Khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể Chó nhà tại A Lưới dựa vào đoạn trình tự 582 Bp vùng HV1 trên bộ gen ty thể

ĐẠI HOC
NGUYỄN TÁT THÀNH
NGUYEN TAT THANH

THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHẢO SÁT Sự ĐA DẠNG DI TRUYỀN
CỦA QUẨN THẺ CHĨ NHÀ TẠI A LƯỚI

DựA VÀO ĐOẠN TRÌNH Tự

582 BP VÙNG HV1 TRÊN BỘ GEN TY THẺ

Sinh viên thực hiện : Vương Thúy Thảo
MSSV

: 1600001589

GVHD

: ThS. Trần Thị Bích Huy

TP. HCM, 2020


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ i

MỤC LỤC..................................................................................................................... ii
TÓM TẮT..................................................................................................................... V

SUMMARY................................................................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH.................................................................................. ix
DANH MỤC BẢNG BIẾU.......................................................................................... X
DANH MỤC CHŨ VIẾT TẤT................................................................................... xi
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
1.

Tính cấp thiết của đề tài................................................................................................... 1

2. Mục tiêu của đề tài............................................................................................................ 1
2.1. Những đóng góp mới của đề tài nghiên cứu................................................................1
2.2. Nghiên cứu sè giúp gì trong giải quyết vấn đề?......................................................... 2
2.3. Những điều sè đạt được trong quá trình nghiên cứu................................................. 2
2.4. Giới hạn và phạm vi nghiên cứu................................................................................... 2

CHƯƠNG 1. TÓNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................... 3
1.1. Phân loại chó nhà............................................................................................................3
1.2. Nguồn gốc chó nhà........................................................................................................ 4
1.3. Đặc điềm di truyền của bộ gen ty thể động vật.......................................................... 5
1.4. Các nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của chó dựa vào trình tự HV1 của vùng
CR trên bộ gen ty thể............................................................................................................... 6

1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới...................................................................................... 6
1.4.2. Các nghiên cứu trong nước........................................................................................ 9

ii


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu............................ 12
2.1. Nơi thực hiện, thời gian thực hiện..............................................................................12

2.2. Vật liệu nghiên cứu..................................................................................................... 12
2.2.1. Thu mầu và ghi nhận các thông tin......................................................................... 12
2.2.2. Hóa chất

................................................................................................................ 13

2.2.3. Dụng cụ và thiết bị.....................................................................................................13
2.2.4. Các phần mềm sử dụng trong nghiên cứu..............................................................13
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................................. 14

2.3.1. Phương pháp thu mẫu............................................................................................... 14
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA tong số.................................................................... 15
2.3.3. Phương pháp kiếm tra độ tinh sạch DNA bằngquang pho kế............................. 16
2.3.4. Kỳ thuật điện di DNA trên gel agarose.................................................................. 17
2.3.5. Khuếch đại trình tự vùng HV1 bằng kỳ thuật PCR.............................................. 17
2.3.6. Phương pháp giải và hiệu chỉnh trình tự................................................................. 19
2.3.7. Phương pháp xử lý và phân tích kết quả................................................................20

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀTHẢO LUẬN............................................................. 23
3.1. Thu thập và xử lý mầu................................................................................................. 23
3.2. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ 15 mẫu lơng chó.............................................. 23
3.3. Ket quả đo tỷ số OD và nồng độ DNA của 15 mẫu lơng chó................................ 24
3.4. Ket quả khuếch đại vùng HV1....................................................................................25

3.5. Ket quả giải trình tự và hiệu chỉnh vùng HV1......................................................... 26

3.5.1. Ket quả giải trình tự.................................................................................................. 26
3.5.2. Hiệu chỉnh và lắp ráp trình tự vùng HV1.............................................................. 30

3.6. Ket quả so sánh trình tự truy vấn cùa các mầu nghiên cứu với các cơ sở dữ liệu trên
Gen Bank................................................................................................................................31

3.7. Xác định các vị trí đa hình từ 15 cá thể chó nhà ở A Lưới- Thừa Thiên Huế......34

iii


3.8. Định loại haplotype của quần thế chó nhà tại vùng A Lưới - Thừa Thiên Huế ....36
3.9. Đánh giá sự đa dạng di truyền dựa vào vùng HV1 DNA ty thể của quần thể chó nhà

tại vùng núi A Lưới - Thừa Thiên Huế............................................................................... 38

3.9.1. Sự đa dạng ở cấp độ nucleotide............................................................................. 38
3.9.2. Sự đa dạng ở cấp độ haplotype.............................................................................. 40

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................................ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 44
PHỤ LỤC.................................................................................................................... 46

IV


TĨM TẤT

Chó nhà là lồi động vật đầu tiên được con người thuần hóa, chúng được xem là
lồi động vật thơng minh có mối quan hệ gần gũi với con người, được con người xem

như thú cưng trung thành đồng hành cùng con người trong mọi hoạt động.
Những năm gần đây, việc nghiên cứu về sự đa dạng di truyền cùa chó ở Việt Nam
trở nên pho biến. Vào năm 2012 Viện Công Nghệ Cao trường Đại học Nguyễn Tất
Thành đã tiến hành những nghiên cứu sâu hơn đánh giá sự đa dạng di truyền và nguồn
gốc của giống chó lưng xốy Phú Quốc bằng cơng nghệ phân tử giải mã trình tự DNA

vùng HV1 (Hypervarible region 1). Đen năm 2019 đã đưa ra kết luận giống chó này có

nguồn gốc từ chó nhà Việt Nam khu vực đất liền tỉnh Kiên Giang di cư ra và bác bỏ ý

kiến rằng chó lưng xốy Phú Quốc có nguồn gốc từ chó lưng xốy Thái Lan.
Bên cạnh đó cũng có rất nhiều nghiên cứu về sự đa dạng di truyền chó nhà tập
trung ở khu vực mien Nam như ở thành phố Rạch Giá và huyện đảo Phú Quốc thuộc

tỉnh Kiên Giang, Hồ Chí Minh... Và vẫn chưa có các nghiên cứu về sự đa dạng di truyền
chó nhà ở khu vực biên giới, đặc biệt là khu vực biên giới miền trung như khu vực huyện
A Lưới - Thừa Thiên Huế.

