(TIỂU LUẬN) NGHIÊN cứu ẢNH HƯỞNG của một số yếu tố đến KHẢ NĂNG LOẠI bỏ NITƠ, PHỐTPHO TRONG nước THẢI CHĂN NUÔI BẰNG sự kết hợp VI tảo CHLORELLA VULGARIS và VI KHUẨN AZOSPIRILLUM BRASILENSE

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MƠI TRƯỜNG

ĐỀ CƯƠNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ
YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG LOẠI BỎ NITƠ,
PHỐTPHO TRONG NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI
BẰNG SỰ KẾT HỢP VI TẢO CHLORELLA
VULGARIS VÀ VI KHUẨN AZOSPIRILLUM
BRASILENSE

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
SINH VIÊN THỰC HIỆN: PHẠM THÙY DUYÊN
LỚP: 16CNSH
GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: TS. PHẠM THỊ MỸ

Đà Nẵng, 6/2019

Tieu luan


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU........................................................................................................................... 4
1 Tính cấp thiết của đề tài..................................................................................................4
2 Mục tiêu đề tài.................................................................................................................5
3 Ý nghĩa của đề tài............................................................................................................ 5
3.1 Ý nghĩa khoa học.........................................................................................................5
3.2 Ý nghĩa thực tiễn..........................................................................................................6
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................7

1.1 Khái quát chung về vi tảo Chlorella vulgaris...............................................................7
1.1.1 Sơ lược về vi tảo Chlorella vulgaris.........................................................................7
a) Phân loại khoa học và lịch sử phát hiện.........................................................................7
b) Đặc điểm hình thái.........................................................................................................7
c) Cơ chế hình thành tế bào................................................................................................8
d) Các thành phần hóa học trong tảo Chlorella vulgaris....................................................9
e) Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối và các thành phần hóa học trong tảo...................11
1.1.2 Ứng dụng của tảo Chlorella vulgaris......................................................................11
a) Thực phẩm, sức khỏe và năng lượng sinh học.............................................................11
b) Xử lý nước thải............................................................................................................12
1.2 Khái quát chung về vi khuẩn Azospirillum brasilense................................................13
1.2.1 Sơ lược về vi khuẩn Azospirillum brasilense..........................................................13
a) Phân loại khoa học và lịch sử phát hiện.......................................................................13
b) Đặc điểm hình thái.......................................................................................................13
c) Khả năng hoạt động.....................................................................................................14
1.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn Azospirillum brasilense trong xử lý môi trường................14
1.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về việc xử lý nước thải bằng vi tảo.............15
1.3.1 Một số nghiên cứu trong nước.................................................................................15
1.3.2 Một số nghiên cứu trên thế giới...............................................................................16
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....19
2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu..............................................................................19
2

Tieu luan


2.1.1 Đối tượng nghiên cứu..............................................................................................19
2.1.2 Phạm vi nghiên cứu.................................................................................................19
2.2 Nội dung nghiên cứu..................................................................................................19
2.3 Phương pháp nghiên cứu............................................................................................19

2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm............................................................................................19
2.3.2 Hóa chất và mơi trường...........................................................................................21
a) Mơi trường nuôi cấy sinh khối vi khuẩn......................................................................21
b) Môi trường nuôi cấy sinh khối vi tảo...........................................................................21
2.3.3 Phương pháp khảo sát nồng độ tối ưu của vi khuẩn, vi tảo, alginate và CaCl2........21
a) Nuôi cấy sinh khối vi sinh vật......................................................................................21
b) Cố định vi khuẩn, vi tảo vào Alginate..........................................................................22
c) Đếm Azospirillum brasilense và Chlorella vulgaris.....................................................22
2.3.4 Phương pháp khảo sát khả năng hấp thụ nitơ và phôtpho trong nước thải của vi tảo
Chlorella vugaris kết hợp vi khuẩn Azospirillum brasilense trong Alginate....................23
a) Chuẩn bị nước thải nhân tạo.........................................................................................23
b) Phân tích hàm lượng nitơ và phơtpho..........................................................................23
2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu.......................................................................................23
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ DỰ KIẾN..........................................................................23
CHƯƠNG IV: KẾ HOẠCH THỰC HIỆN.................................................................24
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................26

