THIẾT KẾ QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE TỪ CHỦNG BACILLUS LICHENIFORMIS VỚI CÔNG SUẤT 200 TẤNNĂM

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, chúng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn Thị Quỳnh
Mai người đã tận tình hướng dẫn cho chúng tơi những kiến thức và nhiều bài học kinh
nghiệm trong suốt quá trình thực hiện đồ án.
Tiếp theo, chúng tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến các Thầy, Cơ của khoa
Sinh Học và Môi Trường, trường Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM đã tạo
điều kiện cũng như trang bị nhiều kiến thức và định hướng giúp chúng tơi hồn thiện
đề tài.
Lời cuối cùng, cảm ơn tất cả bạn bè, những người đã đóng góp ý kiến, cùng chia
sẻ những khó khăn và giúp đỡ nhau rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2022


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................................... i
ĐẶT VẤN ĐỀ .........................................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................................................2
1.1. Giới thiệu enzyme protease ........................................................................................................2
1.1.1. Khái niệm enzyme protease .................................................................................................2
1.1.2. Cơ chế phản ứng của enzyme Protease ..............................................................................4
1.1.3. Ứng dụng enzyme Protease .................................................................................................6
1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng enzyme protease ....................................................................................8
1.2.1. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động enzyme ...................................................................8
1.2.1.1. Ảnh hƣởng của nồng độ pH..............................................................................................8
1.2.1.2. Ảnh hƣởng nhiệt độ...........................................................................................................8
1.2.1.3. Ảnh hƣởng của nồng độ thơng khí...................................................................................9

1.2.1.4. Ảnh hƣởng độ ẩm ..............................................................................................................9
1.2.1.5. Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy ..........................................................................................9
1.2.1.6. Ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng.................................................................................9
1.2.1.7. Ảnh hƣởng cùa nguồn cacbon ..........................................................................................9
1.2.1.8. Ảnh hƣởng của nguồn Nitơ ............................................................................................10
1.2.1.9. Ảnh hƣởng của khoáng chất...........................................................................................10
1.2.1.10. Ảnh hƣởng của các nguyên tố vi lƣợng, NaCl, vitamin, một số nguyên tố khác .....10
1.3.Giới thiệu chủng Bacillus licheniformis ....................................................................................10
1.3.1. Tổng quan về Bacillus licheniformis ................................................................................10
1.3.2. Vị trí phân loại ....................................................................................................................11
1.3.3. Đặt điểm hình thái ..............................................................................................................11
1.3.4. Tình hình nghiên cứu thu nhận protease từ chủng Bacillus licheniformis....................12
ii


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

CHƢƠNG 2. PHÂN TÍCH, LỰA CHỌN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ SẢN
XUẤT ENZYME PROTEASE ...........................................................................................................15
2. Sơ đồ quy trình ni cấy chủng Bacillus licheniformis để thu nhận enzyme protease ..........15
2.1. Thuyết minh quy trình..............................................................................................................16
2.1.1. Chuẩn bị giống....................................................................................................................16
2.1.2. Chuẩn bị môi trƣờng..........................................................................................................16
2.1.3. Lên men ...............................................................................................................................18
2.1.6. Lọc màng .............................................................................................................................19
2.1.7. Kết tủa .................................................................................................................................21
2.1.8. Ly tâm .................................................................................................................................22
2.1.9. Sấy phun..............................................................................................................................23

2.1.10. Bao gói ...............................................................................................................................25
CHƢƠNG 3: TÍNH TỐN CÂN BẰNG VẬT CHẤT .....................................................................26
3. Kế hoạch sản suất .........................................................................................................................26
3.1. Cân bằng vật chất......................................................................................................................27
3.1.1. Quá trình sấy ......................................................................................................................27
3.1.2. Quá trình ly tâm ................................................................................................................27
3.1.3. Quá trình kết tủa ................................................................................................................28
3.1.4. Quá trình lọc .......................................................................................................................29
3.1.5. Quá trình lên men ..............................................................................................................29
CHƢƠNG 4: TÍNH TỐN THIẾT BỊ...............................................................................................31
4.1. Thiết bị lên men .........................................................................................................................31
4.2. Tính tốn thiết kế 1 bể lên men ................................................................................................31
4.2.1. Cánh khuấy .........................................................................................................................32
4.2.2. Tốc độ cánh khuấy .............................................................................................................33
iii


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

4.2.3. Tốc độ cấp oxy (OTR) ........................................................................................................34
4.2.4. Tốc độ sử dụng oxy (OUR) ................................................................................................35
4.3. Thiết bị lọc .................................................................................................................................35
4.4. Thiết bị kết tủa ..........................................................................................................................37
4.5. Thiết bị ly tâm............................................................................................................................39
4.7. Thiết bị sấy phun .......................................................................................................................40
4.8. Tính tốn thiết bị đóng gói .......................................................................................................45
CHƢƠNG 5: TÍNH TỐN KINH TẾ................................................................................................46
5. Vốn cố định ...................................................................................................................................46