Nên đề tài: “Khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể chó nhà tại A Lưới -

Thừa Thiên Huế dựa vào đoạn trình tự 582 bp vùng HV1 trên bộ gen ty thể” được
thực hiện.
Đe hoàn thành các mục tiêu cùa nghiên cứu này, các mục tiêu sau phải được thực
hiện:

- Thu mẫu lơng chó tại A Lưới-Thừa Thiên Huế;
- Tách chiết DNA của các mẫu thu được;

- Khuếch đại vùng HV1 trên DNA của chó nhà lấy ở A Lưới - Thừa Thiên Huế;
- Xác định halotype của chó dựa trên trình tự 582 bp trong vùng HV1;
- Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên kết quả thu được.
Ket quả đạt được sau 6 tháng nghiên cứu:

- 15 mẫu ADN thu được từ lơng chó ở A Lưới - Thừa Thiên Hue;
V


- 15 trình tự DNA của vùng HV1 thu được sau khi PCR và giải trình tự;
- Đánh giá được sự đa dạng di truyền giừa quần thế chó nhà tại A Lưới- Thừa
Thiên Huế với các khu vực khác tại Việt Nam.

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Chó nhà (ảnh do tác giả thực hiện)....................................................................... 3
Hình 1.2 Vị trí và các thành phần vùng CR trong bộ gen ty the 6.................................... 5

Hình 2.1 Vị trí địa lí các mẫu được thu trong nghiên cứu....................................................... 12
Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt mơ tả các bước nghiên cứu trong đề tài.....................................14
Hình 2.3 VỊ trí bắt cặp của mồi 15412F và 16625R8....................................................... 17
Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số của 8/15 mầu lơng chó............................................ 24

Hình 3.2 Ket quả điện di DNA tổng số của 8/15 mẫu lơng chó.................................... 25
Hình 3.3 Biểu đồ huỳnh quang (Electropherogram) của một đoạn trình tự vùng HV1
của mầu L02 được giải trình tự bằng cặp moi 15412F và 16114R.................................27

Hình 3.4 Biểu đồ huỳnh quang (Electropherogram) của mẫu L05 với các đỉnh (peak)

trên đường nền (base line)....................................................................................................28

Hình 3.5 Biểu đo huỳnh quang (Electropherogram) của một đoạn trình tự của mẫu L10
có cường độ tín hiệu giảm dần............................................................................................ 29

Hình 3.6 Biểu đồ huỳnh quang (Electropherogram) the hiện kết quả của !4 mầu giải
trình tự lại...............................................................................................................................29

Hình 3.7 Đại diện một đoạn trình tự đong nhất (consensus sequence) vùng HV1 của
mẫu L02.................................................................................................................................. 30

Hình 3.8 Đại diện đoạn trình tự đồng nhất (Consensus sequence) vùng HV1 của 15 mầu
chó nhà vùng núi A Lưới-Thừa Thiên Huế........................................................................ 31

Hình 3.9 Kết quả so sánh trình tự mầu L02 với cơ sở dữ liệu trên GenBank thơng qua
cơng cụ BLAST..................................................................................................................... 32

Hình 3.10 Đo thị mơ tả số lượng SNP xuất hiện trong 11 nhóm................................... 34
Hình 3.11 Kết quả xác định haplotype với trình tự truy vấn là mầu L03..................... 37

IX


DANH MỤC
• BẢNG BIÉU
Bảng 2.1 Cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong phản ứng khuếch đại trình tự vùng HV1 8 18
Bảng 2.2 Các thành phần có trong phản ứng khuếch đại vùng HV1.............................. 18

Bảng 2.3 Chương trình nhiệt khuếch đại vùng HV1 11..................................................... 18
Bảng 2.4 Cặp mồi sử dụng trong phản ứng trình tự vùng HV1....................................... 19

Bảng 3.1 Ket quả đo tỷ so OD và nong độ DNA thu thập được 8/15 mẫu chó nhà thu tại
A Lưới................................................................................................................................... 24

Bảng 3.2 Các SNP tìm thấy trong đoạn trình tự 582 bp vùng HV1 của 15 cá thể chó.
Các con số trong cột dọc mơ tả vị trí nucleotide. Dấu chấm (.) đại diện cho một
nucleotide trùng khóp với trình tự tham khảo,.................................................................. 35

Bảng 3.3 Sự phân bo haplogroup, haplotype của chó nhà tại A Lưới- Thừa Thiên Huế
................................................................................................................................................ 37

Bảng 3.4 Tần số haplogroup của các quần the trong nghiên cứu................................... 38

Bảng 3.5 Bảng tóm tat số lượng và loại vị trí đa hình trên đoạn trình tự 582 bp vùng
HV1 trong quần the chó nhà.................................................................................................38

Bảng 3.6 Chỉ số đa dạng ở cấp độ Nucleotide.................................................................. 39
Bảng 3.7 Tỷ lệ phân bo haplotype trong các haplogroup của các quần thế................... 41

Bảng 3.8 Mức độ đa dạng haplotype cùa các khu vực.................................................... 42

X


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẤT
pg

Microgram

pL

Microlit

pM

Micromole

BLAST

Local Alignment Search Tool

Bp

Base pair

CHD

Canis mtDNA HV1 database

CR

Control Region

D - loop

Displacement - loop

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA

Ethylenediamine tetraacetate

EtBr

Ethidium bromide

F

Forward

HV1

Hypervariable region 1

HV2

Hypervariable region 2

Kb

Kilo base

mg

Miligram

Ml

Mililit

mM

Milimol

mtDNA

Mitochondrial DNA

NCBI

National Center for Biotechnology Information

nm

Nanomet

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

R

Reverse

RNA

Ribonucleic acid

rRNA

Ribosomal RNA

SNP

Single Nucleotide Polymorphism

Taq

Thermus aquaticus
XI


TBE

Tris/Borate/EDTA

Tm

Melting Temperature

tRNA

Transfer RNA

uv

Utraviolet

VNTR

Variable number tandem repeat

Xll


ĐẶT VÁN ĐÈ
1.

