Tiểu luận:Chuẩn đoán vi khuẩn Pasteurella multocida bằng kỹ thuật gen pot

- 1 -




TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC




Chuẩn đoán vi khuẩn Pasteurella
multocida bằng kỹ thuật gen.


Giáo viên phụ trách: TS. Nguyễn Ngọc Hải.
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trung Tuyến.
MSSV: 06126179
Khoa: Công Nghệ Sinh Học







- 2 -


I. ĐẶT VẤN ĐỀ.

Sinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở
mức độ phân tử. Phạm vi nghiên cứu của môn này có phần trùng lặp với
các ngành khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh.
Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các
hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại
giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách
thức điều hòa các mối tương tác này.
Sinh học phân tử là một bộ môn khoa học còn rất non trẻ nhưng đã
có nhiều bước tiến vượt bậc và tác động toàn diện đến nhiều ngành
khoa học, đến sản xuất và đời sống.
Ngành kinh tế chăn nuôi hiện nay đang gặp nhiều nguy cơ đe dọa
quá trình phát triển. Trong đó, dịch bệnh đã ảnh hưởng rất lớn về lợi
nhuận, quá trình sản xuất, tình hình chăn nuôi gia cầm trên thế giới.
Vì vậy, việc ứng dụng những kỹ thuật sinh học phân tử vào việc
chẩn đoán, điều trị bệnh trên vật nuôi hiện nay là một tất yếu.

Ngày 02 tháng 10 năm 2009.

- 3 -


II. TỔNG QUAN.
II.1. Bệnh tụ huyết trùng.
Tụ huyết trùng là bệnh nhiễm khuẩn có độc lực cao ở gia súc gia cầm, do
vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra. Bệnh chủ yếu gây nhiễm khuẩn huyết. Vi
khuẩn tấn công vào cơ quan tiêu hoá, các hạch và nhất là cơ quan hô hấp. Bệnh
lưu hành ở từng địa phương, hoặc thành dịch lớn ở trâu, bò, dê, cừu, thỏ, gia
cầm. Bệnh ở gia cầm còn gọi là hoắc loạn gà. Bệnh ở trâu, bò, lợn còn gọi là
nhiễ
m khuẩn huyết xuất huyết. Bệnh ở trâu còn gọi là bacbon (barbone). Bệnh
thường xảy ra khi thời tiết thay đổi, thường phát vào mùa nóng ẩm ở những vùng
ẩm thấp, cơ thể thú nuôi giảm sức đề kháng, bệnh thường lây qua đường hô hấp,
tiêu hoá, vết thương ngoài da hoặc tiếp xúc với nguồn bệnh.

II.2. Vài nét lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng.
II.2.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trên thế giới.
Năm 1875, Bollinger là người đầu tiên phát hiện ra bệnh tụ huyết trùng ở
bò tại Đức.
Năm 1879, Tousain phát hiên bệnh tụ huyết trùng ở gà.


Gà bị bệnh do vi khuẩn Pasteurell amultocida


- 4 -
Năm 1880, Louis Pasteur, nhà vi trùng học người Pháp đã phát hiện được
vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng ở gà (Fowl cholera)
Năm 1881, Gaffky phát hiện bệnh ở thỏ và đặt tên là bệnh bại huyết

(Septicaemia disease).
Năm 1886, Loeffer phát hiện bệnh ở lợn.
Hueppe, nhà giải phẫu bệnh lý học người Đức phát hiện thấy sự tương
đồng về triệu chứng, bệnh tích ở gà, bò và thỏ mắc bệnh tụ huyết trùng.
Năm 1887, Oroste và Armani phát hiện ra bệnh ở trâu và đặt tên là
Barbone.

Bò chết do bệnh tụ huyết trùng.

