Báo cáo nghiên cứu khoa học " XÁC ĐỊNH TÝP EBV TRONG TỔ CHỨC SINH THIẾT VÒM CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG BẰNG KỸ THUẬT PCR " potx

49
XÁC ĐỊNH TÝP EBV TRONG TỔ CHỨC
SINH THIẾT VÒM CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ
VÒM MŨI HỌNG BẰNG KỸ THUẬT PCR
Phan Thị Minh Phương
Trường Đại học Y khoa, Đại học Huế

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Epstein-Barr Virus (EBV) thuộc nhóm Lymphocryptovirus, liên quan mật
thiết với họ gamma herpesvirus ở người. EBV được biết là tác nhân gây bệnh
tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn và liên quan chặt chẽ với một số bệnh lý ác
tính ở người như: u lympho Burkitt (BL), ung thư vòm mũi họng [7], [10], [12],
[14].
Theo tổ chức nghiên cứu ung thư Quốc tế (IARC-1993) thì ung thư vòm
mũi họng (UTVMH) là bệnh phổ biến ở miền Nam Trung Quốc, Đông Nam Á và
là 1 trong 8 loại ung thư hay gặp [1], [6],[8],[13]. Việt Nam là nước có tỉ lệ mắc
bệnh trung bình song điều đáng quan tâm là UTVMH đứng hàng đầu các ung thư
vùng đầu, cổ và đứng hàng thứ năm trong các loại ung thư chủ yếu gặp ở nam


50
giới [1], [4]. Hơn thế nữa bệnh có đặc điểm là các biểu hiện lâm sàng thường là
“mượn”, dễ chẩn đoán nhầm, trên 95% bệnh nhân được phát hiện đã ở giai đoạn
III và IV [2],[4].
Nhiều nghiên cứu về UTVMH cho thấy bệnh là do sự phối hợp giữa yếu
tố di truyền (HLA) và yếu tố môi trường, trong đó nhiễm EBV là quan trọng
nhất. Hàng loạt dấu ấn EBV được phát hiện thông qua các kháng thể (KT) kháng
các kháng nguyên (KN) của EBV như IgA/VCA, IgA/EA, IgG/VCA trong huyết
thanh bệnh nhân UTVMH. Tiếp đó, DNA- EBV cũng như các gien, sản phẩm

gien của EBV cũng được tìm thấy trong huyết thanh, trong tổ chức sinh thiết
vòm họng, trong dịch tiết đường mũi họng của bệnh nhân UTVMH
[1],[3],[4],[9],[11] càng khẳng định vai trò của EBV trong bệnh sinh UTVMH.
Nhằm mục đích xác định tỷ lệ và phân bố của týp EBV trong UTVMH
của người Việt Nam và góp phần tìm hiểu mối liên quan giữa các týp EBV với
UTVMH giúp quản lý và theo dõi bệnh. Trong đề tài này chúng tôi tiến hành xác
định týp EBV trong tổ chức sinh thiết vòm họng của bệnh nhân UTVMH thể
không biệt hóa, thể hay gặp nhất ở Việt Nam (trên 80%)[4].


51
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng
- Nhóm nghiên cứu: 91 mẫu sinh thiết vòm họng hoặc khối paraffin của
bệnh nhân UTVMH thể không biệt hóa (đã xác chẩn mô bệnh học) ở miền Bắc
và miền Trung.
- Nhóm chứng: 32 mẫu sinh thiết tươi hoặc khối paraffin của bệnh nhân
ung thư vùng đầu, cổ khác không phải UTVMH (có xác chẩn mô bệnh học).
2. Phương pháp nghiên cứu
- Tách DNA:
+ Tổ chức sinh thiết tươi vòm họng của bệnh nhân UTVMH thể không
biệt hóa và ung thư vùng đầu, cổ khác được chiết tách DNA theo quy trình Rapid
prep micro genomic DNA isolation kits.
+ Tổ chức sinh thiết trong khối paraffin chiết tách DNA theo quy trình của
Choon Kook Sam 1995, có bổ sung.
+ Hoá chất của Amersham Pharmacia Biotech.