Tính cấp thiết của đề tài
Chó nhà (Canis familiaris) là động vật đầu tiên được con người thuần hóa, chúng

có nguồn gốc từ Sói và được thuần hóa bởi nhùng người săn bắn. Chó được xem là một
trong những lồi động vật có mối quan hệ mật thiết với con người được con người xem

như thú cưng sống gần gũi và được đánh giá như là loài vật thông minh, trung thành với
con người nhất và theo chân con người đi khắp các lục địa trong suốt quá trình lịch sử

phát triển của chúng.

A Lưới là huyện miền núi phía Tây của dãy Trường Sơn Bắc, có độ cao trung bình
600 - 800 m so với mặt nước biển cách Thành phố Huế 70 km về phía Đơng, có đường

biên giới tiếp giáp với Lào. A Lưới là địa bàn sinh sống, ngụ cư lâu đời của đồng bào

dân tộc thiểu số. Chó được coi là người bạn đồng hành trong cuộc sống người dân mà

là cịn có vai trị quan trọng trong đời sống văn hố tín ngường tâm linh của công đồng
dân tộc thiểu số nơi đây.

Đen nay, đã có nhiều nghiên cứu di truyền về lồi chó Phú Quốc dựa trên vùng
HV1 tại TP. Hồ Chí Minh, Phú Quốc, hay chó nhà tại vùng Kiên Giang, Sóc Trăng, ...
Tuy nhiên các khu vực này đều ở vị trí đồng bằng, thuận lợi trong việc giao thương,
buôn bán trao đoi. Nhưng tại A Lưới với vị trí địa lý hiếm trở, được ngăn cách bởi dãy

Trường Sơn nên sự di chuyển giao thương, trao đổi, buôn bán giữa vùng A Lưới với các
khu vực lân cận khó khăn. Cùng với đó, chó nhà tại vùng núi A Lưới vần cịn bản tính

bản tính hoang dã khá cao cả trong hình thể lần tính cách, nên liệu có sự khác biệt di

truyền giữa chó nhà tại vùng A lưới so với các khu vực khác tại Việt Nam hay khơng?
Vì thế chúng tơi tiến hành “Khảo sát sự đa dạng di truyền ciía quần thể chó nhà tại

A Lưới - Thừa Thiên Huế dựa vào đoạn trình tự 582 bp vùng HV1 trên bộ gen ty

thể”.

2.

Mục tiêu của đề tài

2.1.

Những đóng góp mói của đề tài nghiên cứu
Định loại được haplotype của các cá thể chó nhà tại vùng A Lưới.

1


Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể chó nhà tai A Lưới dựa vào đoạn trình
tự 582 bp vùng HV1 trên bộ gen ty thể.
Nghiên cứu này sẽ bổ sung cơ sở dữ liệu chó nhà tại Việt Nam.

2.2.

Nghiên cứu sẽ giúp gì trong giải quyết vấn đề?
Đánh giá được sự đa dạng di truyền chó nhà tai A Lưới so với các khu vực khác

tại Việt Nam dựa vào đoạn trình tự 582 bp vùng HV1 hệ gen ty thể chó.

2.3.

Những điều sẽ đạt được trong quá trình nghiên cứu
Định loại được haplotype các cá the chó nhà tại vùng A Lưới.
So sánh tần suất haplotype giữa quần the chó nhà tại A Lưới với các khu vực khác

tai Việt Nam.

Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thế chó nhà tại A Lưới dựa vào trình tự

HV1, từ đó bổ sung thêm vào nguồn dừ liệu để đánh giá toàn diện hơn về sự phân bố
của quần thể chó nhà tại Việt Nam nhằm bảo tồn các nịi chó có đặc diem di truyền quý
hiếm của Việt Nam.

2.4.

Giói hạn và phạm vi nghiên cứu
Đe tài thực hiện nghiên cứu trên đoạn trình tự 582 bp vùng HV1 trên bộ gen ty the

chó. Số lượng 15 cá the chó nhà được thu thập tại vùng núi A Lưới -Thừa Thiên Huế.

2


Chương 1. Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TÔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Phân loại chó nhà

Giới: Động vật {Animalia).
Phân giới: Động vật đa bào {Metazoa).
Ngành: Có dây song {Chordata).

Phân ngành: Động vật có xương sống {Vertebrata).

Lớp: Thú {Mammalia).
Bộ: Ăn thịt {Carnivora).
Họ: Chó {Canidae).

Phân họ: Chó {Caniae).
Giơng: Chó {Canis Linnaeus, 1758).

Lồi: Chó {Canis lupus Linnaeus, 1758).
Phân lồi: Chó nhà {Canis lupus familiaris Linnaeus, 1758).

Hình 1.1 Chó nhà (ảnh do tác giả thực hiện)
3


Chương 1. Tổng quan tài liệu

1.2.

Nguồn gốc chó nhà
Chó nhà (Canis lupus familiris hay Canis familiri) là lồi được ni phổ biến và

phân bố ở khắp mọi nơi trên thế giới. Có nhiều nghiên cứu cho rằng chó nhà được thuần
hóa từ chó sói cổ đại cách đây khoảng 11.000 - 16.000 năm1, nhưng cho đến nay nguồn
gốc của chó nhà vần chưa được xác minh rõ ràng. Hiện nay, trên thế giới có khoảng 400

giống chó nhà phân bố khắp các châu lục: Châu Âu, Châu Mỳ, Châu Á1.... Hiện tại,
Việt Nam có một số giống chó địa phương và một số giống chó nhập nội; tiêu biểu nhất

của các giong chó địa phương là tứ đại danh khuyến của quốc gia là chó cộc đi

H’Mơng, chó Bắc Hà, chó Lài (Dingo Đơng Dương) và chó Phú Quốc; các giống chó

nhập nội như Becgie, Ngao Tây Tạng, Chihuahua, Huski, Alaska, Samoyed...

Các giống chó nhà Việt Nam là giống chó được ni phơ biến nhất, nhìn chung
có tầm vóc trung bình và nhỏ từ 45 - 65 cm, nặng trung bình từ 10 - 15 kg. Cơ the hơi

dài hơn so với chiều cao, thơng thường chó đực sè to hơn chó cái. Với bản tính của chó
nhà Việt Nam hiền lành, thông minh, sức khỏe tốt và trung thành với chù nên chúng

được ni với nhiều mục đích khác nhau như thú nuôi, giữ nhà hoặc làm thực phấm.

