Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể chó nhà tại khu vực thành phố Huế dựa vào trình tự vùng HV1 (Hypervariable Region 1) trên bộ gene ty thể

ĐẠI HỌC
NGUYEN TẤT THÀNH
NGUYEN TAT THANH

THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THựC DANH - THỤC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ Sự ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẢN THẺ CHÓ
NHÀ TẠI KHU Vực THÀNH PHÓ HUẾ DựA VÀO TRÌNH

Tự VỪNG HV1 (HYPERVARIABLE REGION 1)
TRÊN Bộ GENE TY THẺ

Sinh viên thực hiện
Mã số sinh viên
Giáo viên hướng dần

TP.HCM, 2020

Nguyễn Phương Anh
1411535468
ThS. Nguyền Thành Công


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
TĨM TẮT................................................................................................................................ i

SUMMARY............................................................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH.......................................................................................iii

DANH MỤC BẢNG.............................................................................................................iv
DANH MỤC CHỮ VIÉT TẤT........................................................................................ V

1. Lí do chọn đề tài..................................................................................................... vii
2. Mục đích nghiên cứu............................................................................................. viii

3. Nhiệm vụ nghiên cứu............................................................................................ viii
4. Đối tượng nghiên cứu............................................................................................ viii

5. Phạm vi nghiên cửu............................................................................................... viii
CHƯƠNG 1. TÔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................... 1

1.1.

Giới thiệu về giống chó nhà................................................................................1

1.1.1. Phân loại............................................................................................................. 1
1.1.2. Đặc điểm chung của giống chó nhà.................................................................... 1
1.1.2.1. Đặc điểm phần đầu của chó............................................................................ 2
1.1.2.2. Đặc điểm phần thân của chó........................................................................... 2

1.1.2.3 Đặc tính di truyền của hệ gen ti thể ở động vật có xương sống........................ 3
1.2.

Các nghiên cứu về sự đa dạng di truyền góp phần tìm hiểu thêm nguồn gốc chó

nhà dựa trên trình tự hệ gen ty thể (mtDNA)................................................................. 4

1.2.1. Hệ gen ty thể ở động vật hữu nhũ nói chung vàchó nhà nói riêng..................... 4
1.2.2. Ty thê trong nghiên cứu đa dạng di truyền........................................................ 5
1.2.3. Các nghiên cứu trên thế giới về đa dạng di truyền của chó............................... 5
1.2.4. Các nghiên cứu đa dạng di truyền trong nước....................................................8
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu............................ 10

2.1.

Địa diêm nghiên cứu......................................................................................... 10

2.2.

Vật liệu.............................................................................................................. 10


2.2.1. Mầu vật nghiên cứu........................................................................................... 10
2.2.2. Tiêu chuân chọn mầu........................................................................................ 10
2.2.3. Hóa chất.............................................................................................................11
2.2.4. Dụng cụ và thiết bị............................................................................................ 11
2.2.5. Phần mềm.......................................................................................................... 11
2.3.

Phương pháp nghiên cứu...................................................................................20

2.3.1. Thu mẫu............................................................................................................ 20
2.3.2. Tách chiết DNA tổng số................................................................................... 20
2.3.3. Phân tích, kiểm tra độ tinh sạch của DNA........................................................ 21
2.3.4. Điện di DNA trên gel agarose...........................................................................23
2.3.5. Khuếch đại trình tự vùng HV1 bằng kỳ thuật PCR.......................................... 23

2.3.6. Giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự................................................................... 24

2.3.6.1. Giải trình tự sản phẩm PCR........................................................................... 24
2.3.6.2. Hiệu chỉnh trình tự........................................................................................ 25
2.3.7. So sánh với cơ sở dừ liệu GenBank................................................................. 26
2.3.8. Định loại haplotype ( kiểu đơn bội)................................................................. 27

2.3.8.1. Các chỉ số đa dạng di truyền.......................................................................... 28
CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 30

3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số.......................................................................... 30
3.2. Kết quả khuếch đại vùng HV1............................................................................. 32
3.3. Ket quả giải trình tự và hiệu chỉnh vùng HV1..................................................... 32

3.3.1. Kết quả giải trình tự.......................................................................................... 32
3.3.2. Hiệu chỉnh và lắp ráp trình tự vùng HV1......................................................... 33
3.3.3. Ket quả so sánh trình tự truy vấn của các mầu nghiên cứu với các cơ sở dừ liệu
trên Gen Bank............................................................................................................... 34

3.4. Ket quả xác định haplotype từ 10 cá thể chó nhà................................................ 35


3.5. Sự đa dạng di truyền Vùng HV1 của quần thể chó nhà khu vực thành phố Huế 36
3.5.1. Sự đa dạng ở cấp độ nucleotide....................................................................... 36
3.5.2. Sự đa dạng ở cấp độ haplotype........................................................................ 39
3.6. So sánh sự đa dạng di truyền của quần thể chó nhà tại khu vực thành phố Huế với
một số quần thê chó nhà khác tại Việt Nam và một số giống chó khác trên thế giới...41

3.6.1. So sánh sự đa dạng di truyền của quần thể chó nhà tại khu vực thành phố Huế
với một số quần thể chó khác tại Việt Nam................................................................. 41

3.6.2. So sánh sự đa dạng di truyền của quần the chó nhà khu vực thành phố Huế với
một số quần thể chó nhà khác trên thế giới.................................................................. 44
KÉT LUẬN...........................................................................................................................46
KIÉN NGHỊ......................................................................................................................... 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................. 48


TÓM TẮT
Những năm gần đây, việc nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của chó ở Việt

Nam trở nên phổ biến. Nên đề tài: “Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể
chó nhà tại thành phố Huế dựa vào vùng HV1 trên bộ gene ty thể” được thực hiện

từ tháng 2/2020 đến tháng 8/2020 được thực hiện tại Khoa công nghệ sinh học NTT Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, số 298A-300A, Phường 13, Quận 4, Tp. Hồ Chí

Minh. Đe tài thực hiện với mục tiêu Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần the chó

nhà và so sánh sự đa dạng di truyền của quần thể chó nhà tại khu vực thành phố Huế

với các quần thể chó nhà tại các khu vực địa lý khác nhau của Việt Nam.
Đe tài có các nội dung như sau:

-

Thu được mẫu lơng của chó tại khu vực Huế;

-

Tách chiết được DNA các mẫu thu được;

-

Khuếch đại được trình tự vùng HV1 của các cá thể chó nhà khu vực Huế;

-

Định loại được halotype của chó dựa trên trình tự 582 bp vùng HV1;

-

Đánh giá đa dạng di truyền từ kết quả thu được.