3

Tieu luan


MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, sự phát triển của kinh tế, các q trình cơng nghiệp hóa, hiện đại
hóa đã kéo tình trạng ơ nhiễm mơi trường gây mất cân bằng sinh thái và tác động
xấu đến sức khỏe con người vô cùng nghiêm trọng. Bên cạnh các hiểm họa như sự
nóng lên của Trái Đất, sự hoang mạc hóa thì tình trạng ơ nhiễm nguồn nước đang
là một vấn đề nghiêm trọng cần được quan tâm [1].
Nguồn nước mặt ở các châu lục hiện đang bị ô nhiễm hữu cơ nghiêm trọng

do nước thải từ các khu công nghiệp, đô thị, nhà máy…với nhiều loại chất hữu cơ
phức tạp, độc hại, ảnh hưởng đến các loại thủy sinh. Đặc biệt trong những năm gần
đây, lượng nước thải chứa hàm lượng lớn ion amoni và ion photpho từ các hoạt
động sinh hoạt hay nông nghiệp với xu hướng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trên
diện rộng ngày càng tăng cao, gây ra những mối nguy hại lâu dài đến sức khỏe con
người [2].
Với mục đích hướng đến môi trường sinh thái bền vững trong những năm
gần đây việc xử lý nước thải bằng vi sinh vật đang đươc nhiều nhà khoa học quan
tâm. Nguyên lý chính của phương pháp này là sử dụng các chất khống và chất
hữu cơ có sẵn trong nước thải tạo mơi trường sống cho các vi sinh vật có thể biến
đổi các hợp chất khó phân giải thành các chất đơn giản hơn [3]. Trong quá trình
này vi sinh vật sẽ tiếp thu các chất làm vật liệu để xây dựng tế bào, từ đó phát triển
và sinh sản làm cho sinh khối tăng lên.
Trong số đó vi tảo là một đối tượng được ứng dụng khá rộng rãi [4]. Phương
pháp xử lý sinh học bằng vi tảo được chú ý đặc biệt nhờ vào khả năng quang hợp
của nó, chuyển đổi năng lượng mặt trời vào q trình tích lũy sinh khối và sử dụng
các hợp chất dinh dưỡng như nito và phốt pho để sinh trưởng [5]. Các hệ thống xử
lý nước thải bằng vi tảo đã được nghiên cứu nhằm xử lý chất thải sinh hoạt, nước

4

Tieu luan


thải chăn nuôi, nước thải nông nghiệp và nước thải từ các nhà máy chế biến thực
phẩm [6]. Trong tất cả lồi tảo thì Chlorella vugaris (C. vugaris) được khai thác
nhiều nhất. Ngồi ra đã có nghiên cứu chỉ ra rằng sự kết hợp của Chlorella
vulgaris với việc thúc đẩy tăng trưởng của vi khuẩn Azospirillum brasilense làm
tăng đáng kể sinh khối và sự sản xuất sắc tố của vi tảo [7].
Sự kết hợp giữa vi khuẩn nội sinh Azospirillum sp. và vi tảo Chlorella sp.

như là một công cụ trong việc tạo ra các phương pháp xử lý nước thải mới. Tương
tác giữa vi khuẩn và vi tảo làm kích thích sự phát triển của vi tảo Chlorella sp. nhờ
các phytohormone do chủng vi khuẩn Azospirillum sp. tiết ra. Từ đó, làm tăng khả
năng loại bỏ nitơ (chủ yếu là amoni) và photpho trong xử lí nước thải. Điều này
được thực hiện hướng tới phát triển phương pháp xử lý nước thải phong phú nitơ
và photpho như nước thải nơng nghiệp…
Xuất phát từ những lí luận và thực tiễn trên, tôi tiến hành thực hiện tiểu luận
với đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng loại bỏ
nitơ, phốtpho trong nước thải chăn nuôi bằng sự kết hợp vi tảo Chlorella
vulgaris và vi khuẩn Azospirillum brasilense”
2 Mục tiêu đề tài
Xác định được các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu quả của việc xử lý nitơ,
phôtpho trong nước thải bằng sự kết hợp vi khuẩn Azospirillum brasilense và vi tảo
Chlorella vulgaris trong hạt Alginate. Từ đó tạo dữ liệu khoa học về chủng vi
khuẩn, vi tảo đồng cố định và ứng dụng thực tiễn tại địa phương.
3 Ý nghĩa của đề tài
3.1 Ý nghĩa khoa học
Tối ưu hóa điều kiện đồng cố định vi khuẩn và vi tảo cũng như hiệu quả xử
lý nitơ, phôtpho trong nước thải bằng mơ hình này sẽ tạo được dữ liệu khoa học có
tính hệ thống để phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng về sau.

