Giải Trình Tự Và Phân Tích Gần Đầy Đủ Genome Parvovirus Gây Bệnh Tiêu Chảy Cấp Tính Trên Chó

ĐẠI HOC
NGUYỄN TẤT THÀNH
NGUYEN TAT THANH

THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP

GIẢI TRÌNH Tự VÃ PHÂN TÍCH

GẦN ĐÀY ĐỦ GENOME PARVOVIRUS
GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TÍNH TRÊN CHĨ

Sinh viên thực hiện

: Võ Thị Tài Hậu

MSSV

: 1711548166

GVHD

: TS. Thân Văn Thái

TP. HCM, 2020


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ i
MỤC LỤC..................................................................................................................... ii
TÓM TẮT..................................................................................................................... V

SUMMARY.................................................................................................................. vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH.................................................................................. vi
DANH MỤC BẢNG BIẾU....................................................................................... viii

DANH MỤC CHŨ VIẾT TẮT................................................................................... ix

ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................... xi
CHƯƠNG 1. TÓNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................... 1
1.1

Tổng quan về Canine parvovirus..................................................................................1

1.1.1 Lịch sử phát hiện.......................................................................................................... 1

1.1.2 Phân loại........................................................................................................................2
1.1.3 Genome.......................................................................................................................... 2

1.1.4 Phương thức lây nhiễm................................................................................................ 6
1.1.5 Tổng quan bệnh do nhiềm Canine parvovirus......................................................... 8
1.1.6 Cách phòng bệnh và điều trị....................................................................................... 9
1.1.7 Dịch tễ học................................................................................................................... 12

1.1.8 Các phương pháp chấn đoán bệnh CPV.................................................................. 13

1.2 Tổng quan về giải trình tự genome Canine parvovirus............................................ 16
1.2.1 Phương pháp giải trình tự.......................................................................................... 16

1.2.2 Lắp ráp trình tự........................................................................................................... 18
1.2.3 Phân tích, chú giải genome...................................................................................... 18
1.2.5 Xây dựng cây phát sinh loài.................................................................................... 19
1.3

Các nghiên cứu trong và ngoài nước......................................................................... 20

ii


1.3.1 Nghiên cứu trong nước.............................................................................................. 20
1.3.2 Nghiên cứu trên thế giới........................................................................................... 21

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu.......................... 23
2.1 Địa điểm thực hiện........................................................................................................23
2.2 Nội dung nghiên cứu.................................................................................................... 23
2.3 Đối tượng nghiên cứu................................................................................................... 23

2.4 Vật liệu nghiên cứu....................................................................................................... 23

2.4.1 Thiết bị, dụng cụ......................................................................................................... 23
2.4.2 Hóa chất và thuốc thử................................................................................................ 24
2.3 Phương pháp nghiên cứu................................................................................................24
2.3.1 Thu nhận mầu và xử lý mầu..................................................................................... 24

2.3.2 Tách chiết DNA......................................................................................................... 25

2.3.3 PCR phát hiện............................................................................................................. 26

2.3.4 PCR gần đầy đủ genome.......................................................................................... 27
2.3.5 Phương pháp điện di.................................................................................................. 28
2.3.6 Chuẩn bị gel agarose nồng độ 1,2 %.......................................................................28
2.3.7 Bơm mẫu vào giếng và chạy điện di....................................................................... 28
2.3.8 Giải trình tự gen và xây dựng cây phát sinh lồi....................................................29

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 30
3.1 Thu nhận mầu............................................................................................................... 30
3.2 Tách chiết DNA............................................................................................................30
3.3 Kết quả PCR phát hiện................................................................................................. 31

3.4 Ket quả PCR gần đầy đủ genome.............................................................................. 31
3.5 Phân tích kết quả giải trình tự..................................................................................... 33

3.6 Ket quả so sánh mức độ tương đồng..........................................................................47
3.7 Ket quả xây dựng cây phát sinh loài........................................................................... 49

iii


3.7.1 Cây phả hệ gen VP2.................................................................................................. 49

3.7.2 Cây phả hệ gen NS1................................................................................................... 52

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................................ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 56
PHỤ LỤC.................................................................................................................... 59

IV

TĨM TẤT
Canine parvovirus (CPV) có thế gây bệnh nặng cho động vật và liên tục tạo ra các
chủng biến the và tái to hợp mới ở chó. Do đó, cần phải điều tra các chùng CPV gây

dịch để nâng cao hiểu biết cùa chúng ta về sự lây truyền của CPV và sự lưu hành virus.
Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào phân tích VP2, và do đó, thơng tin

về mối quan hệ giữa các chủng vẫn cịn hạn chế. Trong nghiên cứu này chúng tơi tiến

hành giải trình tự và phân tích trình tự 02 chủng CPV phân lập trên mầu phân chó tiêu
chảy tại Tp Ho Chí Minh năm 2020. Chủng nghiên cứu thuộc genotype 2c với một so
biến đổi về trình tự nucleotide được tìm thấy. Phân tích cây phát sinh lồi của gene VP2

và NS1 cho thấy các chủng nghiên cứu thuộc cũng nhóm với các chúng CPV phân lập
được tại một số nước Châu Á.

Đe tài: “Giải trình tự và phân tích gần đầy đủ genome parvovirus gây bệnh tiêu

chảy cấp tính trên chó” được thực hiện từ tháng 06-09/2020 tại Phịng thí nghiệm Vi
sinh, trường Đại học Nguyền Tất Thành. Với mục tiêu dùng các kĩ thuật như tách chiết

DNA, phản ứng PCR, giải trình tự và phân tích gần đầy đủ trình tự genome Canine

parvovirus bằng phần mem tin sinh học.
Đe tài có 4 nội dung: Chan đốn phát hiện CPV trong mầu bệnh phẩm bằng phương
pháp PCR. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại genome CPV. Giải trình tự genome
CPV. Phân tích trình tự genome CPV bằng phần mềm tin - sinh học.

Những kết quả đạt được sau 3 tháng nghiên cứu:

- Chấn đoán phát hiện được 10 chùng CPVs trong mẫu phân chó tiêu chảy cấp
tính bằng phương pháp PCR.

- Đã thực hiện được phản ứng PCR khuếch đại bộ gene của 05 chủng CPVs phân
lập được.

-

Giải được 2 trình tự genome CPV 1, 2 và đặt lại tên là Par-21 và Par-24.

- Phân tích trình tự bộ gene thu được từ kết quả giải trình tự 02 genomes của chủng
CPVs dựa trên vùng trình tự gene VP2 và NS 1.

