Thiết kế quy trình sản xuất enzyme Protease từ Chủng Bacilus Licheniformis với công suất 200 tấnnăm

ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. 2
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................... 6
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................ 7
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................. 8
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................ 9
1.1

Giới thiệu enzyme protease ................................................................................ 9

1.1.1

Protease ........................................................................................................ 9

1.1.2

Phân loại .................................................................................................... 10

1.1.3

Cơ chế phản ứng của protease ................................................................... 12

1.1.4

Ứng dụng của enzyme protease ................................................................. 13

1.2

Các yếu tố ảnh hƣởng lên quá trình sinh tổng hợp protease ............................ 15

1.2.1

Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng.................................. 15

1.2.2

Ảnh hƣởng của yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp protease .. 17

1.3

Khái quát về chủng Bacillus licheniformis ...................................................... 19

1.3.1

Đặc điểm phân bố ...................................................................................... 19

1.3.2

Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 20

1.4

Ứng dụng .......................................................................................................... 22

CHƢƠNG 2: LỰA CHỌN CÔNG NGHỆ .................................................................... 23
2.1

Lựa chọn phƣơng pháp nuôi cấy ...................................................................... 23

2.1.1

Phƣơng pháp lên men bề mặt..................................................................... 23

2.1.2

Phƣơng pháp lên men bán rắn ................................................................... 24

2.1.3

Phƣơng pháp lên men chìm ....................................................................... 25

2.1.4

Kết luận lựa chọn phƣơng pháp lên men ................................................... 25

2.2

Phƣơng pháp lên men ....................................................................................... 26
Page 3


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
2.2.1 Lên men gián đoạn ...............................................................................................
26
2.2.2

Lên men liên tục ........................................................................................ 27

2.2.3

Kết luận lựa chọn phƣơng pháp nuôi cấy .................................................. 29

CHƢƠNG 3: QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE ............................... 30
3.1

Sơ đồ sản xuất .............................................................................................. 303.2
Thuyết minh quy trình ...................................................................................... 32

3.2.1 Quy trình nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis để thu nhận enzyme
protease ……………………………………………………………………………32
3.2.2

Quy trình thu nhận enzyme protease ......................................................... 33

CHƢƠNG 4: CÂN BẰNG VẬT CHẤT ....................................................................... 44
4.1

Quá trình sấy phun ............................................................................................ 45

4.2

Lọc .................................................................................................................... 46

4.3

Ly tâm ............................................................................................................... 46

4.4

Lên men ............................................................................................................ 47

4.4.1

Thành phần môi trƣờng ni cấy ............................................................... 49

CHƢƠNG 5: TÍNH TỐN THIẾT BỊ .......................................................................... 51
5.1

Thiết bị lên men ................................................................................................ 51

5.1.1

Thiết bị nhân giống cấp 2 (Thiết bị lên men chính) .................................. 51

5.1.2

Thiết bị nhân giống cấp 1 .......................................................................... 52

5.1.3

Thiết bị nuôi cấy ........................................................................................ 52

5.2

Qúa trình ly tâm ................................................................................................ 56

5.3

Qúa trình lọc ..................................................................................................... 59

5.4

Sấy .................................................................................................................... 62

CHƢƠNG 6: TÍNH TỐN KINH TẾ ........................................................................... 69
6.1

Vốn cố định ...................................................................................................... 69

6.1.1

Chi phí nhà đất và xây dựng ...................................................................... 69

6.1.2

Chi phí thiết bị ........................................................................................... 70
Page 4


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
6.2

Chi phí sản xuất trực tiếp .................................................................................. 71

6.2.1

Chi phí nhân cơng ...................................................................................... 71

6.2.2

Chi phí nguyên liệu .................................................................................... 72

6.2.3

Chi phí điện nƣớc....................................................................................... 72

6.3

Chi phí sản xuất gián tiếp ................................................................................. 72

6.3.1

Chi phí bảo trì ............................................................................................ 72

6.3.2

Chi phí bảo hiểm: ....................................................................................... 73

6.3.3

Chi phí bên ngoài nhà máy: ....................................................................... 73

6.4

Vốn đầu tƣ ........................................................................................................ 74

6.5

Lãi và doanh thu ............................................................................................... 74

6.6

Lợi nhuận và dịng tiền ..................................................................................... 74

6.7

Gía trị hiện tại thuần ......................................................................................... 76

6.8

Tỷ suất nội tại (IRR) ......................................................................................... 77

CHƢƠNG 7: RỦI RO KINH TẾ ................................................................................... 78
7.1

Rủi ro khi giá biến động ................................................................................... 78

7.2

Rủi ro do sản phẩm tồn kho .............................................................................. 78

7.3

Tổn thất do sản phẩm không đạt chất lƣợng .................................................... 79

PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 80
Thiết bị ................................................................................................................. 80
Điện, nƣớc ............................................................................................................ 83
Nguyên liệu .......................................................................................................... 83

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 86

Page 5


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1: Phản ứng thủy phân liên kết peptide. ..............................................................................9
Hình 2: Cấu trúc khơng gian enzyme protease .........................................................................10
Hình 3: Sơ đồ phân loại protease ...................................................................................................11
Hình 4: Hình dạng của Baccilus Licheniformis .......................................................................20
Hình 5: Đƣờng cong sinh trƣởng trong hệ thống kín (Theo sách của Prescott, Harley và
Klein) ....................................................................................................................................................27
Hình 6: Sơ đồ thu nhận enzyme protease từ chủng Baccilus licheniformis. .....................31
Hình 7: Quy trình ni B. lichenifomis để sinh tổng hợp protease ......................................32
Hình 8: Sơ đồ dây chuyền cơng nghệ nuôi cấy vi sinh vật bằng phƣơng pháp nuôi chìm
........................................................................................................................................ 35
Hình 9: Quy trình tách lọc khác nhau giữa các vật liệu khác nhau ............................... 37
Hình 10: Hiệu quả loại bỏ cặn đối với các loại màng khác nhau .................................. 38
Hình 11: Màng lọc UF KOCH – USA ........................................................................... 39
Hình 12: Hệ thống sấy phun tổ hợp ............................................................................... 42
Hình 13: Thiết bị ly tâm dạng đĩa .................................................................................. 57
Hình 14: Ramzin ............................................................................................................ 64