5

Tieu luan


3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Việc đồng cố định vi khuẩn Azospirillum brasilense và vi tảo Chlorella
vugaris trong hạt alginate sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu, khảo sát khả năng của
chúng trong xử lý chất dinh dưỡng trong nước thải và ứng dụng thực tiễn tại địa

phương.

6

Tieu luan


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Khái quát chung về vi tảo Chlorella vulgaris
1.1.1 Sơ lược về vi tảo Chlorella vulgaris
a) Phân loại khoa học và lịch sử phát hiện
Chlorella vulgaris là loài tảo xanh lá cây, thuộc về phân loại khoa học sau
đây:

tên

miền:

Eukaryyota,

giới:

Protista,

nhóm:

Chlorophyta,

lớp:

Trebouxiophyceae, bộ: Chlorellales, họ: Chlorellaceae, chi: Chlorella, lồi:
Chlorella vulgaris [8].

Hình 1: Vi tảo Chlorella vulgaris
Chlorella vulgaris được Martinus Willem Beijerinck một nhà nghiên cứu Hà
Lan phát hiện vào năm 1890 là vi tảo đầu tiên có nhân được xác định rõ. Chloralla
xuất phát từ “Cholos” có nguồn gốc tiếng Hy Lạp, có nghĩa là màu xanh và hậu tố
“ella” tiếng La Tinh nghĩa là có kích thước nhỏ. Đây là loài vi tảo đơn bào phát
triển trong nước ngọt và có mặt từ thời kỳ tiền Cambri cách đây 2,5 tỷ năm [9]
b) Đặc điểm hình thái
Chlorella vulgaris là một tế bào hình cầu có đường kính từ 2-10 µm và có
nhiều cơ quan có cấu trúc tương tự thực vật.
7

Tieu luan


Thành tế bào : độ cứng bảo tồn tính tồn vẹn của tế bào và về cơ bản là một
sự bảo vệ chống lại những kẻ xâm lược và môi trường khắc nghiệt. Nó thay đổi
theo từng giai đoạn tăng trưởng. Thành tế bào của tế bào con tăng dần độ dày cho
đến khi nó đạt 17-21nm sau khi trưởng thành. Trong giai đoạn trưởng thành, độ
dày thành tế bào và thành phần tế bào không thay đổi theo điều kiện khác nhau của
môi trường [10][11].
Tế bào chất: Giống như gel bị nhốt trong hàng rào của màng tế bào bao
gồm nước, protein hịa tan và chất khống. Là nơi lưu trữ các cơ quan nội tạng của
Chlorella Vulgaris như ty thể, một nhân nhỏ, không bào [12], một lục lạp đơn và
bộ máy Golgi [13].
c) Cơ chế hình thành tế bào

Hình 2: Hình ảnh cho thấy các giai đoạn khác nhau của sự hình thành tế bào

con trong Chlorella Vulgaris: (a) giai đoạn phát triển tế bào sớm; (b) giai đoạn
tăng trưởng tế bào muộn; (c) lục lạp giai đoạn phân chia; (d) giai đoạn phân chia tế
bào trầm sớm; (e) giai đoạn phân chia tế bào trần muộn; (f) giai đoạn trưởng thành
tế bào con và (g) giai đoạn nở.
Chlorella vulgaris sinh sản không di động, sinh sản vơ tính và nhanh chóng.
Do đó, trong vịng 24 giờ, một tế bào của Chlorella Vulgaris phát triển trong điều
kiện tối ưu nhân lên bằng cách tự động tổng hợp, đây là sinh sản vơ tính phổ biến
nhất trong tảo. Theo cách này, bốn tế bào con có thành tế bào riêng được hình
thành bên trong thành tế bào của tế bào mẹ [10][11]. Sau khi các tế bào con trưởng
thành, vách tế bào của tế bào mẹ vỡ ra, cho phép giải phóng các tế bào con và các
mảnh vụn còn lại của tế bào mẹ sẽ được tiêu thụ làm thức ăn bởi các tế bào con
mới được hình thành.
8