V


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1

Genome hồn chỉnh của Canine parvovirus................................................ 6

Hình 1.2

Ket quả dương tính khi xét nghiệm bằng phương pháp ELISA.............. 14

Hình 3.1

Mầu phân chó thu thập từ cơ sở thú y ở thành phố Hồ Chí Minh.......... 30

Hình 3.2

Kết quả sau khi chạy PCR phát hiện ......................................................... 31

Hình 3.3

PCR genome với cặp mồi NS-Fext - Parvo-Rl ........................................ 32

Hình 3.4

PCR genome với cặp moi Parvo-F2 - Parvo-R2....................................... 32

Hình 3.5

PCR genome với cặp moi Parvo-F3 - Parvo-R3....................................... 33

Hình 3.6

PCR genome với cặp mồi Parvo-F4 - 4823R.......................................... 33

Hình 3.7

Kết quả giải trình tự khơng tốt................................................................... 34

Hình 3.8

Kết quả giải trình tự tốt............................................................................... 34

Hình 3.9

Hiệu chỉnh trình tự bằng SeqMan............................................................... 35

Hình 3.10

Kết quả sau khi BLAST trên NCBI........................................................... 36

Hình 3.11

Kết quả sau khi BLAST trên NCBI...........................................................36

Hình 3.12

Phần trăm tỷ lệ các base của genome Par-21 và Par-24...........................37

Hình 3.13

Ket quả khi phân tích genome Par-21 và Par-24 bằng chương trình Python

............................................................................................................................................... 38

Hình 3.14

Đoi chiếu vị trí mở đầu đoạn gen NS1 và NS2 của Par-24 bằng EditSeq 39

Hình 3.15

Sai khác base ở vị trí T462C ở đoạn gen NSI ........................................... 42

Hình 3.16

Cây phát sinh lồi của Canine parvovirus đoạn gen VP2 ........................51

Hình 3.17

Cây phát sinh loài của Canine parvovirus đoạn gen NS1 ........................53

vii


DANH MỤC BANG BIÊU
Bảng 2.1

Danh mục thiết bị sử dụng trong nghiên cứu................................................. 23

Bảng 2.2

Danh mục dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu.............................................. 24

Bảng 2.3

Danh mục hóa chất và thuốc thử.................................................................... 24

Bảng 2.4

Các thành phần của phản ứng PCR phát hiện................................................26

Bảng 2.5

Chu kì nhiệt của phản ứng PCR phát hiện..................................................... 26

Bảng 2.6

Các thành phần của phản ứng PCR genome..................................................27

Bảng 2.7

Các cặp moi sử dụng cho PCR genome........................................................ 27

Bảng 2.8

Chu kì nhiệt của phản ứng PCR genome với cặp mồi NS-Fext - Parvo-Rl,

Parvo-F4 - 4823 R có nhiệt độ bắt cặp là 54 °C và cặp moi Parvo-F 1 - Parvo-Rl,

Parvo-F3 - Parvo-R3 có nhiệt độ bắt cặp là 58 °C............................................................ 28
Bảng 3.1

Mô tả thông so của các cặp mồi sử dụng trong PCR gần đầy đủ genome.32

Bảng 3.2

Vị trí các đoạn gen của genome Par-21 và Par-24........................................ 38

Bảng 3.3

Bảng thống kê số lượng amino acid giữa các vùng gen đã được dịch mã

của 2 trình tự Par-21 và Par-24............................................................................................ 40

Bảng 3.4

Bảngthống kê base giữa các đoạngen của 2trìnhtự Par-21 và Par-24 ...41

Bảng 3.5

VỊ trí thayđối amino acid đoạngen VP2giữa các chủng phân lậpvà các

chúng tham chiếu................................................................................................................... 44
Bảng 3.6

VỊ trí thay đổi amino acid đoạn gen NSỉ giữa các chủng phân lập và các

chùng tham chiếu................................................................................................................... 46
Bảng 3.7

Mức độ tưong đồng về nucleotide (amino acid) (%) giữa phân đoạn gen

VP2 và NS1 của các chủng Par-21, Par-24 và các chủng tham chiếu............................ 47

viii


DANH MỤC CHỮ VIÉT TẮT
CPV

Canine parvovirus

FPV

virus panleukopenia

PCR

Polymerase Chain Reaction

NS1

Non-structural protein 1

NS2

Non-structural protein 2

ORF

open reading frame

ssDNA

single-stranded DNA

dsDNA

double-stranded DNA

VLP

virus-like particle

Ori

origin of replication

RCR

rolling-circle replication

PIF

Parvovirus initiation factor

SF3

superfamily 3

ATP

Adenosine triphosphat

DNA

Deoxyribonucleic acid

TÍR

Transferrin receptor

HI

Hemagglutination Inhibition

PLA2

Phospholipase A2

TCID50

Median Tissue Culture Infectious Dose

ddNTP

dideoxynucleotide

CL

cell lysis

PBS

Phosphate-buffered saline

WB1

washing buffer 1

WB2

washing buffer 2

EB

elution buffer

TAE

Tris-acetate-EDTA

IƯPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry
IX


Arg

Arginine

His

Histidine

Lys

Lysine

Asn

Asparagine

Cys

Cysteine

Glu

Axit glutamic

Gin

Glutamine

Gly

Glycine

He

Isoleucine

Leu

Leucine

Met

Methionine

Phe

Phenylalanin

Pro

Proline

Ser

Serine

Thr

Threonine

Trp

Tryptophan

Tyr

Tyrosine

Vai

Valine

X


ĐẶT VẤN ĐÈ

Tại Việt Nam nhu cầu ni chó làm thú cưng và ni chó nghiệp vụ ngày càng

tăng. Song song đó, vấn đề sức khỏe của chúng cũng được chủ ni đặt mối quan tâm.
Trên thực tế, chó thường hay mac các bệnh như: bệnh dại, bệnh care, bệnh viêm gan
truyền nhiễm gây nguy hại đến tính mạng. Trong so các bệnh trên chó, bệnh tiêu chảy
cấp tính do Canine parvovirus (CPV) gây nên là bệnh đặc biệt nguy hiểm cần phải lưu
ý. CPV là một loại virus truyền nhiễm chủ yếu ảnh hưởng đến chó. CPV rất dễ lây lan

giữa các cá the chó với nhau do tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với phân của chó bị
mắc bệnh. Chó con dễ mắc bệnh do CVP gây ra hơn là chó trưởng thành. Khi bị mắc
bệnh, chó có triệu chứng lờ đờ, mệt mỏi, kèm theo đó là đi tiêu ra máu. Tình trạng bệnh
lý thường diễn biến nhanh chóng, kèm theo đó là tỷ lệ tử vong cao đối với chó con và

chó chưa tiêm chùng vaccine nên việc phòng chống bệnh do CPV gây ra là điều rất quan
trọng khi ni chó.

Theo các nghiên cứu trên thế giới, có the thấy CPV thường xuyên xuất hiện các
loại biến chủng với tần số và biến đối di truyền khác nhau giừa các quốc gia. Hiện nay
tại Việt Nam, các nghiên cứu phần lớn chỉ mang tính cập nhật về tỷ lệ nhiễm CPV qua

từng năm khác nhau và cập nhật về một số đặc điểm di truyền của virus. Việc giải trình
tự đầy đủ genome CPV và phân tích các thay đổi trong đặc điểm di truyền của các chủng

CPV sè đóng góp vào việc xác định đồng nhiễm và tái to hợp, làm sáng tỏ chủng của
CPV hoặc phát hiện các chủng virus mới tại Việt Nam; từ đó cũng truy được nguồn gốc
tiến hóa và cung cấp thông tin để chế tạo nên các vaccine mới đặc hiệu với chủng thuộc

địa. Xuất phát từ tính cấp thiết trên, chúng tơi đề xuất đề tài “Giải trình tự và phân tích

gần đầy đủ genome parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính trên chó”.

Mục tiêu nghiên cứu:
-

Chẩn đoán phát hiện được CPV trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp PCR.

-

Khuếch đại được genome CPV bằng phương pháp PCR.

-

Xác định đặc điểm di truyền học phân tử của Canine parvovirus thơng qua kết
quả giải trình tự thu được.