Đặc điểm để nhận biết chó nhà Việt Nam là chiều dài toàn đầu so với chiều dài mõm là
2:1, hộp sọ có hình tam giác, mõm chó hình chừ V nhọn chiếm khoảng 1/3 so với khuôn

mặt, đầu mõm hơi nhọn, gốc mõm khá rộng, cân đối với tổng thế chiều dài của đầu. Mũi
có màu đen lười có màu hồng nhạt hoặc có đốm màu đen ở lưỡi. Tai nằm hai bên hộp
sọ, dựng đứng như hình vỏ sị hoặc hướng ra phía trước. Tai to vừa phải, cân đối, khơng
nhọn, mặt trong tai có ít lơng. Neu nhìn thăng trực diện thì hai tai dựng đứng, vng góc

với đỉnh sọ. Mắt có màu đen hoặc có màu nâu. Các màu lông phổ biến là màu lông dở
lửa, đen tuyền, trắng, xám, nâu hoặc vện. Sức đề kháng của chó nhà Việt Nam khá tốt
gần như khó mắc bệnh, khả năng kháng bệnh cao, thích nghi với điều kiện mơi trường
nhiệt đới gió mùa của Việt Nam2.
Chó nhà Việt Nam bắt đầu sinh sản khi được 12 tháng tuổi, chó thường sinh từ 4

đến 8 con trên một lần mang thai, có trường họp có the sinh đến 10-12 con. Thời gian

mang thai của chó nhà khoảng từ 60 - 62 ngày. Tỉ lệ song sốt của mồi cá the chó sơ sinh
đến khi trưởng thành là hơn 80%2.

4

Chương 1. Tổng quan tài liệu

1.3.

Đặc điểm di truyền của bộ gen ty thể động vật
ở động vật, ngoài bộ gen trong nhân cịn có bộ gen tế bào chất nằm trong ty thể

chiếm tỷ lệ từ 1 - 5 % của tế bào, có dạng vịng với kích thước khoảng 15,7 - 19,5 kb.
Mồi ty thể có 2 - 10 bản sao DNA, mồi tế bào có từ 100 - 1000 ty thể tùy thuộc vào
loại tế bào3, nên số lượng bản sao DNA ở ty thể rất lớn. DNA ty thể có tỷ lệ đột biến
nhanh hơn 10-25 lần bộ gen nhân do cơ che sửa sai không hiệu quả trong quá trình tái
bản DNA4.

Trình tự genome ty thể ở chó nhà (Canis lupus familiaris) được Kim và cộng sự

cơng bố vào 1998 có cấu trúc dạng vịng với chiều dài 16728 bp, chiều dài này còn tùy
thuộc vào vùng motif 5’ - GTACACGT(A/G)C - 3’ lặp lại, số lần lặp lại của motif làm
thay đổi kích thước ty thể. Bộ gen ty thể chứa vùng không mã hóa CR dài 1270 bp, 13
gen mà hóa protein, 22 gen mã hóa tRNA, 2 gen mã hóa cho rRNA (12S và 16S rRNA)5.

Vùng CR (Control Region) hay còn gọi vùng D-loop (Displacement - loop) bat
đầu từ 15458 - 16727 bp đóng vai trị quan trọng trong việc điều khiển quá trình phiên
mã, chứa điểm khởi đầu sao chép và các promoter cho quá trinh phiên mã5. Vùng D -

loop chia làm 3 vùng riêng biệt gồm vùng siêu biến 1 (Hypervariable region 1 - HV1),
vùng siêu biến 2 (Hypervariable region 2 - HV2), vùng lặp lại song song (Variable

number tandem repeat - VNTR).

Hình 1.2 Vị trí và các thành phần vùng CR trong bộ gen ty thể 6
5


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Vùng siêu biến 1 (Hypervariable region 1 - HV1): nằm ở đầu 5’ của vùng CR,
dài khoảng 672 bp. Đây là một vùng rất đa hình, được sử dụng để phân tích, xác định
haplotype tương tự như vùng HV1 cùa người. Đây cũng là một mối quan tâm của pháp

y vì HV1 có thể khuếch đại và xác định haplotype từ các mẫu DNA bị thoái biến nghiêm
trọng. Himmelberger và cộng sự (2008) cho thấy 32 đột biến xuất hiện ở vùng HV1 thì
1/3 trong số đó tập trung ở đoạn 60bp hay cịn gọi là đoạn “hotspot” hay “điểm nóng”.

“Điểm nóng” được dùng làm phương tiện sàng lọc sơ bộ các mẫu và rất phù hợp trong
các trường hợp DNA bị các tác nhân gây suy thoái hoặc nhiềm bấn.

Vùng siêu biến 2 (Hypervariable region 2 - HV2): nằm ở đầu 3’ của vùng CR,
dài khoảng 350 bp, có tốc độ tiến hóa chậm hơn HV1 từ 10-20 lần. Đây là vùng bảo thủ
nhất có chứa một số đơn vị cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không thay đổi ngay

cả ở bậc phân loại họ. Một đoạn trình tự lặp lại (Variable number tandem repeat): nằm
giữa HV1 và HV2 với 10 nucleotide lặp lại khoảng 30 lần. số lần lặp lại tùy vào mồi cá

thể nên trình tự này gây ra khó khăn trong q trình nghiên cứu và thường được loại đi
khi phân tích di truyền vùng CR.

1.4.