Những kết quả đạt được sau 6 tháng nghiên cứu:
1. Thu được 15 mầu DNA từ lơng chó ở khu vực Huế
2. Sau khi PCR và giải trình tự có được 15 đoạn DNA vùng HV1.

3. Xác định được 12 haplotype thuộc 2 haplogroup (A, B) khác nhau trong đó có
3 haplotype mới (Ani. An2, Bni) chưa từng xuất hiện trong các nghiên cứu trước

đây.
4. Đánh giá được sự dạng di truyến thông qua các chỉ số đa dạng di truyền cơ bản.


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Chó nhà.......................................................................................................... 1
Hình 1.2 Hệ gene ty thể của chó nhà............................................................................ 3
Hình 1.3 Vùng trình tự HV-1....................................................................................... 4

Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp thực hiện đề tài.............................................................. 13
Hình 3.1 Đại diện kết quả điện di DNA tổng sổ của 8/15 mầu trong đề tài M: Ikb

DNA Ladder Marker chuẩn.......................................................................................... 24
Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng HV1 của 8/15 mầu chó nhà............... 26
Hình 3.3 Biểu đồ huỳnh quang (Electropherogram) của một đoạn trình tự vùng HV1

của mẫu H3................................................................................................................... 27
Hình 3.4 Đoạn trình tự đồng nhất (Consensus sequence) vùng HV1 của mẫu H3..... 28
Hình 3.5 Đại diện đoạn trình tự đồng nhất (Consensus sequence) vùng HV1 của mười

lăm mầu chó nhà..........................................................................................................28
Hình 3.6 Đại diện kết quả so sánh trình tự truy vấn của mẫu H3 với cơ sở dữ liệu trên

GenBank...................................................................................................................... 29
Hình 3.7 Ket quả xác định Haplotype với trình tự truy vấn là mầu H3....................... 30

iii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Thơng tin về kí hiệu mầu, giới tính, màu lơng và địa điểm thu thập mầu.... 10
Bảng 2.2 Cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong phản ứng khuếch đại trình tự vùng HV1.. 16
Bảng 2.3 Các thành phần có trong phản ứng khuếch đại vùng HV1........................... 16
Bảng 2.4 Chu trình nhiệt khuếch đại vùng HV1.......................................................... 18
Bảng 2.5 cặp mồi sử dụng trong phản ứng trình tự vùng HV1.................................... 19
Bảng 2.6 Motif thay thế nucleotide của các haplogroup..............................................20

Bảng 3.1 Ket quả đo tỷ số OD và nồng độ DNA thu thập được 15/15 mẫu trong

nghiên cứu.................................................................................................................... 25
Bảng 3.2 Bảng tóm tắt số lượng và loại vị trí đa hình trên đoạn trình tự 582 bp vùng

HV1 trong quần thể chó nhà......................................................................................... 31
Bảng 3.3 Các vị trí đa hình trong đoạn trình tự 582 bp vùng HV1 của 15 cá thể chó

nhà khu vực Huế........................................................................................................... 32
Bảng 3.4 Các haplotype được xác định trên mười lăm cá thể chó nhà........................ 33
Bảng 3.5 Tỷ lệ phân bo haplotype trên các haplogroup và các chỉ số đa dạng di truyền

co bản............................................................................................................................34
Bảng 3.6 Tỷ lệ phân bố của các haplotype trên các haplogroup và chỉ số đa dạng di

truyền của quần thể chó nhà khu vực thành phố Huế với các quần thể chó khác tại
Việt Nam.......................................................................................................................36
Bảng 3.7 Tỷ lệ phân bo của các hapotype trên các haplogroup và chỉ số đa dạng du

truyền của quần thể chó nhà khu vực thành phố Huế với các giống chó khác trên thế
giới................................................................................................................................ 40

iv


DANH MỤC CHỮ VIÉT TẮT
pg

Microgram

ụL

Microlit

pM

Micromole

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

Bp

Base pair

CHD

Canis mtDNA HV1 database

CR

Control Region

D - loop

Displacement - loop

dATP

Deoxyadenosinem triphosphate

dCTP

Deoxycytidine triphosphate

dGTP

Deoxyguanosine triphotphase

DNA

Deoxyribonucleic acid

DNAse

Deoxyribonuclease

dNTP

Deoxyribonucleotide triphotphase

EtBr

Ethidium bromide

F

Forward

HV1

Hypervariable region 1

HV2

Hypervariable region 2

Kb

Kilo base

Mg

Miligram

mL

Mililit

IĨ1M

Milimole

mtDNA

Mitochondrial DNA

NCBI

National Center for Biotechnology Information

Nm

Nanomet

V


nM

Nanomole

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

R

Reveerse

RNA

Ribonucleic acid

rRNA

Ribosomal RNA

SNP

Single Nucleotide Polymorphism

TAE

Tris/ Acetate/ EDTA

TE

Tris - EDTA

Tm

Melting Temperature

tRNA

Tranfer RNA

u
ưv

Unit

VKA

Vietnam Kennel Association

VNTR

Variable number tandem repeat

Ultraviolet

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Lý do chọn đề tài

Chó là lồi động vật được con người thuần hóa đầu tiên với mục đích hồ trợ con
người trong q trình săn bắt tìm kiếm thức ăn, hay sử dụng với mục đích chăn nuôi gia

súc, xua đuổi các mối nguy hiểm. Hiện nay, đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về

nguồn gốc của các giống chó khác nhau, thuộc các khu vực khác nhau trên thế giới và
xác định được rằng nguồn gốc chung của chó nhà là Sói, và chó nhà được thuần hóa cách
đây hơn 15.000 năm. Tiếp nối những thành tựu nghiên cứu trên, những năm gần đây,

việc nghiên cứu về sự đa dạng di truyền ở chó nhà tại Việt Nam đã được tiến hành tại
khoa Công nghệ Sinh học của trường Đại học Nguyền Tất Thành. Ket quả nghiên cứu
bước đầu về việc đánh giá sự đa dạng di truyền của chó lưng xốy Phú Quốc dựa vào

trình tự DNA vùng HV1 (Hypervarible region 1) đã cho thấy chó lưng xốy Phú Quốc
vẫn cịn giữ được tính đa dạng di truyền khá cao, đặc biệt là có sự xuất hiện của các
haplotype hiem (El, E4). Đen năm 2019 nhóm nghiên cứu đã đưa ra kết luận giống chó

Phú Quốc có nguồn gốc từ chó nhà Việt Nam khu vực đất liền tỉnh Kiên Giang di cư ra

và bác bỏ ý kiến rằng chó lưng xốy Phú Quốc có nguồn gốc từ chó lưng xốy Thái Lan.