XI


Chương 1. Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TỐNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về Canine parvovirus

1.1.1 Lịch sử phát hiện
CPV là một biến thế đặc trưng của vật chủ của virus panleukopenia (FPV), xuất

hiện vào những năm 1970, lây truyền từ các lồi ăn thịt khác sang chó qua một loài vật
trung gian. Vào năm 1978, CPV mới xuất hiện, được đặt tên là CPV-2, nhanh chóng lan

rộng trên tồn thế giới và gây ra bệnh viêm ruột cấp tính ở chó.Việc virus lây nhiễm
được giữa các lồi khác nhau và sự thích nghi của virus với lồi chó liên quan đến một

số lượng nhỏ đột biến điểm trong protein capsid của virus '.
Năm 1979, CPV-2a (một biến thể di truyền của CPV-2) lây lan trên toàn cầu.

Chùng CPV-2a sở hữu năm dư lượng trong VP2 và có khả năng lây nhiễm cho mèo với
các động vật ăn thịt khác 2’3. Sau đó, CPV-2a trải qua các q trình tiến hóa và giữ lại

một số đột biến điếm. Một số đột biến này làm thay đoi tính chất kháng nguyên của
capsid và đã đạt tần số cao trong quần the virus. Ngồi loại kháng ngun CPV-2a ban

đầu, có hai biến the kháng nguyên được biết đến, được gọi là CPV-2b và CPV-2c. CPV2b được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1984 tại Hoa Kỳ 4 và CPV-2c được xác định
vào năm 2000 tại Ý 5. Sự khác biệt về kháng nguyên giữa ba biến thể được thể hiện qua
biến đổi tại vị trí amino acid 426 (Asn trong CPV-2a, Asp trong CPV-2b, và Giam trong

CPV-2c), nằm ở đầu gai ba lần, domain kháng nguyên chính của gen VP2. CPV-2a, 2b và - 2c hiện đang lưu hành trên toàn thế giới với tần số tương đối và đặc điểm di

truyền của chúng thay đổi theo địa lý, thời gian6-7.
Tại Việt Nam, nhiễm CPV-2 lần đầu tiên được quan sát ở các trường hợp lẻ tẻ vào

năm 1994 (dừ liệu chưa được cơng bố). Sau đó, sau khi xuất hiện lần đầu tiên, đã có sự
bùng phát rộng rãi của bệnh viêm ruột xuất huyết ở chó với tỷ lệ mắc bệnh và từ vong
cao xảy ra trên toàn quốc 8.

1


Chương 1. Tông quan tài liệu

1.1.2 Phân loại
Phân loại khoa học:

Họ (familia)

: Parvoviridae

Phân họ (isolate)

: Parvovirinae

Chi (genus)

: Protoparvovirus

Loài (species)

: Canine parvovirus

Hiện có hai loại Parvovirus lây nhiễm trên chó tên là CPV-1 và CPV-2. Trong đó,

CPV-20 bao gồm những chủng gây bệnh nghiêm trọng hơn với 3 biến chủng là CPV2a, CPV-2b và CPV-2c. Các mầu kháng nguyên của dạng biến chủng CPV-2a và - 2b

tương tự với CPV-2 gốc và biến chủng 2c được đánh giá có độc lực mạnh nhất.

1.1.3 Genome
Genome là một chuồi DNA đơn mạch âm, có chiều dài 5.3 Kb, bao gom các protein
VP1 (~10 %) và VP2 (~90 %), với hai yếu tố biểu hiện ba cấu trúc (VP1, VP2 và VP3)

và hai protein không cấu trúc (NS 1 và NS2) thông qua việc ghép xen kè các mRNA của

virus. VP2 (64 kDa) là một dạng rút gọn NH2 của VP1 (84 kDa) và là thành phần chính

của capsid. VP3 có nguồn gốc từ VP2 bởi sự phân tách protein và chỉ có mặt hồn chỉnh
trong virion (chứa DNA). Các hạt rồng khơng chứa protein VP3. Sử dụng trypsin sẽ

tách VP2 thành VP3 9J0.

Genome có hai khung đọc mở chính open reading frame (ORF). ORF bên trái mã
hóa các protein phi cấu trúc NS 1 và NS2, rất cần thiết cho sự sao chép và đóng gói DNA.

Vùng đầu cực N của NS1 và NS2 có trình tự giống hệt nhau, trong khi vùng đầu cực c
của NS2 có nguồn gốc từ sự phân tách vi sai của mRNA và được dịch từ một khung đọc

khác với NS1. ORF bên phải mã hóa các protein capsid 1 và 2 của virus (VP1 và VP2),

là các kháng nguyên chính tạo ra các kháng thể bảo vệ. VP1 và VP2 là các biến thể mối
nối giống hệt nhau về trình tự, ngoại trừ vùng N-143-amino-acid (aa) duy nhất của VP1.

ớ cả hai đầu của genome CPV, có những vùng khơng được dịch với cấu trúc kẹp tóc
cần thiết cho sự sao chép mồi

2


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Vở capsid của Parvovirus được tạo thành từ 60 tiếu đơn vị protein của VP1 Và
VP2. Trong đó VP1 chứa từ 5 - 6 tiếu đơn vị proteins, hình thành nên một icosa - hedral

đối xứng giúp chúng có khả năng chong lại axit, bazơ, dung môi và nhiệt độ lên đến

50 °C (122 °F). VP2 được tạo thành từ 54 - 55 protein còn lại là thành phần chính cấu

trúc nên vỏ capsid và là yếu tố độc lực chính l0. Parvovirus khơng có màng bao nên
được gọi là virus trần.

Genome của Canine parvovirus gồm có 5 gen là VP1, VP2, CPVgpl, CPVgp2,

CPVgp5. Trong đó có 3 gen mã hóa protein cấu trúc (VP1, VP2, CPVgp5) và 2 gen mà
hóa protein khơng cấu trúc (CPVgp2, CPVgp5Ỵ

VP1 và VP2: VP1 nằm tại vị trí 2,034 - 4,289 (chiều dài 2329 nt) và VP2 nằm tại
vị trí 2535 - 4289 (dài 1755 nt) là protein Capsid tự lắp ráp đe tạo thành capsid hình tứ

diện với đối xứng T=l, đường kính khoảng 22 nm và bao gồm 60 bản sao của hai biến
the kích thước cùa protein capsid, VP1 và VP2, khác nhau bởi sự hiện diện của N - mờ

rộng đầu cuối trong minor protein VP1. Vùng kết thúc N duy nhất của protein capsid
parvovirus VP 1 là can thiết cho khả năng lây nhiễm của capsid nhưng không cần thiết

để tập họp capsid. Đầu cuối VP 1 N chứa một số nhóm amino acid cơ bản giống với trình
tự bản địa hóa hạt nhân cổ điển, bao gồm một trình tự bảo tồn gần đầu cuối N bao gồm
bon amino acid cơ bản, trong một peptit có the hoạt động đe vận chuyển các protein
khác vào nhân tế bào. Capsid bao bọc single-stranded DNA (ssDNA) của genome. Các
protein Capsid chịu trách nhiệm cho việc gắn vào TFRC thụ the của tế bào chủ. Sự gắn

kết này chủ yếu gây ra sự nội hóa virion thơng qua q trình nội bào hóa clathrin. Liên
kết với các thụ the vật chủ cũng gây ra sự sắp xếp lại capsid dần đến sự tiếp xúc trên bề
mặt của VP1 N - endinus, đặc biệt là vùng giống như phospholipase A2 cùa nó. Đầu tận

cùng VP 1 N có thể hoạt động như một enzym phân giải chất béo để phá vờ màng nội
mơ trong q trình xâm nhập vào tế bào chủ. Vận chuyển nội chất liên quan VP2 là

protein cấu trúc phong phú nhất, chiếm 90 % capsid của virus và có khả năng tự lắp ráp
đe tạo ra các hạt giống virus (virus-like particle - VLP)1'. VP2 là một yếu tố quyết định

kháng nguyên chính và đóng một vai trị quan trọng trong việc xác định tính hữu tính
của mơ virus và phạm vi vật chủ. Đáng chú ý, chỉ một số thay the amino acid trong trình

tự của nó có thể làm thay đổi các đặc điểm sinh học liên quan cùa virus. Canine
parvovirus (còn được gọi là CPV loại 2) xuất hiện vào năm 1978 tại Hoa Kỳ và nhanh
3