Page 6


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Thông số kỹ thuật Màng lọc UF KOCH _ PURON MP ............................... 40
Bảng 4.1: Hiệu suất thu hồi enzyme Protease qua các giai đoạn trong quá trình lên
men chủng Bacillus licheniformis. ................................................................................. 44
Bảng 4.2: Tổng thời gian làm việc của công ty trong một năm. .................................... 44
Bảng 4.3: Tỷ lệ các thành phần môi trƣờng lên men ..................................................... 49
Bảng 4.4: Khối lƣợng của các thành phần môi trƣờng cần dùng trong 1 năm .............. 50
Bảng 5.1: Thông số của bể nuôi cấy .............................................................................. 53
Bảng 5.2: Thông số kỹ thuật của thiết bị ly tâm ............................................................ 58
Bảng 5.3: Thơng số của q trình lọc ............................................................................ 59
Bảng 5.4: Thơng số của thiết bị sấy phun LPG - 150 .................................................... 68
Bảng 6.1: Chi phí xây dựng ........................................................................................... 69
Bảng 6.2: Chi phí thiết bị ............................................................................................... 70
Bảng 6.3: Chi phí nhân cơng .......................................................................................... 71
Bảng 6.4: Chi phí nguyên liệu cho 1 năm sản xuất........................................................ 72
Bảng 6.5: Chi phí điện nƣớc cho 1 năm ni cấy .......................................................... 72
Bảng 6.6: Thống kê chi phí đầu tƣ ................................................................................. 75
Bảng 6.7: Thống kê lợi nhuận dự án ............................................................................. 75
Bảng 6.8: Bảng tính giá trị hiện tại dự án ..................................................................... 77
Bảng 7.1: Rủi ro khi giá biến động ................................................................................ 78

Page 7


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển, tiến bộ vƣợt bậc qua nhiều thời kỳ thì nghành Cơng nghệ
sinh học đã đóng góp rất nhiều cho sự tiến bộ của xã hội nói chung và nghành nghiên
cứu nói riêng. Và enzyme protease là loại enzyme quen thuộc trên thị trƣờng chế phẩm
enzyme hiện nay, khơng chỉ có ý nghĩa cho q trình sinh trƣởng và phát triển mọi sinh

vật mà cịn góp phần quan trọng trong các nghành cơng nghệ chế biến thực phẩm,
trong y học, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trƣờng, … là công cụ giúp phục vụ và
nâng cao đời sống con ngƣời.
Enzyme có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ thực vật, động vật,
nhƣng hiện nay việc thu nhận enzyme từ nguồn vi sinh vật đƣợc coi là thuận lợi nhất.
Sự đa dạng về hình dạng và nhiều lồi vi sinh vật khác nhau là tỷ lệ thuận kéo theo sự
đa dạng về hình dạng và nhiều lồi enzyme khác nhau. Và chủng Bacillus licheniformis
và lồi vi khuẩn có khả năng sản sinh nhiều enzyme protease là loại enzyme quan trọng
thuộc hệ thống tiêu hóa, có khả năng thủy phân glucid, lipid, protid, … thành các thành
phần có lợi cho đƣờng tiêu hóa
Chính vì những ƣu điểm của enzyme protease và nhìn thấy đƣợc lợi thế từ
chủng Bacillus licheniformis nhóm chúng em đã quyết định thực hiện đề tài “Thiết kế
quy trình sản xuất enzyme protease từ chủng Bacilus Licheniformis với công suất
200 tấn/năm"

Page 8


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu enzyme protease
1.1.1 Protease
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho q trình thủy phân liên
kết peptide (-CO – NH-) trong phân tử protein giải phóng các acid amin, peptone hoặc
ditripeptone [Hình 1]. Ngồi ra, protease cịn có khả năng thủy phân liên kết este và
vận chuyển acid amin.
+H2O
H2N-CH-CO-NH-CH-CO - ….- NH-CH-COOH

R1

R2

RX

H2N-CH-COOH + H2N-CH-CO…NH-CH-COOH

R1

R2

RX

Hình 1: Phản ứng thủy phân liên kết peptide.
Thƣờng các protease trong cơ thể tồn tại ở dạng không hoạt động (zymogen)
và có thể trở thành hoạt động do chính protease tƣơng ứng tác động bằng sự cắt đứt
một hay một số liên kết peptide trong phân tử của nó giúp làm thay đổi cấu trúc
phân tử có lợi cho hoạt động xúc tác, enzyme chuyển sang trạng thái hoạt động.
Cấu trúc bậc bốn của phân tử protein ảnh hƣởng đến quá trình phân giải chất
dƣới tác dụng của enzyme protease.

Page 9


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào, cơ quan đến cơ thể nên đƣợc phân bố rộng rãi: vi sinh vật (vi khuẩn, virus,
nấm), thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật (gan, dạ dày bê…).

Hình 2: Cấu trúc khơng gian enzyme protease

1.1.2 Phân loại

Page 10


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4).