Tieu luan


d) Các thành phần hóa học trong tảo Chlorella vulgaris
Protein: có tầm quan trọng trung tâm trong hóa học và thành phần của vi
tảo. Nó có vai trị trong sự tăng trưởng, sửa chữa và bảo trì tế bào cũng như phục
vụ hoạt động tế bào, liên kết hóa học, điều tiết các hoạt động của tế bào và bảo vệ
chống lại những kẻ xâm lược nước ngoài [13]
Tổng hàm lượng protein trong Chlorella Vulgaris trưởng thành chiếm 42% 58% trọng lượng khô sinh khối [14][15], và thay đổi tùy vào điều kiện phát triển.
Protein có nhiều vai trị khác nhau, gần 20% tổng số protein được sử dụng để liên
kết với thành tế bào, hơn 50% protein trong tế bào và 30% di chuyển vào và ra
khỏi tế bào [16].
Chất lượng dinh dưỡng protein được xác định bởi axit amin của nó, cũng
giống như phần lớn các vi tảo, axit amin của Chlorella Vulgaris được đánh giá
thuận lợi và thậm chí tốt hơn với so với hồ sơ tiêu chuẩn về dinh dưỡng của con
người do Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Tổ chức Nông nghiệp và Thực phẩm đề

xuất (FAO), vì các tế bào của Chlorella Vulgaris tổng hợp các axit amin thiết yếu
và cả axit amin không thiết yếu.
Lipid: Trong điều kiện tăng trưởng tối ưu, Chlorella Vulgaris có thể đạt từ
5% đến 40% lipid trên trọng lượng khô của sinh khối [14] và chủ yếu bao gồm
glycolipids, sáp, hydrocarbon, phospholipid và một lượng nhỏ axit béo tự do[17]
[18]. Các thành phần này được tổng hợp bởi lục lạp và cũng nằm trên thành tế bào
và trên màng của bào quan (màng lục lạp và màng ty thể). Tuy nhiên, trong điều
kiện tăng trưởng không thuận lợi, hàm lượng lipid (chủ yếu bao gồm
triacyglycerol) có thể đạt tới 58% [19][14][20].
Carbohydrate: Tinh bột là loại polysacarit dồi dào nhất trong C. Vulgaris.
Nó thường nằm trong lục lạp và bao gồm amyloza và amylopectin, cùng với
đường, chúng đóng vai trị dự trữ năng lượng cho các tế bào.

9

Tieu luan


Cellulose là một polysacarit cấu trúc có sức đề kháng cao, nằm trên thành tế
bào của Chlorella Vulgaris như một hàng rào sợi bảo vệ. Ngoài ra, một trong
những polysacarit quan trọng nhất có trong Chlorella Vulgaris là β1-3 glucan [21],
có nhiều lợi ích về sức khỏe và dinh dưỡng.
Sắc tố: Các sắc tố phong phú nhất trong Chlorella Vulgaris là chất diệp lục
có thể đạt 1%-2% trọng lượng khơ khô và nằm trong màng lục lạp. Chlorella
Vulgaris cũng chứa một lượng carotenoids quan trọng hoạt động như các sắc tố
phụ kiện bằng cách bắt ánh sáng. Ở thực vật trên cạn, một số sắc tố hoạt động như
chất bảo vệ quang bằng cách bảo vệ các phân tử diệp lục khỏi sự xuống cấp và tẩy
trắng trong khi tiếp xúc mạnh với bức xạ và oxy [13]. Những sắc tố này có nhiều
đặc tính trị liệu, như hoạt động chống oxy hóa [22], tác dụng bảo vệ chống thối
hóa võng mạc [23], điều hòa cholesterol trong máu, phòng ngừa các bệnh mãn tính