Trevissan đã đề nghị đặt tên chung cho nhóm vi khuẩn gây bệnh tụ huyết
trùng là Pasteurella để tưởng nhớ đến nhà bác học Louis Pasteur, người đầu tiên
phát hiện ra bệnh tụ huyết trùng ở gà. Từ đó người ta căn cứ vào đặc tính sinh
bệnh của từng loài vất, chia Pasteurella thành các loài khác nhau:
Pasteurella gây bệnh cho bò là: P. boviseptica
Pasteurella gây bệnh cho trâu là: P. bubaliseptica
Pasteurella gây bệnh cho lợn là: P. suiseptica
Pasteurella gây bệnh cho gia cầm là: P. aviseptica
N
ăm 1939, Rosenbusch và Merchant đã đề nghị đặt tên chung cho vi khuẩn
gây bệnh tụ huyết trùng là Pasteurella multocida để thể hiện khả năng gây bệnh
cho nhiều loài vật của vi khuẩn này.

- 5 -

Vi khuẩn Pasteurella multocida dưới kính hiển vi.

II.2.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Viêt Nam.
Ở Việt Nam, bệnh tụ huyết trùng trâu, bò được phát hiện lần đầu tiên năm
1798. Từ đó, bệnh được thấy ở khắp các vùng trong nước.
Năm 1994, Dương Thế Long đánh giá hiệu quả những biện pháp phòng trị

bệnh tụ huyết trùng ở Sơn La trong giai đoạn 1990-1993, khảng định: tiêm
phòng bệnh tụ huyết trùng là biện pháp hiệu quả, kinh tế và quan trọng hàng đầu.

Tiêm phòng bệnh tụ huyết trùng là biện pháp hiệu quả, kinh tế và quan trọng
hàng đầu.

Năm 1995, Nguyễn Ngã nghiên cứu tính kháng nguyên và độc lực vi khuẩn
gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò ở khu vực miền trung nhằm chọn giống vi khuẩn

- 6 -
địa phương thích hợp có khả năng kết hợp với giống vi khuẩn nước ngoài để chế
tạo vắc-xin có hiệu lực cao.
Năm 1996, Hoàng Đạo Phấn nghiên cứu tác động của thực khuẩn thể đặc
hiệu đối với khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ gia súc gia cầm.
Năm 1996, Nguyễn Thu Thiên và Nguyễn Ngã đã phân lập và xác định các
type huyết thanh Pasteurella multocida ở trâu bò nuôi tại miền trung Việt Nam.
Nă
m 2000, Đinh Duy Kháng và Lê Văn Phan đã ứng dụng kỹ thuật PCR để
định type vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập ở miền trung Việt Nam. HB1,
HB2 và HS1, HS2 là hai cặp mồi được dung để xác định Pasteurella multocida
gây bại huyết, xuất huyết.

II.3. Vi khuẩn Pasteurella multocida.
II.3.1. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Pasteurella multocida.
Vi khuẩn Pasteurella nằm trong bộ Eubacteriales, thuộc họ
Parvobacteriaceae, thuộc giống Pasteurella và chia làm ba loài, trong đó có loài
gây bại huyết, xuất huyết cho gia súc, gia cầm là: Passteurella multocida và
Pasteurella haemolytica.

II.3.2. Đặc tính hình thái của vi khuẩn Pasteurella multocida.

Pasteurella multocida là một cầu trực khuẩn nhỏ, có kích thức 0,25 -0,4 ×
0,4 -1,5 μm. Vi khuẩn có giáp mô, không sinh nha bào, không lông, không di
động.
Trong canh khuẩn thường thấy vi khuẩn hình trứng, hình cầu, đứng riêng lẻ
hoặc thành chuỗi ngắn. Trong canh khuẩn già, vi khuẩn suy yếu, biến dạng, thay
đổi hình thái như hình gậy, dùi cui, quả đấm, kích thước lớn hơn bình thường, có
khi dài 2-3 μm hay hơn nữa.