5.1. Chi phí thiết bị .......................................................................................................................46
5.1.2. Chi phí vận chuyển.............................................................................................................46
5.1.3. Chi phí nhà xƣởng ..............................................................................................................47
5.2. Chi phí sản xuất trực tiếp .........................................................................................................48
5.2.1. Chi phí nguyên liệu ............................................................................................................48
5.2.2. Chi phí nhân cơng ..............................................................................................................48
5.2.3. Chi phí năng lƣợng .............................................................................................................49
5.3. Chi phí sản xuất gián tiếp .........................................................................................................50
5.3.1. Chi phí bảo trì thiết bị........................................................................................................50
5.3.2. Chi phí quảng cáo...............................................................................................................50
5.3.3. Chi phí bảo hiểm ................................................................................................................50
5.3.4. Chi phí xử lý nƣớc thải ......................................................................................................50
5.3.5. Tổng khấu hao ....................................................................................................................51
5.4. Vốn lƣu động..............................................................................................................................51
5.5. Tổng vốn đầu tƣ.........................................................................................................................51
5.6. Giá sản phẩm .............................................................................................................................51
iv


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

5.7. Lợi nhuận ...................................................................................................................................51
5.8. Thời gian hoàn vốn....................................................................................................................52
5.9. Giá trị hiện tại thuần NPV .......................................................................................................52
5.10. Tỷ suất nội tại (IRR) ...............................................................................................................53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................................56

v

ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

DANH MỤC HÌNH
1.Hình 1.1. Sơ đồ phân loại protease .................................................................................... 4
2.Hình 1.2. Cấu trúc phân tử protease ................................................................................. 4
3.Hình 1.3. Hình dạng Bacillus licheniformis .................................................................... 11
4.Hình 1.4. Hình thái Bacillus licheniformis trên đĩa thạch ............................................. 11
5.Hình1.5. Protease (Subtilisin A from Bacillus licheniformis) ........................................ 13
6.Hình 1.6. Protease Subtilisin A (from Bacillus licheniformis) Powder ......................... 14
7.Hình 2.1. Sơ đồ thu nhận enzyme protease từ chủng Bacillus licheniformis ............... 15
8.Hình 2.2. Thiết bị lên men fermentor- bioreactor equipment ....................................... 19
9.Hình.2.3. Kích thƣớc các loại màng (Gregory Russotti and Kent E.Goklen) .............. 20
10.Hình 2.4. Thiết bị lọc màng UF KOCH – USA ............................................................. 21
11.Hình 2.5. Mơ hình thiết bị kết tủa .................................................................................. 22
12.Hình 2.6. Máy Ly Tâm Ngăn Xếp Đĩa Tự Động DHC400 ........................................... 23
13.Hình 2.7. Thiết bị sấy LPG 150 ...................................................................................... 24
14.Hình 2.8. Máy đóng gói bột KSFY-C60F ...................................................................... 25
15.Hình 4.1: Giản đồ Ramzin .............................................................................................. 42

vi


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

DANH MỤC BẢNG
1.Bảng 2.1. Môi trƣờng nhân giống chủng Bacillus licheniformis ................................... 17
2.Bảng 2.2. Môi trƣờng nuôi lên men Bacillus licheniformis thu nhận protease ............ 17
3.Bảng 3.1. Số ngày nghỉ và làm việc trong năm ............................................................... 26
4.Bảng 4.1 Thông số thiết bị kết tủa ................................................................................... 38
5.Bảng 4.2. Thơng số thiết bị ly tâm ................................................................................... 39
6.Bảng 5.1: Tính toán thiết bị .............................................................................................. 46
7.Bảng 5.2. Phƣơng tiện vận tải .......................................................................................... 46
8.Bảng 5.3. Chi phí phí nhà xƣởng ..................................................................................... 47
9.Bảng.5.4. Chi phí ngun liệu........................................................................................... 48
10.Bảng 5.5. Chi phí nhân cơng........................................................................................... 48
11.Bảng 5.6. Chi phí năng lƣợng ......................................................................................... 49
12.Bảng 5.7. Tỷ lệ hoàn vốn nội tại IRR ............................................................................. 52
13.Bảng 5.8. Tỷ lệ hoàn vốn nội tại IRR ............................................................................. 53

vii


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển, tiến bộ vượt bậc qua nhiều thời kỳ thì nghành Cơng nghệ
sinh học đã đóng góp rất nhiều cho sự tiến bộ của xã hội nói chung và nghành nghiên
cứu nói riêng. Và enzyme protease là loại enzyme quen thuộc trên thị trường chế phẩm
enzyme hiện nay, khơng chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng và phát triển mọi
sinh vật mà cịn góp phần quan trọng trong các nghành công nghệ chế biến thực phẩm,
trong y học, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường,… là công cụ giúp phục vụ và
nâng cao đời sống con người. Enzyme có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như

thực vật, động vật, nhưng hiện nay việc thu nhận enzyme từ nguồn vi sinh vật được coi
là thuận lợi nhất. Sự đa dạng về hình dạng và nhiều lồi vi sinh vật khác nhau là tỷ lệ
thuận kéo theo sự đa dạng về hình dạng và nhiều lồi enzyme khác nhau. Và chủng
Bacillus licheniformis và lồi vi khuẩn có khả năng sản sinh nhiều enzyme protease là
loại enzyme quan trọng thuộc hệ thống tiêu hóa, có khả năng thủy phân glucid, lipid,
protid,… thành các thành phần có lợi cho đường tiêu hóa. Chính vì những ưu điểm của
enzyme protease và nhìn thấy được lợi thế từ chủng Bacillus licheniformis nhóm
chúng em đã quyết định thực hiện đề tài “Thiết kế quy trình sản xuất enzyme protease
từ chủng Bacilus licheniformis với công suất 200 tấn/năm".