Các nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của chó dựa vào trình tự HV1

của vùng CR trên bộ gen ty thể

1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Sau khi tồn bộ trình tự bộ gen ty the chó cùa Kim và cộng sự cơng bố vào năm
19985 thì cho đen nay nhiều nhóm nghiên cứu ở các nước khác nhau tiến hành truy tìm

nguồn gốc cũng như đánh giá đa dạng di truyền quần the chó dựa vào trình tự vùng H V1.
Một trong những nghiên cứu mtDNA đầu tiên ở chó nhà được thực hiện bởi Vila

và cộng sự2 đã hỗ trợ thêm cho các bằng chứng về khảo cổ học cho rằng Sói là tổ tiên
của chó nhà. Khi đó nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân tích đoạn trình tự 261 bp vùng

HV1 của 162 con chó Sói ở 27 quốc gia khác nhau trên thế giới và 140 con chó nhà đại
diện cho 67 nịi chó khác nhau. Ket quả phân tích đã cho thấy vùng HV1 của chó nhà
và Sói có tính đa hình rất cao. Khi đó qua kết quả định loại haplotype đã xác định được
27 haplotype ở chó Sói, 26 haplotype ở chó nhà. Khi phân tích các vị trí đa hình trên

vùng trình tự này đã cho thấy trình tự của chó nhà khác với trình tự của chó Sói khơng
6


Chương 1. Tổng quan tài liệu

nhiều hơn 12 vị trí thay thế trong khi so sánh trình tự chó nhà với chó rừng và chó Sói

đồng cỏ (coyotes) thì có ít nhất 20 vị trí thay thế và 2 vị trí chèn khác nhau. Ket quả này
góp phần khẳng định thêm chó nhà có nguồn gốc từ Sói. Ngồi ra, sự phân kỳ trình tự

giũa các nhóm trình tự này cũng cho thấy chó nhà có nguồn gốc cách đây hơn 100.000

năm15.
Nguồn gốc của chó nhà từ Sói đà được xác định, tuy nhiên số lượng nhừng sự

kiện này diễn ra một lần hay nhiều lần và diễn ra ở nơi nào vào thời diem nào vẫn chưa
được biết đến một cách tường tận. Đê góp phần trả lời nhứng câu hỏi trên Savolainen

và cộng sự (2002)16 đã phân tích tính đa dạng di truyền vùng trình tự 582 bp thuộc vùng

HV1 của 654 con chó nhà đại diện cho tất cả các quần thể lớn trên the giới bao gồm cả
Châu Âu, Châu Á, Châu Phi, Bắc Mỹ và 38 cá the chó Sói thuộc lục địa Á-Âu

(Eurasian). Qua phân tích phát sinh chủng lồi, bước đầu nhóm nghiên cứu đã cho thấy
tất cả các nhóm chó nhà trên thế giới được chia thành 6 nhóm phát sinh chủng lồi từ
(A - F) và có nguồn gốc từ ít nhất 5 dịng Sói cái khác nhau. Ngồi ra khi phân tích sự

đa dạng di truyền giừa các nhóm chó nhà với nhau đã cho thấy chó nhà trên thế giới có
hơn 95,9%trình tự thuộc các nhóm haplotype pho qt (A, B, C), trong đó 71,3% cá the
thuộc nhóm A. Nhóm A đại diện cho tất cả các nhóm chó nhà trên thế giới, nhóm B,

c

cũng đại diện cho tất cả các nhóm chó nhà ở các vùng địa lý khác nhau ngoại trừ Châu

Mỹ. Vì vậy, 3 haplogroup (A, B, C) này cấu thành một nguồn chung với tỉ lệ đa dạng
mtDNA rất cao của tất cả các quần thể chó nhà. Như vậy ba nhóm (A, B, C) chiếm hầu

hết tất cả các kiểu haplotyle khác nhau ở tất cả các quần thể chó nhà, hơn nừa tần sổ của
các nhóm (A, B, C) lại tương tự nhau ở tất cả các khu vực địa lí. Hơn nữa, ko có sự phân

chia rõ ràng về mặt hình thái cũng như các giống chó có kích thước lớn hay nhở nên tỉ

lệ phân bố của 3 haplogroup này, điều này cho thấy sự đa dạng về hình thái của các lồi
chó khơng phải là kết quả của sự thuần hóa chó Sói ở từng khu vực địa lí riêng lẻ, bởi

vì các haplotype thuộc các haplogroup (D, E, F) chỉ được tìm thấy ở một số vùng như
Tho Nhĩ Kỳ, Tây Ban Nha, Scandinavia, Nhật Bản, Hàn Quốc, Siberia. Ket quả trên đã

gợi ý rằng phần lớn chó nhà ngày nay có nguồn gốc chung từ một vốn gen duy nhất
chứa các nhóm phổ qt (A, B, C). Ngồi ra, từ kết quả phân tích đa dạng di truyền
trong nghiên cứu này đã chỉ ra chó nhà ở Đơng Á có sự đa dạng di truyền lớn hon so

7


Chương 1. Tổng quan tài liệu

với các khu vực địa lý còn lại, kết quả này cùng với sự phân tích phát sinh chủng lồi ờ
từng khu vực địa lý đã gợi ý rằng chó nhà có nguồn gốc từ Đông á cách đây khoảng
15.000 năm16.
Gokcek (2005) sử dụng đọan trình tự 585 bp vùng HV1 để phân tích mối quan
hệ di truyền giữa chó Kangal và chó Akbash của Thổ Nhì Kỳ. So sánh 105 trình tự của

chó Kangal và 9 trình tự của chó Akbash cho thấy tỉ lệ suất hiện SNP của chó Kangal

(5,12%) cao hơn chó Akbash (3,08%) nhung tỷ lệ đa dạng Hyplotype cùa chó Akbash
(55,56%) lại cao hơn chó Kangal (20,96%). Dựa vào trình tự vùng HV1, chó Kangal có

mối quan hệ di truyền gần với nhũng con chó Bắc Âu và Tây Nam Á hơn, trong khi đó
Akbash lại có mối quan hệ di truyền gần với chó Châu Âu và Đơng Á. Ngồi ra, chó

Kangal mang một haplotype chỉ tìm thấy ở những con chó Bắc Âu, Bồ Đào Nha, Tho

Nhĩ Kỳ và một con chó Tây Ban Nha những khơng có ở chó Akbash, Trung Đơng, Châu
Âu, Đơng Á và Ấn Độ. Ket quả phân tích dựa trên đoạn trình tự 585 bp vùng HV1 cho

thấy chó Kangal và chó Akbash khá khác biệt nhau về di truyền Sindiele và cộng sự
(2011) sử dụng đoạn trình tự 281 bp vùng HV1 như là một cơng cụ để nhận diện lồi và
phân biệt chó sói với chó Croatia. Ket quả nghiên cứu đà xác định được 12 haplotype

có Croatia với 17 SNP (6,0%) và 4 haplotype chó sói với 11 SNP (3,9%). Các haplotype
chó Croatia khác nhau từng đơi trong khoảng 1(0,3%) đến 10(3,6%) SNP, các haplotype

sói khác nhau từng đơi trong khoảng 1(0,3%) đến 9(3,2%) SNP. Sự khác biệt giữa
haplotype chó sói với chó Croatia từ 3 đến 12 SNP.