Vi khuẩn Pasteurella multocida


- 7 -
II.3.3. Tính bắt màu của vi khuẩn Pasteurella multocida.
Pasteurella multocida bắt màu Gram âm với thuốc nhuộm gram, vi khuẩn
thường dễ bắt màu với thuốc nhuộm aniline, tốt nhất là Methylen blue, đỏ
Fucsin, có thể thấy khi dùng phương pháp nhuộm Giemsa và Wright. Các chủng
có hình thành giáp mô thì có thể dùng phương pháp nhuộm Hiss và Zilnelson.
Trong cơ thể gia súc mắc bệnh (máu và phủ tạng) và trong môi trường mới
nuôi cấy, vi khuẩn Pasteurella khi nhuộm màu có hiện tượng bắt màu sẫm ở hai
đầu, còn ở giữa không bắt màu hoặc bắt màu nhạt h
ơn so với hai đầu, nên người
ta gọi Pasteurella là vi khuẩn lưỡng cực. Năm 1919, Manninger giải thích tính
lưỡng cực của vi khuẩn là do tế bào vi khuẩn đang trong giai đoạn phân chia, vi
khuẩn tăng lên về kích thước, độc lực và nguyên sinh chất, khi đó nguyên sinh
chất dung giải dồn về hai đầu của tế bào.

II.3.4. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Pasteurella multocida.
Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Pasteurella multocida đã được các nhà
nghiên cứu khảo sát dựa trên nguyên lý: vi khuẩn là một tế bào sống nên khi

được nuôi trong các môi trường dinh dưỡng, quá trình trao đổi chất diễn ra trong
tế bào vi khuẩn sẽ tạo ra các sản phẩm có thể làm thay đổi pH của môi trường.
Khi đó dựa vào các chất chỉ thị màu thì người ta có thể xác định đặc tính sinh
hóa của chúng.


















- 8 -


II.3.5. Đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida.
Đặc tính kháng nguyên của Pasteurella multocida rất phức tạp và cấu trúc
từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi. Kháng nguyên của Pasteurella
multocida có 2 loại chính là kháng nguyên vỏ K và kháng nguyên thân O. Việc
tìm hiểu cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida có vai trò rất

quan trọng không những trong phân loại vi khuẩn Pasteurella multocida mà cả
trong nghiên cứu đặc tính sinh miễn dịch của chúng và khả năng chế tạo vắc-xin
phòng bệnh. Một vắc-xin có hiệu lực tốt phải bao gồm các kháng nguyên t
ương
ứng với các serotype của các chủng phân lập được trong từng vùng hay khu vực.
Pasteurella multocida có tính kháng nguyên giao hỗ (tương đồng kháng
nguyên) tức là có khả năng miễn dịch chéo giũa các chủng, tính chất này nhiều
hay ít phụ thuộc vào từng chủng.


II.3.5.1. Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen).
Kháng nguyên vỏ K bao xung quanh thân vi khuẩn, che chở cho kháng
nguyên O khỏi bị thực bào tác động. Đồng thời kháng nguyên K ngăn cản sự tiếp
xúc giữa kháng nguyên O với kháng thể O. Do đó, muốn phát hiện kháng
nguyên O phải phá hủy kháng nguyên K.
Kháng nguyên K chỉ có ở vi khuẩn P. multocida tạo khuẩn lạc dạng S,
không có ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng nhầy (M) và xù xì (R). Có 5 type kháng
nguyên thân là A, B, D, E và F


II.3.5.2. Kháng nguyên thân O (Somatic antigen).
Kháng nguyên O có hai nhóm, đặc hiệu và không đặc hiệu. Các chủng vi
khuẩn khác nhau sẽ khác nhau về kháng nguyên O. Chỉ có serotype B là hầu như
đồng nhất thuộc một nhóm kháng nguyên O.
Kháng nguyên O có hai hệ thống phân loại:
+ Phân loại của Namioka và Murata (1961) kháng nguyên O có 12 yếu tố.
+ Phân loại của Heddleston (1972) kháng nguyên O có 16 yếu tố, được
đánh dấu từ 1-16.