Bên cạnh đó, cũng có rất nhiều nghiên cứu về sự đa dạng di truyền chó nhà tập trung ở
khu vực miền Nam như ở thành phố Rạch Giá và huyện đảo Phú Quốc thuộc tinh Kiên

Giang, Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, có thể thấy rằng việc nghiên cứu chỉ tiến hành trên một
vài đối tượng giong chó cụ thể cũng như một số khu vực địa lý hạn hẹp, vẫn chưa có
nhiều các nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của chó nhà ở khu vực miền Bắc, miền
Trung, đặc biệt là tỉnh Thừa Thiên Huế -là nơi đã từng là cố đơ của Việt Nam.

Có thể thấy, Thành phố Huế hiện nay đã từng là trung tâm trao đồi, buôn bán sầm uất
và sinh sống của người dân dưới triều Tây Sơn và nhà Nguyễn. Nơi đây thường xuyên có
sự di chuyển qua lại của những người lái bn, tiểu thương. Theo thói quen những người

thương lái, tiểu thương thường mang theo chó để làm bạn hay hộ vệ, nên thành phố Huế

cũng là nơi tập trung được nhiều cá thể chó thuộc nhiều khu vực địa lý khác nhau của
Việt Nam. Điều này đã làm tăng sự đa dạng di truyền của quần thê chó nhà ở Huế và có
thể được lưu giữ cho đến ngày nay. Thêm nữa, vị trí địa lý của tỉnh Thừa Thiên Huế bị

ngăn cách với các tỉnh ở phía Nam bởi dãy núi Bạch Mã thuộc dãy núi Trường Sơn nên
làm hạn chế việc di chuyền của người dân hay thương lái đen kinh đơ điều này có thể có
vii


sự khác biệt về các haplotype của các giống chó nhà ở thành phố Huế với các tỉnh miền

Nam. Với mong muốn tìm hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền của chó nhà ở thành phố

Huế, sự khác biệt về di truyền với chó nhà thuộc các vùng miền khác nhau ở Việt Nam

nên tôi quyết định lựa chọn đề tài: “Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể chó
nhà tại khu vực thành phố Huế dựa vào trình tự vùng HV1 (Hypervariable region 1)

trên bộ gene ty thể” nhằm đối chiếu, so sánh, đánh giá sự đa dạng di truyền của quần

thể chó nhà tại khu vực thành pho Huế với các quần thể chó nhà khác tại Việt Nam và
một số giống chó khác thuộc các khu vực địa lý khác nhau trên thế giới. Ket quả thu
được sè cho ra cái nhìn khách quan hơn về sự đa dạng di truyền của quần thể chó nhà, bố

sung thêm bộ cơ sở dừ liệu hữu ích nhằm hồ trợ các nghiên cứu di truyền tiếp theo về

đánh giá, so sánh mối quan hệ di truyền giữa các nhóm chó nhà tại Việt Nam, cũng như
góp phần làm sáng tỏ con đường di cư, phân bố của chó nhà trên khắp thế giới.
2. Mục đích nghiên cứu

Đánh giá sự đa dạng di truyền của chó nhà tại khu vực thành phố Huế dựa vào
trình tự vùng HV1 (Hypervariable region 1) trên bộ gene ty thê.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu

Thu thập mầu lơng chó nhà tại khu vực thành phố Huế
Tách chiết DNA tổng số từ mầu lơng thu được
Khuếch đại trình tự vùng HV1

Giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự
So sánh trình tự vùng HV1 với cơ sở dừ liệu trên GenBank

Định loại haplotype của quần thể chó nhà tại thành phố Huế
Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần the chó nhà tại khu vực thành phố Huế.
4. Đối tượng nghiên cứu

Đe tài thực hiện nghiên cứu trên vùng 582 bp thuộc vùng HV1 trên bộ gene ty thể
của chó. Tổng cộng 15 cá thể chó nhà được khảo sát trong phạm vi đề tài nghiên cứu.
5. Phạm vi nghiên cứu

Đề tài tập trung nghiên cứu vùng trình tự 582 bp thuộc vùng HV1 DNA ty thể trên

15 cá thể chó nhà tại khu vực thành phố Huế. Nghiên cứu không bao gồm thơng tin trên

tồn bộ hệ gene ty thê của chó hay các gene trên bộ gen trong nhân của chó. Các giống
chó trên thế giới được sử dụng trong việc xác định mối quan hệ di truyền với quần thể
viii


chó nhà khu vực Huế được chọn dựa trên thơng tin về hành trình di cư của chó đã được

cơng bố, và dựa trên sự sằn có của thơng tin, khơng bao gồm tất cả các giống chó hiện
hữu trên toàn thế giới.

ix


Chương 1. Tống quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TÒNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Giới thiệu về giống chó nhà

1.1.1. Phân loại

Giới: Animalia (Động vật)

Phân giới: Metazoa (Động vật đa bào)

Ngành: Chordata (Có dây sống)
Phân ngành: Vertebrata (Động vật có xương sống)

Lớp: Mammalia (Thú)
Bộ: Carnivora (Ân thịt)
Họ: Caninae (Chó)

Giống: Canis Linnaeus, 1758 (Chó)

Lồi: Canis lupus Linnaeus, 1758 (Chó)
Phân lồi: Canis lupus familiaris Linnaeus, 1758 (Chó nhà)

Hình 1.1 Chó nhà Cams lupus familiaris (ảnh do nhóm nghiên cứu thuộc Khoa

Cơng nghệ Sinh học thực hiện)
1.1.2. Đặc điểm chung của chó nhà

Thân hình chó là một cơ thể sống thống nhất, được cấu trúc từ những cơ quan, hệ
thống khác nhau, thực hiện những chức năng sống thích hợp. Thể chất của chó, được xác

định bởi những cấu trúc giải phẫu của nó song để cho dễ quan sát người ta thường quan
sát ngoại hình thơng qua bon phần chính: Ngoại hình của đầu, thân và các chi.

1.1.2-1

Chương 1. Tống quan tài liệu

1.1.2.1.

