BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN CÔNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME potx

1
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 PROTEIN - ENZYME







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Lp : K55 - CNSHB
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 ng dn : TS. Nguyn 

i, 2012

2
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1. (Ion Exchange Chromatography):
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Nga MikhailTsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet)   1903 khi 
    chlorophyll.
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 t 
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   
  .
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3
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
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
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2.  (Gel-Filtration Chromatography):
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           
 -
         


   



3.

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

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4
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

              

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
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III   :
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5
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6
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IV  
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m phosphate).
2. Chun b gel:
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- 

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4.  (equilibration):
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280
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280
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280
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7
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280
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0,076
17
0,034
32
0,322
3
0,108
18
0,062
33
0,294
4
0,048
19
0,056
34
0,286
5

0,026
20
0,076
35
0,252
6
0,026
21
0,122
36
0,238
7
0,020
22
0,134
37
0,218
8
0,024
23
0,190
38
0,238
9
0,018
24
0,220
39
0,244
10

0,020
25
0,256
40
0,264
11
0,194
26
0,278
41
0,158

8
12
0,040
27
0,308
42
0,162
13
0,046
28
0,326
43
0,166
14
0,028
29
0,338

15
0,076
30
0,326



Đ th nng đ protein trong sc k lc gel
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0.050
0.100
0.150
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0.300
0.350
0.400
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OD 280 (A)
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OD
280
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OD
280
(A)

OD
280
(A)
1
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0,028
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0,212
2
0,110
17
0,020
32
0,210
3
0,112
18
0,041
33
0,195
4
0,106
19
0,116
34

0,192
5
0,126
20
0,106
35
0,294
6
0,482
21
0,120
36
0,070
7
0,067
22
0,128
37
0,223
8
0,241
23
0,158
38
0,191
9
0,123
24
0,106
39

0,163
10
0,066
25
0,101
40
0,208
11
0,002
26
0,096
41
0,099
12
0,005
27
0,088
42
0,133
13
0,046
28
0,290


14
0,041
29
0,109

15
0,021
30
0,155



9

Đồ thị nồng độ protein trong sắc ký trao đổi ion
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ống nghiệm
OD 280 (A)
OD280 (A)


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280
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II  :
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4
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4
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4
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c dung dch g  Bo qun   
trong 2 tun.
2. L th ng chun:
Ly 6 ng nghi t 1  t tham gia phn 
tng ng nghing sau:
Bng : L th ng chun BSA
STT
BSA 10
mg/ml
ml
H
2
O
(ml)
Thuc th
Biuret (ml)
N protein
(mg/ml)
1
0.0
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4
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540
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540
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540
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540
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540
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0.034

10
0.039

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R
2
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0
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0.02
0.03
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OD540
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13
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540
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134383
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540
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540
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3
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4
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14
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H
2
O
(ml)
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1
20
0.98
20
2
40
0.96
40
3
60
0.94
60
4
80
0.92

80
5
100
0.90
100
6
120
0.88
120

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660
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660
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0.105
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0.153
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0.173
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0.206
120
0.271

15


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

MT1X
MC7

OD
660
(A)
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0,325
0,196
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281
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173
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660
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660
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

c
+


16






 





  

 


            

1. Dung dch thuc th Bradford 5X:
 Ethanol tuyi
(99,99%). B sung 100 ml axit phosphoric (H
3

PO
4
85%). Hn h c
khu  c cn th 
ml (nu c lc). Chia nh  nh o qun trong ti.
c khi s d ch thuc th 
n t dung dch gc). Chng hn ly 10 ml Bradford 5X, b
c ct s c th 1X. Thuc th 1X ch
s d
:
- 
- Albumin
- 
:
- 
- 
- 
- 
:
a) Xây dựng đồ thị chuẩn:

17
Pha dung dch g
   c ct). T dung dch g      ch
chu gim dn (xem bng).

(*) ng s 5: lch t ng s 4, b 
2
O
(**) ng s 6: lch t ng s 5, b 

2
O
ng chun:
Chun b mng nghim s ng








Lng nghit theo bng sau:

ng nghim

1
2
3
4
5
6
 i
chng)
BSA t ch chu
100
100
100
100
100

100
100 ml
H
2
O
Bradford 1X (ml)
5
5
5
5
5
5
5
H
2

0
0
0
0
0
0
100
     i
ng nghim (mg)
1,25
1,0
0,8
0,5
0,25

0,125
0

Để tăng độ chính xác của đường chuẩn, tương ứng với mỗi nồng độ chuẩn BSA
nên lặp lại 3 lần (sử dụng 3 lần nhắc lại hoặc 3 ống nghiệm cho 1 lần).
Sau khi trng nghi trong ti  nhi 
kho hp th   ng
chun bng Excel s dng kt qu 
OD, trng protein. Tuy

t
ng eppendorf
1
2
3
4
5
6
H
2

420
450
460
950
*
**
N BSA g
60
50

40
50
*
**
Tng th 
480
500
500
1000
*
**
N cu
1,25
1,0
0,8
0,5
0,25
0,125
1
2
3
4
5
6
7
8