Aminopeptidase
Exopeptidase
(E.C.3.4.11-17)
Carboxypeptidase
Peptidase
(Protease)
(E.C.3.4)

Serine proteinase

Cystein proteinase
Endopeptidase
(E.C.3.4.21-99)
Aspartic proteinase

Metallo proteinase
Hình 3: Sơ đồ phân loại protease
Enzyme protease đƣợc phân theo những cách khác nhau, tuy nhiên hai đặc điểm
chính để phân loại protease gồm có:
Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các liên kết peptide trong phân tử
protein, ngƣời ta chia protease thành hai nhóm:

 Endopeptidase (proteinase): chủ yếu phân giải các liên kết peptide nằm trong
phân tử protein tạo thành những đoạn peptide có trọng lƣợng phân tử nhỏ.
 Exopeptidase (polypeptidase): chủ yếu phân cắt peptide ở hai đầu mạch.
Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ƣu của protease, ngƣời ta chia
protease các nhóm:
Page 11


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
 Protease acid: pepsin, renin, … hoạt động ở vùng pH acid.
 Protease kiềm: trypsin, chymotrypsin, … hoạt động ở vùng pH kiềm.
 Protease trung tính: papain, … hoạt động ở vùng pH trung tính.

1.1.3 Cơ chế phản ứng của protease
Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhƣng
chúng đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng cơ chế chung nhƣ
sau:
E + S → ES → ES’+ P1 → E + P2
Trong đó:
E: Enzyme; S: cơ chất ;ES: Phức chất enzyme – cơ chất
ES’: Phức chất trung gian enzyme- cơ chất acyl hóa Acyl enzyme)
P1: sản phẩm đầu tiên của chuỗi phản ứng (nhóm amin tự do mới đƣợc tạo thành)
P2: sản phẩm thứ hai của chuỗi phản ứng (nhóm carboxyl tự do mới đƣợc tạo thành)
Giai đoạn 1: Acyl hóa
Cơ chất kết hợp với enzyme tạo phức hợp trung gian ES. Sau khi tạo thành phức
hợp ES, carbon trong nhóm cacboxyl của liên kết peptide dễ bị phân cắt bới serin ở
trung tâm hoạt động, qua đó tạo thành một chất trung gian tứ diện với một trung tâm
oxylanion trên cacbon cacbonyl làm nhớ lại trạng thái chuyển tiếp của phản ứng, Trạng
thái chuyển tiếp này đƣợc làm bền bời các tƣơng tác liên kết hydro đặc hiệu giữa các
gốc trong túi trung tâm hoạt động và trung tâm oxylanion của cơ chất.

 Trong subtillizin, liên kết hydro này đƣợc tạo thành từ nitơ của serin 195 trong
bộ khung và của serin 155 chuỗi bên.
 Trong chymotrypsin, các liên kết hydro này đƣợc tạo thành nitơ của gốc serin ái
nhân và một glyxin ở trung tâm hoạt động.
Page 12


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Các gốc ser- 195 và His-57 trực tiếp tham gia trong phản ứng cắt đứt liên kết
peptide của cơ chất.
Các nguyên tử liên kết C của –CO- sắp xếp nhƣ một khối bốn mặt, do đó đƣợc
giải phóng sản phẩm P1 và phức acyl- enzyme. Để tạo thành phức diện tức thời cịn có
sự tham gia của 2 nhóm –NH- của mạch chính enzyme. Chúng tạo liên kết hydrogen
với oxyanion (O2 và CO)
Giai đoạn 2: Deacyl hóa
Phức hợp acyl- enzyme bị thủy phân bởi H2O theo chiều ngƣợc lại của giai đoạn
acyl hóa. Enzyme bị khử acyl do sự tác dụng ái nhân của phân tử nƣớc đi vào trung
tâm hoạt động của enzyme từ một khoảng do sự tạo thành trong q trình acyl hóa và
gắn liền với sự làm bền liên kết H với Enyme. Trong đó, nhóm imidazole chuyển
proton của gốc –OH từ serin cho nhóm amin để tái sinh lại enzyme.[1]

1.1.4 Ứng dụng của enzyme protease
Protease đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ công nghiệp
thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dƣợc phẩm và nông nghiệp…
Trong công nghiệp chế biến thịt, protease đƣợc dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy
phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có
vị tốt hơn.
Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách đƣợc chế
phẩm keratineza thuỷ phân đƣợc keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ da, lông
vũ. Nếu dùng axit để thuỷ phân sẽ mất đi hoàn toàn các axit amin chứa lƣu huỳnh, nếu

dùng kiềm để thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng L sang D làm giảm giá trị sinh
học của axit amin) [2].
Để thuỷ phân triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế)
cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy ngƣời ta
Page 13


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
thƣờng dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ
lệ tổng cộng 1- 2% khối lƣợng protein cần thuỷ phân.
Ƣu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn đƣợc vitamin của
nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân
Trong công nghiệp sữa, protease đƣợc dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính
làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật nhƣ A. candidus, P. roquerti,
B. mesentericus,… đƣợc dùng trong sản xuất pho mát. Trong công nghiệp sản xuất
bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột,
tạo độ xốp và nở tốt hơn.
Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm
tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae đƣợc dùng để
thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn. Trong công nghiệp
da, protease đƣợc sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ
yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các
chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó đƣợc hoàn thiện hơn
sau khi thuộc da. Trƣớc đây, để làm mềm da ngƣời ta dùng protease đƣợc phân lập từ
cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đƣa các protease tách từ vi khuẩn (B.
mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn (S. fradiae, S.
griseus, S. rimosus...) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần
chiếm một vị trí quan trọng. Trong công nghiêp dệt: Proteinase vi sinh vật đƣợc sử
dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo đƣợc tạo bằng các dung dịch
cazein, gelatin) để sợi đƣợc đƣợc bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp

protein serisin đã làm dính các sợi tơ tự nhiên, làm bông và tách rời các loại tơ tằm, do
đó làm giảm lƣợng hố chất để tẩy trắng. Ngồi ra, protease cịn đƣợc ứng dụng rộng
rãi trong rất nhiều ngành khác nhƣ: điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh
dƣỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng. Protease của
Page 14