1


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu enzyme protease
1.1.1. Khái niệm enzyme protease
Protease (còn gọi là peptidase hay proteinase) là nhóm các enzyme có khả năng
phân hủy protein thành những thành phần đơn giản hơn như các chuỗi polypeptide
ngắn hay các acid amin tự do nhờ vào khả năng cắt đứt các liên kết peptide (-CO-NH).
Dựa vào cơ chế xúc tác: Protease được phân chia thành 2 loại là endopeptidase
và exopeptidase:
Exo-peptidase còn gọi là peptidase hay enzyme phân cắt đầu mạch. Thủy phân
đầu tận cùng của chuỗi polypeptide. Dựa vào vị trí tác động trên mạch polipeptide,
exopeptidase được phân chia thành 2 loại
Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc tripeptide.

Carboxypeptide: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide.
Endo-peptidase còn gọi là protease hay enzyme phân cắt nội mạch. Xúc tác phản
ứng thủy phân liên kết peptide bên trong chuỗi polipeptidase. Dựa vào động học của
cơ chế xúc tác endopeptidase được chia thành 4 loại:
Serin proteinase: là những protein chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung
tâm hoạt động và có vai trị đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme.
Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin
bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin
bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carsberg, subtilisin BPN. Các serine
proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất
tương đối rộng.

2


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động.
Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài
protein động vật và protein kí sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở
vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
Aspatic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm
pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các
aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt
động mạnh ở pH trung tính.
Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường

hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động người ta chia enzyme làm 4 nhóm: Protease-serin (OH): trypsin, chymotrypsin, alastase, subtilisin,…
Protease -thiol (SH): Papain, bromelin, ficine,...
Protease-acide (COOH): Pepsin, rennin,... trong trung tâm hoạt động có chứa
asparagyl hay glutamyl. - Protease-kim loại: collagenase,...
Dựa vào nguồn thu nhận enzyme có thể chia làm 3 loại:
Protease động vật: Trypsin, chymotry psin, pepsin, rennin,…
Protease thực vật: Papain, bromelin, ficine,...
Protease vi sinh vật: colagenase, protease acide, protease bazo, protease trung
tính,...[1]
Dựa vào hoạt tính ở những điều kiện pH khác nhau, protease được chia thành 3
nhóm bao gồm: protease acid, protease trung tính và protease kiềm tính. Theo đó,
protease acid hoạt động tốt nhất ở pH 2,0 đến 5,0; protease có pH tối ưu vào khoảng 7
được gọi là protease trung tính; protease kiềm tính có hoạt tính tốt nhất khi pH lớn hơn
8 (pH kiềm) [1]
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4).
3


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

Hình 1.1. Sơ đồ phân loại protease [1]

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử protease

1.1.2. Cơ chế phản ứng của enzyme Protease
Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng
chúng đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng cơ chế chung

như sau:
E + S → ES → ES’+ P1 → E + P2
Trong đó:
E: Enzyme; S: cơ chất; ES: Phức chất enzyme – cơ chất
4


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

ES’: Phức chất trung gian enzyme- cơ chất acyl hóa Acyl enzyme)
P1: sản phẩm đầu tiên của chuỗi phản ứng (nhóm amin tự do mới được tạo
thành)
P2: sản phẩm thứ hai của chuỗi phản ứng (nhóm carboxyl tự do mới được tạo
thành)
Giai đoạn 1: Acyl hóa
Cơ chất kết hợp với enzyme tạo phức trung gian ES. Sau khi tạo thành phức hợp
ES, cacbon trong nhóm cacbonyl của liên kết peptide dễ bị phân cắt (ví dụ: trên vị trí
P1) bởi serin ở trung tâm hoạt động, qua đó tạo thành một chất trung gian tứ diện
(tetrahedral) với một trung tâm oxyanion trên cacbon cacbonyl làm nhớ lại trạng thái
chuyển tiếp của phản ứng. Trạng thái chuyển tiếp này được làm bền bởi các tương tác
liên kết hydro đặc hiệu giữa các gốc trong túi trung tâm hoạt động và trung tâm
oxyanion của cơ chất.
Trong subtilizin, liên kết hydro này được tạo thành từ nitơ của serin 195 trong bộ
khung (ai nhân trung tâm hoạt động) và của serin 155 chuỗi bên.
Trong chymotrypsin, các liên kết hydro này được tạo thành từ nitơ của gốc serin
ái nhân và một glyxin ở trung tâm hoạt động.
Các gốc Ser-195 và His-57 trực tiếp tham gia trong phản ứng cắt đứt liên kết
peptide của cơ chất. Băt đầu là nguyên tử O2 của Ser-195 tấn cơng vào ngun tử C