Một cơng trình nghiên cứu của Himmelberger và cộng sự (2008)7 đã phát hiện

một đoạn trình tự đặc biệt nằm ở vị trí 15.595-15.654 trên cùng HV1 mtDNA chó. Các

vị trí đa hình này được xem như một cơng cụ tiềm năng và giá trị trong việc phân tích
các mẫu DNA với số lượng ít hoặc bị suy thối trầm trọng. Ngồi ra, nhóm nghiên cứu

cũng phân tích và tìm hiếu về đặc diem di truyền của mtDNA chó nhà. Ket quả nghiên
cứu cho thấy có 16 haplotype (44,44%) và 32 SNP (5,26%) được tìm thấy trong 36 các
the. Tiếp tục so sánh với 201 trình tự chó nhà, 2 trình tự chó soi và 2 trình tự chó sói

đồng cở Bắc Mỳ phát hiện thấy 66 haplotype, trong đó có 62 haplotype (99,94%) chỉ
xuất hiện ở chó nhà và có 14 haplotype (22,58%) xuất hiện với tần số cao trong số 16
haplotype đã nhận diện. Baute và cộng sự (2008) cũng đă sử dụng đoạn trình tự 60 bp
8

Chương 1. Tổng quan tài liệu

của 83 cá thể chó nhà và xác định được 18 SNP (12,41%) và 19 haplotype (22,89%)
nhằm phục vụ các phân tích pháp y. Ket quả của nghiên cứu nhấn mạnh sự mạnh mè và

hữu hiệu khi sử dụng đoạn trình tự 60 bp trong việc sàng lọc nhanh chóng các mẫu phân
tích cũng như giúp định loại các mầu DNA bị suy thoái trầm trọng.

Hiện nay, giống chó Ngao Tây Tạng - là giống chó lâu đời có kích thước lớn,

lớp lơng dày thích nghi với mọi thời tiết khắc nghiệt nhất, có bản tính hung dừ, sống ở

vùng cao nguyên Tây Tạng Tuy nhiên, nguồn gốc của giống chó Ngao Tây Tạng và mối

quan hệ phát sinh lồi cùa nó với nhùng giống chó kích thước lớn khác như Saint
Bernard là khơng rõ ràng. Li và Zhang (2012)3 đã tiến hành phân tích trình tự 582 bp
vùng HV1 đe truy tìm nguồn gốc chó Ngao Tây Tạng. Nhóm nghiên cứu tiến hành so
sánh, phân tích trình tự 51 cá the chó Ngao Tây Tạng với 439 trình tự các nịi chó nhà,
95 trình tự sói xám và 24 trình tự chó hoang đồng cỏ. Ket quả nghiên cứu cho thấy có

tất cả 15 haplotype đều thuộc haplogroup A. Tỷ lệ haplotype của chó Ngao Tây Tạng
(15/50) cao hơn so với chó khu vực Đơng Á (121/730), trong đó có 5 haplotype chung

(A51, A95, AI 17, A55, A53) với quần thể chó nhà khu vực Đông Á và một haplotype

A151 chung với quần the chó nhà từ Ấn Độ. Ket quả cũng chó thấy rằng chó Ngao Tây
Tạng có thể bắt nguồn từ phía đơng dãy Himalayas hơn là phía tây. Điều đặc biệt hơn
nữa, chó Ngao Tây Tạng cùng sống với chó nhà ở cao nguyên Tây Tạng và chó Nhật

Bản có chung 3 haplotype Al 1, AI9 và A29 cho thấy giữa hai quần thể này có mối liên

kết với nhau về mặt di truyền.
Như vậy có the thấy trình tự HV1 của vùng CR mtDNA là công cụ đắc lực giúp

truy tìm nguồn gốc tiến hóa giừa các nịi, lồi. Thơng qua việc xác định vị trí đa hình

đơn (SNP) và định loại haplotype có thể giúp phân biệt các cá thể trong quần thể, phân
tích, đánh giá và so sánh mức độ đa dạng di truyền giừa các quần thể cùng lồi, sự di cư

phân tán, truy tìm nguồn gốc của quần thế chó nhà tại Việt Nam.

1.4.2. Các nghiên cứu trong nước
Đen nay tại Việt Nam việc đánh giá đa dạng di truyền, truy tìm nguồn gốc quần

the chó Phú Quốc dựa vào dựa vào trình tự DNA vùng HV1 của bộ gen ty the ngày càng
được tập trung nghiên cứu.

9


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Thái Ke Quân và cộng sự (2016)8'9 tiến hành đánh giá đa dạng di truyền chó lưng
xốy Phú Quốc dựa vào đoạn trình tự 582 bp vùng HV1 trên 30 cá thể chó lưng xốy
Phú Quốc song tại huyện đảo Phú Quốc. Nhóm nghiên cứu đã phân tích và định loại
haplotype các cá the chó lưng xốy Phú Quốc kết quả phân tích cho thấy có 28 vị trí đa
hình trên đoạn trình tự khảo sát định loại được 11 haplotype thuộc 4 haplogroup A, B,

c, E trong đó haplogroup phổ quát A, B, c chiếm 83,33% (haplotype Bl, Al 1, A18, C3
lần lượt chiếm 30%, 16,67%, 10%, 10%), tỷ lệ này tưong tự với các quần thế chó nhà

khác trên khắp thế giới, và điều đáng ngạc nhiên ở nghiên cứu này là tỷ lệ haplotype
nhóm E lên đến 16,67%. Trái lại, tỷ lệ này xuất hiện trên thế giới (chỉ chiếm 1-2%) và

phân bố hạn hẹp ở khu vực Đông Á như Shiba Nhật Bản, Indo Hàn Quốc, Shar-Pei
Trung Quốc và Pungsang Triều Tiên. Việc haplotype nhóm E xuất hiện với lỷ lệ cao