Chương 1. Tổng quan tài liệu

chóng lây lan trong các quần the chó trên tồn thế giới với tỷ lệ mắc bệnh cao. Virus trải
qua sự biến đối di truyền liên tục. CPV-2a, CPV-2b và CPV-2c là ba biến thể kháng

nguyên chính hiện tại của CPV. Sự thay thế amino acid ở gốc VP2 cụ thể là cơ sở để
phân loại virus CPV loại 2 thành các biến thể CPV-2a, CPV-2b và CPV-2c đến các vi

ống và tương tác giữa các protein capsid và dynein của vật chủ.
NS1 (non-structure protein 1): Nằm tại vị trí 21 - 2027 (chiều dài 2007 nt), NS1 là

protein đa chức năng hiển thị các hoạt động endonuclease và helicase cần thiết để bắt
đầu và chỉ đạo sao chép DNA của virus. NS1 là protein không cấu trúc thiết yếu duy

nhất của CPV '2. Cũng đóng một vai trị trong việc đóng gói virus và chuyển hóa một

số chất xúc tiến. Liên kết vị trí cụ thể với 2 - 3 bản sao song song gần đúng trong nguồn
gốc của quá trình sao chép origin of replication (Ori), tháo vùng kẹp tóc này và kẹp một

sợi DNA, do đó bắt đầu sao chép vịng trịn lăn rolling-circle replication (RCR). Liên
kết hợp tác Ori với Parvovirus initiation factor (PIF) và có the là các yếu tố máy chù

khác, kích hoạt chức năng nickase của NS1. Trở thành gắn cộng hóa trị vào đầu 5' của
nick và cung cấp 3'OH đế tổng họp DNA moi. Hoạt động helicase tháo xoắn DNA theo

hướng 3' - 5 'trên sợi dài hơn. ức chế chu kỳ tế bào chủ trong quá trình chuyến đoi

G1/ s, pha s và chuyến tiếp G2/ M. Nhùng vụ bắt giữ này có thê cung cấp các yếu tố tế
bào cần thiết cho quá trình sao chép DNA của virus. Thúc đay quá trình apoptosis trong
tế bào vật chủ.

Genome của parvovirus được tiếp xúc từ capsid trong nhân của tế bào chủ. Trong
các tế bào pha s, bộ máy sao chép của vật chủ bắt đầu sao chép genome của virus từ các

lần lặp lại đầu cuối ngược. Đầu tiên, genome của virus ssDNA được bố sung thành dạng
sao chép DNA chuồi kép double-stranded DNA (dsDNA) cộng hóa trị đóng. Tiếp theo,

protein NS1 được sản xuất và bắt đầu kiếm soát sự sao chép genome. NS1, một

phosphoprotein hạt nhân đa chức năng 76,7 kDa, sở hừu nhiều chức năng thiết yếu trong
vòng đời của virus. Các protein Parvoviral NS1 thuộc superfamily 3 (SF3) helicases ‘3.

Vùng helicase, bao gồm túi liên kết ATP được bảo tồn, nằm ở giữa chuồi polypeptit '4.
Franking N và đầu cuối c cùa vùng helicase là nguồn gốc của các miền liên kết sao chép

(Ori) và miền chuyển tiếp xúc tiến tương ứng. Nhiều chức năng của NS1 phụ thuộc vào

tương tác của NS1 với DNA. Sự nhân lên của virus gây ra sự hình thành của hai phức
họp nhận biết Ori. Chúng được đặt tên là OriL và OriR, theo vị trí của chúng ở bên trái

4


Chương 1. Tông quan tài liệu

và bên phải của genome, tương ứng. Trong cả hai phức hợp, NS1 liên kết với dsDNA
theo cách trình tự cụ thể. Nó tạo thành một phức hợp bậc ba với các protein nội sinh:
các protein liên kết phần tử điều biến glucocorticoid trong OriL 15 và các protein nhóm

có tính di động cao trong OriR '6. Cả hai sự nhận biết đều dần đến sự phân hóa của
genome dsDNA theo cách thức cụ the từng sợi và từng vị trí và liên kết cộng hóa trị của

NS1 với đầu 5’ mới xuất hiện của genome. Trong cả hai phức hợp, NS1 liên kết với
dsDNA theo cách trình tự cụ thể. Nó tạo thành một phức hợp bậc ba với các protein nội
sinh: các protein liên kết phần tử điều biến glucocorticoid trong OriL và các protein

nhóm có tính di động cao trong OriR. Cả hai sự nhận biết đều dẫn đen sự phân hóa của
genome dsDNA theo cách thức cụ thể từng sợi và từng vị trí và liên kết cộng hóa trị của
NS1 với đầu 5' mới xuất hiện.
Hoạt động của vi khuẩn helicase NS1 là bắt buộc để sao chép genome của virus.

Tương tác NS1 - DNA trong che độ helicase độc lập với trình tự, nhưng chúng u cầu
phần nhơ ra của ssDNA để bắt đầu, như được chỉ ra trong các thí nghiệm in vitro. Hoạt
động nhận biết, tạo vịng và men xoắn của ORI phụ thuộc vào Adenosine triphosphat

(ATP). Tuy nhiên, yêu cầu về năng lượng đầu vào chỉ hiển nhiên đối với chức năng
helicase và liên kết ATP có khả năng thúc đấy q trình oligome hóa NS1 cho các hoạt

động khác.

Miền tận cùng N của NS1 nhận biết trình tự ORI của virus và gắn hệ gen dsDNA
theo cách cụ the về vị trí và từng sợi. Trong Rep, các tương tác với ORI được duy trì

bằng hai vịng lặp nằm ở một trong các khía cạnh của miền này. Các amino acid quan
trọng cho quá trình tạo khuôn nằm ở bề mặt xúc tác, ở một khía cạnh khác l7.
NS2: Nằm ở vị trí 21 - 1990 (chiều dài 1970 nt) là protein không cấu trúc - 2 (non-

structure protein 2 - NS2) của virus parvovirus ở chó (CPV) được tạo ra từ khung đọc

mở bên trái của genome virus và chứa 87 amino acid đầu tận cùng với protein không
cấu trúc 1 (NS1) liên kết với 78 amino acid từ một khung đọc mở thay thế. Trong virus
minus của chuột parvovirus NS2 đóng vai trị kiếm sốt q trình lắp ráp và dịch mã

protein capsid theo cách thức cụ thể của vật chủ. Nhưng NS2 dự đốn của CPV khác
với protein của các lồi parvovirus ở loài gặm nhấm, và protein cũng như các chức năng
của nó chưa được mơ tả.