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức
ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn ni gia súc và gia cầm.[3]
1.2 Các yếu tố ảnh hƣởng lên quá trình sinh tổng hợp protease
1.2.1 Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng
Số loại và tỷ lệ các thành phần dinh dƣỡng của mơi trƣờng có ý nghĩa quyết
định đến khả năng sinh tổng hợp protease ở vi sinh vật nói chung, vi khuẩn Bacillus
nói riêng. Để tăng lƣợng protease trong môi trƣờng cần lựa chọn nguồn carbon, nguồn
nitrogen, muối khống thích hợp, chọn tỷ lệ thích hợp các thành phần này và đặc biệt là
nguồn cơ chất cảm ứng [3].
1.2.1.1 Nguồn dinh dƣỡng carbon
Nguồn carbon thƣờng dùng để nuôi cấy vi sinh vật là các glucid: mono-, di- và
polysaccharide (tinh bột). Tác dụng của nguồn carbon này tuỳ thuộc bản chất hoá học
của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật. Nồng độ glucid thích hợp nhất cho q
trình sinh tổng hợp protease cũng thay đổi tuỳ loài vi sinh vật. Nguồn carbon tự nhiên
thƣờng dùng trong ni cấy là bột mì, bột gạo, các loại cám hoặc nƣớc chiết của những
nguyên liệu này .[3]
Tinh bột là nguồn carbon của nhiều trong chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme
protease.
Ví dụ: Vi khuẩn B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở mơi trƣờng
tinh bột > 8%.
Glucose, saccharose, maltose, fructose và sorbitol là nguồn carbon tốt nhất cho
sự tổng hợp protease đối với vi khuẩn B. subtilis .[3]

Page 15


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
1.2.1.2 Nguồn dinh dƣỡng nitơ
Nguồn nitơ trong môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật có thể là các chất hữu cơ
(protein và các sản phẩm thuỷ phân của protein) hoặc các muối vô cơ chứa nitơ
(amoni, nitrat). Giá trị dinh dƣỡng của các nguồn nitơ khác nhau tuỳ thuộc vào khả
năng thu nhận nitơ từ nguồn là NH3.
Nguồn nitơ hữu cơ thƣờng ảnh hƣởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease,
vì chúng có vai trị nhƣ chất cảm ứng của quá trình này. Các nguồn nitơ hữu cơ thƣờng
dùng là: pepton, casein, albumin, bột đậu tƣơng...Trong số này, peptone ở nồng độ thấp
thƣờng là chất cảm ứng tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp protease. Thay thế peptone
bằng casein sẽ làm giảm rõ rệt lƣợng protease đƣợc tổng hợp nhất là khi casein ở nồng
độ cao.
Nguồn nitơ vô cơ tốt nhất cho vi khuẩn thƣờng là (NH4)2SO4, các muối clorua,
sulphate, nitrate amon thƣờng có ảnh hƣởng khơng tốt đến quá trình sinh tổng hợp
protease.
Khi sử dụng phối hợp nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng kể q trình
tổng hợp protease. [4]
1.2.1.3 Các ngun tố khống đa lƣợng và vi lƣợng
Các hợp chất khống có ý nghĩa rất lớn trong q trình ni cấy vi sinh vật vì
chúng làm thay đổi trạng thái hố keo của tế bào chất. Trong đó, phospho và lƣu huỳnh
có ảnh hƣởng đáng kể đến quá trình sinh tổng hợp protease. Các photphase vơ cơ có
ảnh hƣởng khơng tốt đến sự sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, KH2PO4 thƣờng có ảnh
hƣởng tốt đến q trình sinh tổng hợp do tính chất đệm của nó. Lƣu huỳnh có ảnh
hƣởng khác nhau lên q trình sinh tổng hợp protease, nó có vai trị điều hịa q trình
tổng hợp protease của vi sinh vật. [5]

Page 16


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Trong tế bào vi sinh vật ngƣời ta còn thấy sự có mặt của nhiều yếu tố khống
nhƣ: magiê, natri, sắt,... Các vi sinh vật có thể lấy các chất khống này từ môi trƣờng
hay đƣợc bổ sung vào môi trƣờng ni cấy một số dạng muối khống hoặc có sẵn
trong nguyên liệu pha môi trƣờng. [6]
1.2.1.4 Cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp protease
Trong số các enzyme do vi sinh vật tổng hợp, một số enzyme trong điều kiện
thƣờng đƣợc tổng hợp với một lƣợng rất ít, nhƣng hàm lƣợng của chúng có thể tăng
gấp nhiều lần khi cho thêm một số chất nhất định vào môi trƣờng nuôi cấy. Enzyme
này còn đƣợc gọi là enzyme cảm ứng. Chất gây nên hiệu quả này là chất cảm ứng.
Chất cảm ứng là cơ chất đặc hiệu của enzyme hay những chất tƣơng tự nhƣ cơ
chất hoặc những sản phẩm trung gian của quá trình biến đổi các chất. [5]
Khả năng sinh tổng hợp protease thƣờng đƣợc cảm ứng bởi các chất giàu đạm
nhƣ bột đậu nành, đậu phộng, bột cá, bột tơm, bột nghiền móng, sừng hoặc lơng vũ...
Tuy nhiên, đối với các loại cơ chất khác nhau thì hoạt độ enzyme cũng thể hiện khơng
giống nhau. Do đó, trong mơi trƣờng ni cấy vi sinh vật ta có thể lựa chọn bổ sung
các cơ chất thích hợp nhằm thu lƣợng lớn protease cần thiết một cách nhanh chóng và
khoa học.
1.2.2 Ảnh hƣởng của yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp protease
1.2.2.1 Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hƣởng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi
sinh vật cũng nhƣ tính chất của enzyme đƣợc tổng hợp. Tùy từng chủng vi sinh vật mà
nhiệt độ thích hợp khác nhau.
Nấm sợi thƣờng phát triển ở khoảng nhiệt độ 22 – 320C. Cịn vi khuẩn thì phát
triển ở nhiệt độ cao hơn thƣờng là 35 – 550C [7]
Page 17

ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Đa số các vi sinh vật tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm
nhanh chóng khi ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp.
1.2.2.2 pH mơi trƣờng
Khi dùng phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt, pH của mơi trƣờng thƣờng ít làm ảnh
hƣởng đến q trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật vì mơi trƣờng bán rắn có tính đệm
cao và hầu nhƣ khơng thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Đối với nấm
sợi, pHopt thích hợp cho q trình tổng hợp protease vào khoảng 6 - 6,5. Các vi khuẩn
phát triển tốt và tạo nhiều enzyme ở pHopt trung tính 6,6 – 7,4. [7]
Khi dùng phƣơng pháp nuôi cấy bề sâu, pH có ảnh hƣởng rất lớn đến sự tích lũy
protease trong môi trƣờng. pH của môi trƣờng thay đổi sau khi thanh trùng môi trƣờng
và đặc biệt thay đổi rất lớn trong q trình ni cấy, pH ban đầu thích hợp cho phát
triển của nấm sợi 3,8 – 5,6, với vi khuẩn 6,2 – 7,4. Trong q trình ni cấy, tùy theo
thành phần môi trƣờng và các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật,
mà pH của mơi trƣờng sẽ chuyển dần về phía axit hoặc kiềm [8].
Đối với các loài thuộc chi Bacillus, pH thƣờng chuyển về kiềm. Ngƣời ta có thể
căn cứ vào pH của mơi trƣờng sau khi ni cấy để dự đốn lƣợng protease tích lũy
trong mơi trƣờng. pH của mơi trƣờng ảnh hƣởng tới tỷ lệ giữa các protease đƣợc tổng
hợp. Do đó, nếu giữ pH của mơi trƣờng ổn định trong suốt thời gian nuôi cấy, vi sinh
vật sẽ tạo một loại protease xác định chiếm ƣu thế trong môi trƣờng. [9, 10]
1.2.2.3 Độ thơng khí
Oxy rất cần đối với đời sống vi sinh vật hiếu khí. Tăng sự thơng khí đến giới
hạn xác định thì sự phát triển của vi sinh vật cũng tăng theo. Đối với nhiều vi sinh vật,
thơng khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trƣởng, rút ngắn pha tiềm phát và nâng cao sinh khối.
Lƣợng oxy thích hợp cho q trình tổng hợp protease của các vi sinh vật khác nhau.
Trong một số trƣờng hợp thiếu oxy tuy có kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật nhƣng
Page 18

ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
lại tăng q trình tổng hợp protease. Sự hiếu khí mạnh làm kìm hãm sự tổng hợp
protease [5]. Ở mơi trƣờng bề mặt ngƣời ta thƣờng thêm chất tạo xốp nhƣ trấu vào, cịn
ở mơi trƣờng bề sâu (mơi trƣờng dịch thể), thì ngƣời ta thƣờng dùng thiết bị sục khí.
1.2.2.4 Độ ẩm
Độ ẩm mơi trƣờng là lƣợng nƣớc có trong mơi trƣờng ni cấy. Nƣớc đóng vai
trị quan trọng trong mọi hoạt động sống vi sinh vật. Nƣớc tham gia vào thành phần tế
bào, tham gia các phản ứng sinh hóa trong q trình trao đổi chất, là chất dung mơi hịa
tan chất dinh dƣỡng ở vi sinh vật.
Độ ẩm là yếu tố cần thiết cho sự sinh trƣởng của vi sinh vật khi nuôi cấy bằng
phƣơng pháp bề mặt và phụ thuộc vào thành phần môi trƣờng bề mặt. Độ ấm mơi
trƣờng xốp thích hợp ni nấm sợi là 50 – 60%, còn đối với vi khuẩn là 50 – 70%. [6]
1.2.2.5 Thời gian nuôi cấy
Các chủng vi sinh vật khác nhau có tốc độ sinh trƣởng khác nhau. Tốc độ sinh
trƣởng vi sinh vật thƣờng liên quan đến thời gian ni cấy và là yếu tố có vai trò rất
quan trọng trong việc sinh tổng hợp enzyme. Mặt khác, yếu tố thời gian còn quyết định
năng suất của việc sản xuất chế phẩm enzyme. Thông thƣờng, enzyme đƣợc tổng hợp
nhiều nhất trong môi trƣờng nuôi cấy tại một thời gian nhất định nào đó. Thời gian lên
men cịn phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, thành phần môi trƣờng, điều kiện nuôi cấy.