Do tầm quan trọng của vi khuẩn Pasteurella multocida trong bệnh học thú

y, người ta đã giải trình tự và xác định được 104 gene có liên quan đến kh
ả năng
gây bệnh của Pasteurella multocida, chiếm khoảng 7% bộ gene. Đại diện trong
số đó là nhóm gene pfh (Pasteurella filamentous hemagglutinin, pfh). Nhóm

- 9 -
gene này có kích thước 24 kb, bao gồm 2 gene liên quan đến khả năng gây bệnh
của Pasteurella multocida đó là gene pfhB1 (tổng hợp protein 2615aa) và pfhB2
(3919aa). Nhóm gene này có những đặc điểm quan trọng sau:
- Đầu amino của 2 gene pfhB1 và pfhB2 theo mô hình N(P/Q)NG(I/M),
mô hình này liên quan đến tiến trình tiền phiên mả va tính hiệu ngoại
bào.
- Vùng trung tâm có chứa một vùng quy định khà năng bám dính của vi
khuẩn vào bề mặt của tế bào. Điều này giúp vi khuẩn có thể tấn công vô
tế bào và gây bệnh cho vật chủ.
-
Đầu carboxy chứa vùng có cấu trúc tương tự như protein kháng huyết
thanh p76 của Haemophilus somnus (có 66% amino acid tương tự). Khả
năng này giúp cho Pasteurella multocida tăng khả năng sống sót trong
cơ thể vật chủ từ đó tăng cường khả năng gây bệnh của vi khuẩn.

II.3.5.3. Xác định type kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella
multocida.
Vi khuẩn Pasteurella multocida mọc dễ dàng trên các môi trường nhân tạo
vì vậy việc chuẩn đoán vi khuẩn không có khó khăn gì đặc biệt. Tuy nhiên để
xác định chính xác type kháng nguyên của vi khuẩn đó thì lại khá phức tạp khi
sử dụng các kỹ thuật thông thường.
Việc xác định type kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida chủ
yếu được thực hiện bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính, ng
ưng

kết trong ống nghiệm, kỹ thuật kết tủa khuếch tán trên thạch (agar gel
precipitation test, AGP) và bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu.
Ngày nay, việc giám định vi khuẩn có thể được thực hiện nhờ sự trợ giúp
của các kỹ thuật phân tử như: kỹ thuật PCR, kỹ thuật RT-PCR, kỹ thuật phân
tích thành phần protein của vi khuẩn trên bản gel…

III. PHƯƠNG PHÁP – VẬT LIỆU.
III.1. Giám định vi khuẩn Pasteurella multocida serotype B
bằng kỹ thuật PCR.

Trong quy trình chuẩn đoán này người ta sử dụng 2 cặp mồi.

- Cặp mồi HSB



- 10 -
KTT72 5’-AGGCTCGTTTGGATTATGAAG-3’


KTSP61 5’-ATCCGCTAACACTCTC-3’
(Townsend và cs., 1998)

- Cặp mồi B capsule type (CAPB)


CAPB-FWD 5’-CATTTATCCAAGCTCCACC-3’


CAPB-REV 5’-GCCCGAGAGTTTCAATCC-3’

(Townsend và cs., 2001)


Với 2 cặp mồi HSB và CAPB sản phẩm DNA tương ứng được tạo ra có kích
thước tương ứng là 620 bp và 720 bp (Townsend và cs., 2001). Với cặp mồi
HSB có thể nhận diện được hầu hết các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida,
trong đó cặp mồi CAPB cho phép phân biệt các chủng Pasteurella multocida
serotype B (B:2, B:5, B:2,5). Ngoài ra để xác định vi khuẩn Pasteurella
multocida serotype D người ta sử dụng cặp mồi CAPD (
đặc hiệu cho vi khuẩn P.
multocida serogroup D) (Townsend và cs., 2001). Do các chủng Pasteurella
multocida có thể dương tính cùng lúc với cặp mồi HSB và CAPB hoặc HSB và
CAPD, nên để xác định vi khuẩn Pasteurella multocida serotype B hoặc
serotype D cần thiết phải sử dụng đồng thời 2 cặp mồi HSB và CAPB hoặc HSB
và CAPD.
Kết quả PCR có tính chính xác cao và rất nhanh chóng, vì thế có thể sử dụng
chúng trong chuẩn đoán và nghiên cứu dịch tễ bệnh do Pasteurella multocida
trên gia súc gia cầm.


III.2. Xác định serotype vi khuẩn Pasteurella multocida
bằng phương pháp nested-PCR.

