THIẾT KẾ QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE TỪ Bacillus subtilis NĂNG SUẤT 300 TẤNNĂM.

MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 6
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ 7
Chương 1. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI ................................................................................ 8
1.1

Tổng quan về Enzyme Protease ............................................................................. 8

1.1.1 Giới thiệu ........................................................................................................... 8
1.1.2 Phân loại ............................................................................................................. 8
1.1.3 Ứng dụng.......................................................................................................... 10
1.1.4 Các nguồn thu nhận .......................................................................................... 10
1.2

Tổng quan về Bacillus subtilis ............................................................................. 12

1.2.1 Giới thiệu ......................................................................................................... 12
1.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh lí ............................................................................ 12
Chương 2. LỰA CHỌN, PHÂN TÍCH VÀ ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ
...................................................................................................................................... 14
2.1.

Sơ đồ cơng nghệ .................................................................................................. 14

2.2.

Phân tích quy trình ............................................................................................... 14

2.2.1 Nhân giống ....................................................................................................... 14
2.2.2 Lên men ............................................................................................................ 15
2.3.3 Lọc màng .......................................................................................................... 18

2.2.4 Kết tủa .............................................................................................................. 21
2.2.5 Ly tâm .............................................................................................................. 22
2.2.6 Sấy phun ........................................................................................................... 26
Chương 3. CÂN BẰNG VẬT CHẤT .......................................................................... 29
3.1 Tính tốn cơng suất của một mẻ ............................................................................... 29
3.2 Cân bằng vật chất ..................................................................................................... 30
CHƯƠNG 4 TÍNH TỐN THƠNG SỐ THIẾT BỊ ................................................... 34
4.1 Tính tốn thiết bị lên men ........................................................................................ 34
4.1.1 Bể lên men chính .............................................................................................. 35
4.1.2 Thiết kế cánh khuấy và hệ thống cung cấp oxi .................................................. 35
4.1.3 Tính tốn tốc độ cánh khuấy ............................................................................. 36
2


4.1.4 Tính tốn tốc độ cung cấp Oxy (OTR) .............................................................. 36
4.2 Tính tốn thiết bị lọc ................................................................................................ 39
4.3 Tính tốn thiết bị ly tâm ........................................................................................... 41
4.4 Tính tốn thiết bị sấy phun ....................................................................................... 43
Chương V: TÍNH TỐN HIỆU QUẢ KINH TẾ ....................................................... 48
5.1 Vốn cố định ............................................................................................................. 48
5.1.1 Chi phí thiết bị .................................................................................................. 48
5.1.2 Đất và nhà xưởng.............................................................................................. 49
5.2 Nguồn vốn lưu động ................................................................................................ 50
5.2.1 Chi phí sản xuất trực tiếp .................................................................................. 50
5.2.2 Chi phí sản xuất gián tiếp .................................................................................. 53
5.3 Tính tốn lợi nhuận và thời gian hồn vốn. .............................................................. 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 57

3

Mục lục bảng
Bảng 2.1: Môi trường nhân giống Bacillus Subtilis ........................................................ 15
Bảng 2.2: Môi trường lên men ....................................................................................... 15
Bảng 2.3: Bảng so sánh về thông số giữa thiết bị ly tâm dạng đĩa và ly tâm dạng ống.... 25
Bảng 3.1: Hiệu suất thu hồi enzyme protease ở từng giai đoạn....................................... 29
Bảng 3.2: Cân bằng vật chất của các quá trình sản xuất enzyme protease....................... 33
Bảng 4.1: Thơng số chính bể lên men ............................................................................ 36
Bảng 4.2: Thông số thiết bị lọc màng ............................................................................. 41
Bảng 4.3: Thông số máy ly tâm dạng đĩa DHY/DHYC500 ............................................ 42
Bảng 4.4: Thông số thiết bị sấy phun LPG-150 .............................................................. 43
Bảng 5.1: Bảng giá thiết bị sử dụng ............................................................................... 48
Bảng 5.2: Bảng giá xe sử dụng ...................................................................................... 48
Bảng 5.3: Cơ cấu nhà máy ............................................................................................. 49
Bảng 5.4: Chi phí nhân sự trong 1 tháng ........................................................................ 50
Bảng 5.5: Chi phí nguyên vật liệu dùng trong 1 năm...................................................... 51
Bảng 5.6: Chi phí nhiên liệu dùng trong 1 năm .............................................................. 52
Bảng 5.7: Chi phí bán hàng trong 1 năm ........................................................................ 53
Bảng 5.8: Chi phí gián tiếp khác .................................................................................... 54
Bảng 5.9: Giá trị hiện tại thuần của dự án ...................................................................... 55

4


Mục lục hình
Hình 1.1: Phương trình thủy phân có sự xúc tác của enzyme protease.............................. 8
Hình 1.2: Sơ đồ phân loại protease................................................................................... 9
Hình 1.3: Hình ảnh tế bào B. subtilis dưới kính hiển vi .................................................. 13
Hình 2.1: Đề xuất sơ đồ cơng nghệ ................................................................................ 14
Hình 2.2: Cấu tạo bể lên men có cánh khuấy ................................................................. 17

