thuận lợi cho

việc kích thích ra rễ, thêm than hoạt tính vào mơi trường ni cấy mơ sẽ cung cấp dinh
dường thiết yếu và có tác dụng khử độc. Khi bo sung than hoạt tính vào mơi trường

ni cấy thi sè kích thích sự tăng trưởng và biệt hóa phong lan, hành, carot, cà chua,
cây trường xuân nhưng lại có tác dụng ức chế đối với cây thuốc lá, đậu nành và trà mi.

Than hoạt tính nhìn chung có ảnh hưởng ở ba mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất

điều hịa sinh trưởng hoặc làm đệm mơi trường. Người ta cho rằng, nguyên nhân gây

ức chế sự tăng trưởng cùa mơ cấy khi có sự hiện diện của than hoạt tính trong mơi
trường là do than hút chất điều hịa sinh trưởng trong mơi trường. NAA, IAA, kinetin,

7


Chương 1. Tổng quan tài liệu

BAP, 2ĨP liên kết với than hoạt tính. Trong khi đó, khả năng kích thích sự tăng trưởng
của than hoạt tính đối với mơ cấy là do nó kết họp với các họp chat phenol độc trong

thời gian ni cấy. Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ
0,5 - 3% (w/v).
Nguyên tố đa lượng: thường chiếm 0,1% khối lượng khô của thực vật, cịn có

Nitơ, Phot pho, kali, magie, lưu huỳnh,... là các muối vơ cơ. Chúng có mặt trong các
hợp chất quan trọng như diệp lục, protein, acid amin,... tham gia q trình như điều

hồ áp xuất thấm thấu thấu của tế bào, quang hợp, vận chuyến năng lượng trong
hô hấp,...

Hàm lượng nitơ (N): Là một yếu to quan trọng đối với thực vật vì nó cần thiết
cho q trình hình thành chất diệp lục và cho phép cây trồng sử dụng ánh sáng đe biến
nước và CƠ2 thành đường để cung cấp cho cây. N kích thích sự phát triển của thân -

cành - lá cây. Là thành phần chính của hầu hết các mơi trường là nitơ vô cơ dưới dạng

nitrat (NO.v) hoặc amonium (NH4+). Mô tế bào thực vật trong ni cấy có thể sử dụng
nitrogen như khoáng aminonium và nitrate, đồng thời sử dụng các dạng nitrogen hữu
cơ như amino acid. Amonium chù yếu được dự trừ ở rễ như nguồn nitơ hữu cơ. Tỉ lệ

amonium và nitrate thay đối tùy theo loài và trạng thái phát triển cùa mơ. Vì the, N

đóng vai trị quan trọng quyết định sự sinh trưởng cũng như năng suất của thực vật.

Bên cạnh sự khử độc tính của amonium cà amoniac, các họp chất chứa N phân lượng

thấp cịn có một số chức năng khác như: Cung cap N trong các liên kết hữu cơ và NH2 được thực vật hấp thụ như nguồn N hữu cơ cho quá trình sinh tong họp các amino
axit và protein là quan trọng nhất. Các họp chất phân tử lượng nhỏ này còn được sử

dụng làm chất mang cation như Mn, Cu để vận chuyển các cation qua hệ thông mạch
dần trong cây.
Lưu huỳnh (S): Hàm lượng s trong phân bón có tác dụng gián tiếp đến ngành

chăn ni do đồng cỏ được bón bổ sung lưu huỳnh làm tăng năng suất chất xanh cao
hơn, hàm lượng protein tăng rõ rệt, đồng thời làm giảm lượng nitrat có hại. Lưu huỳnh
rất cần thiết trong dinh dưỡng thực vật để thực hiện các chức năng tổng họp axit

amin(xystin, xistin, metionin), tống họp protein, tạo clorophil, ferrodoxin, glucoxit,

hoạt hoá một so men (papainaza, sufun-laza ATP), tong họp một so vitamin (biotin,
8


Chương 1. Tổng quan tài liệu

timin, vitamin Bi) và chen-zim A. Đối với nguồn s như so được hấp thụ ở rễ cây với
tốc độ chậm. Giống như nitrat, lưu huỳnh phải được khử trước khi sử dụng để sinh
tống họp các họp chất có chứa s như amino axít, protein và enzym. s ở dạng chưa khử