Đặc điểm phần đầu của chó

Đầu: hình dáng đầu thường có hình trịn, hình nhọn, hình vng và hình chừ nhật.

Vùng mặt: Mõm: hình dạng của mõm phụ thuộc vào sự phát triên của hàm và môi,
chiều dài của mõm được thê hiện bằng tỷ lệ chiều dài mõm so với chiều dài của trán.
Môi: mơi khơ phác họa rõ mõm.

Mắt: Mắt chó có đến 3 mí: một mí trên, một mí dưới và mí thứ ba nằm ở giữa, hơi
sâu vào phía trong, giúp bảo vệ mắt khỏi bụi bẩn.

Hàm/ Răng: Mõm của loại chó to có 42 răng ổn định. Trong sổ đó có 12 răng cửa,

4 răng nanh và 26 răng hàm.
Tai: dựng đứng, khơng q to, hướng về phía trước.

Cổ: phần cổ gồm 7 đốt sống, cổ gồm có: họng cổ, mang cổ và sống cổ. Độ uốn
nếp và trề của da ở khu vực cô gọi là “yếm cô”.
1.1.2.2.

Đặc điểm phần thân của chó

Da và lơng: Chó có đến 2 lớp lơng: lớp bên ngồi dễ thấy, cịn lớp lót bên trong

giúp cho chúng giữ ấm.
Phần đuôi: đuôi luôn vểnh cao, thẳng.

Lưng: phần mình giữa bướu vai và thắt lưng, bên phải và bên trái được giới hạn
bằng rẻo sườn của lồng ngực. Nó bao gồm khoảng 8-9 đốt sống lưng và những đoạn

trên của xương sườn. Lưng được đánh giá theo chiều rộng, chiều dài và hình dáng.
Ngực và lồng ngực: Phần phía trước của lồng ngực gọi là ngực. Lồng ngực bị giới

hạn bời các bộ phận như sau: ở phía trên là bướu vai và lưng, ở phía dưới là xương ngực,

ở phía trước là khoảng trổng giữa vai và chồ bắt đầu cô họng nối với mình, ở phía sau là

những xương sườn cụt. Ngực và lồng ngực được đánh giá theo chiều rộng, chiều dài,
chiều sâu, thề tích và hình dáng. Lồng ngực thường có dáng phẳng, ơ van cụt, hình thùng

(ống).
Bụng: thành bụng mềm, đoạn từ xương sườn cụt đến xương chậu, về hình dáng,

bụng thường thon đều, béo mờ và xệ.
Mơng: phần mình bị giới hạn ở phía trước bởi eo lưng, ở phía sau bởi đi và hai
bên bởi đùi. Xương chậu và xương cùng nằm ở phần mơng. Mơng thường có các dạng
như sau: rộng, hẹp, dài, ngắn, phẳng, tròn, thẳng, xệ, hếch và "mông treo".

1.1.2.2-2


Chương 1. Tống quan tài liệu

1.1.2.3.

Đặc tính di truyền của hệ gen ti thể ở động vật có xương sống

Ty thể là bào quan có tất cả ở các sinh vật nhân chuẩn, chịu trách nhiệm cho việc
cung cấp năng lượng cho tế bào và chịu trách nhiệm cho các q trình apoptosis, bệnh tật
và lão hóa. Mồi tế bào có từ 100 - 1.000 ti thể, tùy thuộc vào loại tế bào mà số lượng ti

thể này lại khác nhau và mồi ti thể có từ 2-10 mtDNA (mitochondrial DNA), như vậy

mồi tế bào có từ 1.000-10.000 mtDNA, điều này rất hữu ích trong việc nghiên cứu đặc
tính di truyền động vật1.

mtDNA có cấu trúc dạng vịng, mạch đơi và đơn bội. Khơng có hiện tượng tái tố

hợp, có bộ máy sao chép độc lập so với các gen trong nhân và có tỷ lệ đột biến trên mồi
cặp base cao hơn gấp 10 lần so với trong nhân do cơ che sửa sai không hiệu quả. Hệ gen

ti thể có kích thước khác nhau từ 14-20 kb.

Hình 1.2 Hệ gene ty thể của chó nhà1

Hệ gen ty thể của chó nhà (Canis familiaris) lần đầu tiên được giải trình tự hồn
chỉnh có kích thước 16727 kb, phần lớn thành phần cũng như số lượng gen giống như ở

động vật có xương sống gồm có 37 gen mã hóa, trong đó có 22 gen mã hóa cho tRNAs,

13 gen mã hóa cho protein, 2 gen mã hóa cho rRNAs và hầu như khơng có introns, chỉ có
vùng D-loop (Displacement-loop) hay cịn gọi là vùng CR (Control Region) là vùng
khơng mã hóa2. Vùng CR dài khoảng 1270 bp (15458-16727) là vùng khơng mã hóa
nhưng giữ vai trị quan trọng trong việc điều khiển quá trình phiên mã. Vùng CR chia

làm 3 vùng riêng biệt gồm có vùng siêu biến Hypervariable region 1 (HV1), vùng

Hypervariable region 2 (HV2) và vùng lặp lại song song VNTR (Variable number
tandem repeat).

1.1.2.3-3


Chương 1. Tống quan tài liệu

Hình 1.3 Vùng trình tự HV-P
Vùng siêu biến 1 (Hypervariable region 1- HV1): vùng HV1 là vùng siêu biến nhất

trong hệ gen ti thề động vật. Ở chó nhà vùng HV1 nằm ở đầu 5’ của vùng CR ở vị trí
(15458-16130) dài khoảng 673 bp, cũng giống như ở người vùng HV1 ở chó có tính đa

hình rất cao, thường được sử dụng trong phân tích pháp y trong trường hợp lượng DNA
quá ít hoặc mẫu DNA trong nhân bị thối biến nghiêm trọng4’8. Ngồi ra, vùng HV1 còn
được sử dụng để nhận diện các SNP (Single Nucleotide Polymorphism) và xác định
haplotype ở chó nhà.6’9
Vùng siêu biến 2 (Hypervariable region 2-HV2): nằm ở đầu 3’ của vùng CR, dài

khoảng 350 bp, có tốc độ tiến hóa chậm hơn HV1 từ 10-20 lần. Đây là vùng bảo thủ nhất
có chứa một số đơn vị cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng khơng thay đổi ngay cả ở

bậc phân loại họ. Một đoạn trình tự lặp lại (Variable number tandem repeat): nằm giữa

HV1 và HV2 với 10 nucleotide lặp lại khoảng 30 lần. số lặp lại tùy vào mồi cá thể nên
trình tự này gây ra khó khăn trong q trình nghiên cứu và thường được loại đi khi phân
tích di truyền vùng CR9’".
1.2.