52
- Tiến hành PCR cho DNA thu được sau chiết tách.

PCR được tiến hành theo nguyên lý của KaryMullis (1986) với các cặp
mồi đặc hiệu cho gien EBNA - 2A và EBNA - 2B, trình tự mồi:
Gien EBV
Kích
thước sản
phẩm
Vị Trí Trình tự mồi
EBNA 2A-
5’
(B95-8)
115 bp 49213 -
49232
AACTTCAACCCACACCA
TCA
EBNA-2A-3’ 49309 -
49328
TTCTGGACTATCTGGAT
CAT
EBNA-2B-5’
(AG876)
119 bp 2060 - 2079 TACTCTTCCTCAACCCA
GAA
EBNA-2B-3’ 2160 - 2179 GGTGGTAGACTTAGTTG
ATG
Điều kiện chu kỳ nhiệt để làm phản ứng PCR:
+ 94
0
C/90 giây

53
+ 94
0
C/1 phút
+ 55
0
C/2 phút 25 chu kỳ
+ 72
0
C/1 phút
+ 72
0
C/10 phút
+ 4
0
C
Hóa chất cần thiết của hãng Perkin - Elmer



54
III. KẾT QUẢ
Bảng 1: Tỷ lệ phát hiện DNA-EBV với mồi EBNA-2A, -2B trong tổ chức
sinh thiết vòm họng của bệnh nhân UTVMH

Vùng n DNA - EBV % p
Miền Bắc 61 56 91, 8
Miền Trung 30 27 90, 0
>0,05
Tổng số 91 83 91, 2

Bảng 2: Tỷ lệ phát hiện DNA-EBV với mồi EBNA-2A, -2B trong tổ chức
sinh thiết bệnh nhân ung thư đầu, cổ khác
Vùng n DNA - EBV % p
Miền Bắc 14 4 28,56 >0,05


55
Miền Trung 18 2 11,11
Tổng số 32 6 18,75

76,9%
11%
3,3%
12,5%
6,25%
0
20
40
60
80
%
UTVMH UT §Çu, cæ kh¸c
Týp 1
Týp 2
Týp 1 & 2
0%

Biểu đồ 1: Tỷ lệ phát hiện các týp của EBV trong UTVMH và ung thư đầu, cổ
khác.

56
IV. BÀN LUẬN
EBV là loại gamma Herpesvirus, được Epstein và Barr phát hiện từ năm
1964, kể từ đó EBV không ngừng được nghiên cứu. Cho đến nay, EBV được
phân thành 2 týp: týp 1 (týp A), týp 2 (týp B) dựa trên sự khác biệt về trình tự
nucleotide của các gien mã cho các kháng nguyên nhân của nó (EBNA-
2,3,4&6)[5]. Nhiều công trình nghiên cứu về EBV đã nhận định rằng EBV là loại
virus ái tế bào biểu mô và lympho bào B. Người ta thấy rằng EBV lây truyền chủ
yếu qua nước bọt, sau đó xâm nhập vào các tế bào lympho B, tế bào biểu mô
vòm họng, liên bào tuyến nước bọt trực tiếp qua thụ thể CD21 và gián tiếp qua
lgA nhờ các phân tử gp350/250 của EBV. Tại các tế bào này, virus được lưu trữ,
sao chép đồng thời thiết lập một quá trình nhiễm tiềm ẩn. Như vậy, tế bào biểu
mô vòm họng là nơi lưu giữ virus ở khu vực vòm họng. Sự nhiễm EBV ở tế bào
biểu mô thường dai dẳng, còn số lượng tế bào lympho B nhiễm EBV tiềm ẩn
trong máu ngoại vi thường thấp (ít hơn 0,001%). Số lượng thấp của tế bào
lympho B nhiễm EBV tiềm ẩn được quy là do hoạt động của tế bào lympho T
độc (Tc) đối với EBV, hoạt động này xuất hiện sau nhiễm EBV tiên phát. Chính
vì vậy, trong đề tài này chúng tôi chọn mẫu bệnh phẩm là tổ chức sinh thiết vòm
họng chứ không chọn mẫu là máu hay huyết thanh của bệnh nhân UTVMH (mặc
dù mẫu máu hay huyết thanh dễ thu thập hơn) để khả năng phát hiện EBV cao.
Kết quả bảng 1 cho thấy 91,8% trường hợp ở miền Bắc phát hiện có
DNA-EBV trong tổ chức sinh thiết vòm họng và ở miền Trung là 90,0% trường
hợp không có sự khác biệt về tỷ lệ phát hiện DNA-EBV giữa hai vùng (p> 0,05).
Kết quả của chúng tôi có hơi thấp hơn một ít so với kết quả của một số tác giả
trong và ngoài nước khác là do các tác giả khác sau PCR đã sử dụng thêm những
kỹ thuật đặc biệt hơn để phân tích. Ví dụ, tác giả Uraiwan Kositanont [14] và