1.3 Khái quát về chủng Bacillus licheniformis
1.3.1 Đặc điểm phân bố
Bacillus licheniformis là loài vi khuẩn thƣờng đƣợc tìm thấy trong đất và trên
lơng chim. Những con chim có xu hƣớng ở trên mặt đất nhiều hơn khơng khí nhƣ là
chim sẻ, hoặc trên mặt nƣớc nhƣ là vịt là những vật phổ biến mang vi khuẩn này. Nó
chủ yếu đƣợc tìm thấy xung quanh khu vực ngực của chim và bộ lông.
Page 19


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019

Các nhà khoa học hiện nay đang khám phá khả năng làm giảm lơng cho các
mục đích nơng nghiệp. Da có chứa một lƣợng lớn các protein khơng tiêu hóa, nhƣng
các nhà nghiên cứu hy vọng rằng, thơng qua q trình lên men B. licheniformis, chúng
có thể sử dụng lơng vũ để tạo ra bột lông vũ rẻ và bổ dƣỡng để ni gia súc

1.3.2 Đặc điểm hình thái
Khả năng bài tiết cao của protease serine kiềm của Bacillus licheniforms giúp
chúng trở thành một trong những vi khuẩn quan trọng nhất trong sản xuất enzyme công
nghiệp. Bacillus lichenifoarmis đƣợc giới thiệu là: [Hình 4]
Giới (Kingdom): Bacteria
Ngành (Division): Firmicutes
Lớp ( Class): Bacilli
Bộ (Order): Eubascteriales
Họ (Family): Bacillaceae
Giống (Genus): Bacillus
Lồi (Species): Bacillus licheniformis

Hình 4: Hình dạng của Baccilus Licheniformis
Page 20


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
B. licheniformis là một vi khuẩn gram dƣơng, hình que, ƣu nhiệt. B.
Licheniformis có nhiệt độ tăng trƣởng tối ƣu khoảng 300C, nhiệt độ tối ƣu để sản sinh
enzyme là 370C, là vi khuẩn có khả năng sản sinh các enzyme protease và amylase có
khả năng thủy phân glucid, lipid, protid, enzyme cellulase biến đổi chất xơ thành các
loại đƣờng dễ tiêu, lecitinase thủy phân các chất béo phức hợp, enzyme phân giải
gelatin, enzyme phân giải fibrin và một loại enzyme giống lysozyme gây tác dụng trực
tiếp dung giải một số vi khuẩn Proteus gây bệnh đƣờng ruột…[7]
Ngoài ra, B. licheniformis góp phần ổn định hệ vi khuẩn có ích cho đƣờng ruột,

có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng ức chế sinh trƣởng
hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn gram âm lẫn gram
dƣơng, nấm gây bệnh.[5] Do đó, B. licheniformis có khả năng cạnh tranh tốt với các vi
khuẩn gây hại khác
B. licheniformis giúp cải thiện trọng lƣợng, chuyển hóa thức ăn và giảm bệnh
tiêu chảy, tỷ lệ chết non ở vật nuôi
B. licheniformis tiết ra enzyme phân hủy các chất nhƣ carbohydrate, chất béo và
đạm thành những đơn vị nhỏ hơn. Chúng cũng có khả năng phân hủy các chất hữu cơ,
tích lũy trong nền đáy ao ni, làm sạch nƣớc. B. licheniformis có tác dụng làm giảm
COD, H2S trong ao tôm làm tăng năng suất ni
Các chế phẩm men vi sinh chứa nhóm vi khuẩn Bacillus có tác dụng phân hủy
nhanh hợp chất hữu cơ, làm mất mùi hơi, kích thích sự phát triển các vi khuẩn có lợi,
cạnh tranh mơi trƣờng sống, làm giảm số lƣợng vi khuẩn có hại gây bệnh, là ổn định
mơi trƣờng. Giúp chuyển hóa các chất hữu cơ nhƣ: xác động thực vật, cặn bã thành
CO2 và nƣớc, chuyển các chất độc hại nhƣ NH3, NO2- thành các chất khơng độc nhƣ
NO3-, NH4+ từ đó làm ổn định chất lƣợng nƣớc

Page 21


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
1.4 Ứng dụng
B. licheformis xuất hiện trong nhiều lĩnh vực nhƣ nuôi trồng thủy sản là yếu tố
giúp cải thiện trọng lƣợng, chuyển hóa thức ăn và giảm bệnh tiêu chảy và tỷ lệ chết non
ở vật nuôi [10].
Bacillus licheniformis đƣợc ni cấy để có đƣợc protease để sử dụng trong rửa
sinh học . Vi khuẩn này thích nghi tốt để phát triển trong điều kiện kiềm, do đó
protease tạo ra có thể chịu đƣợc độ pH cao, làm cho nó trở nên lý tƣởng cho việc sử
dụng này, các thành phần khác của chất tẩy rửa tạo ra độ pH kiềm . Protease có độ pH
tối ƣu từ 9 đến 10 và đƣợc thêm vào chất tẩy giặt để tiêu hóa, và do đó loại bỏ, bụi bẩn

tạo ra từ protein.
Bacillus licheniformis có thể đƣợc sử dụng trong tổng hợp các ống nano
vàng. Các nhà nghiên cứu đã tổng hợp các hạt nano vàng với kích thƣớc từ 10 đến 100
nanomet.[11] Hạt nano vàng thƣờng đƣợc tổng hợp ở nhiệt độ cao, trong dung môi hữu
cơ và sử dụng thuốc thử độc hại. Vi khuẩn sản xuất chúng trong điều kiện nhẹ hơn
nhiều.

Page 22


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
CHƢƠNG 2: LỰA CHỌN CƠNG NGHỆ
2.1 Lựa chọn phƣơng pháp ni cấy
Công nghiệp sản xuất enzyme hiện nay trên thế giới áp dụng hai phƣơng pháp
nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm.