Các nghiên cứu về sự đa dạng di truyền góp phần tìm hiểu thêm nguồn gốc
chó nhà dựa trên trình tự hệ gen ty thể (mtDNA)

1.2.1. Hệ gen ty thể ỏ' động vật hữu nhũ nói chung và chó nói riêng

Ớ động vật, ngồi hệ gen trong nhân cịn có hệ gen trong te bào chất nằm ở ty thể,

chiếm từ 1-5% DNA của tế bào. Kích thước của mtDNA của động vật hữu nhũ thường
dao động từ 16kb đến 17.5kb. Mỗi ty thể có từ 2 đến 10 bản sao của DNA và mồi tế bào
chứa từ hàng trăm đến hàng triệu ty thể nên số lượng mtDNA là rất lớn . Với số lượng

1.2.1-4


Chương 1. Tống quan tài liệu

bản sao lớn như vậy nên có thể thu được mtDNA có giá trị cho các phân tích quan hệ di

truyền từ một số lượng ít tế bào. mtDNA có những đặc điểm co bản sau:
- Tốc độ đột biến lớn gấp 10-25 lần so với hệ gen nhân;
- Số lượng bản sao lớn;
- Đơn bội, hầu như khơng có sự tái tổ hợp;

- Di truyền theo dịng mẹ ở phần lớn các lồi;
1.2.2. Ty thể trong nghiên cún đa dạng di truyền

MtDNA mặc dù có kích thước rất nhỏ trong kích thước tồn bộ hệ gen của sinh
vật nhưng nó lại được coi là một marker đa dạng phân tử phổ biến nhất ở động vật trong
suốt nhiều thập kỳ qua. Đã có rất nhiều những nhà di truyền học quần thể và hệ thống

học áp dụng công cụ này trong nghiên cứu của họ l2’13.

Những lý do của việc mtDNA trở thành một lựa chọn tot cho marker phân từ đó là:
mtDNA tương đối dề khuếch đại bởi nó có nhiều bản sao trong tế bào, trình tự gen ty thể
được bảo tồn rất mạnh giữa các lồi động vật, với rất ít sự trùng lặp, không chứa intron,

các vùng intergenic ngắn '4.

MtDNA có độ đa dạng cao trong quần thể tự nhiên do tỷ lệ đột biến lớn, đây được
cho là bằng chứng lịch sử phát triển của quần thể. MtDNA được xem là giải pháp tiện lợi

nhất và rẻ nhất cho việc khám phá gen của loài mới trong tự nhiên. Vùng kiểm soát ( hay
D-loop) nằm trong mtDNA là vùng khơng mã hóa duy nhất và liên quan đến sự mở đầu
tái bản mtDNA.

Kim và cộng sự đã xác định, cơng bố trình tự hồn chỉnh hệ gen ty the đầu tiên

của chó vào năm 1998 và đăng ký trên GenBank với số đăng ký là NC-002008. Chiều

dài của mtDNA chó là có kích thước 16.728 bp, tuy nhiên, chiều dài này không tuyệt đối
do biển thể.
1.2.3. Các nghiên cứu trên thế giói về đa dạng di truyền của chó

Một trong những nghiên cứu mtDNA đầu tiên ở chó nhà được thực hiện bởi Vila

và cộng sự2 đã hồ trợ thêm cho các bằng chứng về khảo cổ học cho rằng Sói là tổ tiên

của chó nhà. Khi đó nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân tích đoạn trình tự 261 bp vùng
HV1 của 162 con chó Sói ở 27 quốc gia khác nhau trên thế giới và 140 con chó nhà đại

diện cho 67 nịi chó khác nhau. Ket quả phân tích đã cho thấy vùng HV1 của chó nhà và
Sói có tính đa hình rất cao. Khi đó qua kết quả định loại haplotype đã xác định được 27

1.2.3-5


Chương 1. Tống quan tài liệu

haplotype ở chó Sói, 26 haplotype ở chó nhà. ỈGhi phân tích các vị trí đa hình trên vùng

trình tự này đã cho thấy trình tự của chó nhà khác với trình tự của chó Sói khơng nhiều

hơn 12 vị trí thay thế trong khi so sánh trình tự chó nhà với chó rừng và chó Sói đồng cỏ
(coyotes) thì có ít nhất 20 vị trí thay thế và 2 vị trí chèn khác nhau. Ket quả này góp phần

khẳng định thêm chó nhà có nguồn gốc từ Sói. Ngồi ra, sự phân kỳ trinh tự giữa các
nhóm trình tự này cũng cho thấy chó nhà có nguồn gốc cách đây hơn 100.000 năm15.
Nguồn gốc của chó nhà từ Sói đã được xác định, tuy nhiên số lượng nhừng sự kiện
này diễn ra một lần hay nhiều lần và diễn ra ở nơi nào vào thời điểm nào vẫn chưa được
biết đen một cách tường tận. Đê góp phần trả lời những câu hỏi trên Savolainen và cộng
sự (2002)16 đã phân tích tính đa dạng di truyền vùng trình tự 582 bp thuộc vùng HV1 của
654 con chó nhà đại diện cho tất cả các quần thể lớn trên thế giới bao gồm cả Châu Âu,