được kết hợp trong các sulpholipid và các polysaccharid. Cystein là sản phẩm bền đầu
tiên trong q trình đồng hóa và là tiền chất của tất cả các hợp chất hữu cơ có chứa s

trong thực vật, ví dụ như: Protein, co - enzym, các họp chất trao đổi chất thứ cấp...
Quá trình đồng hóa s chủ yếu diễn ra ở lục lạp. Khi thiếu s, sinh tống họp protein bị

kìm hãm, lượng diệp lục tố trong cây bị giảm sút. s chưa bị khử là thành phần cấu tạo

sulpholipid, là phân tử tạo thành cấu trúc cùa màng sinh học (thylakoid) và tham gia
vào quá trình vận chuyến các ion qua màng. Đồng thời nhờ sự hiện diện của

sulpholipid trên màng tế bào cũng gây ảnh hưởng đến khả năng chịu muối cùa thực vật.

Magiê (Mg) là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tống hợp diệp lục tố và đong

thời nó cũng tham gia vào cấu trúc của một số emzim vận chuyển photphat Trong
phân tử chlorophyl, các photon được hấp thụ tạo ra dịng điện tử, từ đó tạo ra ATP
và NADPH đóng vai trị quan trọng đối với cố định ở lục lạp. Nồng độ cao các ion

Mg và K là cần thiết để duy trì pH khoảng 6,5 - 7,5 trong lục lạp và tế bào chất, trái

với ở khơng bào pH chỉ vào khoảng 5-6. Ngồi ra, pH còn xác định cấu trúc của
protein và emzym nên nó ảnh hưởng đến q trình sinh tống họp cấu trúc protein.

Photpho (P) là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật, chúng tham gia vào

việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, axit nucleotic và tham gia cấu trúc
của màng. Trong môi trường nuôi cấy photpho được cung cấp dưới dạng mono hay

dihydrogenphosphate potasium hay sodium. Đây cũng là ion dề được thực vật hấp

thụ nhất.
Kali (K) K+ là một cation chủ yếu trong cây, giúp cây cần bằng được các amino
vô cơ và hữu cơ. lon được chuyến qua màng tế bào dễ dàng và có vai trị chính là điều

hồ pH và áp suất thấm thấu của môi trường nội bào. Sự thiếu hụt K+ trong mơi trường

ni cấy thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thiếu nước. K+ được cung cấp dưới dạng muối

KNƠ3, KC1. 6H2O, KH2PO4. Muối kali có vai trị quan trọng trong việc điều chỉnh tính
thẩm thấu cùa tế bào, có vai trị quan trọng trong việc duy trì cân bằng ion.

9


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Canxi (Ca) cũng là một cation chủ yếu giúp cân bằng các amino trong cây nhưng
cách thức không giống K+ và Mg2+ và Ca2+ không phải là ion tăng động. Có vai trị

quan trọng trong việc phát sinh hình thái đong thời với sự cảm ứng của các chất điều
hoà sinh trưởng đặc biệt auxin và cytokinin. Ngồi ra, cịn là thành phần quan trọng

của thành te bào và màng tế bào, giúp cũng cố độ vừng chắc cho thành tế bào và điều
hoà cấu trúc màng tế bào.

Các yếu tố khác: Agar đối với nuôi cấy tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có
thể bị chìm và chết vì thiếu oxi. Đe tránh tình trạng này, mơi trường ni cấy được làm
đặc bằng cách bổ sung agar ở nồng độ thích hợp, một loại tinh bột được chế từ rong
biến và mô được cấy trên bề mặt của môi trường. Agar thường được sử dụng ở nồng
độ 0,6 - 1%.