2.1.1 Phƣơng pháp lên men bề mặt
Phƣơng pháp ni cấy bề mặt là phƣơng pháp tạo môi trƣờ ng cho vi sinh vật
phát triển trên bề mặt môi trƣờng. Môi trƣờ ng sử dụng là môi trƣờng lỏng hoặc sử
dụng môi trƣờng đặc (môi trƣờng bán rắn). Ở môi trƣờng lỏng vi sinh vật sẽ phát triển
trên bề mặt môi trƣờ ng tạo thành ván khuẩn ngăn cách pha lỏng và pha khí. Theo
Nguyễn Đức Lƣơng vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dƣỡng từ dung dịch môi trƣờng,
oxy

khơng

khí,

tiến

hành

q

trình

tổng

hợp

enzyme

Phƣơng pháp ni cấy vi sinh vật trên mơi trƣờng rắn (bề mặt) có một số ƣu điểm hơn
so với phƣơng pháp chìm. Do lƣơng nƣớc trong cơ chất thấp nên enzyme và những sản
phẩm khác ở trạng thái cô đặc vì vậy dễ tinh sạch. Ni cấy bề mặt dễ sấy khơ và ít bị
giảm hoạt tính enzyme. Khơng cần trang thiết bị phức tạp, chủ yếu nuôi trên khay và
buồng ni giữ ở nhiệt độ, độ ẩm thích hợp.Đối với một số mục đích đặc biệt, ngƣời ta
ni vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt gạt gạo (sản xuất tƣơng), hạt đậu tƣơng (đậu
tƣơng men – misô) đã đƣợc nâu chín trộn hạt cốc cịn sống (làm men thuốc bắc, men
dân tộc, làm tƣơng) [3].
Ngƣời ta thƣờng dùng cám mì, cám gạo, ngơ mảnh, … có chất phụ gia là trấu.
Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo đƣợc độ xốp nhiều, khơng có những chất
gây ảnh hƣởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ gia phải đảm bảo
sao cho hàm lƣợng tinh bôt trong khối nguyên liệu không đƣợc thấp hơn 20%, có thể
bổ sung thêm nguồn nito vô cơ (NH4)2SO4, (NH4)2CO, photpho, nito hữu cơ và các
chất kích thƣớc sinh trƣởng nhƣ malt, nƣớc chiết ngơ, nƣớc lọc bã rƣợu.
Page 23


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019

2.1.2 Phƣơng pháp lên men bán rắn
Lên men trên môi môi trƣờng bán rắn hay lên men trên cơ chất rắn là một q
trình trong đó sự sinh trƣởng của vi sinh vật và sự hình thành sản phẩm diễn ra trên bề
mặt của ngun liệu gần nhƣ khơng có mặt của nƣớc tự do, cơ chất chứa ẩm dƣới dạng
hấp phụ trong mạng chất rắn. Hoạt động sống của vi sinh vật diễn ra chủ yếu trên bề
mặt chất rắn. Sự trao đổi nhiệt và khí hầu nhƣ là trực tiếp giữa pha rắn hay pha khí
khơng qua chất lỏng lỏng trung gian. Các phản ứng sinh học và sự chuyển hóa thực
hiện trực tiếp giữa tết bào vi sinh vật và cơ chất tại nơi tiếp xúc. Lên men trên môi
trƣờng bán rắn đã đƣợc sử dụng từ nhiều năm qua. Ngày nay, lên men bán rắn đang
đƣợc quan tâm trở lại một cách mạnh mẽ và đƣợc sử dụng rộng rãi nhằm gia tăng giá
trị cho các sản phẩm từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền, các phế liệu nông nghiệp và chất
thải công nghiệp.
Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt có một số ƣu điểm:
 Nồng độ enzyme thu nhận cao
 Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà khơng làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme. Chế
phẩm khơ sẽ dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu
không cần khâu tách và làm sạch enzyme
 Khơng cần các thiết bị phức tạp, q trình sản xuất ít tốn năng lƣợng
 Loại bỏ vi sinh vật tạp nhiễm một cách dễ dàng, không cần giữ mơi trƣờng tuyệt
đối trong cả q trình.
 Có thể thực hiện quy mơ gia đình, trang trại cũng nhƣ ở quy mơ lớn đến 20
tấn/ngày
Bên cạnh đó phƣơng pháp lên men bề mặt cũng đi kèm với những nhƣợc điểm
khác nhƣ:
 Mang lại năng suất thấp
Page 24


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
 Khó cơ khí hóa, tự động hóa, cần diện tích nuôi lớn, chất lƣợng chế phẩm ở mẻ

không đều.
 Tốn nhiều diện tích của nơi sản xuất

2.1.3 Phƣơng pháp lên men chìm
Ni cấy chìm hay ni cấy bề sâu dùng môi trƣờng dịch thể và đƣơc thực hiện
trong những thùng lên men có trang trƣờng đƣợc phân tán khắp mọi điểm và chung
quanh bề mặt tế bào đƣợc tiếp xúc với dịch dinh dƣỡng. Đặc điểm này đòi hỏi trong
suốt q trình ni cấy sử dụng thiết bị có cánh khuấy và cung cấp oxy bằng cách sục
khí liên tục. Ngày nay phƣơng pháp ni cấy chìm đƣợc dùng phổ biến trong công
nghệ vi sinh để sản xuất men bánh mì, protein đơn bào, các chế phẩm vi sinh làm phân
bón, thuốc trừ sâu, các enzyme, các acid amin, vitamin, các chất kháng sinh, các chất
kích thích sinh học, v.v...
Phƣơng pháp ni cấy chìm có một số ƣu điểm nổi trơi sau:
 Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền.
 Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩm thấp.
 Dễ tổ chức đƣợc xí nghiệp có sản lƣợng lớn.
 Các thiết bị lên men chìm dễ cơ khí hoá, tự động hoá và dễ dàng kiểm soát các
yếu tố nhƣ nhiệt độ, pH,…trong q trình ni cấy.
Tuy vậy phƣơng pháp này vẫn còn tồn tại một số nhƣợc điểm nhƣ: dễ bị nhiễm
tồn bộ và chi phí trang thiết bị khá cao.