của nhóm -CO- trong liên kết peptide, do đó liên kết đơi giữa C và O của -CO- trở
thành liên kết đơn, O2 tích điện âm (gọi là oxyanion). Các nguyên tử liên kết với C của
-CO- săp xếp như một khối bốn mặt, do đó được gọi là phức trung gian tứ diện tức
thời (trạng thái chuyển tiếp), sau đó giải phóng sản phẩm P1 và phức acyl-enzyme. Để
tạo thành phức diện tức thời cịn có sự tham gia của hai nhóm -NH- của mạch chính
enzyme. Chúng tạo liên kết hydrogen với oxyanion (O2 của -CO-). [2]
Giai đoạn 2: Deacyl hóa
Phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O theo chiều ngược lại của
giai đoạn acyl hóa. Enzyme bị khử acyl do sự tác dụng ái nhân của phân tử nước đi
5


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

vào trung tâm hoạt động của enzyme từ một khoang do đích đến của sản phẩm peptide
đầu tiên. Phản ứng khử acyl xảy ra cùng với sự tạo thành trong q trình acyl hóa và
gắn liền với sự làm bền liên kết H với enzyme. Trong đó, nhóm imidazole chuyển
proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amin để tái sinh lại enzyme.
Sản phẩm amine đang liên kết với His-57 bằng liên kết hydrogen sẽ khuyếch tán
ra ngồi. Thế vào đó là H2O. His-57 lấy H+ của H2O. Ion OH- được tạo thành tấn công
C của -CO- đang gắn với Ser-195 để tạo thành phức trung gian tứ diện tức thời. Sau
đó, His-57 dâng H+ cho oxygen của Ser-195, đồng thời giải phóng P2 (phần acid của
cơ chất). P2 khuếch tán ra ngồi
Ngồi ra enzyme có thể mất hoạt tính do q trình phân giải protein và q trình
oxy hóa, hoặc bị phân hủy bởi các thành phần hóa học khác của chất tẩy rửa và thậm
chí bởi các enzyme khác. Vì vậy, enzyme phải có khả năng chống phân giải protein
cao và phải có thời gian bảo quản lâu dài. [2]
1.1.3. Ứng dụng enzyme Protease

Trong công nghiệp sữa: protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính
làm đơng ntụ sữa của chúng. Người ta chỉ sử dụng các Protease của vi sinh vật có tính
chất tương tự renin hoặc chỉ thay thế 25-50% renin. Protease từ một số vi sinh vật như A.
candidus, P. roquerti, B. mesentericus,… được dùng trong sản xuất pho mát. Trong cơng
nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm
nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn. Ngồi ra có thể sử dụng protease để thu casein kỷ
thuật (từ sữa) để sản xuất vectri, chất màu, keo dán, hương liệu
Trong chế biến thủy sản: nước mắm là sản phẩm được lên men từ các loại cá, là
sản phẩm truyền thống của dân tộc Việt Nam. Nước mắm là hổn hợp các acid amin.
Các acid amin này được tạo thành do sự thủy phân của protease, các protease này do
các vi sinh vật tổng hợp nên.
Trong công nghiệp chế biến thịt: Enzyme protease được dùng làm mềm thịt nhờ
sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích
hợp và có vị tốt hơn.
6


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

Trong công nghiệp da: Enzyme protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy
phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị
cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất
định, tính chất đó được hồn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm da
người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc
đưa các protease tách từ vi khuẩn (B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (A. oryzae,
A. flavus) và xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus…) vào công nghiệp thuộc da
đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng.
Trong công nghiệp dệt: Proteinase vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm,

tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch cazein, gelatin) để sợi được
được bóng, dể nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính
bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hố
chất để tẩy trắng.
Trong sản xuất bia: Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan
trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A.
oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt
hơn.
Trong y học: Sử dụng nhiều enzyme proteaese để sản xuất thuốc hổ trợ tiêu hóa,
chữa bệnh nghẽn mạch máu, tiêu viêm vết thương.
Trong cơng nghiệp xà phịng, các chất tẩy rửa, mỹ phẩm và sản xuất bánh kẹo
và một số ngành khác: Người ta bổ sung thêm enzyme proteinase trong các loại xà
phịng diệt khuẩn, kem dưỡng da, xà phịng có tính tảy rửa cao.
Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bánh kẹo nhằm tăng mùi và vị của
bánh. Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như:
Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm
và sản xuất một số thức ăn kiêng. Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với
amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý
nghĩa lớn trong chăn ni gia súc và gia cầm. Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi
7


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh,…Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp
để tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mĩ phẩm,… [10]
1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng enzyme protease
1.2.1. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động enzyme