Trong phương pháp này người ta sử dụng 2 cặp mồi: cặp mồi chung cho
loài và cặp mồi riêng cho vùng mã hóa chuyên biệt của một serotype nào đó. Cặp

- 11 -
mồi chung được thiết kế dựa vào vùng bảo tồn của loài Pasteurella multocida,
không chuyên biệt cho serotype nào cả.

- Sp6 promoter: 5’-TATTTAGGTGAGACTATAG-3’


- T7 promoter: 5’-TAATACGACTCACTAT-3’

Và cặp mồi riêng cho một serotype nào đó. Dưới đây là cặp mồi cho serotype B:

- KMT1SP61: 5’-ATCCGCTAACACACTCTC-3’


- KMT1T72: 5’-AGGCTCGTTTGGATTATGAAG-3’


Đầu tiên với cặp mồi Sp6 promoter và T7 promoter, đoạn gene của vùng
bảo tồn sẽ được nhân lên với một số lượng nhất định trong lần chạy PCR thứ
nhất. Ở lần ch
ạy PCR thứ hai, với cặp mồi KMT1SP61 và KMT1T72, đoạn gene
chuyên biệt của serotype B sẽ được khuếch đại cho phép xác định serotype của
vi khuẩn.

Trong kỹ thuật này người ta có thể sử dụng 2 cặp mồi sau:
Cặp mồi thứ nhất là cặp mồi chung được thiết kế áp dụng cho vùng bảo
tồn.

- PmCapComAni-F: 5’-TATTTTATGGCTTGTTGTGA-3’


- PmCapComAni-R: 5’-CTTTTTGTTTCATTTGGACTG-3’

Cặp mồi thứ hai chuyên biệt cho một serotype Pasteurella multocida.

- KMT1T7: 5’-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’



- 12 -
- KMT1SP6: 5’-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3’


III.3. Phân tích thành phần protein của vi khuẩn.
Việc phân tích thành phần protein của vi khuẩn được thực hiện trên gel
SDS-PAGE. Các chủng vi khuẩn được pha thành dung dịch huyền phù có nồng
độ khoảng 5x10
9
cfu/ml, trộn với dung dịch đệm 15% β-mecapthoethanol.

Điện di protein vi khuẩn P. multocida trên thạch Polyacrylamide 10%

Cột 1 và 8: Trọng lượng protein chuẩn
Cột 1 đến 7: Dịch chiết protein các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida.

Việc phân tích thành phần protein của vi khuẩn cho phép ta nhận biết các
chủng Pasteurella multocida.
Những nghiên cứu của Lugtenberg và cộng sự (1984) cho thấy có 3 loại
protein màng ngoài khác nhau và kí hiệu chúng là I, II, III. Các protein này thay
đổ
i trọng lượng phân tử từ 28.000 đến 48.000 daltons. Tuy những protein màng

- 13 -
ngoài này dường như không có mối liên quan tuyệt đối với các chủng gây bệnh,
nhưng theo tác giả thì những chủng Pasteurella multocida có lớp protein màng
ngoài thuộc loại I sẽ có thể là chủng gây bệnh. Trong khi đó nếu thuộc loại II thì
sẽ có thể là những chủng không gây bệnh.



III.4. Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong việc chuẩn đoán
phân biệt Pasteurella multocida serotype A:1, A:3, B:2.

Đây là sự kết hợp giữa kỹ thuật PCR và kỹ thuật cắt phân đoạn đa hình
RFLP. Kỹ thuật PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP)