Nước dừa: Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mơ thuộc về
Van Overbeek và cộng sự. Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong mi trường

ni cấy mô, tế bào thực vật được nhiều tác giả ghi nhận. Nước dừa được xác định là

giàu các chất hữu cơ, chất khống và chất kích thích sinh trưởng. Nước dừa đã được
sử dụng đế kích thích phân hóa và nhân nhanh choi ở nhiều loại cây trong nhiều loại

môi trường khác nhau. Nước dừa được sử dụng ở hai dạng: một là được lấy từ quả của

các giống cây và cây chọn lọc đe sử dụng tươi hoặc sau bảo quản, hai là nước dừa

được một số công ty bán hóa chất bán dưới dạng đống chai sau che biến và bảo quản.
Vitamin: Tất cả các tế bào được ni cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các

loại vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức u cầu. Đe mơ có sức

sinh trưởng tốt phải bo sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin. Các

vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hóa. Các vitamin sau đây được sử dụng
pho biến: inositol, thiamine HC1 (Bl), pyridoxine HC1 (B6), nicotinic axit, trong đó

vitamin B1 là khơng the thiếu và được sử dụng trong hầu hết những môi trường nuôi
cấy mô và tế bào thực vật. Linsmaier và Skoog đã khắng định vitamin B1 là cần thiết
cho sự sinh trưởng của cây sau khi nghiên cứu kỹ lưỡng về sự có mặt của nó trong mơi

trường MS. Các tác giả khác cũng khẳng định vai trò rất quan trọng của BI trong mơi
trường ni cấy mơ. Inositol thường được nói đến như một vitamin kích thích một

cách tích cực đối với sự sinh trưởng và phát triến của thực vật, mặc dù nó khơng phải

10


Chương 1. Tổng quan tài liệu

cần thiết trong mọi trường họp. Các vitamin khác, đặc biệt là ticotinic axit (vitamin

B3), canxi phantothenate (vitamin B5) và biotin cũng được sử dụng đê nâng cao sức

sinh trưởng của mô nuôi cấy. Anh hưởng của vitamin lên sự phát triển cùa tế bào ni
cay in vitro ở các lồi khác nhau là khác nhau hoặc thậm chí cịn gây hại (độc).

Hàm lượng đường: Đường sucrose (saccharoza) là nguồn cacbon chủ yếu và
được sử dụng thường xuyên trong hầu hết trong các môi trường nuôi cấy mô, ke cả khi
mẫu nuôi cấy là các chồi xanh có khả năng quang hợp. Mơ thực vật có khả năng hấp

thụ một số đường khác như maltose, galatose, lactose, mannose, thậm chí là tinh bột,
nhưng các loại đường này hầu như rất ít được sử dụng hơn glucose trong môi trường

nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mô và tế bào thực vật nuôi cay in vitro sống chủ yếu

theo phương thức dị dưỡng, mặc dù ở nhiều trường họp chúng có the sống bán dị
dường nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang họp. Vì vậy, việc

đưa vào mơi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn cacbon
thông dụng nhất đã được kiếm chứng là sucrose, nong độ thích họp phố biến là 2 - 3%,

song cũng cịn phụ thuộc vào mục đích ni cấy mà thay đoi có khi giảm xuống tới 0,2%
(chọn dịng tế bào) và tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước)9.

1.3.2 Chất điều hòa sinh trưởng
Các chất điều hòa sinh trưởng: có vai trị quan trọng trong q trình phát sinh
hình thái của mơ ni cấy. Hiệu quả tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng phụ

thuộc vào: nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của nó và mẫu ban đầu. Tỷ lệ cytokinin

và auxin trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự thành lập tạo trồi và rề. Một tỉ lệ
cao cytokinin và auxin thấp thích hợp cho sự tạo rễ, còn ở mức độ trung gian thích hợp
cho tạo mơ sẹo.

Các chất điều hồ sinh trưởng thực vật: là thành phần quan trọng bậc nhất của

môi trường nuôi cấy. Nhờ những chất này các nhà nghiên cứu có the chủ động điều
chỉnh q trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Trong ni cấy mơ tế bào hai
nhóm chất điều hồ sinh trưởng được sử dụng rộng rãi là auxin và cytokinin.
Cytokinin là nhóm các phytohoocmon dẫn xuất cùa adenin nó liên quan chặt chẽ

đến q trình phân bào, kích thích phân hố chồi từ mơ cay. Cytokinin là một trong
các chất điều hịa sinh trưởng được sử dụng pho biến nhất, nó có vai trị kích thích sự

11


Chương 1. Tổng quan tài liệu

phân chia tế bào và hình thành cơ quan, tạo chồi và tăng trưởng nụ nách. Các
cytokinin thường dùng trong nuôi cấy là kinetin, BA.