Thành phần dinh dưỡng của môi trường có ý nghĩa quyết định đến khả năng sinh
tổng hợp protease ở vi sinh vật nói chung, vi khuẩn Bacillus nói riêng. Để tăng lượng
protease trong mơi trƣờng cần lựa chọn yếu tố phù hợp như pH, nhiệt độ, oxy hịa tan,
độ ẩm thời gian ni cấy và các nguồn carbon, nguồn nitrogen, muối khống thích
hợp, chọn tỷ lệ thích hợp các thành phần này và đặc biệt là nguồn cơ chất cảm ứng.
1.2.1.1. Ảnh hƣởng của nồng độ pH
Muốn đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn mạnh hay yếu
cần chú ý vào nồng độ pH của môi trường. Khi vi khuẩn được nuôi cấy bằng phương
pháp nuôi cấy bề mặt, nồng độ pH của mơi trường ít ảnh hưởng đến q trình sinh
tổng hợp enzym ở vi khuẩn (pH = 6,6 – 7,4). Khi được nuôi cấy bằng phương pháp bề
sâu, pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn, đơi khi nó cịn có vai trị quyết định sự phát
triển và sự tích luỹ protease, điều đó thể hiện khá rõ ở các lồi thuộc giống Bacillus,
nồng độ pH có thể thay đổi của mơi trường có thể thay đổi sau khi được khử trùng và
quá trình phát triển của vi sinh vật, nồng độ pH ban đầu thích hợp đối với sự phát triển
của vi khuẩn là pH = 6,2 – 7,4. Tuỳ theo các thành phần của mơi trường trong q
trình ni cấy và sản phẩm trong q trình trao đổi chất của vi sinh vật, pH của mơi
trường có thể sẽ chuyển dần thành axit hoặc kiềm, đối với các lồi thuộc giống
Bacillus, pH thường chuyển thành kiềm. Vì vậy có thể dựa vào pH của mơi trường sau
khi đem đi ni cấy để dự đốn lượng enzym protease được tích luỹ. [19]
1.2.1.2. Ảnh hƣởng nhiệt độ
Các cuộc nghiên cứu cho thấy nhiệt độ sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh
vật, khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật, và tính chất của enzym sau khi
được tổng hợp. Mỗi lồi vi sinh vật đều có nhiệt độ thích hợp khác nhau. Các loại vi
khuẩn phát triển thích hợp ở 35oC – 55oC. Đa số các vi sinh vật tổng hợp enzym
8


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

protease không bền với nhiệt và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ
thích hợp với nó.[19]
1.2.1.3. Ảnh hƣởng của nồng độ thơng khí
Độ thơng khí trong mơi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp của
enzym protease, nhưng ảnh hưởng này sẽ có khác nhau tuỳ theo từng lồi vi sinh vật.
Đơi khi việc thiếu oxy tuy kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng thành ra lại
làm tăng quá trình tổng hợp protease. Bình thường nếu thiếu khí mạnh sẽ làm cho kìm
hãm sự sinh tổng hợp của enzym protease.[19]
1.2.1.4. Ảnh hƣởng độ ẩm
Độ ẩm cũng là một yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng của vi khuẩn được nuôi
cấy bằng phương pháp bề mặt, độ ẩm thích hợp nhất đó là khoảng 60 – 70%. Bình
thường các loại vi khuẩn cần thiết sử dụng độ ẩm cao hơn nấm mốc.[19]
1.2.1.5. Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy
Để thu được lượng enzym protease cao thời gian nuôi cấy đối với vi khuẩn
thường là trong khoảng 36 – 48 giờ. Thời gian ni cấy cịn tuỳ thuộc vào chủng vi
sinh vật, thành phần có trong mơi trường, điều kiện nuôi cấy, nhưng để phân giải
protein đạt hiệu suất cao nhất, thì thời gian phải lâu hơn.[19]
1.2.1.6. Ảnh hƣởng thành phần mơi trƣờng
Các thành phần có trong mơi trường ni cấy và tỷ lệ các dinh dưỡng có trong đó
đều có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzym protease của vi khuẩn. Muốn
tăng lượng protease được tạo ra thì cần lựa chọn thích hợp các nguồn C, N, muối
khoáng... và đặc biệt là phải sử dụng chất cảm ứng.[19]
1.2.1.7. Ảnh hƣởng cùa nguồn cacbon
Nguồn cacbon thường được dùng để nuôi cấy vi sinh vật là các gluxit như: mono,
di, polysaccarit, muốn biết các đặc tính và tác dụng của nguồn C thì phải xem bản chất
hố học và đặc tính sinh lý của vi sinh vật. Các nguồn C tự nhiên thường được dùng để
làm môi trường ni cấy đó là bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết từ chúng.[19]
9

ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

1.2.1.8. Ảnh hƣởng của nguồn Nitơ
Các nguồn cung cấp nitơ cho vi sinh vật có thể là các chất hữu cơ hoặc các muối
hữu cơ. Nguồn N được làm từ các chất hữu cơ có ảnh hưởng tốt đến q trình sinh
tổng hợp enzym protease, vì nó đóng vai trị như chất cảm ứng q trình này. Nguồn N
vô cơ tốt nhất cho vi khuẩn thường là (NH4)2PO4, còn các muối clorua, sulphate,
nitrat amon thường mang lại những ảnh hưởng khơng tốt đến q trình sinh tổng hợp
enzym protease. Nếu sử dụng phối hợp nguồn N hữu cơ và vơ cơ sẽ tăng q trình sinh
tổng hợp enzym protease.[19]
1.2.1.9. Ảnh hƣởng của khống chất
Có ý nghĩa rất lớn đối với q trình ni cấy vi sinh vật ví sẽ làm thay đổi trạng
thái hố keo của tế bào chất. Photpho và lưu huỳnh cũng là các chất có ảnh hưởng
đáng kể lên q trình sinh tổng hợp enzym protease, ngồi ra magiê, natri, sắt,... cịn
được tìm thấy trong tế bào vi sinh vật. Các chất khoáng này có thể tới từ mơi trường,
mơi trường ni cấy.[19]
1.2.1.10. Ảnh hƣởng của các nguyên tố vi lƣợng, NaCl, vitamin, một số nguyên tố
khác
Tác dụng của NaCl là có thể làm thay đổi khả năng thẩm thấu của tế bào còn một
số kim loại thì các chất hoạt hố enzym. Chúng tham gia vào việc cấu tạo nên enzym
và các enzym đó được gọi là metaloenzim.[19]
1.3.Giới thiệu chủng Bacillus licheniformis
1.3.1. Tổng quan về Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis là một phân nhóm subtilis cùng với bacillius subtilis và
bacillus pumius. Những vi khuẩn này thường được biết đến là gây ngộ độc thúc ăn và
sự hư hỏng thực phẩm. Bacillus licheniformis cũng được biết đến vì các sản phẩm bơ
sữa.

Vi khuẩn này mặc dù bất lợi tuy nhiên nó có thể được sửa đổi để trở nên có lợi.
Các nhà khoa học hiện nay đang nghiên cứu biến lông chim thành thức ăn bổ dưỡng
10


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

cho gia súc bằng cách lên men các protein khơng tiêu hóa được trên long chim bacillus
licheniformis.
1.3.2. Vị trí phân loại
Chủng Bacillus licheniformis thuộc
Giới (Kingdom): Bacteria
Ngành (Division): Firmicutes
Lớp (Class): Bacilli
Bộ (Order): Eubascteriales
Họ (Family): Bacillaceae
Giống (Genus): Bacillus
Loài (Species): Bacillus licheniformis
1.3.3. Đặt điểm hình thái

Hình 1.3. Hình dạng Bacillus licheniformis
( />
Hình 1.4. Hình thái Bacillus licheniformis trên đĩa thạch
( />
11


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

B. licheniformis là một vi khuẩn gram dương, hình que, ưa nhiệt. B. licheniformis
có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu khoảng 300C, nhiệt độ tối ưu để sản sinh enzyme là
370C, là vi khuẩn có khả năng sản sinh các enzyme protease và amylase có khả năng
thủy phân glucid, lipid, protid, enzyme cellulase biến đổi chất xơ thành các loại đường
dễ tiêu, lecitinase thủy phân các chất béo phức hợp, enzyme phân giải gelatin, enzyme
phân giải fibrin và một loại enzyme giống lysozyme gây tác dụng trực tiếp dung giải
một số vi khuẩn Proteus gây bệnh đường ruột… [7]
Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, nghèo dinh dưỡng, đặc biệt trong đất,
nó cũng có khả năng sinh bào tử. Những bào tử này khá chiệu nhiệt, lạnh, bức xạ, và
các áp lực môi trường khác. Dưới những điều kiện tốt, các bào tử nảy mầm trở thành
tế bào vi khuẩn thể hoạt động.[7]
1.3.4. Tình hình nghiên cứu thu nhận protease từ chủng Bacillus licheniformis
Bài báo của các tác giả C. Suganthi, A. Mageswari, S. Karthikeyan,.... Mục tiêu
của bài báo này là phân lập chủng Bacillus licheniformis TD4 từ trầm tích ao ni
(Tuticorin) và nghiên cứu mơi trường tối ưu để sản xuất protease. Đầu tiên là phân lập
và xác định chủng Bacillus licheniformis bằng cách giải trình tự gen 16S rRNA. Để có
lượng protease tối đa thì các yếu tố dinh dưỡng như Cacbon và Nitơ, NaCl và các yếu
tố vật lý như thời gian ủ, pH, sự khuấy động, kích thước chất cấy. Từ các nghiên cứu
về sự ảnh hưởng của các nguồn C – N khác nhau cho thấy xylose và ure có khả năng
giúp tăng cường sản xuất enzym proteae. Vì thế với các nguồn C – N được chọn + 1M
NaCl, thu được lượng protease tối đa là 141,46 U/mg trong thời gian ủ 24 giờ ở nơng
độ pH 8 với 250 vịng / phút. [10]
Bài báo của các tác giả Diana Nur Afifah, Muhammad Sulchan, Dahrul Syah,....
Mục tiêu của bài báo này là nghiên cứu và đưa ra các thông số nhầm chứng minh red
oncom có thể được xử dụng để sản xuất fibrinogenolytic protease. Bacillus
licheniformis RO3 được phân lập từ red oncom và đem đi lên men ở ba môi trường đã
được phân tích là mơi trường LB, mơi trường LBS và mơi trường LBO, sau đó đem đi

xác định hoạt tính protease bằng cách đo quang phổ và dùng chất nền là casein. Thơng
qua kết quả đo OD 595nm có thể thấy mơi trường LB có thể tạo ra protease có hoạt độ
12