57
Choon - Kook - Sam [5] sau PCR, sản phẩm khuếch đại thay vì được đọc trực
tiếp trên gel agarose thì được tiếp tục lai southern blot giúp cho việc phát hiện tốt
hơn, nên kết quả của họ đạt đến 94,1% và 96,0%. Nghiêm Đức Thuận [4] của
Việt Nam, sản phẩm PCR tiếp tục được lai dot blot làm cho số lượng acid nucleic
được tăng cường nên càng dễ dàng phát hiện và vì thế mà tỷ lệ có DNA-EBV
trong mẫu sinh thiết vòm họng rất cao 98,1% và 95,7%. Hoặc các tác giả
Kantakamalakul W. của Thái Lan, Peh S. C của Malaysia [12] thì sử dụng kỹ
thuật PCR lồng (nested - PCR) thay vì PCR đơn thuần. Độ nhạy của PCR lồng
rất cao do sản phẩm PCR được tiếp tục khuếch đại lại một lần nữa, vì thế kết quả
đạt được ở mức cao nhất là 96,5% và 100%.
Bảng 2 cho thấy trong tổng số 32 mẫu ung thư đầu, cổ khác chỉ phát hiện
được 6 mẫu có chứa DNA-EBV với mồi EBNA-2A, -2B, chiếm tỷ lệ 18,75%.
Phân tích giữa 2 vùng (miền Bắc và miền Trung) cho thấy tỷ lệ phát hiện DNA-
EBV ở miền Bắc cao hơn (28,56%) so với miền Trung (11,11%) nhưng sự khác
biệt này không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). Tỷ lệ chênh lệch giữa hai vùng có
thể quy cho số mẫu được thu thập.
Kết quả của chúng tôi (18,75%) cũng tương đối phù hợp so với kết quả
nghiên cứu của một số tác giả khác nghĩa là tỷ lệ phát hiện DNA-EBV trên đối
tượng chứng thấp hơn nhiều so với bệnh nhân UTVMH. Tuy nhiên, những con
số cụ thể có thể hơi khác nhau tùy thuộc vào số lượng nghiên cứu, chất liệu
nghiên cứu, kỹ thuật ứng dụng trong nghiên cứu và cũng không loại trừ tính
chất của dân tộc nghiên cứu.
Như vậy, tỷ lệ phát hiện cao (91,2%) DNA-EBV với mồi EBNA-2A, -2B
trong tổ chức sinh thiết vòm họng của bệnh nhân UTVMH và tỷ lệ thấp (18,75%)


58
DNA-EBV trong các ung thư đầu, cổ khác. Nghiên cứu của chúng tôi hoàn toàn
phù hợp với những khẳng định trước đây rằng UTVMH có liên quan chặt chẽ với