5


Chương 1. Tơng quan tài liệu

I;«,

Genes
CPUgp2 :

.rI

A o X

-

HP-041400.1

VP2

ỤP1 ■

CPỤgpl T 'L------------------

----------

_.. __

CPUgpS L~

^.; -7- ■

—

pot ORF B mRNfl; pa. e _• L

n

HP .0414011 SKH

ũ<,

Repeat region

A o X

,. J
repeat-region: 0RFB... :=

repeat-region ORFB... HE^H

I

Ịseẹ

11K

11,see ,

12 K

13 K

|2.sẹe

|3,sẹe

14 K

14,see ■

15 K

5,323

Hình 1.1 Genome hoàn chỉnh của Canine parvovirus
(nguồn: />
1.1.4 Phương thức xâm nhiễm
Chu trình lây nhiễm parvovirus là một quá trình phức tạp bao gồm liên kết thụ the

tế bào, vận chuyển nội bào và tế bào chất, vận chuyển hạt nhân, sao chép DNA trong
nhân, lắp ráp capsid, xuất nhân và thốt ra hoặc giải phóng các virion mới hình thành.

Do đó, các protein capsid cùa virus được yêu cầu thực hiện nhiều chức năng phức tạp
khác nhau đe hoàn thành các bước này, và các capsid chỉ được lắp ráp từ một số dạng
của một protein virus duy nhất. Capsid bao bọc bộ gen của virus và bảo vệ nó trong quá
trình chuyển giao giữa các tế bào và giữa các vật chủ động vật nhưng cũng thực hiện

nhiều chức năng cần thiết để cung cấp bộ gen đến nhân để lây nhiễm. Một số quá trình

phụ thuộc vào capsid này là đặc trưng của vật chù và dần đến sự biến đối phạm vi vật
chủ của virus, xác định tính nhạy cảm của động vật với các loại virus khác nhau. Nhiều

cấu trúc capsid của parvovirus đã được xác định là có độ phần giải gần nguyên tử, nhưng

chi tiết về cách các thành phần khác nhau của capsid và cấu trúc của chúng làm trung

gian lây nhiễm tế bào và các bước khác trong chu trình sao chép liên quan đến những
thay đổi năng động trong capsid vẫn còn kém hiếu biết.
Capsid parvovirus ở CPV là một khối hình mặt phang T = 1 được tập hợp từ 60

bản sao của sự kết họp của các protein virus VP 1 và VP2. Dạng VP3 được tạo ra ở dạng

capsid đầy đủ (chứa DNA) thông qua sự phân cat protein của ~19 gốc từ đầu cuối N

theo tỷ lệ của các phân tử VP2. VP1 là dạng VP2 mở rộng có thêm 143 amino acid đầu
N, bao gom trình tự nhắm mục tiêu hạt nhân và mien enzyme PLA2. VP1 bao gồm ~10 %
tiểu đơn vị capsid. Be mặt của capsid CPV có cấu trúc phức tạp và bao gồm các đặc

điếm như các lồ hong đi ra bên ngoài capsid theo trục 5 nep gấp, vùng be mặt nâng lên

6


Chương 1. Tông quan tài liệu

(gai) xung quanh trục 3 nếp gấp và vùng trũng bề mặt nằm khoảng 2 nếp gấp trục và
trục đối xứng 5 lần (tương ứng là nếp gấp và canyon). Capsid liên kết với thụ the
transferrin loại 1 (TfR), và TfR là thụ thế thiết yếu và dường như duy nhất được CPV

và các họ hàng của nỏ yêu cầu đe liên kết và lây nhiễm các te bào của vật chủ ăn thịt.
Chất capsid cũng có thể liên kết với axit sialic, đặc biệt là dạng biến đổi N-

glycolylneuraminic acid (Neu5Gc), có ở một số vật chù nhưng khơng có ở một số vật
chủ khác, và mặc dù liên kết đó khơng phải là tương tác thiết yếu với thụ thể, nhưng nó
có the làm giảm khả năng lây nhiễm của tế bào. Chat capsid kích thích sự hình thành và

là mục tiêu của các kháng the vật chù có tác dụng ngăn chặn nhiễm trùng và hồ trợ phục
hồi sau bệnh tật một cách hiệu quả.
TfR liên kết capsid thông qua một cấu trúc trên các 3-fold spikes dường như xoay

quanh dư lượng VP2 300 nhưng liên quan đến các dư lượng khác cách nhau 20 đến 30

Ả, cho thấy một tương tác rộng rãi với capsid. Các 3-fold spikes cũng là mơ-típ liên kết
kháng the chính và các vị trí liên kết kháng the được chia thành hai nhóm hơi khác biệt,
được gọi là vị trí A và B. Axit sialic thay đối Neu5Gc liên kết với một vị trí trong chồ
trũng 2-fold.

CPV lây nhiễm vào tế bào bang cách liên kết với TfR trên màng tế bào, nhanh
chóng sau đó là quá trình tiêu bào nội bào qua trung gian clathrin. Điều này dẫn đen việc

capsid tiếp xúc với pH thấp hơn khi endosome axit hóa, điều này có khả năng gây ra

giải phóng một số ion canxi liên kết với capsid và chuyển động của các vòng capsid

cũng tạo điều kiện giải phóng vùng duy nhất VP 1. Nhiều thay đoi trong cấu trúc capsid
do xử lý pH thấp (khoảng pH 5,0 hoặc có the thấp hơn) dường như có the đảo ngược và

dường như không làm thay đổi cấu trúc theo cách thay đổi tính nhạy cảm tổng thể của
capsid đối với xử lý protease bên ngoài. Tuy nhiên, những thay đổi nhỏ hoặc không đối
xứng do liên kết TÍR, có thể kết hợp với pH thấp hoặc sự phân cat protein cùa một tỷ lệ

protein capsid sau khi lắp ráp, và điều đó cần thiết cho sự lây nhiềm tế bào bởi virus có
thê xảy ra '8.

7


Chương 1. Tổng quan tài liệu

1.1.5 Tổng quan bệnh do nhiễm Canine parvovirus
1.1.5.1 Cách thức lây nhiễm
Khi chó bị nhiễm bệnh, thời gian ủ bệnh là từ 3 đến 7 ngày trước khi có các biểu

hiện lâm sàng. Sau đó CPV xâm nhiễm vào trong cơ thể vật chủ và sử dụng nguồn
nguyên liệu trong tế bào cùa vật chủ để tiến hành phân chia hàng loạt. Đầu tiên, virus
tấn công amidan hoặc hạch bạch huyết tại vùng họng. Khi đã ở trong các hạch bạch

huyết, virus xâm nhập vào tế bào lympho (một loại tế bào bạch cầu) trong 1 hoặc 2 ngày
rồi tạo ra nhiều bản sao của nó. Nhừng virus này cản trở đường đi bên trong của các tế
bào lympho, nơi chúng được bảo vệ tránh khỏi hệ thống phòng thủ của vật chủ và xâm

nhập vào máu. Nhiều trong số các tế bào lympho bị nhiễm CPV này cuối cùng sẽ bị tiêu
diệt, làm giảm số lượng bạch cầu.

Khi đi vào trong máu, CPV tấn công mạnh vào tủy xương cũng như trong các tế
bào xếp dọc theo thành của ruột non. CPV có the gây nhiễm trùng tim, dần đến viêm cơ
tim, chức năng kém và rối loạn nhịp tim trên chó non.