18
b) Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford:
Gi s t mu protein cha bi

dung dch BSA chun, lch protein cho ng nghim.
B sung 5 ml thuc th c ti
 th chu  OD.
 


c) Cách tính hàm lượng:
i chi c vng chun s
c n ng ca mu cng
 
5. D th ng chun:

OD
595
0.125
0.006
0.25
0.017
0.5
0.081
0.8
0.129
1
0.188
1.25
0.256





y = 0,222x  0,032
g/ml)
y
595
(A)

19
6. Kt qu m:
-

MT1X
MC7

OD
595
(A)
0,156
0,136
0,154

1,694
1,514
1,676
Nh
-  OD
595
ca mu nm tr OD
595
cng chu
th chp nhn kt qu  protein ca mu.

IV  Nh

MT1X
MC7



134383
134809
139489


281
1510
173


1,694
1,514
1,676

T bng tng ky:
- N c  t ln.
- N 
 n.


- m.
- Phn ng ca mi loi protein trong m

- Mu protein chun b c chun.
- t chun b c chun.
-

20


I  
- 
.
- .

II 
-          

-


g

-
-     




-




- SDS-PAGE (sodium     

-
--

-

-

-

--PA


21
-






-PAGE

III:

lang.
.
1. 
- 1,5 M Tris HCl pH 8,8

- 0,4% SDS

- Tris base (KLPT 121,14) 90,83 g
- H
2
O 400 ml
- 
- 10 % SDS 20 ml
-  500 ml

2. 
- 0,5 M Tris-Cl pH 6,8
- 0,4% SDS

- Tris base 15,14 g
- H
2
O 200 ml
- 
- 10 % SDS 10 ml
-  250 ml

3. 

10 ml
20 ml

0,5 M Tris pH 6,8
5 ml
10 ml

0,25 M, pH 6,8
SDS
0,6 g
1,2 g
6 %
Glycerol
4 ml
8 ml
40 %
Bromopjenol Blue 1%
0,4 ml
0,8 ml
0,04 %
H
2
O
8 ml
16 ml


22

 20
0
C.

4. 
- 10X SDS Laemmli Running Buffer (0,25 M Tris, 1.92 M Glycine, 1 %
SDS, pH 8,3).


- Tris base 30,2 g
- Glycine 144 g
- SDS 10 g
- 
2
O, c

5. 
- Acrylamide 58, 42 g
- Bis-acrylamide 1,6 g
- H
2
O dn t t n 200 ml

6. 
- Coomassie R250 1 g
- Glacial acetic acid 100 ml (10%)
- Methanol 400 ml (40%)
- H
2
O 500 ml
 1000 ml

7. Dung dch ty (Destaining solution)
- Methanol 150 ml (15%)
- Acetic acid 100 ml (10%)
- H
2
O 750 ml
Tng s: 1000 ml

8. 
- 10% SDS 10 g SDS/ 100 ml H
2

- 10% APS 10 g APS / 100 ml H
2

0



IV :
- 
- 
- 


23
1. 


V
Acrylamide (12 %)
H
2
O
(ml)
2,19
1,5 M Tris HCl pH 8,8

(ml)
1,5
29:1 Acrylamide:Bis
(ml)
2,5
10 % APS
(l)
3,25
TEMED
(l)
5

ml
6,19825 ml

2. Gel 


V
Acrylamide (5 %)
H
2
O
(ml)
2,32
0,5 M Tris HCl pH 6,8
(ml)
1
29:1 Acrylamide:Bis
(ml)

0,68
10 % APS
(l)
16
TEMED
(l)
8

ml
4,024 ml

 di protein:
- .
- 


- 

- .
- .

VI :
- Sau khi  
- .
- .
- .

VII
1. 


24






1

5
Tag
9
GFP
2

6

o
)
10

o
)
3
GFP
7
VK (ecoli)
11
BSA

4
BSA
8

12




1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12



2
-

25
-
- 

-
-

-

- T

-

-

-


a) BSA:
-m 607 acid amin.
- 
- 66463Da (= 66,5 kDa)
- 
o
C: 4,7
-824 M
-1
cm
-1
279 nm
-
3
c)
b) GFP (

-
-