BA (6 - benzylaminopurine) là dạng bột kết tinh màu trắng, khó tan trong nước,
hoạt lực của BA cao hơn nhiều so với Kinetin và bản thân BA bền vững hơn zeatin
dưới tác động của nhiệt độ cao. BA có khả năng làm tăng hình thành các sản phấm thứ
cấp và tăng kích thước của te bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và q
trình trao đổi chất.

Kinetin (6 - furfurylaminopurine) được phân lập từ chế pham DNA cũ hoặc

nucleic acid mới sau khi khử trùng ở nhiệt độ cao hay đun sôi. Trong cơ thể sống

khơng có kinetin tồn tại, sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá

nuôi cấy, nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nong độ thích họp thì sè kích
thích q trình phân chia tế bào (do đó có tên là kinetin) ở các mơ khơng phân hóa.

Auxin kích thích sự sinh trưởng giãn dài của tế bào, đặc biệt giãn theo chiều

ngang của tế bào làm tế bào to theo chiều ngang, vì vậy làm cho các bộ phận của cây
to về chiều ngang. Ngồi ra, auxin cịn kích thích sự tong họp các họp cấu trúc nên
thành tế bào như các chat cenlulose, pectin, hemicenlulose... Auxin còn ảnh hưởng đến

sự phân chia tế bào, tuy nhiên ảnh hưởng của auxin lên sự giàn và sự phân chia tế bào
trong mồi tác động tương hồ với các phytohormone khác.

Auxin gây kìm hàm sự rụng lá, hoa, quả của cây, vì nó ức chế sự hình thành
tầng rời ở cuống lá, hoa, quả vốn được cảm ứng bởi các chất ức chế sinh trưởng. Vì

vậy, khi phun auxin ngoại sinh có the gây giảm sự rụng lá, làm tăng khả năng đậu quả

và hạn chế sự rụng nụ hay quả non, dần đến tăng năng suất cho cây. Trong điều kiện
tự nhiên, khi cây tổng họp đủ lượng auxin sẽ ức chế sự rụng hoa, quả, lá 10.
Auxin là nhóm chất điều hịa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên
trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là

IAA (1H- indole-3-acetic acid, NAA (1-naphthaleneacetic acid), IBA (lH-indole-3-

butyric acid) kích thích chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng của chồi
đỉnh, đóng vai trị kích thích sự phân hố của các mô dẫn (xylem and phloem). Auxin

kết họp chặt chè với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng đe kích thích sự
tăng trưởng của mơ sẹo, huyền phù tế bào và điều hịa sự phát sinh hình thái và có khả
12

Chương 1. Tổng quan tài liệu

năng khởi đầu sự phân chia tế bào.. Đặc điếm chung của các auxin là tính chất phân
chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài
thân, long (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu the ngọn, tạo rề và phân hóa mạch

dần. Các auxin liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rề... Đối với nuôi cấy mô,
auxin đã được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ.

1.4 Các cơng trình nghiên cứu trong nước và ngồi nước

1.4.1 Các cơng trình nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu ni cay in vitro cây Dạ
Yen Thảo nhằm tạo ra so lượng lớn phục vụ cho sản xuất.
Năm 2004, Kortessa Dimasi-Theriou và cộng sự đã nghiên cứu tái sinh cây Dã