EBV.
Liên quan của EBV với UTVMH nói riêng và với các bệnh lý ác tính nói
chung đã đặt ra câu hỏi rằng: có những dưới nhóm khác nhau của EBV có thể
liên quan đến các bệnh lý này hay không? Và câu trả lời được khẳng định qua
biểu đồ về tỷ lệ phát hiện các týp của EBV. Biểu đồ trên cho thấy sự vượt trội
của týp 1 trong UTVMH (76,9%) so với týp 2(11%), týp 1&2(3,3%) cũng như so
với nhóm ung thư đầu cổ khác (12,5%). Kết quả này của chúng tôi là hoàn toàn
tương tự với các nghiên cứu của các tác giả khác. Theo Uraiwan K. và cs [14]
phân tích 34 mẫu sinh thiết UTVMH với cặp mồi EBNA - 2A, -2B phát hiện
82,3 % là týp 1, 5,9% týp 2 và 5,9% cả týp 1&2. Tác giả Janse van Rensburg E.
và cs [7] nghiên cứu trên 15 bệnh nhân UTVMH ở Nam Phi cho thấy 14/15
trường hợp tế bào có EBV týp 1, chỉ có 1 trường hợp có cả týp 1&2. Nghiên cứu
tại Malaysia, Choon Kook Sam và cs [5] cũng thấy EBV týp 1 gặp ở 72% số mẫu
sinh thiết và dịch tiết đường mũi họng bệnh nhân UTVMH. Peh SC. và cs [12]
thấy EBV týp 1 trong tất cả 38 trường hợp u lympho và 14 trường hợp UTVMH
được nghiên cứu (100%). Từ kết quả trên có thể nói rằng EBV týp 1 là týp chiếm
ưu thế trong UTVMH thể không biệt hóa người Việt Nam.
Như vậy, phát hiện chủ yếu của đề tài chúng tôi là sự nổi trội của EBV týp
1 trong tổ chức sinh thiết vòm họng của bệnh nhân UTVMH so với một tỷ lệ thấp
trong tổ chức tương ứng của nhóm chứng bệnh nhân ung thư đầu, cổ khác (76,9% so
với 12,5%); sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,0001. Mức độ cao của
sự biểu lộ EBV týp 1 trong tổ chức sinh thiết vòm họng của bệnh nhân UTVMH
cho thấy mối liên quan giữa EBV týp 1 với tế bào u trong sinh thiết UTVMH.


59
Việc xác định týp 1 của EBV là týp chiếm ưu thế trong UTVMH cùng với sự
hiểu biết về đặc tính sinh học của EBV týp 1 sẽ tạo một cơ sở khoa học cho việc
thiết kế vacxin phòng EBV. Đồng thời cần khảo sát các biến thể của týp 1 trong
chủng EBV ở Việt Nam để có thể thiết kế vacxin hiệu quả.

V. KẾT LUẬN
- Với cặp mồi EBNA-2A,-2B tỷ lệ phát hiện DNA-EBV ở bệnh nhân
UTVMH là 91,2%, ở bệnh nhân ung thư vùng đầu, cổ khác là 18,75%.
- EBV týp 1 chiếm ưu thế với tỷ lệ 76,9% trong tổ chức sinh thiết vòm
họng của bệnh nhân UTVMH, tỷ lệ EBV týp 2 là 11,0% và EBV týp 1&2 là
3,3%.
- Tỷ lệ EBV týp 1 trong tổ chức sinh thiết của bệnh nhân ung thư đầu, cổ
khác là 12,5%, týp 2 là 6,25%. Không phát hiện nhiễm phối hợp EBV týp 1&2
trong những trường hợp này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phạm Hoàng Anh, Nguyễn Hoài Nga, Trần Hồng Trường và cs. Tình
hình bệnh ung thư ở Hà Nội giai đoạn 1996-1999. Tạp chí Y học thực
hành, Chuyên đề Ung thư học (431) (2000) 4 - 7.