Trong tủy xương, CPV làm suy yếu khả năng tự bảo vệ cơ the của vật chủ bằng

cách phá hủy các tế bào miền dịch và làm giảm số lượng tế bào bạch cầu, làm cho CPV
dễ dàng xâm nhập đường tiêu hóa và phá hủy ruột. Cụ thể, CPV phá huỷ biểu mơ của

ruột non - lớp lót giúp hấp thụ các chất dinh dưỡng và cung cấp một rào cản quan trọng
chống lại sự mất chất lỏng và sự xâm nhập của các vi khuấn từ ruột vào cơ the. Các tế

bào tạo nên bề mặt biểu mơ có thời gian tồn tại ngắn và được thay thế liên tục bởi các
tế bào mới được sinh ra ở các khu vực phân chia nhanh. CPV xâm nhập vào nơi các tế

bào biểu mô mới được sinh ra và vô hiệu hóa khả năng cùa cơ the de bo sung bề mặt

ruột, dần đen bề mặt ruột không the hấp thụ đầy đủ chất dinh dưỡng, ngăn ngừa tái hấp

thụ nước ở ruột và tạo cơ hội cho vi khuẩn xâm nhiễm vào máu. Hậu quả là chó nhiễm
bệnh biếu hiện triệu chứng mất nước nặng và rơi vào trạng thái nhiễm trùng lan rộng

(nguồn: https://www. vet. Cornell, edu/).

1.1.5.2 Triệu chứng
Bệnh thường xảy ra quanh năm nhưng thường thấy vào thời tiết nóng ấm, mưa

nhiều. Thời gian ủ bệnh khoảng từ 3 - 7 ngày. Bệnh ở dạng đường ruột hay gặp và pho

8


Chương 1. Tổng quan tài liệu

biến nhất của bệnh Parvo ở chó, thường mắc ở chó nhỏ từ khoảng 5-10 tuần tuổi. Chó

sốt kéo dài từ lúc phát bệnh đến khi có các biểu hiện lâm sàng đặc trưng cùa bệnh (có
khi chó khơng sốt hoặc nhiệt độ hạ). Con vật ủ rũ, bỏ ăn, nơn mửa. Chó đi tiêu phân
lỏng, phân có màu hồng hoặc có máu tươi, có lẫn cả niêm mạc ruột và chất keo nhầy,

phân có mùi tanh rất đặc trưng. Con vật mất nước và chất điện giải nhanh chóng, niêm

mạc nhợt nhạt, hố mắt trũng sâu.
Dạng viêm cơ tim hay gặp ở chó con từ 4 - 8 tuần tuổi. Chó bị suy tim cap do virus

tấn công gây hoại tử cơ tim. ớ dạng này con vật thường chết đột xuất khi chưa có triệu
chứng của bệnh Parvo ở chó. Một vài trường hợp có thể thấy chó biểu hiện thiếu máu

nặng, niêm mạc (mắt, miệng, V.V..) nhợt nhạt hay thâm tím, thở khó, nơn mửa, kêu la

rồi lăn ra chết. Đây là dạng nguy hiếm nhất của bệnh Parvo ở chó.

ở dạng viêm ruột kết hợp con vật chết nhanh sau 24h tính từ khi có triệu chứng
đầu tiên, ngun nhân là do tiêu chảy nặng, thiếu máu, mất cân bằng điện giải, sốc tim,

phù phổi, V.V..

1.1.6 Cách phòng bệnh và điều trị

Chủng ngừa
Vấn đề lớn nhất trong việc bảo vệ chó con chống lại nhiễm trùng Canine
parvovirus lại bắt nguồn từ cơ chế bảo vệ tự nhiên đã phát triển. Sau khi sinh được một

ngày, chó con đă có được khả năng miễn dịch từ sừa mẹ, sữa non. Theo một vài nghiên
cứu đã chứng minh rằng có mối tương quan chặt chè giữa HI hoặc hiệu giá kháng the
trung hòa trong huyết thanh và khả năng chống nhiễm trùng CPV. Xét nghiệm HI rất

hữu ích để đo các kháng thể tương quan tốt với khả năng miễn dịch. Hiệu giá HI 1:80
trở lên được coi là bảo vệ nhưng hiệu giá HI 1:40 khơng có tác dụng bảo vệ mà ảnh
hưởng đến việc chủng ngừa chù động chống lại CPV-2 ở chó. Tỷ lệ nhiễm cao nhất
được báo cáo ở chuột con trên 6 tuần tuổi. Cũng như các bệnh truyền nhiễm khác của

chó, chó con khỏi những con chó cái miễn dịch được bảo vệ trong tuần đầu tiên của

cuộc đời bằng các kháng the của mẹ được thu nhận qua sữa non. Việc chủng ngừa thành

công với hầu hết các loại vaccine có the được thực hiện với mức độ tin cậy cao chỉ ở
những con chuột con có huyết thanh âm tính hoặc ở những con chuột con có hiệu giá

kháng the rất thấp. Các kháng the cùa mẹ thu được trong 2-3 ngày đầu tiên của cuộc
9


Chương 1. Tổng quan tài liệu

đời và sau đó giảm dần, với thời gian bán hủy trung bình khoảng 9-10 ngày. Có một
giai đoạn quan trọng mà các kháng thể của mẹ khơng cịn có đủ số lượng để bảo vệ.

Nhưng 90 % chuột con từ quần thể được tiêm chủng đáp ứng với vaccine khi được 12
tuần tuổi.

Chủng ngừa cho chó thường được thực hiện bằng cách sử dụng vaccine đa giá, có
chứa CDV, CPV, leptospira bacterin và virus dại bất hoạt. Các loại vaccine CPV-2 đơn

giá cũng có sằn, một số loại có chứa virus hiệu giá rất cao (107 TCID50) và được khuyến
cáo rộng rãi để tiêm phịng ban đầu cho chó con. Khoảng 60 % tất cả chó con đã chuyển

đổi huyết thanh sau khi tiêm một mũi vaccine khi được 6 tuần tuổi bằng vaccine đơn giá

CPV hoặc khi được 8 tuần tuổi với vaccine đa giá. Khi 12 tuần tuổi, một mũi tiêm khác
được tiêm khi tất cả chuột con đã được tiêm 2 - 3 lần ở tuổi này nhưng gần 10 % chuột
con vần chưa được chuyển đồi huyết thanh. Lý do chính cho chú chó khơng đáp ứng là

sự tồn tại của các mức độ can thiệp của kháng thể mẹ. Khơng có vaccine nào được thử

nghiệm có khả năng phá vỡ hiệu giá kháng thể của mẹ là 1: 160 hoặc cao hơn, bất kể

vaccine đó có được chuẩn độ cao hay không. Neu cần thiết phải xây dựng lịch tiêm
chùng cho từng cá thể, việc xác định hiệu giá kháng the của một hoặc hai con trong lứa

có the được xác định khi 5 hoặc 6 tuần tuổi, sau đó việc tiêm phịng cho lứa có the được
tính tốn dựa trên hiệu giá. Việc chùng ngừa có khả năng thành công khi hiệu giá kháng

thể của mẹ giảm xuống dưới 1:10.

Đã có những lo ngại được bày tỏ về hiệu quả của vaccine parvovirus ở chó dựa
trên chủng loại 2 ban đầu. Các báo cáo về viêm dạ dày ruột sau khi tiêm chùng có liên

quan đến việc nhiễm các chùng vi khuẩn CPV trong thời gian ngắn trước hoặc sau khi
tiêm vaccine. Trước đây, người ta đã chứng minh rằng vaccine loại 2 có thể bảo vệ

chống lại các chủng phân lập tại hiện trường loại 2a và 2b. Sự xuất hiện của biến the 2c

đương nhiên đặt ra câu hỏi liệu vaccine CPV-2 có thể bảo vệ chống lại biến thể mới này
hay không. Nghiên cứu cho đến nay cũng cho thấy rằng tất cả các vaccine hiện có dựa
trên CPV-2 và CPV-2b đều bảo vệ chống lại tất cả các chủng CPV đã biết, bao gồm cả

chùng CPV-2c mới hơn. ở Án Độ, hầu hết các vaccine được bán trên thị trường đều dựa
trên CPV-2 được phân lập cách đây khoảng 30 năm. Tuy nhiên, CPV-2a/ 2b/ 2c gần đây
đã thay thế tỷ lệ mac CPV-2 ở chó ở hầu hết các nơi trên thế giới bao gồm cả Án Độ.