Châu Á, Châu Phi, Bắc Mỳ và 38 cá thể chó Sói thuộc lục địa Á-Âu (Eurasian). Qua
phân tích phát sinh chủng lồi, bước đầu nhóm nghiên cứu đã cho thấy tất cả các nhóm
chó nhà trên thế giới được chia thành 6 nhóm phát sinh chủng lồi từ (A - F) và có

nguồn gốc từ ít nhất 5 dịng Sói cái khác nhau. Ngồi ra khi phân tích sự đa dạng di

truyền giữa các nhóm chó nhà với nhau đã cho thấy chó nhà trên thế giới có hơn 95,9%

trình tự thuộc các nhóm haplotype phố qt (A, B, C), trong đó 71,3% cá thể thuộc nhóm
A. Nhóm A đại diện cho tất cả các nhóm chó nhà trên thế giới, nhóm B, c cũng đại diện
cho tất cả các nhóm chó nhà ở các vùng địa lý khác nhau ngoại trừ Châu Mỹ. Vì vậy, 3
haplogroup (A, B, C) này cấu thành một nguồn chung với tỉ lệ đa dạng mtDNA rất cao

của tất cả các quần thể chó nhà. Như vậy ba nhóm (A, B, C) chiếm hầu hết tất cả các kiểu

haplotyle khác nhau ở tất cả các quần thế chó nhà, hơn nữa tần số của các nhóm (A, B, C)
lại tương tự nhau ở tất cả các khu vực địa lí. Hơn nữa, ko có sự phân chia rõ ràng về mặt
hình thái cũng như các giống chó có kích thước lớn hay nhỏ nên tỉ lệ phân bo của 3

haplogroup này, điều này cho thấy sự đa dạng về hình thái của các lồi chó khơng phải là

kết quả của sự thuần hóa chó Sói ở từng khu vực địa lí riêng lẻ, bởi vì các haplotype
thuộc các haplogroup (D, E, F) chỉ được tìm thấy ở một số vùng như Thổ Nhĩ Kỳ, Tây
Ban Nha, Scandinavia, Nhật Bản, Hàn Quốc, Siberia. Ket quả trên đã gợi ý rang phần lớn

chó nhà ngày nay có nguồn gốc chung từ một vốn gen duy nhất chứa các nhóm phơ qt

(A, B, C). Ngồi ra, từ kết quả phân tích đa dạng di truyền trong nghiên cứu này đã chỉ ra
chó nhà ở Đơng Á có sự đa dạng di truyền lớn hơn so với các khu vực địa lý còn lại, kết
1.2.3-6


Chương 1. Tống quan tài liệu

quả này cùng với sự phân tích phát sinh chủng lồi ở từng khu vực địa lý đã gợi ý rằng
chó nhà có nguồn gốc từ Đông á cách đây khoảng 15.000 năm16.
Nhằm làm sáng tỏ thêm q trình di cư của chó nhà đến Châu úc và vùng lãnh thổ

Polynesia diễn ra một cách cụ thê như thế nào, Oskarsson và cộng sự3 đã tiếp nối các kết

quả cùa nghiên cứu trên. Khi đó nhóm nghiên cứu đã lập ra một bản đồ về sự phân bố
của haplotype A29 và chó cổ ở vùng Polynesian (Arcl và Arc2) bằng cách thu thập mầu

ở đất liền Đông Nam Á (424 mầu) và các đảo ở Đông Nam Á (219 mẫu). Thông qua kết
quả xác định haplotype dựa trên đoạn trình tự 582 bp vùng HV1 của tất các quần thể chó

nhà như đã nêu trên đã cho thấy tất cả 3 haplotype (A29, Arc 1, Arc2) đều được tìm thấy

ở phía nam Trung Quốc với tỷ lệ tương ứng (2%, 9%, 1%). Khu vực đất liền Đông Nam
Á (1%, 8%, 7%) và đảo quốc Indonesia (2%, 3%, 51%), nhưng lại không thấy haplotype

(A29, Arcl, Arc2) xuất hiện ở vùng lãnh thổ Đài Loan và đảo quốc Philippines. Ngoài ra,
sự đa dạng mtDNA ở vùng HV1 của chó Dingo cũng đã chỉ ra rằng chó Dingo được

mang đến Châu úc cách đây từ 4.600-18.300 năm. Những kết quả trên cũng gợi ý rằng
chó Dingo và chó ở vùng Polynesia khơng có nguồn gốc từ Đài Loan hay vùng lãnh thơ
mở rộng Austronesian mà có nguồn gốc từ đất liền Đơng Nam Á sau đó di chun đến

Indonesia trước khi đến Châu úc.

Một trong những nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền nhằm làm sáng tỏ thêm

về nguồn gốc của chó nhà tại Tây Nam Á cũng như sự phân bố của chó nhà trên khắp thế

giới. Ardalan và cộng sự phân tích đoạn trình tự 582 bp của 345 cá thể chó nhà4. Qua kết

quả định loại haplotype đã xác định được 49 haplotype, trong đó có 17 haplotype mới
(11 haplotype thuộc haplogroup A, 5 haplotype thuộc haplogroup B, 1 haplotype thuộc

haplogroup D), tỷ lệ các haplotype thuộc nhóm haplogroup phơ qt (A, B, C) chiếm tỷ

lệ 97,4% tỷ lệ các haplogroup (A, B, C) tương tự với các nghiên cứu trước đó. Tuy nhiên

tỷ lệ haplogroup B (33,3%) cao hơn so với một số quần thể chó nhà lân cận như Châu Âu

(20,6%), Siberia (21%). Bên cạnh đó, haplogroup D khơng phổ qt chiếm 2,6% .Vì vậy,

dữ liệu mtDNA từ vùng HV1 khơng chỉ ra được chó nhà ở Tây Nam Á có nguồn gốc từ
sự thuần hóa Sói một cách độc lập. Haplogroup D có thể có nguồn gốc từ phép lai giữa

chó nhà với chó Sói ở khu vực này. Ngồi ra, khi so sánh ve tỷ lệ các haplogroup phụ,

nhóm chó nhà ở Tây Nam Á xuất hiện 5 haplogroup phụ. Trong khi đó, nhóm chó nhà ở

phía Nam của sơng Dương Từ ở Đông Nam Á xuất hiện đến 10 haplogroup phụ. Ket quả
1.2.3-7


Chương 1. Tống quan tài liệu

này cho thấy, chó nhà ở Tây Nam Á không đại diện một cách đầy đủ tính đa da dạng di

truyền so với chó Nhà ở Đông Nam A. Ket quả này càng khẳng định thêm nghiên cứu
của Pang và cộng sự về nguồn gốc duy nhất của chó nhà là ở phía nam của sông Dương

Tử gần khu vực Đông Nam Á5.