60
2. Nguyễn Thị Bích Hà. Nghiên cứu giá trị chẩn đoán và tiên lượng ung
thư vòm mũi họng bằng kỹ thuật đặc hiệu lgA kháng VCA và EA của
EBV và tế bào diệt tụ nhiên trong máu ngoại vi, Luận án Tiến sỹ Y
học, Học Viện Quân Y (1995).
3. Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi và cs. Tần suất và sự đột
biến mất đoạn gen LMP1 ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng, Tóm tắt
báo cáo khoa học Hội nghị miễn dịch toàn quốc (2003) 37 - 38.
4. Nghiêm Đức Thuận. Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học và
hoạt tính gen virut Epstein - Barr trong ung thư vòm mũi họng, Luận
án Tiến sĩ Y học, Học viện Quân Y.
5. Choon Kook Sam et al. A special type of EBV associated with
nasopharyngeal carcinoma. Asian Journal of Surgery Vol.19, No.3
(1996) 173 - 174.

6. Fandi A., Cvitkovit E. et al. Biology and treatment of NPC. Current
opinion in Oncology (7), (1995) 255 - 263.
7. Janse van Rensburg E. et al. Epstein - Barr virus strain
characterisation in South African patients with nasopharygeal
carcinomas. Anticancer Res; 20(3B), (2000) 1953 - 1957.
8. Kee Ching G., Chen Yi Hsu et al. Prevalence of Taiwan variant of
Epstein - Barr virus in throat washing from patients with head and


61
neck tumors in Taiwan, Journal of Clinical Miccrobiology, Vol.32,
No.1 (1994) 28 - 31.
9. Hu L.F. Nasopharyngeal carcinoma and EBV. PhD thesis MTC
(1996)
10. Kunimoto M., Tamura S. et al. One-step typing of EBV by PCR:
Predominance of type 1 virus in Japan, J.Gen Virol, 73 (1992) 455 -
461.
11. Katsuyuki Aozasa, Masahiko O. et al. Epstein - Barr virus - and
malignant lymphoma, Gann Monograph on cancer Reseach 45 (1998)
117 - 121.
12. Peh SC. et al. Frequent presence of subtype A virut in Epstein-Barr
virus -associated malignancies, Pathology 34(5) (2002) 446 - 450.
13. Tsao-sy. Nasopharyngeal carcinoma: A review of radiotherapy
technique, Ann. Acad. Med. Singapore Jul 22 (4) (1993) 638 - 645.
14. Uraiwan Kositanont et al. Detection of EBV - DNA and HHV - 6 DNA
in tissue biopsies from patients with nasopharyngeal carcinoma by
PCR Southeast Asian J. Trop. Med. Public (24) (1993) 455 - 460.

62
TYPING EBV IN NASOPHARYNGEAL TISSUES OF PATINETS
WITH NASOPHARYNGEAL CARCINOMA (NPC) BY PCR
Phan Thi Minh Phuong
College of Medicine, Hue University
SUMMARY
In this study, the EBV types in nasopharyngeal tissues of 91 patients with
NPC that is UCNT (undifferentiated carcinoma nasopharyngeal type) from
North and Central Vietnam and 32 controls with other head and neck tumors
were determined by PCR with primers EBNA-2A, EBNA-2B (from genome of
EBV strains B95- 8 and AG - 876).
The results showed that:
1.DNA - EBV was detected in 91.2% patients with NPC and 18.75%
patients with other head and neck tumors.
2. In patients with NPC: 76.9% were positive cases of type 1: 11% were
positive cases of type 2and 3.3 % positive of both types.


63
3. 12.5% cases were of type 1 and 6.25 cases were of type 2 with other head
and neck tumors.
The results indicated that type 1 of EBV is predominant in patients with
NPC (UCNT) from North and Central Vietnam.