Yên Thảo (Petunia hybrỉda L.) in vitro bang ethylene. Nghiên cứu cho thấy giảm

ethylene sản xuất nội sinh bằng ethysorb (KMnOẠ một chất hấp thụ ethylene, làm

giảm số lượng chồi. Mặt khác, việc bổ sung ethylene (0,01 - 10 ppm) vào môi trường

nuôi cấy làm tăng đáng kể số lượng chồi mà không ảnh hưởng đến chiều dài và trọng

lượng tươi. Phương pháp xử lý ethylene (1 ppm) được cho là có hiệu quả nhất khi
chúng được áp dụng vào tuần thứ hai của q trình ni cấy mầu petunia. Việc bo
sung Co2+ vào môi trường dần đến giảm ethylene nội sinh và đồng thời làm giảm sự
hình thành chồi. Tương tự, bổ sung Ag+, một chất ức chế hoạt động của ethylene, dẫn

đến sự hình thành chồi kém. Ethylene dường như cũng đóng một vai trị nào đó đối với
sự ra rề của các micro Petunia in vitro trong mơi trường khơng có auxin. Ethylene ở

nồng độ 10 ppm gây ra sự hình thành rễ nhanh chóng đáng kể, trong khi ở nồng độ
thấp (0,0 - 1 ppm) nó khơng ảnh hưởng đến sự ra rễ 1 ’.
Năm 2007, Moshe Reuveni, Dalia Evenor đã nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh

sáng đến tái sinh chồi ở cây Dã Yên Thảo (Petunia hybrida). Nghiên cứu tiến hành
trên lá cây Dã Yên Thảo đã khử trùng được đặt trên môi trường MS bổ sung 5,7 pM

IAA và 2,25 pM zeatin. Mô lá tiếp xúc với các khoảng thời gian ánh sáng hoặc bóng

tối khác nhau và sự tái sinh đã được ghi lại. Giống Petunia hybrida R khơng tái sinh
trong bóng tối trong khi p. axillaris tái sinh trong bóng tối. p. hybrida và p. axillaris

tái sinh trong ánh sáng. p. hybrida lá trên môi trường tái sinh MS được chiếu sáng, cần

chiếu xạ tối thiếu 6 ngày để tái sinh chồi. Các chồi phát triến tối được hình thành, điều
13


Chương 1. Tông quan tài liệu

này cho thấy rằng ánh sáng là cần thiết đế kích thích sự hình thành chồi. Phép lai giữa

p. hybrida và p. axillaris cho thấy có một locus trội duy nhất cần thiết để tái sinh
trong bóng tối và hai locus đe tái sinh trong ánh sáng 12.

Năm 2010, Alicja Kosatka và cộng sự đã nghiên cửu gây đột biến thông qua xử lý

EMS và sàng lọc trong ống nghiệm đối với cây chịu mặn Dã Yên Thảo (Petunia hybridaỴ
Nghiên cứu tiến hành trên hai thí nghiệm là thí nghiệm nhân và tái sinh. Đối với thí nghiệm

nhân chồi, các mầu chồi lấy từ cây mầm đã nảy mầm được nuôi cấy trên môi trường cơ bản

MS có bổ sung các nồng độ khác nhau của BA (0,1, 0,4, 0,8 mg/1) và NAA ở nồng độ 0,1

mg/1. Số chồi nách cao nhất thu được trên môi trường bổ sung 0,8 mg/1 BA và 0,1 mg/1
NAA. Đối với các thí nghiệm tái sinh, các phần lá lấy từ cây con đã nảy mầm được nuôi

cấy ưên mơi trường MS có bo sung ba mức BA (0,5, 1,0 và 2,0 mg/1) và 0,5 mg/1 NAA. Tỷ
lệ tái sinh chồi cao nhất (45%) được quan sát thấy trong mơi trường MS có bổ sung 2 mg/1

BA. Đe đánh giá sự biến đổi somaclonal, mầu cấy chồi bên được lấy từ những cây Dã Yến
Thảo có màu hồng được trồng trong nhà kính. Các chồi được khử trùng và nuôi cấy trên

môi trường nền MS được cung cấp 30 mg/1 gentamycin sulfate và 30 mg/1 Benlate. Sau khi

chồi phát triển, các phần lá sau đó được lấy từ choi và nuôi cấy vào môi trường tái sinh chồi