Hình 2.3: Thiết bị phân riêng bằng mơ hình sợi ............................................................. 20
Hình 2.4: Cấu tạo sợi màng lọc UF ................................................................................ 21
Hình 2.5: Thiết bị kết tủa ............................................................................................... 22
Hình 2.6:Cấu tạo thiết bị ly tâm dạng đĩa ....................................................................... 24
Hình 2.7: Sơ đồ hệ thống sấy phun ................................................................................ 27
Hình 3.1: Enzyme protease trung tính (EC 3.4.24.28) .................................................... 30
Hình 4.: Bể lên men thể tích 100.000 lít của hãng Zhuoda ............................................. 34
Hình 4.2: Hình ảnh máy ly tâm cơng nghiệp dạng đĩa DHY/DHYC500 ......................... 42
Hình 4.3: Giản đồ Ramzin ............................................................................................. 44
Hình 4.4: Thiết bị sấy phun LPG-150 ............................................................................ 47

5


LỜI MỞ ĐẦU
Enzyme protease chiếm khoảng 60-65% thị trường công nghiệp tồn cầu, có nhiều
ứng dụng rộng rãi phục vụ đời sống con người, trong các lĩnh vực thực phẩm, cơng
nghiệp, dệt may, dược phẩm...
Protease có thể thu nhận từ các nguồn thực vật, động vật và vi sinh vật. Trong đó vi
sinh vật là nguồn cho protease phong phú nhất. Một số lồi vi sinh vật có khả năng tổng
hợp protease như B. subtilis, B. cereus, Streptomyces griseus,… Mặc dù có nhiều nguồn
vi khuẩn có sẵn để sản xuất protease nhưng chỉ có một số ít được nghiên cứu sử dụng sản
xuất thương mại. Trong đó, lượng protease từ vi khuẩn Bacillus sp. được sản xuất với sản
lượng lớn nhất [8], [15].
Việc sản xuất Protease là một việc rất cần thiết, là ngành công nghiệp quan trọng
cho ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, dệt may, dược phẩm…. Hiện nay ở nước ta
vẫn cịn ít các nhà máy sản xuất protease, mà phần lớn là được nhập từ nước ngoài, đây
là lợi thế để xây dựng nhà máy sản xuất protease cung cấp cho thị trường trong nước.
Và đó cũng chính là lý do nhóm chọn đề tài: “THIẾT KẾ QUY TRÌNH SẢN XUẤT
ENZYME PROTEASE TỪ Bacillus subtilis NĂNG SUẤT 300 TẤN/NĂM”

6


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt q trình học tập và hồn thành đồ án kĩ thuật q trình sinh học, nhóm
chúng em đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của Q Thầy Cơ và các bạn cùng
khóa. Nhóm chúng em xin chân thành cảm ơn.
Xin cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trường và tồn thể Q Thầy Cơ Khoa Công nghệ
Sinh học trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều
kiện thuận lợi giúp đỡ nhóm chúng em trong suốt q trình học tập và hoàn thành đồ án
này.
Đặc biệt, chúng em chân thành cảm ơn giáo viên hướng dẫn Thạc sĩ Nguyễn Thị
Quỳnh Mai đã luôn quan tâm, theo dõi, hỗ trợ kiến thức, giúp đỡ tận tình cũng như hướng
dẫn nhóm chúng em thực hiện đồ án này.
Đề tài được thực hiện trong thời gian ngắn. Mặc dù đã cố gắng rất nhiều để thực hiện
đề tài nhưng bước đầu đi vào thực tế, kiến thực còn nhiều hạn chế và nhiều bỡ ngỡ. Do
vậy, thiếu sót là điều khơng thể tránh khỏi, chúng em rất mong nhận được những ý kiến
đóng góp q báu từ q Thầy cơ để kiến thức của chúng em trong lĩnh vực này được
hoàn thiện hơn.
Sau cùng nhóm chúng em xin kính chúc Q Thầy Cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và
gặt hái được nhiều thành công trong sự nghiệp trồng người!

7


Chương 1. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
1.1 Tổng quan về Enzyme Protease
1.1.1 Giới thiệu
Protease hay peptide hydrolase là những enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết

peptid (-O-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thủy
phân này có thể là các acid amin, các polypeptide chuỗi ngắn, nhiều enzyme protease cịn
có thể xúc tác phản ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc
acid amin. Protease là các enzyme công nghiệp quan trọng hàng đầu, chiếm ít nhất một
phần hai tổng sản lượng thị trường enzyme trên toàn thế giới [34]. Protease được chia
thành các protease axit, trung tính và kiềm. Những enzyme này có thể được lấy từ thực
vật, động vật và vi sinh vật trong một số điều kiện, chẳng hạn như nồng độ muối cao [14].