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

0,024 – 0,157 U/mg sau 36 giờ lên men, mơi trường LBS có hoạt độ 0,022 – 0,152
U/mg sau 48 giờ lên men, và trong môi trường LBO với hoạt độ cao nhất là 0,051 –
0,283 U/mg sau 48 giờ lên men. Tiếp theo là xác định hoạt tính fibrinogenolytic bằng
cách xét nghiệm zymography với chất nền là fibrinogen bằng phương pháp điện di ở
điện áp 70V, 50A, trong khoảng 2-3 giờ, và nhận được kết quả của sáu dải
fibrinogenolytic có trọng lượng phân tử là 20, 27, 32, 40, 70 và > 140 kDa. Sau cùng
là khảo sát đặc tính của enzym nhầm xác định được độ pH và nhiệt độ tối ưu nhất.[9]
Bài báo của các tác giả Trần Ngọc Hùng, Lê Phi Nga. Mục tiêu mà bài báo này
hướng tới là có thể sử dụng chế phẩm protease vào sản xuất thức ăn viên cho gia cầm.
Họ nhận thấy chủng Ba15 cho hoạt tính cao nhất và chịu nhiệt tốt, họ đã tiến hành
nghiên cứu chủng Ba15 trên mơi trường bán rắng vì chủng Ba15 sinh tổng hợp
protease trên mơi trường đó tốt nhất với nồng độ pH của dịch khoáng là 6,8 và nuôi
trong thời gian là 72 giờ, cụ thể là họ xác định hoạt tính protease ở MT1, tiếp theo đem
đi nuôi cấy ở MT2 trong 48 giờ, đem đi tăng sinh ở MT3 và mật độ giống phải đạt
1×107 CFU/g canh trường, sau đó tiến hành các bước xác định và khảo sát khác để
khẳng định chủng Bacillus subtilis Ba15 đáp ứng được những mục tiêu đã đặt ra. [18]
Một số sản phẩm trên thị trường hiện nay
Protease (Subtilisin A from Bacillus licheniformis).

Hình1.5. Protease (Subtilisin A from Bacillus licheniformis)
( />

13


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

Hãng sản xuất: MEGAZYME – IRELAND.
Sản phẩm là protease có độ tinh khiết cao (chất lỏng). Sử dụng trong nghiên cứu,
xét nghiệm enzym sinh hoá và phân tích chuẩn đốn in vitro.
Dung tích: 0.5g/10mL, 2g/40mL, 5g/100mL, 2,5g/100mL.
Nhiệt độ bảo quản: 2-8oC.
Độ ổn định: >4 năm ở 4oC.
Protease Subtilisin A (from Bacillus licheniformis) Powder.

Hình 1.6. Protease Subtilisin A (from Bacillus licheniformis) Powder
( />
Hãng sản xuất: MEGAZYME – IRELAND.
Sản phẩm có độ tinh khiết cao ở dạng bột. Sử dụng trong nghiên cứu, xét nghiệm
enzyme sinh hố và phân tích chuẩn đoán in vitro.
Khối lượng: 1g.
Nhiệt độ bảo quản: < -10oC.
Độ ổn định: Tối thiểu 1 năm ở nhiệt độ < -10oC.

14


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

CHƢƠNG 2. PHÂN TÍCH, LỰA CHỌN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH
CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE
2. Sơ đồ quy trình ni cấy chủng Bacillus licheniformis để thu nhận enzyme
protease
Sơ đồ tiến hành nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme như các kỹ thuật nhân
giống, lựa chọn phương pháp nuôi cấy phù hợp với chủng vi khuẩn và enzyme mà ta
nghiên cứu, thiết kế thiết bị nuôi cấy phù hợp với sản lượng và năng suất muốn thu
nhận, kỹ thuật lên men, tách và thu nhận enzyme.

Hình 2.1. Sơ đồ thu nhận enzyme protease từ chủng Bacillus licheniformis
15


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

2.1. Thuyết minh quy trình
2.1.1. Chuẩn bị giống
Mục đích: Kích hoạt giống gốc và tạo điều kiện cho vi sinh vật thích nghi với
mơi trường lên men sản xuất trên quy mô công nghiệp, đồng thởi tạo đủ lượng giống
để sản xuất.
Giống sử dụng: Chủng Bacillus licheniformis- ATCC 21424 chủng vi sinh thuần
chủng theo tiêu chuẩn quốc tế được cung cấp từ công ty Vicomtec chuyên cung cấp
các chủng vi sinh ATCC, sản phẩm của hãng Microbiologics là hàng của Mỹ chuyên
cung cấp cho các thí nghiệm quản lý chất lượng. Hoặc các chủng này cũng có thể cung
cấp do Viện Vi Sinh Vật và Công Nghệ Sinh Học (IMBT) của Đại học Quốc Gia Hà
Nội.
Cách tiến hành: Nhân giống cấp 1 trong trong bình tam giác 250 ml chứa 50 ml