2.1.4 Kết luận lựa chọn phƣơng pháp lên men
Để đáp ứng nhu cầu của ngành công nghiệp, chi phí sản xuất thấp đƣợc ƣu tiên
hàng đầu để sản xuất một enzyme nhƣ protease kiềm. Cả hai hình thức lên men trạng
thái rắn (SSF) và lên men chìm (SMF) đều có thể đƣợc sử dụng để sản xuất enzyme
Page 25


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
này. SSF thì giống qui trình phát triển tự nhiên của vi sinh vật nhƣ ủ chua và ủ phân có

thể đƣợc sử dụng một cách có kiểm sốt để sản xuất sản phẩm mong muốn. Mặc dù
vậy, theo truyền thống thì lên men chìm vẫn đƣợc sử dụng nhiều hơn vì dễ xử lý, kiểm
sốt tốt hơn các u tố môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, pH. Môi trƣờng tổng hợp đã đƣợc sử
dụng để lên men sản xuất amylase thông qua SMF. Thành phần của môi trƣờng tổng
hợp bao gồm canh trƣờng dinh dƣỡng cơ bản và tinh bột hòa tan, những thành phần
này rất đắt tiền và đƣợc thay thế bằng các phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ hơn để giảm
chi phí cho mơi trƣờng ni cấy nếu áp dụng vào sản xuất ở qui mô lớn.
Trong SMF, sẽ chọn phƣơng thức nuôi cấy gián đoạn để nuôi và thu enzyme
theo mẻ vì Bacillus lichenifomis có thể sinh trƣởng tốt trong canh trƣờng dinh dƣỡng
cơ bản mà không bị ức chế bởi nồng độ cao của thành phần dinh dƣỡng, bên cạnh đó
việc sử dụng gián đoạn bổ sung cơ chất ngoài dễ bị nhiễm khuẩn, tốn năng lƣợng thì
cịn sẽ tốn nhiều chi phí cho nhân cơng vận hành, quản lý.

2.2 Phƣơng pháp lên men
Công nghệ lên men là công nghệ phát triển các tế bào trong quy mơ lớn với hiệu
quả cao. Nó cũng bao gồm q trình hồi phục sản phẩm

2.2.1 Lên men gián đoạn
Trong phƣơng pháp lên men gián đoạn (Batch – Culture), thông thƣờng vi sinh
vật sinh trƣởng đến chừng nào một thành phần chủ yếu của môi trƣờng dinh dƣỡng bị
giới hạn. Khi đó culture chuyển từ pha lũy thừa sang pha cân bằng. Sinh trƣởng gắn
liền với sự thay đổi kéo dài của điều kiện nuôi, sự giảm chất dinh dƣỡng và tăng khối
lƣợng tế bào. Trong q trình đó trạng thái sinh lí của tế bào cũng thay đổi. Thơng
thƣờng việc tạo thành sản phẩm mong muốn liên quan với một trạng thái sinh lý nhất
định trong pha sinh trƣởng. Không thể duy trì đƣợc trạng thái này trong một thời gian
dài.
Page 26


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019

Vi sinh vật đƣợc ni cố định trong bình lên men với một thể tích mơi trƣờng
xác định. Vi sinh vật phát triển theo giai đoạn: pha tiềm phát (Lag phase), pha nhân lên
chậm, pha logarit (Log phase) hay còn gọi là pha chỉ số (Exponential phase), pha cân
bằng hay giai đoạn ổn định (Stationary phase), pha suy vong hay giai đoạn suy vong
(Death phase) và tạo ra các sản phẩm. Nếu lấy thời gian ni cấy là trục hồnh và lấy
số logarit của số lƣợng tế bào sống làm trục tung sẽ có thể vẽ đƣợc đƣờng cong sinh
trƣởng của vi sinh vật bằng cách phân đơi.[Hình 5] Kết thúc q trình, ngƣời ta tiến
hành các cơng đoạn cần thiết để thu lấy sản phẩm. Phƣơng pháp lên men chu kỳ đƣợc
ứng dụng để sản xuất nhiều hoạt chất quan trọng nhƣ amino acid, các chất kháng sinh

Hình 5: Đƣờng cong sinh trƣởng trong hệ thống kín (Theo sách của Prescott,
Harley và Klein)
Tuy nhiên, thực hiện theo từng mẻ nên thƣờng có năng suất thấp và chu kỳ sản
xuất bị kéo dài, phƣơng pháp nuôi gián đoạn đƣợc sử dụng trƣớc hết cho sự lên men vơ
trùng, vì cách ni này dễ dàng về mặt kỹ thuật.

2.2.2 Lên men liên tục
Nguyên liệu liên tục đi vào và đồng thời sản phẩm lên men liên tục đi ra
Lên men liên tục là q trình ni vi sinh vật trong thiết bị đƣợc cấu tạo đặc biệt
để sao cho khi vật nuôi đã phát triển đến một giai đoạn nào đó thích hợp cho việc lấy đi
Page 27