(môi trường MS bo sung 2 mg/1 BA). Các chồi bất định tái sinh được ni cấy trên mơi
trường MS khơng có chất điều hịa sinh trưởng. Những choi này sau đó đã mọc rề, được di

thực và chuyển đến nhà kính để đánh giá. Trên cây con xuất hiện hai dạng hình lá (hình cầu
và hình elip) và ba màu hoa (tím, tím và hồng nhạt)13
Năm 2017, Danesh Kazemi và Behzad Kaviani đã nghiên cứu tạo mô sẹo và tạo

cơ quan từ cây Dã Yên Thảo (Petunia hybridal) F1 do BA và NAA tạo ra. Trong thí

nghiệm các mẫu lá Petunia X hybrida F1 được nuôi cấy trên môi trường Murashige và

Skoog (MS) cơ bản bổ sung với các nồng độ khác nhau của N6 - benzyladenine (BA)

(0,25, 0,50 và 1,00 mg/1) và a - naphthalene acetic axit (NAA) (0,10, 0,20 và 0,30

mg/1). Khối lượng tươi tối đa (5,16 g), khối lượng khơ (0,31 g) và thể tích mơ sẹo
(24,50 cm3) thu được trong môi trường chứa 1,00 mg 1 - 1 BA kết họp với 0,30 mg/1
NAA. Mầu cấy lá khơng tạo ra mơ sẹo trong mơi trường khơng có PGR. Cây con được

tạo ra trên tất cả các mô sẹo được trồng trên mơi trường có chứa PGR. số lượng cây
con nhiều nhất được tạo ra trên mô sẹo được tạo ra trên môi trường được làm giàu với

14


Chương 1. Tổng quan tài liệu

1,00 mg/1 BA kết hợp với 0,30 mg/1 NAA. Cây con tái sinh trong ống nghiệm với chồi

và rễ phát triển tốt đã được thiết lập thành cơng trong chậu có chứa than bùn và đá trân
châu (1 : 1) và được trồng trong nhà kính trong vịng 4 tuần với tỷ lệ sống 100%. Các
cây tái sinh giống hệt về hình thái với cây mẹ và khơng có bất kỳ biến đoi kiểu hình
nào có the phát hiện được l4.

1.4.2 Các cơng trình nghiên cứu ở Việt Nam
ớ Việt Nam, công việc nuôi cấy mô tế bào bắt đầu thực hiện trong khoảng năm
1977 ở Phân Viện Khoa học Thành phố Hồ Chí Minh. Hiện nay có rất nhiều phịng thí

nghiệm ni cấy mơ ở các Trường Đại học, Viện nghiên cứu, Sở khoa học và Công

nghệ ở các Tỉnh, Thành phố. Đà Lạt là nơi có nhiều phịng thí nghiệm ni cấy mơ của
tư nhân phục vụ cho công tác nhân giống cây cảnh và rau củ.
Năm 2006, Lê Hồng Thủy Tiên đã khảo sát sự ra hoa trong ống nghiệm ở cây
Dừa cạn (Catharanthus roseus) và cây Dã Yên Thảo (Petunia hybrida) đã thu được

kết quả. Đối với cây Dừa cạn môi trường thích họp nhất cho cây Dừa cạn in vitro ra
hoa (đạt tỉ lệ 100%) là môi trường MS bổ sung 0,05 mg/1 TDZ và 0,1 mg/1 NAA. Cây

ra nụ sau 58 ngày ni cấy và 68 ngày thì hoa nở, trung bình có 4 hoa/cây. Mơi trường
MS bổ sung 0,1 mg/1 TDZ và 0,1 mg/1 NAA có tỉ lệ ra hoa thấp hơn đạt 33,33% nhưng

có số hoa/cây cao nhất, 5,67 hoa/cây. Đối với cây Dă Yên Thảo trong môi trường MS

chứa 340 mg/1 KH2PO4 (gấp 2 lần so với nồng độ trong MS) và 40 g/1 đường 100%

cây ra nụ nhưng nụ khơng nở thành hoa. Các thí nghiệm bo sung TDZ hoặc BA kết

hợp với NAA, tăng nong độ KH2PO4 và nồng độ đường, giảm nồng độ KNO3 đều

khơng cảm ứng sự hình thành nụ và hoa '.
Năm 2017, Bùi Thị Cúc và cộng sự đã “Nhân nhanh in vitro cây Dạ Yen Thảo
hoa hồng sọc tím (Petunia hybridà)”. Nghiên cứu đã xác định được môi trường thích