Hình 1.1: Phương trình thủy phân có sự xúc tác của enzyme protease
Protease được tiết ra bởi tất cả các sinh vật sống, bao gồm cả thực vật, động vật và
vi sinh vật, vì sự tham gia của chúng vào các quá trình sinh lý thiết yếu. Protease nội bào
đóng một vai trị quan trọng trong việc điều chỉnh các q trình trao đổi chất và tế bào
khác nhau [34].Các quá trình này bao gồm dị hóa protein, đơng máu, tăng trưởng và di
chuyển tế bào, sắp xếp mơ, phát triển hình thái, chống viêm, tăng trưởng khối u và di căn,
kích hoạt zymogens, giải phóng hormone và peptide hoạt động dược lý từ protein tiền
chất và vận chuyển protein qua màng tế bào. Mặt khác protease ngoại bào, đóng một vai
trị quan trọng trong dinh dưỡng[34]. Chúng thủy phân protein lớn thành các phân tử nhỏ
hơn như peptide và axit amin để tế bào hấp thụ và sử dụng giai đoạn tiếp theo.
1.1.2 Phân loại
Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các peptide trong phân tử protein, người ta
chia protease làm 2 nhóm chính: exopeptidase và endopeptidase (hình 1.2) [23]

8


Protease
(peptidase)
E.C.3.4
Exopeptidase
(E.C.3.4.11-17)

Endopeptidase
(E.C.3.4.21-99)

Aminopeptidase

aspartic
endopeptidases

Carboxypeptidase

serine
endopeptidases

metallo
endopeptidases

cysteine
endopeptidases
Hình 1.2: Sơ đồ phân loại protease
-

-

Trong nhóm các exopeptidase:
+ Carboxypeptidase tách axit amin ở đầu carboxyl hoặc C của chuỗi
polypeptide[23]
+ Aminopeptidase tách axit amin ở đầu amino hoặc N của chuỗi
polypeptide[23]
Trong nhóm các endopeptidase: được chia thành bốn lớp aspartic endopeptidases,

serine endopeptidases, metallo endopeptidases, and cysteine endopeptidases, theo
NC-IUBMB. Mỗi loại protease có khả năng cắt chính xác một liên kết peptide cụ
thể và cho thấy một nhóm đặc trưng của các phân tử axit amin hoạt động tổ chức
theo cấu hình đặc trưng để xác định vị trí xúc tác [24].
+ Serin proteinase: là những protein chứa nhóm –OH của gốc serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc
tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và
subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như
chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi
9


khuẩn như subtilisin Carsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase
thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất
tương đối rộng[12].
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin,
bromelin, một vài protein động vật và protein kí sinh trùng. Các cystein
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất
rộng[12].
+ Aspatic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin,
cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung
tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính[12].
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở
vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh
dưới tác dụng của EDTA[12].
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành 3 nhóm[12]:
- Protease acid: pH 2-4

- Protease trung tính: pH 7-8
- Protease kiềm: pH 9-11
1.1.3 Ứng dụng
Một số enzyme protease có tiềm năng sử dụng trong chất tẩy rửa, công nghiệp dược
phẩm, quy trình xử lý sinh học và cơng nghiệp thực phẩm [29]. Trong các ngành cơng
nghiệp thực phẩm, protease đóng vai trị trong các q trình lên men để tạo ra các hợp
chất với đặc tính đặc trưng của hương vị và mùi thơm. Protease cũng đã được sử dụng
trong chế biến nước mắm [16], trong tiền xử lý da trong ngành thuộc da, và trong công
thức của các sản phẩm ăn kiêng trị liệu [14].
1.1.4 Các nguồn thu nhận
Protease có thể được lấy từ động vật, thực vật và các nguồn vi sinh vật. Protease động
vật bao gồm trypsin tụy, chymotrypsin, pepsin và renin. Chúng được sản xuất với số
lượng nhỏ vì việc sản xuất phụ thuộc vào sự sẵn có của vật ni phải hy sinh để có thể
chiết xuất được những protease này từ các cơ quan hoặc mơ của chúng. Trong nhóm các
protease từ nguồn gốc thực vật, papain và bromelain là những ví dụ điển hình – chiết xuất
từ vỏ quả đu đủ Carica và từ thân và nước ép của dứa. Tuy nhiên, việc sử dụng thực vật
làm nguồn protease bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các yếu tố như khả năng sống sót, canh
tác, điều kiện khí hậu và q trình khai thác kéo dài. Vì những lý do trên, hầu hết các
enzyme quan trọng về mặt thương mại được sản xuất từ một số lượng vi sinh vật hạn chế.
Ngoài ra, các enzyme của vi sinh vật được ưa thích hơn các loại khác, bởi vì chúng
thường có thể thu được với số lượng lớn, một cách thường xuyên và với chất lượng đồng
đều. Enzyme vi sinh vật thường ổn định hơn so với các đối tác động vật và thực vật của
chúng và quá trình sản xuất nhanh hơn do thời gian nhân đôi ngắn và yêu cầu dinh dưỡng
tương đối đơn giản của chúng. Ngoài ra, các enzyme của vi sinh vật được ưa thích hơn
10


các loại khác, bởi vì chúng thường có thể thu được với số lượng lớn, thường xuyên và với
chất lượng đồng đều. Enzyme vi sinh vật thường ổn định hơn so với nguồn gốc động vật
và thực vật, quá trình sản xuất nhanh hơn do thời gian nhân đôi ngắn và yêu cầu dinh