là một kỹ thuật mà trong đó trình tự ADN biến thể được xác định bằng cách
khuếch đại thông qua kỹ thuật PCR. Tiếp theo đó sản phẩm của quá trình PCR
sẽ được phân cắt bởi một endonuclease hạn chế. Các phân đoạn DNA khác nhau
về kích thước và sẽ được phân tách trên gel agarose / gel acrylamide.Việ
c phân
biệt được các serotype Pasteurella multocida dựa trên sự khác biệt nucleic acid
của các serotype Pasteurella multocida.
Kiến thức về serotype của Pasteurella multocida tham gia vào một ổ dịch
là điều rất cần thiết để tạo nên các biện pháp kiểm soát hiệu quả. Đặc tính kháng
nguyên của Pasteurella multocida được thực hiện bởi serogrouping capsular và
serotyping soma. Tuy nhiên những kỹ thuật này lại được thực hiện bởi các phòng
thí nghiệm tham khảo. Điều này thường d
ẫn đến sự chậm trễ trong việc xác định
các serotype cô lập được. Kỹ thuật gene dựa cho sự khác biệt về nucleic acid của
serotypes có thể thay thế cho các kỹ thuật thông thường. Một kỹ thuật PCR-REA
(Polymerase chain reaction-restriction enzyme analysis) đã được chuẩn hóa để
phân biệt Pasteurella multocida serotype A: 1, A: 3 và B: 2.


Vật liệu và phương pháp:

Pasteurella multocida chủng DP1 và FP1 cô lập tại Kerala, Ấn Độ
serotyped là A: 1 do Viện Nghiên cứu thú y, Izatnagar, Ấn Độ cung cấp.
Pasteurella multocida chủng LKO serotypes A: 3, B: 2 do Viện Nghiên
cứu thú y, Izatnagar, Ấn Độ cung cấp nhằm hình thành các chủng tham khảo cho
nghiên cứu này.
Hai oligonucleotides dựa theo trình tự của P. multocida X-73 ompH gene,
U50907 (Luo et al ., 1997) được thiết kế bằng cách sử dụng phần mềm Primer3.

- 14 -

Mồi được tổng hợp bằng cách tuỳ chỉnh M / s Bangalore Genei Ấn Độ. Trình tự
của hai mồi được như sau:
- OmpH 1: 5'-GCG TTT CAT TCA AAG CAT CTC-3'

- OmpH 2: 5'-ATG ACC GCG TAA CGA CTT TC -3'
Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi trên để khuếch đại đoạn trình tự OmpH
gen của Pasteurella multocida.
Enzyme giới hạn phân tích sản phẩm OmpH-PCR: Các sản phẩm PCR
khuếch đại sẽ được phân cắt bởi các enzym cắt hạn chế Dra I và Hinf I. (ở 37
0
C
trong hai giờ, sau đó là bất hoạt các men tiêu hóa ở 80
0
C trong 20 phút). Điện di
các kết quả của enzyme cắt giới hạn được tiến hành trên gel acrylamide 8%. Gels
được xem trên một transilluminator và chụp ảnh.
Kết quả:
Các cặp mồi OmpH 1 và OmpH
2, được thiết kế để khuếch đại gen
OmpH của Pasteurella multocida
thành công với tất cả các serotypes
A:1, A:3 và B: 2. Các sản phẩm
khuếch đại có kích thước khoảng
1000bp.
Đặc trưng của mồi: Cặp primer
OmpH 1 và OmpH 2 đã chỉ chuyên
biệt cho đoạn OmpH của vi khuẩn
Pasteurella multocida.

- 15 -

Phân tích hạn chế của các sản phẩm khuếch đại của serotypes A: 1, A: 3 và
B: 2 đã được tiến hành bằng cách sử dụng cùng một enzyme cắt giới hạn Dra I
và Hinf I. Enzyme Hinf I tạo ra mô hình tương tự như ở A: 3 và B: 2 nhưng khác
biệt từ A: 1, trong khi Dra I đã cho các cấu hình khác biệt với nhau cho ba
serotypes.




- 16 -
REA sản phẩm khuếch đại của OmpH-PCR với Dra I tạo ra các cấu hình
riêng biệt cho ba serotypes A: 1, A: 3 và B: 2, trong khi Enzyme Hinf I tạo ra mô
hình tương tự ở A: 3 và B: 2 nhưng khác biệt ở A: 1 . Vì vậy, REA sản phẩm
khuếch đại của OmpH-PCR với Dra I cung cấp một kỹ thuật lý thuyết cho sự
khác biệt giữa các serotype của Pasteurella multocida. Nếu mô hình duy nhất
cho tất cả các serotypes có thể được xác định một cách tương tự thì chúng ta có
thể
có một kỹ thuật serotyping đơn giản, nhanh chóng và có thể được thực hiện
trong bất kỳ phòng thí nghiệm có năng lực để thực hiện PCR. Sự phát triển của
ADN dựa trên một kỹ thuật cho biết sự khác biệt của serotypes có thể cung cấp
một thay thế cho hệ thống quy ước serotyping.