Như vậy, các nghiên cứu trên đã cho thấy đoạn trình tự dài 582 bp vùng HV1

trong hệ gen ti thể là một marker phân tử quan trọng, được sử dụng trong hầu hết các
nghiên cứu trên thế giới trong việc đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các cá thể trong

cùng một quần thể và giữa các quần thể trong cùng một lồi. Thơng qua việc xác định vị
trí đa hình, định loại haplotype, từ đó có thể đánh giá sự đa dạng di truyền, vạch ra quá

trình di cư và sự phân tán của chó nhà đến các khu vực địa lý khác nhau cũng như ước
tính thời gian phân kỳ, truy tìm nguồn gốc của các quần thể chó nhà trên khắp thế giới.
1.2.4. Các nghiên cứu đa dạng di truyền trong nước

Hiện nay ở Việt Nam, chưa có sự quan tâm đúng mức về nghiên cứu đánh giá đa

dạng về hình thái cũng như về mặt di truyền. Thái Ke Quân và cộng sự (2016)6'7 tiến
hành đánh giá đa dạng di truyền chó lưng xốy Phú Quốc dựa vào đoạn trình tự 582 bp

vùng HV1 trên 30 cá the chó lưng xốy Phú Quốc sống tại huyện đảo Phú Quốc. Nhóm
nghiên cứu đã phân tích và định loại haplotype các cá thể chó lưng xốy Phú Quốc kết

quả phân tích cho thấy có 28 vị trí đa hình trên đoạn trình tự khảo sát định loại được 11
haplotype thuộc 4 haplogroup A, B, c, E trong đó haplogroup phổ quát A, B, c chiếm

83,33% (haplotype Bl, Al 1, A18, C3 lần lượt chiếm 30%, 16,67%, 10%, 10%), tỷ lệ
này tương tự với các quần thê chó nhà khác trên khắp the giới, và điều đáng ngạc nhiên ở

nghiên cứu này là tỷ lệ haplotype nhóm E lên đến 16,67%. Trái lại, tỷ lệ này xuất hiện
trên thế giới (chỉ chiếm 1-2%) và phân bố hạn hẹp ở khu vực Đông Á như Shiba Nhật

Bản, Indo Hàn Quốc, Shar-Pei Trung Quốc và Pungsang Triều Tiên. Việc haplotype

nhóm E xuất hiện với lỷ lệ cao (16,67%) ở chó lưng xốy Phú Quốc điều này đặt ra nghi
vấn liệu những cá thể chó này bắt nguồn từ chó nhà ở đất liền Việt Nam hay từ các nước

Đơng Á nơi có các cá thể mang haplotype E. Để trả lời cho vấn đề đặt ra này, Thái Kế
Quân và cộng sự (2016)7 tiến hành phân tích đánh giá đa dạng di truyền của 30 cá thể
chó nhà được thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận dựa vào đoạn trình

tự 582 bp vùng HV1. Kết quả đã xác định được 27 vị trí đa hình bao gồm 1 vị trí chèn
mới, 16 haplotype thuộc 3 nhóm haplogroup phổ quát A, B, c lần lượt 63,33%, 20%,

1.2.4-8


Chương 1. Tống quan tài liệu

16,67% trong đó có 3 haplotype mới được tìm thấy cụ thể có 2 haplotype A mới (Anl,
An2) và 1 haplotype c mới (Cnl). Kết quả này cho thấy sự da dạng di truyền quần thể
chó nhà cao hơn quần thể chó lưng xốy Phú Quốc (11 haplotype được phát hiện ở quần

thể chó lưng xốy Phú Quốc), trong đó đó có 6 haplotype (All, A18, A24, Bl, C2, C3)

chung của cả hai quần thể và không xuất hiện haplotype E nào ở quần thể chó nhà tại

Thành Phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận. Điều này cho thấy khơng có mối quan hệ di
truyền gần gũi nào giữa quần thể chó nhà tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận
đối với quần thể chó lưng xốy Phú Quốc.

1.2.4-9

Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1.

Địa điểm nghiên cún

Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại Khoa Công nghệ Sinh học- Trường Đại học

Nguyễn Tất Thành, số 298A-300A, Phường 13, Quận 4, Tp. Hồ Chí Minh.
2.2.

Vật liệu

2.2.1. Mẩu vật nghiên cứu

Thu thập mẫu lơng của chó nhà tại khu vực tỉnh Thừa Thiên Huế (15 mầu).
Trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ tiến hành thu thập 15 mẫu cá thể chó nhà tại
khu vực tỉnh Thừa Thiên Huế. Vì theo các đánh giá di truyền trước đây thì số lượng mẫu

lớn hơn 5 cá thể thì có thể sừ dụng để đánh giá đa dạng di truyền với các khu vực địa lí
tương đối nhỏ.
Bảng 2.1 Thơng tin về kí hiệu mầu, giới tính, màu lơng và địa điểm thu thập mầu
STT

Kí hiệu

Giới tính

Màu sắc

Loại mẫu

Địa chỉ

1

H36

Đực

Vàng - ruốc

Lơng

15 Lê Trung Định, thành phố Huế

2

H37

Đực

Vàng

Lông

Tổ 5, Tản Đà, Hương Sơ, Huế

3

H38

Đực

Vàng

Lơng

4

H39

Cái

Luốc

Lơng

5

H59

Cái

Vện

Lơng

Bình Thành, Hương Trà, Huế

6

H63

Đực

Vàng

Lơng

Bình Thành, Hương Trà, Huế

7

H64

Cái

Luốc

Lơng

Bình Điền, Hương Trà, Huế

8

H67

Cái

Vàng - Luốc

Lơng

Bình Điền, Hương Trà, Huế

9

H69

Cái

Lơng

Bình Điền, Hương Trà, Huế

10

H70

Đực

Lơng

Bình Điền, Hương Trà, Huế

165 Trần Q Khoáng, Hương Sơ,

Huế

30B khu tái định cư, thành phố

Đen - ức

trắng

Luốc

Huế

2.2.2. Tiêu chuẩn chọn mẫu

Các giống chó Việt Nam nhìn chung có tầm vóc trung bình và nhỏ chó ta nặng
khoảng 10 - 12 kg khi trưởng thành, chiều cao (tính từ mặt đất lên tới đỉnh vai) từ 45 cm

2.2.2-10


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

- 65 cm. Cơ thể hơi dài hơn so với chiều cao, thơng thường chó đực to hơn chó cái. Đặc

điểm dễ nhận biết với loài này nếu là thuần chủng phải có bốn chân có màu bít tất trắng,
đi bơng lau và chóp đi trắng (đi bơng lau), đi dài vừa phải, bình thường bng

thõng (cụp đi), lúc hoạt động dựng hướng lên trên, hoặc cuộn trên lưng (cong đuôi).