môi trường dinh dưỡng đã khử trùng và được cấy vơ trùng với một vịng vi khuẩn từ
một mẻ mới và cho phép phát triển ở 37° C trong 24 giờ trong máy lắc. Sau 24 h tăng
trưởng, nuôi cấy vi khuẩn được sử dụng làm giống cấy. Nhân giống cấp 2 dựa trên quy
mô công nghiệp phải đáp ứng các yếu tố về chi phí đầu tư trang thiết bị thấp, yêu cầu
về trình độ nhân viên không quá cao, thiết bị đơn giản dễ vận hành và dễ khắc phục
khi sự cố xảy ra...Từ đó, phương pháp ni cấy Bacillus licheniformis phù hợp ở quy
mô công nghiệp là nuôi cấy gián đoạn cho phương pháp này đơn giản dễ vận hành và
chi phí cho thiết bị thấp, vi sinh vật không bi ức chế bởi nồng độ môi trường cao, phù
hợp với quy mô công nghiệp mà không cần yêu cầu kỹ thuật quá cao. [27]
2.1.2. Chuẩn bị môi trƣờng
Việc lựa chọn thành phần môi trường nuôi cấy Bacillus licheniformis cho đầy đủ
các chất dinh dưỡng cần thiết để vi sinh vật phát triển và sinh enzyme tốt nhất rất quan
trọng. Ngoài ra, cũng cần phải quan tâm đến giá thành của môi trường
Chủng Bacillus licheniformis được nhân giống bằng môi trường LB (Luria
Bertani) có thành phần dưới đây:

16


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

Bảng 2.1. Môi trƣờng nhân giống chủng Bacillus licheniformis [18]

Thành phần

Khối lƣợng

glucose

50g

pepton

10g

cao thịt

3g

agar

20g

nước cất

1l

Bảng 2.2. Môi trƣờng nuôi lên men Bacillus licheniformis thu nhận protease [18]

Thành phần

Nồng độ (g/l)

ZnSO4

0,0014g

KH2PO4

0,4g

DAP

0,8g

NaCl

1,44g

CaCO3

2,4g

MgSO4

0,2g

Bắp

200g

Đậu nành

200g

Nước

60%

Tiến hành hấp khử trùng
Mục đích: Đảm bảo môi trường không bị nhiễm các vi sinh vật lạ trước khi lên
men.
Cách tiến hành: Môi trường sau khi chuẩn bị được khử trùng ở 120 oC trong 30
phút.[16]

17


ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

GVHD: THS. NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

2.1.3. Lên men
Mục đích: Tạo các điều kiện mơi trường dinh dưỡng thuận lợi cho q trình ni
cấy sinh tổng hơp protease.
Đây là giai đoạn chính trong công nghệ sản xuất enzyme protease, cũng là giai
đoạn quyết định đến chất lượng, năng suất của chế phẩm enzyme protease. Chính vì
vậy q trình lên men phải được theo dõi và điều khiển chặc chẽ các điều kiện công
nghệ đã thiết lập.
Lựa chon phương pháp lên men: Chọn lên men chìm (SMF) để đáp ứng nhu cầu
của ngành cơng nghiệp, chi phí sản xuất thấp được ưu tiên hàng đầu để sản xuất một
enzyme như protease. Theo truyền thống thì lên men chìm (SMF) vẫn được sử dụng
nhiều hơn vì dễ xử lý, kiểm sốt tốt hơn các u tố môi trường như nhiệt độ, pH, các
nguồn cơ chất ổn định đồng nhất về thành phần và năng suất thu được sẽ ổn định phù
hợp cho quá trình lên men công nghiệp.
Lựa chọn phương phương nuôi cấy: Chọn nuôi cấy gián đoạn để ni và thu
enzyme theo mẻ vì Bacillus licheniformis có thể sinh trưởng tốt trong canh trường
dinh dưỡng cơ bản mà không bị ức chế bởi nồng độ cao của thành phần dinh dưỡng,

bên cạnh đó việc sử dụng gián đoạn bổ sung cơ chất ngoài dễ bị nhiễm khuẩn, tốn
năng lượng thì cịn sẽ tốn nhiều chi phí cho nhân cơng vận hành, quản lý.
Lựa chọn dạng thiết bị: Chọn thiết bị Bioreactor có hình trụ nón,có khuấy trộn có
sục khí làm bằng thép khơng gỉ phù hợp với vi khuẩn hiếu khí giúp cho vi sinh vật dễ
dàng tiếp xúc với cơ chất trong môi nuôi cấy giúp vi sinh vật phân bố đều trong bể
tăng diện tích tiếp xúc cơ chất-vi sinh vật, kiểm soát các điều kiện tăng tưởng, dễ dàng
đo các tham số quá trình lên men.

18