dưỡng tương đối đơn giản của vi sinh vật [33].
Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm nhiều loài
thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và một số
loại nấm men.
 Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng
trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. fumigatus, A. saitoi, …
Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính.
Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH
2,5-3.
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp
protease có khả năng đơng tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát.
 Xạ khuẩn
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách chiết
từ S. grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên
kết peptide của nhiều protein thành amino acid.
So với thực vật và động vật, vi sinh vật đại diện cho một nguồn protease hấp dẫn vì
chúng có thể được ni cấy với số lượng lớn trong một thời gian tương đối ngắn bằng các
phương pháp lên men được thiết lập, và sản xuất ra một nguồn cung cấp dồi dào, thường
xuyên của sản phẩm mong muốn. Ngồi ra, protein vi sinh vật có thời hạn sử dụng lâu
hơn và có thể được lưu trữ dưới điều kiện lý tưởng trong nhiều tuần mà khơng mất hoạt
động đáng kể. Nói chung, protease vi sinh vật là ngoại bào trong tự nhiên và được vi sinh
vật tiết ra trực tiếp vào dịch lên men, do đó đơn giản hóa việc xử lý enzyme so với
protease thu được từ thực vật và động vật. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác
nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân
triệt để và đa dạng.
 Vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59%
lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc

exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi
khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết
peptide trong phân tử protein.
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B.
mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B.
11


subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998). Các
vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm
yếu.
1.2 Tổng quan về Bacillus subtilis
1.2.1 Giới thiệu
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg
và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis” [20]. Gần 30 năm sau,
Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand
Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vng và đặt tên là Bacillus subtilis[19].
Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc[19]:
– Giới (Kingdom): Bacteria
– Ngành (Division): Firmicutes
– Lớp (Class): Bacilli
– Bộ (Order): Bacillales
– Họ (Family): Bacillaceae
– Giống (Genus): Bacillus
– Loài (Species): Bacillus subtilis
1.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh lí
Mỗi cá thể B. subtilis có chiều dài 1,5 – 10 µm, đường kính (chiều ngang) 0,25 –
1 µm, hai đầu trịn, có thể có 8 – 12 lông nhỏ (Hinhf1). B. subtilis thường tồn tại đơn lẻ,
nhưng cũng tạo thành "quần thể" hình chuỗi ngắn, có khả năng di động trong mơi trường
nước nhờ hoạt động của các lông giống như trùng roi. Bào tử hình bầu dục nhỏ, kích

thước từ 0,8 – 1,8 µm, được bao bọc bởi vỏ gồm nhiều lớp màng với các thành phần
lipoprotein, peptidoglycan… có khả năng chịu được pH thấp, có khả năng chịu nhiệt (ở
100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng, có thể
sống vài năm đến vài chục năm [35]
B. subtilis bắt màu tím (Gram +). Về phương thức sống, ban đầu các nhà khoa học
xếp nó vào nhóm sinh vật hiếu khí bắt buộc [30]. Do nó có catalaza dương tính; nhưng
đến năm 1998 thì xác định lại rằng lồi này có thể sống kị khí (khơng cần ơxy). Bởi
thế, B. subtilis thuộc nhóm lồi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy nghi. Trong nghiên cứu,
mơi trường thuận lợi nhất cho lồi về nhiệt độ tối ưu là 37oC, về pH khoảng 7,0 – 7,4.
Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ bản

12


Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố Carbon: lactose, glucose, sucrose,
maltose, maltodextrin, tinh bột. Nitrogen: casein, cao thịt, cao nấm men, pepton, tryptone,
ure, NH4Cl, NaNO3 và một số nguyên tố vi lượng khác [11].

Hình 1.3 : Hình ảnh tế bào B. subtilis dưới kính
hiển vi

13


Chương 2. LỰA CHỌN, PHÂN TÍCH VÀ ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ
2.1.

Sơ đồ cơng nghệ

Đề xuất sơ đồ cơng nghệ quy trình sản xuất enzyme protease như hình sau:

Nguyên liệu

Chuẩn bị
mơi trường

Thanh Trùng

Bacillus
subtilis

Nhân giống

Lên men
(Chìm)

Ly tâm
(thu tủa)

Tạo kết tủa với
Amoni sunfat

Lọc màng
(thu dịch)

Sấy phun

Enzyme
protease

Hình 2.1: Đề xuất sơ đồ cơng nghệ

2.2.

Phân tích quy trình

2.2.1 Nhân giống
Mục đích: Chuẩn bị giống cho q trình lên men, sản xuất thu enzyme
Mơi trường nhân giống: Chủng Bacillus Subtilis được duy trì trên ống thạch
nghiêng TSA (1,5% trypticase peptone, 0,5% phytone peptones, 0,5% NaCl, 1,5% agar).