(16,67%) ở chó lưng xốy Phú Quốc điều này đặt ra nghi vấn liệu những cá thể chó này
bắt nguồn từ chó nhà ở đất liền Việt Nam hay từ các nước Đơng Á nơi có các cá thể

mang haplotype E.
Đe trả lời cho vấn đề đặt ra này, Thái Ke Quân và cộng sự (2016)9 tiến hành phân
tích đánh giá đa dạng di truyền của 30 cá thể chó nhà được thu thập tại Thành phố Hồ

Chí Minh và các tỉnh lân cận dựa vào đoạn trình tự 582 bp vùng HV1. Ket quả đã xác
định được 27 vị trí đa hình bao gồm 1 vị trí chèn mới, 16 haplotype thuộc 3 nhóm
haplogroup phổ quát A, B, c lần lượt 63,33%, 20%, 16,67% trong đó có 3 haplotype

mới được tìm thấy cụ thế có 2 haplotype A mới (Anl, An2) và 1 haplotype c mới (Cnl).

Kết quả này cho thấy sự da dạng di truyền quần thể chó nhà cao hơn quần thể chó lưng

xốy Phú Quốc (11 haplotype được phát hiện ở quần thể chó lưng xốy Phú Quốc),
trong đó đó có 6 haplotype (Al 1, A18, A24, Bl, C2, C3) chung của cả hai quần the và

khơng xuất hiện haplotype E nào ở quần thể chó nhà tại Thành Phố Hồ Chí Minh và các
tỉnh lân cận. Điều này cho thấy khơng có mối quan hệ di truyền gần gũi nào giữa quần

thể chó nhà tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận đối với quần thể chó lưng
xốy Phú Quốc.

Một giả thuyết được đặt ra về nguồn gốc chó lưng xốy Phú Quốc có the bắt

nguồn từ quần the chó nhà mang haplogroup E tại Thái Lan phát tán ra các quốc gia lân
cận như Campuchia và một số tỉnh lân cận tại vùng biển Tây Nam của Việt Nam trong
10


Chương 1. Tổng quan tài liệu

đó có thành phố Rạch Giá - Kiên Giang, và sau đó cũng được mang đen đảo Phú Quốc

thông qua con đường giao thương buôn bán. Đe làm rõ giả thuyết này, Nguyền Thành

Công (2017)10 đánh giá sự đa dạng di truyền cùa 100 cá the chó nhà lưng khơng xốy
tại huyện đảo Phú Quốc và Thành phố Rạch Giá Kiên Giang.

Kết quả nghiên cứu đã xác định được 20 haplotype thuộc 4 halogroup khác nhau,
trong đó nhóm haplotype phố quát chiếm 93%, cụ the: A chiếm 54%, B chiếm 32%,

c

chiếm 7% (có 1 haplotype mới được tìm thấy chưa từng cơng bố trước đây được ký hiệu

Cn) và haplogroup E chiếm 7%. Ket quả nghiên cứu cũng đưa ra những bằng chứng cho
thấy giả thuyết chó nhà tại đảo Phú Quốc có nguồn gốc trực tiếp từ đất liền Việt Nam

và một phần chỉ chịu ảnh hưởng từ quần thể chó nhà từ Thái Lan. Từ kết quả nghiên
cứu này có thể giải thích chó lưng xốy Phú Quốc có tỷ lệ haplotype cao (16,67%) như

vậy rất có the chó nhà được người dân mang theo trong quá trình di cư từ đất liền lên

đảo Phú Quốc, các cá thể chó nhà mang haplotype A, B, c, E sống trong điều kiện thiếu

thốn cách ly về mặt địa lý thì những con chó mang đặc tính hoang dã phát triển tốt hơn,
đồng thời gây đột biến gen R trong quan hệ đồng huyết (đột biến gen Ridge - xoáy lưng

nằm trên NST số 18, chó có xốy lưng mang kiểu gen R/R, R/r, chó bình thường mang
gen r/r) đột biến nên làm tỷ lệ chó lưng xốy Phú Quốc trên đảo tăng cao hơn so với các

khu vực khác.

11


Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1.

Noi thực hiện, thời gian thực hiện
Đe tài được thực hiện từ tháng 3 đến tháng 9 năm 2020 tại Khoa Công Nghệ Sinh

Học - Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, số 298A-300A, phường 13, Quận 4, Tp. Hồ

Chí Minh.

2.2.

Vật liệu nghiên cứu

2.2.1. Thu mẫu và ghi nhận các thông tin

Thu mầu lông và ghi chép thơng tin của 15 cá thế chó tại A Lưới ghi nhận tên
(nếu có), giới tính, màu lơng và địa điếm thu mầu. Chụp ảnh làm tư liệu được the hiện
trong phần phụ lục B.

Hình 2.1 VỊ trí địa lí các mầu được thu trong nghiên cứu

12


Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Hóa chất
Tất cả các hóa chất sử dụng cho đề tài dùng đế: lấy mầu, tách chiết DNA, trong
kỳ thuật PCR, điện di... theo chuẩn sinh học phân tử được thể hiện trong phần phụ lục

A.

2.2.3. Dụng cụ và thiết bị
Tất cả các loại dụng cụ, thiết bị, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này dùng đe
tách chiết DNA, điện di, thực hiện phản ứng PCR,... theo chuẩn sinh học phân tử được

the hiện trong phần phụ lục A.

2.2.4. Các phần mềm sử dụng trong nghiên cứu

FinchTV 1.4.0-. là phần mềm hỗ trợ xem và hiệu chỉnh trình tự nucleotide được
giải bằng hệ thống ABI dưới dạng biểu đo huỳnh quang, cho phép người dùng có the
sao lưu, hiển thị lại kết quả hiệu chỉnh chính xác, trình tự sau khi hiệu chỉnh được sử

dụng cho các ứng dụng khác nhau trên NCBI,...