họp nhất cho việc tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ của Dạ Yen Thảo là môi
trường MS bổ sung 30 g/1 succrose, 6 g/1 agar và 0,25 mg/1 TDZ, cho đường kính cụm

chồi đạt 1,95 cm, chiều cao trung bình chồi đạt 1,67 cm và có 3,36 chồi cao trên 1 cm.
Chồi Dạ Yen Thảo in vitro cao 1-1,5 cm được sử dụng làm vật liệu đe nhân nhanh.

Hệ số nhân choi đạt cao nhất là 73,11 lần sau 5 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ

sung 30 g/1 succrose, 6 g/1 agar, 0,75 mg/1 BA, 0,1 mg/1 aNAA. Môi trường tối ưu cho
15


Chương 1. Tổng quan tài liệu

sự ra rễ của chồi Dạ Yen Thảo in vitro là môi trường MS bổ sung 30 g/1 succrose, 6 g/1

agar, 0,1 mg/1 aNAA, cho tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100%, số rễ trung bình đạt 51,87 rề/chồi,
chiều dài rề trung bình đạt 0,96 cm sau 4 tuần nuôi cấy6.
Năm 2011, Trần Quốc Cường nghiên cứu về hiệu quả của BA, NAA, TDZ lên tái

sinh chồi Dã Yên Thảo (Petunia hybrida L.) in vitro 15.
Năm 2018, Vũ Thị Mai đã Nghiên cứu nhân giống cây Dã Yên Thảo rũ hồng

đậm (Petunia hybrida L.) bằng kỳ thuật nuôi cấy mô. Ket quả cho thấy khử trùng mầu

Dã Yên Thảo rũ hồng đậm sạch, có khả năng sinh chồi cao nhất bằng cách xử lý sơ bộ

và khử trùng bang Javel 7,5% trong vòng 10 phút cho hiệu quả khử trùng đạt 52%.
Mơi trường thích hợp để nhân nhanh chồi là MS + 30g/l sacarose + 7 g/1 agar + 0,1
mg/1 BAP. Mơi trường thích hợp nhất đe tạo rễ là MS + 30 g/1 sacarose + 7 g/1 agar +

0,1 mg/1 NAA. Mơi trường thích hợp nhất đe rèn luyện cây Dà Yên Thảo khi cho ra
ngồi mơi trường tự nhiên là đất thịt, cát, tro trấu, phân xanh với tỷ lệ sống là 45% '6.

16

Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1 Noi thực hiện
Phòng thí nghiệm ni cấy mơ thực vật khoa Cơng nghệ Sinh học, trường Đại
học Nguyễn Tất Thành.

Thời gian thực hiện đề tài: 06/2020 - 09/2020
Vật liệu: Thí nghiệm tiến hành trên cây hoa Dạ Yen Thảo in vitro do Trung tâm

khoa học Công nghệ Ben Tre cung cấp.

2.2 Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng đến sự sinh trưởng và phát
triển của cây hoa Dạ Yen Thảo.

- Khảo sát ảnh hưởng của đồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo chồi của cây
hoa Dạ Yen Thảo.

- Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến quá trình hình thành rễ của
cây hoa Dạ Yen Thảo.

2.3 Phương pháp nghiên cứu
Điều kiện nuôi cấy: mẫu được cấy trên môi trường đã được khử trùng bằng nồi
hấp vô trùng ở 1 atm, 121°c trong 15 phút, pH của môi trường: 5,8, nhiệt độ phịng

ni cấy: 25 ± 2°c, cường độ ánh sáng: 2.000 - 3.000 lux, thời gian chiếu sáng: 8
giờ/ngày.

Các thí nghiệm được bo trí hồn tồn ngầu nhiên 1 yếu tố (CRD) gồm 3 lần lập

lại, mồi nghiệm thức lặp lại được cấy 3 chai, số liệu thu thập từ các thí nghiệm được

xử lý bằng phần mềm SAS 9.1

17