14


Vi khuẩn Bacillus Subtilis được nhân lên trong môi trường tối ưu cho việc sản xuất
enzyme protease đã được nghiên cứu[22].
THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG

NỒNG ĐỘ

Galactose

1%

Peptone

0.55%

MgSO4.7H2O

0.2%

Na2CO3

1%

KH2PO4

0.2%

Casein

0.5%

Ủ ở PH 7.4 trong 72h, nhiệt độ 37 oC
Bảng 2.1 :Môi trường nhân giống Bacillus Subtilis
2.2.2 Lên men
Mục tiêu: Thu nhận enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus Subtilis
 Chuẩn bị môi trường lên men
Mục tiêu: Chuẩn bị môi trường để lên men, sản xuất
Môi trường lên men được chuẩn bị có thành phần giống với môi trường nhân giống,
là môi trường tối ưu đã được nghiên cứu để sản xuất [22].
THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG

NỒNG ĐỘ

Galactose

1%

Peptone

0.55%

MgSO4.7H2O

0.2%

Na2CO3

1%

KH2PO4

0.2%

Casein

0.5%

Ủ ở PH 7.4 trong 72h, nhiệt độ 37 oC
Bảng 2.2:Môi trường lên men
15


Hiện nay hai phương pháp chủ yếu được áp dụng để sản xuất enzyme protease công
nghiệp từ Bacillus Subtilis là lên men bán rắn (SSF) và lên men chìm (SMF).
Lên men bán rắn (SSF)
Lên men trên môi trường bán rắn hay lên men trên cơ chất rắn là một quá trình
trong đó sự sinh trưởng của vi sinh vật và sự hình thành sản phẩm diễn ra trên bề mặt của
ngun liệu gần như khơng có mặt của nước tự do. Các phản ứng sinh học và sự chuyển
hóa thực hiện trực tiếp giữa tế bào VSV và cơ chất tại nơi tiếp xúc.

Lên men chìm (SMF)
Trong cơng nghệ sản xuất enzyme protease theo phương pháp lên men chìm, người
ta thường sử dụng môi trường với nguyên liệu tinh khiết để tối ưu hóa q trình lên men
đặt hiệu quả cao nhất. Vi sinh vật phát triển triển trên bề mặt dung dịch lỏng, nơi phân
cách giữa pha lỏng và pha khí. Enzyme được tổng hợp trong tế bào trong q trình lên
men, sau đó được đưa ra ngồi mơi trường và tồn tại trên bề mặt canh trường. Quá trình
lên men cần xục khí liên tục và khơng qn khuấy trộn để cung cấp oxy đồng đều cho vi
sinh vật.
Nhóm quyết định chọn phương pháp lên chìm để sản suất vì: sản xuất bằng phương
pháp lên men chìm sử dụng nguồn cơ chất nhất định và đồng nhất về thành phần nên năng
suất thu được sẽ ổn định hơn so với các phương pháp khác. Bên cạnh đó nguồn cơ chất
tinh khiết cho năng suất thu nhận enzyme tối đa, phù hợp với lên men công nghiệp.
Các bước tiến hành
 Giống Bacillus subtilis từ ống giữ giống trên thạch nghiêng được cấy vào bình
tam giác chứa 300 ml mơi trường phân lập với tỉ lệ cấy giống là 2% để nhân
giống.
 Chuẩn bị môi trường sản xuất enzyme protease, thanh trùng môi trường ở
121oC trong 1 giờ.
 Giống đã được chuẩn bị trước đó 48 giờ được cấy vào môi trường môi trường
sản xuất enzyme protase với lượng cấy giống là 10 %
16


 Giống được ni cấy theo mẻ có hệ thống khuấy và sục khí liên tục, pH được
giữ ổn định ở 7.4 ở 37oC, tốc độ khuấy từ 200-250 rpm. Sau 72 giờ nuôi cấy,
dịch enzyme thô trên bề mặt được thu nhận và cố định bằng muối
(NH4)2SO4 để chuẩn bị cho các q trình tiếp theo.
Thơng số vận hành [22]
Tỉ lệ cấy giống: 10%
Thời gian lên men: 72h

Nhiệt độ: 37 o C
Giá trị PH: 7.4
Tốc độ khuấy trộn: 200-250 rpm
 Thiết bị lên men
Thiết bị lên men được lựa chọn theo các tiêu chí sau: thiết bị lên men có hình trụ nón,
và cánh khuấy được làm bằng thép khơng rỉ. Bình được trang bị hệ thống điều khiển vơ
trùng, có trang bị các cảm biến nhiệt độ, pH, đầu dị oxy hịa tan, cảm biến bọt. Mơi
trường lên men và bể được thanh trùng trước khi đưa vào sản suất [9].