Chiều cao tới vai so với chiều dài cơ thể là 1: 1,2 trong đó phần thân nằm trong hình chừ
nhật nằm ngang, lưng thẳng, bụng thon gọn.
Chiều dài toàn đầu so với chiều dài mõm là 2: 1, đầu chúng thon, dài vừa phải và

cân đối, Mặt có hình tam giác theo kiểu chó sói, mõm chó hình chừ V và ngan, đầu mõm
hơi nhọn, gốc mõm khá rộng. Mõm dài gần bằng nửa chiều dài tồn đầu. mũi có màu đen,

lười màu hồng hoặc có đốm màu đen. Tai nằm hai bên hộp sọ, dựng đứng như hình vỏ sị
và hướng về phía trước. Tai to vừa phải, cân đối, khơng nhọn, phía trong tai ít lơng. Neu

nhìn thẳng trực diện thì hai tai dựng đứng, vng góc với đỉnh sọ. Các màu lông phố biến
là màu lông đỏ lửa, đen 4 mắt, trắng, đen tuyền, xám, đốm (khoang) chó lụn, nâu, vện.
2.2.3. Hóa chất

Tất cả các hóa chất sử dụng cho đề tài này dùng để: lấy mầu, tách chiết DNA,

trong kỳ thuật PCR, điện di... theo chuẩn sinh học phân tử
2.2.4. Dụng cụ và thiết bị

Tất cả các loại dụng cụ, thiết bị, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này dùng đe

tách chiết DNA, điện di, thực hiện phản ứng PCR,... theo chuẩn sinh học phân tử, được
thể hiện trong phụ lục A.
2.2.5. Phần mềm

FinchTV : là phần mềm có tính năng như một trình hiển thị dừ liệu, cho phép

người dùng truy cập vào nguồn dừ liệu thực. Với những tập tin có định dạng AB1, người

dùng có thể xem dừ liệu thơ và sử dụng dừ liệu này để khắc phục những hạn chế do cơng
cụ giải trình tự gây ra. Hiệu chỉnh trình tự nucleotide như thay thế một so base (trong

trường hợp dừ liệu trình tự khơng rõ ràng - ambiguous base).Ngồi ra, phần mềm này

cịn cung cấp nhiều tính năng như khơi phục và lặp lại thao tác trước đó (undo/redo), sao

lưu và có thể hiển thị lại kết quả đã hiệu chỉnh lại một cách dễ dàng.
SeaView: là phần mềm thiết kế các tính năng hỗ trợ người dùng trong việc sắp

xếp, gióng cột thẳng hàng nhiều trình tự, hiệu chỉnh trình tự (chèn, xóa, thay thế)

nucleotide, phân tích, xây dựng cây phát sinh chủng loài.
2.2.5-11


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

MEGA 7.0: ngồi tính năng hiệu chỉnh trình tự, gióng cột thẳng hàng các trình tự

nucleotide, phần mềm cịn giúp người dùng tìm kiếm vùng bảo tồn, vị trí đa hình đon
nucleotide một cách nhanh chóng. Phần mềm dị tìm mơ hình tiến hóa tối thích, xây dựng

cây phát sinh chủng lồi bằng phưong pháp tiết giảm tối đa (Maximum Parsimony), khả
năng tối đa hóa (Maximum Likelihood) và kết nối kế cận (Neighbor - Joining).
DnaSP v6: DnaSP (DNA Sequence Polymorphism) là phần mềm tính tốn một số

phép đo sự đa hình dựa trên trình tự DNA của các cá thể trong quần thê và giữa các quần
thể với nhau. Tính tốn các chỉ số đa dạng di truyền cơ bản như mất cân bằng liên kết.

dòng chảy gen (gen flow), tái tổ họp, hoán vị gen, hồ trợ so sánh các chỉ số đa dạng di
truyền cơ bẳn. DnaSP có thể xử lý bộ dừ liệu với số lượng lớn trình tự DNA với chiều

dài hàng ngàn nucleotide. Dề dàng chuyển đổi dừ liệu với các phần mềm khác như gióng
cột thăng hàng nhiều trình tự, phân tích cây phát sinh chủng lồi, phân tích thống kê.

Ngồi ra, DnaSP giúp định dạng, chuyển đổi dừ liệu trình tự hồ trợ cho xây dựng mạng

lưới haplotype (median-joining network).

2.2.5-12


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp thực hiện đề tài
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số

Dựa vào nguyên tắc chung như: phá vỡ màng tế bào cần sử các chất tẩy mạnh có
khả năng làm xáo trộn cấu trúc của màng đôi phospholipid, DNA trong và ngồi nhân sẽ
được giải phóng cùng với các protein. Sau đó, để loại bỏ hồn tồn protein sẽ dựa trên

nguyên tắc hòa tan khác nhau của DNA và protein trong hai pha dung mơi khơng hịa lần

như sử dụng các thành phần như Phenol : Choloroform : Isoamyl alcohol với tỷ lệ

25:24:1. Cuối cùng DNA được rửa tủa bang ethanol 70% lạnh, sau đó được phơi trong bể
ổn nhiệt 10 phút.
Năm 2016, Thái Ke Quân và cộng sự đã đưa ra phương pháp tách chiết DNA tổng

số, có thể nói đây là một quy trình tương đối đơn giản và tiết kiệm nhiều thời gian. Đồng
thời còn thu được lượng DNA và có độ tinh sạch khá cao7.
2.3.2. Phân tích, kiếm tra độ tình sạch của DNA

Sau khi tách chiếc DNA tiến hành đo mật độ quang trên máy đo quang Nano-drop
để xác định lượng DNA thu được cũng như độ tinh sạch DNA. Tiến hành đo mật độ

quang (OD) ở các bước sóng 230 nm (A230), 260 nm (A260), 280 nm (A280) và 320 nm

(A320) đã được thiết lập trên máy đo quang.

Độ tinh sạch của DNA thu được dựa trên tỷ số
OD260nm/OD230nm.

OD260nm/OD280nm

và

DNA được xem là tinh sạch khi ít tạp nhiễm với protein, các hợp chất

hữu cơ và vô cơ khác được sử dụng trong quá trình tách chiết. Khi mầu DNA được xem

là tinh sạch có tỷ số
OD260nm/OD230nm

OD260nm/OD280nm

nằm trong khoảng 1,8-2,0 và tỷ số

nằm trong khoảng 2,0 -2,2.

Tỷ số OD được tính theo cơng thức do nhà sản xuất cung cấp:
OD260nm - OD320nm

OD260/280 =

----------------------------------------

OD280nm

OD320nm

OD260nm - OD320nm

OD260/230 =

-----------------------------------------

OD230nm - OD320nm

2.;