SeaView 4.5.4\ là phần mềm thiết kế các tính năng hỗ trợ người dùng trong việc
sắp xếp, gióng cột thắng hàng nhiều trình tự, hiệu chỉnh trình tự (chèn, xóa, thay thế)

nucleotide, phân tích, xây dựng cây phát sinh chủng lồi.

MEGA 7.0\ ngồi tính năng hiệu chỉnh trình tự, gióng cột thẳng hàng các trình
tự nucleotide, phần mềm cịn giúp người dùng tìm kiếm vùng bảo tồn, vị trí đa hình đon
nucleotide một cách nhanh chóng. Phần mềm dị tìm mơ hình tiến hóa tối thích, xây

dựng cây phát sinh chủng loài bằng phưong pháp tiết giảm tối đa (Maximum Parsimony),
khả năng tối đa hóa (Maximum Likelihood) và kết nối kế cận (Neighbor - Joining).

DnaSP v6: DnaSP (DNA Sequence Polymorphism) là phần mềm tính tốn một
số phép đo sự đa hình dựa trên trình tự DNA của các cá thể trong quần thể và giừa các

quần the với nhau. Tính tốn các chỉ số đa dạng di truyền cơ bản như mất cân bằng liên
kết. dòng chảy gen (gen flow), tái to hợp, hoán vị gen, hồ trợ so sánh các chỉ số đa dạng

di truyền cơ bản. DnaSP có the xử lý bộ dừ liệu với số lượng lớn trình tự DNA với chiều

dài hàng ngàn nucleotide. Dễ dàng chuyển đổi dừ liệu với các phần mềm khác như gióng
cột thắng hàng nhiều trình tự, phân tích cây phát sinh chủng lồi, phân tích thống kê.

13


Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Ngoài ra, DnaSP giúp định dạng, chuyến đổi dừ liệu trình tự hồ trợ cho xây dựng mạng

luới haplotype (median-joining network).

2.3.

Phưong pháp nghiên cứu

Thu thập và xử lý mẫu lơng chó

Tách chiết DNẠ tổng số từ lơng chó

Khuếch đại, giải và hiệu chinh trình tự
V

So sánh trình tự với cơ sở dữ liệu GenBank
Phân tích đoạn trình tự 582 bp vùng HV1 cũa 15 mẫu lơng chó

Đánh giá đa dạng di truyền

Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt mơ tả các bước nghiên cứu trong đề tài
2.3.1. Phương pháp thu mẫu
Chúng tôi dựa vào các tiêu chuẩn hình thái của chó nhà được đưa ra bởi Hiệp hội

những người ni chó giống Việt Nam (VKA: Vietnam Kennel Association - VKA).

Các cá the chó nhà được lựa chọn đe thu mầu tại A Lưới là chó trưởng thành (từ 1 tuoi),
có sức khỏe tốt, không mang bệnh, được điều tra kỳ về lý lịch di truyền nhằm tránh quan
hệ cùng huyết. Các mầu được chọn ngầu nhiên khơng phân biệt giới tính, màu lơng,...

Sử dụng kẹp đã lau sạch bằng cồn 70° đe thu mẫu, đảm bảo lấy đươc phần gốc
nhằm giúp cho việc tách DNA tong so thu được lượng nhiều nhất có thế, sau khi thu

thập mẫu lông bỏ vào túi Zip-lock có khóa để tránh rơi vãi gây tạp nhiễm, trên túi mồi
mẫu ghi đầy đù thông tin của mầu đe tránh nhầm lẫn, chụp ảnh sau đó bỏ vào thùng xốp
có túi đá khơ trừ lạnh và được chuyển về phịng thí nghiệm. Đẻ tránh tạp nhiễm các mầu

với nhau, sau khi thu mồi mầu kẹp lấy mẫu được lau sạch bằng cồn 70°. Mầu sau khi

14


Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
được chuyển về phịng thí nghiệm được trừ bảo quản ở -20°C để sử dụng cho các bước
tiếp theo.

Phương pháp tách chiết DNA tổng số được tách chiết theo quy trình của kit The

ISOLATE II Genomic DNA Kit - BIOLINE.

2.3.2. Phuong pháp tách chiết DNA tổng số
Dựa vào nguyên tắc chung như: phá vờ màng tế bào cần sử các chất tay mạnh có

khả năng làm xáo trộn cấu trúc của màng đơi phospholipid, DNA trong và ngồi nhân

sè được giải phóng cùng với các protein. Sau đó, để loại bở hồn tồn protein sẽ dựa
trên ngun tắc hịa tan khác nhau của DNA và protein trong hai pha dung mơi khơng

hịa lẫn như sử dụng các thành phần như Phenol: Choloroform: Isoamyl alcohol với tỷ

lệ 25:24:1. Cuối cùng DNA được rửa tủa bang ethanol 70% lạnh, sau đó được phơi trong
be on nhiệt 10 phút.

Mầu được tách chiết theo quy trình của BIOLINE kit:

Bước 1: Lấy khoảng 50 sợi lông cắt từng đoạn nhỏ bỏ vào ống eppendoft 1,5mL,

thêm 180pL dung dịch ly giải GL sau đó đơng lạnh mầu trong nitơ lỏng rồi rằ đông mẫu

ở 56°c trong bê ủ nhiệt. Làm đông/rã đông lặp lại 4 lần.
Bước 2: Thêm 25 pL Proteinase K và đem ủ qua đêm ở 56°c, thỉnh thoảng lắc
đều và vortex.

Bước 3: Vortex mẫu và thêm 200pL dung dịch ly giải G3, vortex đều và ủ ở 70°C
trong 10 phút.

Bước 4: Vortex và thêm 210pL ethanol (96 - 100%), vortex đều.
Bước 5: Chuyển mẫu sang cột spin, ly tâm 11000 X g trong 1 phút, loại bỏ dung

dịch phía dưới.
Bước 6: Thêm 500pL dung dịch rửa GW1, ly tấm 11000 X g trong 1 phút, loại
bỏ dung dịch, sau đó thêm 600juL dung dịch rửa GW2, ly tâm 11000 X g trong 1 phút,

loại bỏ dung dịch.
Bước 7: Ly tâm 11000 X g trong 1 phút, loại bỏ cồn cịn sốt lại, chuyển cột Spin
vào một ống tube khác.

15