Tuy nhiên, các nghiên cứu phải tiếp tục được thực hiện với tất cả các
serotypes khác nhau để biết h
ồ sơ duy nhất cho mỗi serotype thu được, trước khi
kỹ thuật này có thể được đặt để sử dụng thường lệ.


















- 17 -
IV. KẾT LUẬN.
Bệnh tụ huyết trùng là một bệnh nhiễm khuẩn có độc lực cao ở gia súc gia
cầm, do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra. Bệnh gây thiệt hại lớn cho nền
kinh tế chăn nuôi trên toàn thế giới.
Ngày nay với kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, đặc biệt là kỹ thuật gene
đang rất phát triển thì chuẩn đoán vi khuẩn Pasteurella multocida (tác nhân gây

bệnh tụ cầu huyết) đã không còn là khó khăn nữa.

M
ột số kỹ thuật gene điển hình được sử dụng trong chuẩn đoán vi khuẩn
Pasteurella multocida:

- PCR (Polymerase Chain Reaction)

- nested-PCR

- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

- PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism)

- 18 -
V. TÀI LIỆU THAM KHẢO.

1. Công nghệ sinh học trong thú y – Nguyễn Ngọc Hải, nhà xuất bản nông
nghiệp.
2. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY về các bài báo có liên
quan.
3. Bài báo cáo tổng kết KHKT Đề tài KC.04.06, nghiên cứu hoàn thiện công
nghệ sản xuất vaccine nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc, gia cầm
và kỹ thuật gene xác định type virus lở mồm long móng, chủ nhiệm đề tài:
TS. Tô Long Thành. 6102, 19/09/2006.

4. />

5. />s_of_pasteurella_multocida_using_polymerase_chain_reaction.htm

6. />e/volume_2_number_2_2/article/nucleic_acid_based_differentiation_of_pa
steurella_multocida_serotypes.html

7. www.aasp.org/shap/issues/v15n5/v15n5p279.htm


8. />

9. />Verona/Papers/P-PerezdeRozas1.pdf

10. www.google.com.vn
( các từ khóa Pasteurella multocida, tụ huyết
trùng, Fowl cholera, Septicaemia disease, PCR-Restriction Fragment Le

11.

ngth Polymorphism…)




- 19 -
MỤC LỤC

I. ĐẶT VẤN ĐỀ 5
II. TỔNG QUAN.
II.1. Bệnh tụ huyết trùng 5
II.2. Vài nét lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng 5
II.2.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trên thế giới 5
II.2.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Viêt Nam 7
II.3. Vi khuẩn Pasteurella multocida 8
II.3.1. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Pasteurella multocida 8
II.3.2. Đặc tính hình thái của vi khuẩn Pasteurella multocida 8
II.3.3. Tính bắt màu của vi khuẩn Pasteurella multocida 9
II.3.4. Đặc tính sinh hóa c
ủa vi khuẩn Pasteurella multocida 9
II.3.5. Đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida 10
II.3.5.1. Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen) 10
II.3.5.2. Kháng nguyên thân O (Somatic antigen) 10
II.3.5.3. Xác định type kháng nguyên của vi khuẩn
Pasteurella multocida 11
III. PHƯƠNG PHÁP – VẬT LIỆU
III.1. Giám định vi khuẩn Pasteurella multocida

serotype B bằng kỹ thuật PCR 11

- 20 -
III.2. Xác định serotype vi khuẩn Pasteurella multocida
bằng phương pháp nested-PCR 12
III.3. Phân tích thành phần protein của vi khuẩn 14
III.4. Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong việc chuẩn đoán phân
biệt Pasteurella multocida serotype A:1, A:3, B:2 15

IV. KẾT LUẬN 19
V. TÀI LIỆU THAM KHẢO 20