Có báo cáo về bệnh viêm dạ dày ruột ở những con chó được tiêm phịng và điều này có

10


Chương 1. Tổng quan tài liệu

thể là do CPV-2 không đủ khả năng để bảo vệ đầy đủ chống lại các chủng mới. Tốt hơn
hết là sử dụng vaccine tương đồng sử dụng CPV-2a hoặc CPV-2Ồ đột biến tùy theo tỷ

lệ bệnh ở những nơi khác nhau để kiểm soát bệnh.

Trị liệu
Phục hồi cân bằng điện giải và cấp nước là mục tiêu quan trọng nhất trong quá

trình trị liệu. Norfloxacin và axit nalidixic đã được chứng minh là có hiệu quả chống lại

bệnh viêm dạ dày ruột xuất huyết ở chó. Điều trị triệu chứng bang steroid, kháng sinh

pho rộng, dịch và chất điện giải có the cứu sống con vật. Sau khi phát hiện ra bệnh, nên

đưa chó đến thú y để truyền dịch. Có thể khuyến nghị bổ sung vào dịch bằng bicarbonate.

Nhiễm toan chuyến hóa phát triển nếu tiêu chảy nặng và bo sung kali dưới dạng KC1 có
the cần thiết đe duy trì cân bằng điện giải. Tất cả các đường uống phải được giữ lại trong
trường họp nôn mửa nghiêm trọng và nên được đưa ra đường tiêm. Trong giai đoạn đầu

của bệnh, việc áp dụng huyết thanh hyperimmune có thể giúp giảm tải lượng virus và

làm cho tình trạng nhiễm trùng ít nghiêm trọng hơn. Điều trị như vậy đà được chứng
minh là làm giảm tỷ lệ tử vong và rút ngắn thời gian bệnh tuy nhiên rất khó lấy được
huyết thanh hyperimmune. Trong trường họp nơn mửa, có the dùng chlorpromazine

hoặc metaclopromide (Reglan), trong đó có Reglan với liều lượng 0,5 mg/ kg the trọng

theo đường tiêm cách nhau 8 giờ. Đe khắc phục vấn đề về dạ dày cần sử dụng cimetidine,
ranitidine, famotidine và để kiêm tra tiêu chảy, có thể dùng loparamide hoặc bismuth
subnitrate hoặc các chế phấm khác. Một con chó bị nơn mừa liên tục khơng nên cho ăn

bất kỳ thức ăn nào cho đến khi tiêu chảy và nơn mửa giảm bớt.

Ngăn ngừa và kiểm sốt
Những con chó bị nhiễm bệnh thải virus trong phân của chúng với số lượng khổng
lồ trong 2 tuần sau khi tiếp xúc. Trung bình cho một con chó chưa được chùng ngừa là
1000 hạt virus. Một con chó bị nhiễm bệnh thải ra 35 triệu hạt virus (gấp 35.000 lần liều

lây nhiễm điển hình) mồi ounce phân. Chó con dưới 4 tháng tuổi, chó chưa được miễn

dịch với bệnh Parvo khơng nên cho tiếp xúc với chó khác hoặc các tác nhân trung gian
có thể truyền bệnh như mơi trường, dụng cụ chăn ni vận chuyển chó, hoặc các chủ

ni chó khác, cần tiêm phòng vaccine chậm nhất 1 tháng trước khi chó mẹ mang thai
để tạo miễn dịch tự nhiên cho chó con sau sinh. Chăm sóc, dinh dường đủ chất và khoa

11


Chương 1. Tông quan tài liệu
học tăng sức kháng bệnh của chó. Tấy giun sán chó non ngay từ một tháng tuổi. Thực

hiện công tác kiểm dịch động vật và vệ sinh môi trường nghiêm ngặt ở các nơi tập trung
nhiều chó. Chủ ni chó phải sau ít nhất 1 tháng từ khi có chó chết dịch mới được mang
chó khác về ni. Các chất tẩy rửa thơng thường có thế diệt được virus, cần làm sạch

và sát trùng thường xun mơi trường, chuồng trại, dụng cụ chăm sóc và các phương
tiện vận chuyến chó 19.

1.1.7 Dịch tễ học
Dịch tề học của Canine parvovirus tại châu Âu cho thấy biến thể mới 2c phổ biến

ở một số quốc gia châu Âu (Ý, Bồ Đào Nha và Đức) và ít xuất hiện tại Anh quốc. Trái

ngược với các nghiên cứu trước đây về CPV-2a ở châu Âu, nghiên cứu cho thấy CPV2a thường xuất hiện nhiều nhất ở Bỉ, trong khi ở Vương quốc Anh, Đức và Ý, nó đã bị

CPV-2b hoặc CPV-2c vượt qua. ở Bồ Đào Nha, CPV-2a hoàn tồn khơng được phát

hiện, nhưng loại 2b và 2c được phân bổ đều. Theo như thống kê thì đây là báo cáo đầu
tiên về biến the 2c mới ở Bồ Đào Nha, Vương quốc Anh và Đức. Tại Đức, CPV-2c được

phát hiện trong các mầu lưu trữ được thu thập vào năm 1996; do đó, nó đã được lưu

hành ở Châu Âu 4 năm trước khi có báo cáo chính thức đầu tiên ở Ý. Sự phân bố địa lý
thay đổi như vậy của các biến thể CPV ở châu Âu có thể liên quan đến các luồng thương

mại khác nhau của chó nhập khẩu từ nước ngồi hơn là do các quy trình tiêm chủng
khác nhau20.
Dịch tễ học phân tử bệnh do parvovirus loại 2 ở Việt Nam từ tháng 11 năm 2016

đến tháng 2 năm 2018 cho kết quả trong số 260 chủng CPV-2 ở Việt Nam, 6 chủng
(2,31 %) được xác định là CPV-2a, 251 chủng (96,54 %) được xác định là CPV-2c và

3 phân lập (1,15 %) là không the phân lập được bằng cách sử dụng SimpleProbe® real
- time PCR. ở miền Bắc Việt Nam, tỳ lệ CPV-2a và CPV-2c lần lượt là 2,97 % (3/101)
và 97,3 % (98/101). ở miền Trung Việt Nam, tỷ lệ CPV-2a và CPV-2c lần lượt là 1,11 %
(1/90) và 98,89 % (89/90). ở miền Nam Việt Nam, tỷ lệ CPV-2a và CPV-2c lần lượt là
3,03 % (2/66) và 96,97 % (64/66). CPV-2b không được khảo sát trong nghiên cứu này.

Các gen VP2 của CPV-2c ở Việt Nam tương tự về mặt di truyền với các gen của CPV2c ở Trung Quốc và Đài Loan hơn là các gen cùa nguyên mầu CPV-2c (FJ222821) hoặc

CPV-2c đầu tiên của Việt Nam (AB120727) 8.
12


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng cho thấy CPV-2c là biến thể phổ biến nhất
ở Việt Nam. Phân tích phát sinh lồi đã chứng minh rằng các chủng CPV-2c Việt Nam
gần đây có chung nguồn gốc tiến hóa với các chủng CPV-2c châu Á.