Hình 2.2: Cấu tạo bể lên men có cánh khuấy
17


2.3.3 Lọc màng
Mục đích: loại bỏ sinh khối khỏi canh trường, sử dụng dịch lọc (có chứa enzyme)
vào các khâu sau.
Cách tiến hành: Canh trường sau khi lên men được bơm vào hệ thống màng để loại
bỏ sinh khối thu dịch lọc.
Có 3 loại màng lọc vi sinh phổ biến hiện nay:
Màng lọc thẩm thấu ngược (Reverse osmosis – RO) Màng lọc RO có kích thước lỗ
rỗng nhỏ hơn 0,0001μm, chúng được hoạt động dưới áp suất cao, thông thường từ 400 –
1000 psi, cho phép loại bỏ hầu hết các thành phần có trong nước như: cacbuahydrat, phân
tử chất, cặn lơ lửng, các chất khoáng, các ion, amino, acid…, .Cơ chế hoạt động của lọc
RO sử dụng tính chất của màng bán thấm, tất cả các chất hoà tan bị giữ lại, trừ một vài
phần tử hữu cơ rất gần với nước có khối lượng mol nhỏ, phân cực mạnh. Trên Bề mặt
màng RO có các lỗ siêu nhỏ, vì thế phải dùng điện để tạo áp lực của máy bơm ép nước
tinh khiết đi qua màng lọc.
Màng lọc nano (Nanofiltration – NF) Màng lọc nano có kích thước lỗ rỗng khoảng
0,001μm, hoạt động dưới áp suất thông thường từ 100 – 600 psi; là màng trung gian giữa
2 hình thức lọc màng là RO và UF. Nó có thể lọc được các phân tử muối hoá trị thấp và

các chất khống . Màng NF khơng cho hiệu quả cao như màng lọc thẩm thấu ngược màng
(R.O), nhưng không tốn nhiều năng lượng như màng R.O, màng Nano có khả năng giữ
các phân tử đường , muối kim loại hóa trị II, vi khuẩn, proteins,…
Màng siêu lọc UF: Với kích thước từ 0,1~0,001micron (µm) màng lọc UF có thể
lọc sạch các tạp chất có kích thước nhỏ hơn cả vi khuẩn, loại bỏ dầu, mỡ, hydroxit kim
loại, chất keo, nhũ tương, chất rắn lơ lửng,và hầu hết các phân tử lớn tử nước và các dung
dịch khác như (phấn hoa, tảo, kí sinh trùng, virut, và vi trùng gây bệnh…)và đặc biệt là có
thể triệt tiêu được vi khuẩn tới 99.9% dường như khơng cịn vi khuẩn. Các phân tử có
kích thước lớn hơn như các loại tạp chất, virus, vi khuẩn sẽ bị giữ lại và thải xả ra

18


ngoài. Màng siêu lọc nước UF được thiết kế từ cơng nghệ hiện đại, tối ưu hóa những
nhược điểm cịn sót của màng RO và màng NANO
Kích thước của Bacilllus subtilic 0.7-1.0µm x 1.5 – 3.0µm [26], nên nhóm tìm hiểu
và lựa chọn lọc màng siêu lọc (UF) có kích thước lỗ khoảng 0.01 µm.
Nguyên nhân để chọn lọc (UF) vì:
 Kích thước của màng lọc bé hơn kích thước Bacilllus subtilic nên dễ dàng
thu được dịch enzyme.
 Chỉ sử dụng phương pháp lọc cơ học nên không làm biến đổi tính chất hóa
học của dịch enzyme sau lọc
 Chi phí lắp đặt rẻ hơn các loại màng lọc khác do các loại màng lọc khác có
kích thước lỗ bé hơn dẫn đến giá thành cao hơn.
Nguyên lý hoạt động: Là một công nghệ lọc dùng áp suất thấp để loại bỏ những
phân tử có kích thuớc lớn ra khỏi nguồn nước. Dưới một áp suất 1.5~3kgf/cm², nước tinh,
muối khoáng, kim loại, tạp chất và các phân tử ion nhỏ hơn lỗ lọc (0.1- 0.001 micron) sẽ
“chui” qua màng dễ dàng để tạo ra một nguồn nước tinh khiết. Các phần tử có kích thước
lớn hơn 0,01 µm sẽ bị giữ lại [2].
Thiết bị mơ hình sợi (Hollow fiber module) sử dụng màng siêu lọc (UF)

19


Hình 2.3: Thiết bị phân riêng bằng mơ hình sợi
Cấu tạo:
Thiết bị có dạng hình trụ, bên trong chứa rất nhiều sợi membran xếp song song với
nhau, đường kính ngồi 1,6m. Màng lọc đóng vai trị như vật liệu lọc cao cấp với nhiều
kích cỡ lỗ màng, từ 0,01μm đến 0,1μm. Kích thước lỗ màng bé có khả năng giữ lại được
tất cả những vật chất cần loại bỏ trong nguồn nước, các phần tử có kích thước lớn hơn
0,01 microns. Trong thiết bị khơng có khung đỡ. Trong q trình hoạt động, dung dịch
nguyên liệu được bơm vào bên trong các sợi membrane từ một phía, đầu cịn lại của các
sợi membrane là chỗ thoát của các ratentate. Một số cấu tử sẽ chui qua phần thân của các
sợi membrane để tạo ra dịng permeate rồi thốt ra bên ngồi thiết bị hình trụ
Màng lọc Ultrafiltration có thể hoạt động theo 2 nguyên lý:
 Từ ngoài vào trong: Lớp lọc nằm bên ngồi màng. Dịng nước có chất ơ
nhiễm được đẩy vào từ bên ngoài màng lọc. Nước sạch sau lọc được thu ở
bên trong màng lọc

20


 Từ trong ra ngoài: Lớp lọc nằm bên trong màng. Dịng nước có chất ơ nhiễm
được châm vào từ bên trong màng lọc. Nước sạch sau lọc được thu ở bên
ngồi màng lọc

Hình 2.4: Cấu tạo sợi màng lọc UF
2.2.4 Kết tủa
Mục đích: thu nhận protein trong dung dịch enzyme thơ.
Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4... Tuy nhiên, người

ta đã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó khơng làm hại mà làm ổn định (làm bền)
hầu hết các loại protein. Loại muối này lại rẻ tiền và phổ biến, độ hòa tan của nó lại rất
lớn (bão hịa 767g/l ở 25oC) [3].
Cách tiến hành: Sau khi lọc bỏ hết sinh khối của canh trường sau lên men, cho từ từ
muối amonium sunfat (nồng độ 80% bão hòa) vào ở nhiệt độ lạnh (40C) để sau đó ly tâm
thu tủa [6].
Khi sử dụng các dung môi hữu cơ, cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5oC trở
xuống) như vậy có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein [3].

21


Khi cho dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa vào dịch chiết protein thì nồng độ
(NH4)2SO4 khơng tăng đột ngột. Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng 2 giờ hoặc
qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hồn tồn [3].
Thiết bị: Chọn thiết bị kết tủa có thân hình trụ đứng, đáy hình chỏm cầu, nắp hình
chóp cầu.

Hình 2.5: Thiết bị kết tủa
Nguyên lý hoạt động:
Độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong
phân tử protein với các phân tử nước. Sự tương tác đó (cịn gọi là sự hydrat hóa) sẽ bị
giảm xuống khi thêm vào dung dịch protein các dung mơi hữu cơ hoặc các muối trung
tính [3].Khi thêm muối vào dung dịch protein thô, các phân tử muối (NH4)2SO4 phân ly
thành các ion, các ion này liên kết với các phân tử nước làm cho protein mất lớp áo nước,
liên kết lại với nhau và hình thành kết tủa.
2.2.5 Ly tâm
Mục đích: tách cặn chứa enzyme khỏi các chất hỗn tạp trong dung dịch.
Cách tiến hành: Protein kết tủa được tách ra bằng cách ly tâm 5000 vòng / phút
trong 30 phút ở 4°C và chất nổi trên bề mặt được sử dụng để tinh chế protease [22].

22


Thiết bị: Do thể tích thùng của máy ly tâm dạng đĩa lớn phù hợp với quy mô công
nghiệp.
Nguyên lý hoạt động: Máy ly tâm dạng đĩa (Disc Separator) phân tách chất rắn và
lỏng với nhau trong một quá trình duy nhất liên tục. Khi các chất rắn có trọng lượng nặng
hơn phải chịu các lực ly tâm mạnh, chúng sẽ bị đẩy ra khỏi vách ngăn lồng quay, trong
khi pha lỏng nhẹ hơn tạo thành lớp bên trong các đĩa xếp đồng tâm. Các chất rắn tách rời
được xả liên tục qua các vòi trên mép trống. Pha lỏng tinh khiết tràn gần trục quay, ở khu
vực đầu ra trên đầu máy. Pha lỏng được phân tách sau đó rời khỏi máy vắt ly tâm do lực
hấp dẫn hoặc bằng phương tiện của một đĩa chà nhám, chúng giống như một loại máy
bơm.


Định nghĩa
Ly tâm được sử dụng để tách các vật liệu có mật độ khác nhau bằng cách sử dụng

một lực lớn hơn trọng lực. Trong xử lý xi dịng, ly tâm được sử dụng để loại bỏ các tế
bào khỏi môi trường lên men, loại bỏ các mảnh vụn của tế bào, thu thập các kết tủa và
tinh thể, và để tách các giai đoạn sau khi chiết bằng chất lỏng. Ly tâm có hiệu quả nhất
khi chênh lệch mật độ giữa các hạt và chất lỏng lớn, các hạt lớn và độ nhớt của chất lỏng
thấp. Nó cũng được hỗ trợ bởi bán kính máy ly tâm lớn và tốc độ quay cao. Công suất
máy ly tâm khơng thể 23ung lên bằng cách 23ung kích thước của thiết bị mà không giới
hạn; ứng suất cơ học trong máy ly tâm 23ung tỷ lệ với (bán kính)2 do đó tốc độ vận hành
an tồn hơn ở các thiết bị ly tâm nhỏ [32].


Phân loại
+ Dạng ống

Máy ly tâm dạng ống hẹp là máy siêu ly tâm . Thiết bị này được sử dụng để thu hồi

các kết tủa mịn từ các dung dịch mật độ cao, để phá vỡ các nhũ tương và để tách các hạt
keo như ribosome và ty thể. Nó tạo ra lực ly tâm 10 5 đến 10 6 G. Máy thường được điều
khiển bằng khơng khí và hoạt động ở áp suất thấp hoặc trong mơi trường khí nitơ để giảm
sự sinh nhiệt của ma sát [32].
23