1.1.8 Các phương pháp chẩn đoán bệnh CPV
Những bệnh do virus gây ra được chẩn đoán bằng một vài kỳ thuật dưới đây.

Chẩn đốn theo triệu chứng-. CPV có the gây ra những triệu chứng như lờ đờ,
mệt mỏi, chán ăn, nôn mửa và đi phân ra máu. Tuy nhiên, chỉ dựa vào triệu chứng bệnh

chỉ có thể chẩn đốn trong ít trường hợp. Trên chó, khơng chỉ có CPV gây ra các triệu
chứng trên mà cịn có một vài chủng virus gây hại đường ruột cũng biểu hiện như trên.

Phương pháp ELISA-. Hiện nay, phương pháp để phát hiện sự hiện diện của CPV
trong mầu bệnh phẩm phổ biến nhất là sử dụng kì thuật ELISA. Nguyên lý của kỳ thuật

ELISA là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng the và được thực hiện bằng những
bước cơ bản sau: Kháng nguyên - antigen hoặc Kháng the - antibody đã biết được gắn
trên một giá thể rắn, sau đó cho mẫu có chứa kháng thề hoặc kháng nguyên cần tìm vào

giếng và cuối cùng là thêm cơ chất vào để enzyme phân giải và phát ra tín hiệu, tín hiệu
pho biến nhất là sự đổi màu cùa các chất hóa học.
Thực hiện như sau:

Phản ứng miễn dịch học là sự kết hợp của kháng nguyên và kháng thể.

Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên từ từ
H2O2 để

oxy hóa cơ chất chỉ thị màu. Do đó làm thay đổi màu cùa dung dịch thí nghiệm.

Ket quả âm tính cũng khơng loại trừ hồn tồn khơng nhiềm bệnh, có thể do mới

bị nhiễm, hoặc bị nhiễm quá lâu, hoặc lượng kháng nguyên/ khảng thể quá ít để có the

phát hiện được bằng phương pháp ELISA. Trong trường họp nghi ngờ mắc bệnh trên

lâm sàng nên làm lại xét nghiệm sau 1 - 2 tuần. Xét nghiệm vài lần để theo dõi biến
động của kháng the/ kháng nguyên có giá trị hơn là xét nghiệm một lần. Neu cần, phải

kiếm tra lại bằng các kỹ thuật khác.
Kết quả dương tính cũng khơng khẳng định hồn tồn vì có thể dương tính giả do

phản ứng chéo giữa các loại ký sinh trùng hoặc căn nguyên gây bệnh.

13


Chương 1. Tông quan tài liệu

Cách đọc kết quả: Vạch chứng c (Control test): Vạch này sẽ luôn luôn xuất hiện
bất kể có sự hiện diện hay khơng của kháng nguyên virus Parvo. Neu vạch này không
xuất hiện, test xem như khơng có giá trị; có thế do chất pha lỗng khơng tinh khiết và
thiếu mẫu xét nghiệm, cần làm lại với chất pha loãng mới.

Vạch mẫu T (Test line): Xác định sự hiện diện của kháng nguyên virus Parvo:
- Âm tính: Chỉ xuất hiện vạch chứng c.

- Dương tính: Xuất hiện cả vạch mầu T và vạch chứng c.
- Làm lại xét nghiệm khi:
+ Cả hai vạch mầu T và vạch chứng c đều khơng xuất hiện.
+ Chỉ có vạch mẫu T xuất hiện.

T

c

CPV

Hình 1.2 Kết quả dương tính khi xét nghiệm bằng phương pháp ELISA
Phương pháp PCR: Neu chỉ sử dụng phương pháp ELISA đơi khi khơng chuẩn
đốn được bệnh. Phản ứng chuồi trùng họp (PCR) là một kỳ thuật sinh học phân tử được

sử dụng đế khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA theo cấp lũy thừa,

tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó.

Được phát triển năm 1983 bởi Kary Mullis, PCR là một kỳ thuật phố biến và khơng
thể thiếu trong các phịng thí nghiệm nghiên cứu y học và sinh học với nhiều ứng dụng

khác nhau. Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt, bao gồm các chu kỳ tăng giảm
nhiệt độ trong phản ứng biến tính DNA và tái bản DNA. Đoạn mồi (là đoạn DNA ngắn)

mang các trình tự bổ sung với trình tự DNA đích và DNA polymerase là những thành

phần quan trọng cho phép khuếch đại một cách chọn lọc và lặp lại. Khi quá trình PCR

diễn ra, DNA mới được tạo ra từ DNA khuôn ban đầu sẽ tiếp tục được sử dụng làm
khuôn để tổng họp phân từ DNA tiếp theo, tạo thành chuồi phản ứng dây chuyền trong

14


Chương 1. Tổng quan tài liệu

đó các mầu DNA được khuếch đại theo cấp số nhân. PCR là một chuồi phản ứng nhiều
chu kỳ nối tiếp nhau, mồi chu kỳ gồm:

Giai đoạn khởi đầu: (Chỉ cần đối với những enzyme DNA polymerase bắt buộc

phải kích hoạt bằng nhiệt độ). Giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 94 - 96 °C (hay 98 °C nếu
sử dụng polymerases cực kỳ bền nhiệt) và được tiến hành trong 1 - 9 phút.

Giai đoạn biến tính: đây là bước đầu tiên của chu kỳ và là quá trình tăng nhiệt độ
lên 94 - 98 °C trong 20 - 30 giây. DNA được biến tính bằng cách phá vỡ liên kết hydro
giữa các bazo, tạo thành phân tử DNA sợi đơn.

Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50 - 65 °C trong 20 - 40
giây để mồi gắn vào sợi DNA đơn. Nhiệt độ này cần phải đủ thấp đe cho phép mồi bắt
cặp với sợi DNA, nhưng cũng đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là, mồi chỉ

nên gắn hồn tồn với phần trình tự bồ sung trên mạch khuôn. Nếu nhiệt độ quá thấp,

mồi sẽ gắn khơng đặc hiệu. Neu q cao, mồi có the khơng gắn. Thông thường nhiệt độ
gắn mồi thường thấp hơn 3 - 5 °C so với Tm của mồi dùng trong phản ứng. Liên kết

hydro bền giữa phân tử DNA - DNA chi được hình thành khi mồi bo sung hồn tồn với

khn. Polymerase liên kết với các phân tử lai DNA mồi - khuôn và bắt đầu tổng họp

DNA.
Giai đoạn kẻo dài: Nhiệt độ trong giai đoạn này phụ thuộc vào các DNA

polymerase sử dụng; Taq polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 75 - 80 °C, và nhiệt
độ 72 °C thường được sử dụng với enzyme này. Tại giai đoạn này DNA polymerase

tong họp sợi DNA mới bổ sung với DNA khuôn bằng cách thêm dNTP theo nguyên tắc
bo sung theo chiều 5' đến 3', phản ứng trùng ngưng xảy ra giữa nhóm 5' phosphate của

dNTP với nhóm 3' - hydroxyl phía cuối của sợi DNA vừa mới được hình thành. Thời

gian cùa giai đoạn kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase và độ dài của đoạn DNA
cần khuếch đại. Thơng thường, các DNA polymerase có khả năng khuếch đại được hàng

nghìn bazo nitơ trên một phút. Trong điều kiện tối ưu, tức là, nếu khơng có hạn chế do
giới hạn của cơ chất hoặc chất phản ứng thì sau mồi giai đoạn kéo dài, số lượng DNA

được khuếch đại sau mồi chu kì tuần theo hàm mũ.

Giai đoạn kết thúc kéo dài: Giai đoạn này đôi khi được thực hiện ở nhiệt độ
70 - 74 °C (đây là nhiệt độ cần thiết cho hoạt động tối ưu của hầu hết các enzyme
15