+ Dạng đĩa
Máy phân ly dạng đĩa 24ung để phân ly huyền phù có hàm lượng pha rắn nhỏ hoặc
phân ly nhũ tương khó phân ly
Máy ly tâm ngăn xếp đĩa có thể tác dụng một lực từ 4000 đến 14.000 rpm do đó
giảm thời gian tách. Đây là những máy ly tâm công nghiệp phổ biến nhất và được sử dụng
rộng rãi trong các nhà máy thương mại cho các sản phẩm vi sinh có giá trị cao và trong
các nhà máy thí điểm nhiên liệu sinh học siêu nhỏ. Có nhiều loại máy ly tâm đĩa; sự khác
biệt chính giữa chúng là phương pháp được sử dụng để xả các chất rắn tích lũy. Trong
máy ly tâm đĩa đơn giản, chất rắn phải được loại bỏ định kỳ bằng tay. Có thể xả chất rắn
liên tục hoặc gián đoạn trong nhiều loại máy ly tâm đĩa mà không làm giảm tốc độ bát.
Một số máy ly tâm được trang bị vòi phun ngoại vi để loại bỏ chất rắn liên tục [32].

 Cấu tạo [4]

Hình 2.6:Cấu tạo thiết bị ly tâm dạng đĩa
a) Đĩa ly tâm
1 Đĩa ly tâm

24

0 Kênh thốt cho chất lỏng có tỷ trọng thấp
1 Lổ biên
4 Cửa vào cho nguyên liệu
b) Sơ đồ chuyển động giữa các dòng
1 Chất lỏng tỉ trọng thấp
2 Chất lỏng tỉ trọng cao
3 Đĩa
 Nguyên lý hoạt động:
Nhập liệu được phân phối vào ở đáy chén xoay, theo các kênh được tạo thành bởi
các lỗ, đi vào khoảng trống giữa các dĩa, tại các khoảng trống này, dưới tác dụng của lực
ly tâm, pha nặng sẽ di chuyển ra xa tâm của dĩa. Còn pha nhẹ sẽ di chuyển vào gần tâm
của dĩa và được đẩy lên đỉnh của chén xoay để thu hồi. Trong thiết bị này, khoảng các di
chuyển của chất lỏng là ngắn hơn so với thiết bị ly tâm ống. ngoài ra trong thiết bị này
cịn diễn ra q trình trượt giữa 2 lớp chất lỏng trong q trình ly tâm, góp phần phá vỡ hệ
nhũ tương
So sánh về thông số của thiết bị ly tâm dạng ống và đĩa [32]:
Đường kính
Loại

Tốc độ

Lực ly tâm tối

Cơng suất

(rpm)

đa (×gravity)

(l/ phút)

10

15.000

13.200

0.4 – 40

1.5

13

15.000

15.900

0.8 – 80

2.2

18

12.000

14.300

0.4 – 40

0.25

33

7.500

10.400

20 – 200

4.5

61

4.000

5.500

80 – 800

5.6

miệng đĩa
(cm)

Hình ống

Hình đĩa

Động cơ (Kw)

Bảng 2.3: Bảng so sánh về thông số giữa thiết bị ly tâm dạng đĩa và ly tâm dạng ống
25


Nguyên nhân để lựa chọn máy ly tâm dạng đĩa thay vì dạng ống là:
Quá trình ly tâm chỉ cần tách enzyme đã được tủa ra khỏi hỗn hợp dung môi nên chỉ
cần tốc độ ly tâm thấp để thu tủa nên thơng số máy ly tâm hình đĩa cho thấy phù hợp hơn
Vì thể tích roto của máy ly tâm đĩa lớn hơn so với thiết bị ly tâm dạng ống nên phù
hợp với quy mô công nghiệp.
2.2.6 Sấy phun
Mục đích: tách nước, làm giảm khối lượng vật liệu, tăng độ bền và bảo quản sản
phẩm được lâu hơn.
Thiết bị sấy phun: Sấy phun lý tưởng khi sản phẩm cuối cùng phải tuân thủ các tiêu
chuẩn chất lượng chính xác bao gồm các yếu tố như: phân bố kích thước hạt, mật độ cịn
lại và hình thái hạt…
Cách tiến hành: Sau khi kết thúc quá trình ly tâm, bổ sung thêm 1% glucose + 0,5%
Maltodextrin + 0,04% Cacboxymethylcellulase để ổn định hoạt tính enzyme, chuyển hỗn
hợp dịch enzyme này vào thiết bị sấy phun liên tục, và thực hiện quá trình sấy ở 1100C là
nhiệt độ đầu vào, nhiệt độ đầu ra 760C [31]
Cơ cấu chung thiết bị sấy phun bao gồm:
 Cơ cấu phun:
Có chức năng đưa nguyên liệu (dạng lỏng) vào buồng dưới dạng hạt mịn (sương
mù). Q trình tạo sương mù sẽ quyết định kích thước các giọt lỏng và sự phân
bố của chúng trong buồng sấy, do đó sẽ ảnh hưởng đến giá trị bề mặt truyền nhiệt
và tốc độ sấy. Cơ cấu phun có các dạng như: cơ cấu phun áp lực, cơ cấu phun
bằng khí động, đầu phun ly tâm.
 Buồng sấy:
Là nơi hòa trộn mẫu sấy (dạng sương mù) và tác nhân sấy (khơng khí nóng).
Buồng sấy phun phổ biến nhất là buồng sấy hìnhtrụ đứng, đáy cơn.
 Tác nhân sấy:

26