(ung thư tim mạch và ruột kết) và củng cốhệ thống miễn dịch [24]
Khống chất: Chúng đóng vai trị chức năng quan trọng ở người. Ví dụ,
cation kali là chính cho dinh dưỡng của con người, nó có liên quan với sự cân bằng
chất lỏng nội bào, chuyển hóa carbohydrate, protein tổng hợp và xung thần kinh.
Ngồi ra, nó được sử dụng làm hóa chất phân bón trong nông nghiệp ở dạng clorua
(KCl), sunfat (K2SO4) hoặc nitrat (KNO3).
Magiê rất quan trọng trong việc duy trì hoạt động thần kinh bình thường,
liên tục và co cơ, do đó thiếu magiê trong cơ thể người có thể dẫn đến trầm cảm và
các triệu chứng của hành vi tự tử. Kẽm là thành phần thiết yếu của enzyme, tham
gia vào quá trình trao đổi chất các quá trình bao gồm tổng hợp carbohydrate, lipid
và protein và nó cũng là một đồng yếu tố của enzyme superoxide effutase, có liên
quan đến việc bảo vệ chống lại q trình oxy hóa và giảm mức độ nghiêm trọng
của tiêu chảy.
Vitamin: được phân loại là hịa tan trong nước (C và B) và khơng tan trong
chất béo (A, D, E và K). Chlorella Vulgaris có chứa rất nhiều vitamin quan trọng
10

Tieu luan


là các yếu tố chính cho sự phát triển và biệt hóa của tế bào trong cơ thể con người
(Vitamin A) và có hoạt tính chống oxy hóa đóng vai trò là người nhặt rác triệt để
cùng với việc cải thiện lưu thơng máu và kiểm sốt các chức năng cơ bắp (Vitamin
E và C) [25].
Phức hợp vitamin B chiếm số lượng lớn nhất trong các sinh vật sống và là
tác nhân chính cho hoạt động của enzyme trong quá trình trao đổi chất [26], Thúc
đẩy tăng trưởng tế bào hồng cầu, giảm nguy cơ tuyến tụy ung thư, và duy trì làn
da, tóc và cơ bắp khỏe mạnh.
e) Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối và các thành phần hóa học trong
tảo

Hàm lượng lipid, hàm lượng tinh bột tăng và năng suất sinh khối ngừng
hoặc giảm [27] nếu trong quá trình tăng trưởng xuất hiện các yếu tố không thuận
lợi như hạn chế nitơ và phốt pho, nồng độ CO 2 cao, tiếp xúc quá nhiều với ánh
sáng [28][29][30], vượt quá hàm lượng sắt trong môi trường [31] hoặc tăng nhiệt
độ [32].
1.1.2 Ứng dụng của tảo Chlorella vulgaris
a) Thực phẩm, sức khỏe và năng lượng sinh học
Những người đầu tiên tiêu thụ tảo xanh là người Aztec và những người
Mesocerican khác, họ đã sử dụng sinh khối tảo như một nguồn thực phẩm quan
trọng [33].
Ngày nay, Nhật Bản là nước dẫn đầu thế giới trong việc tiêu thụ Chlorella và
sử dụng nó để điều trị y tế bởi vì nó cho thấy có khả năng điều chỉnh miễn dịch và
chống ung thư [18].
Vi tảo Chlorella vulgaris được tiêu thụ dưới dạng thực phẩm bổ sung, các
sản phẩm của chúng cũng được sử dụng với các mục đích khác nhau như thuốc
nhuộm, dược phẩm, thức ăn chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản và mỹ phẩm [34].

11

Tieu luan


Trong bối cảnh này, vi tảo Chlorella vulgaris được coi là một nguồn năng
lượng bền vững đầy hứa hẹn do khả năng tích lũy số lượng lớn lipit phù hợp để sản
xuất dầu diesel sinh học giống như nhiên liệu dầu mỏ [35][36].
Chúng cũng được chứng minh là một nguồn sản phẩm như protein,
carbohydrate, sắc tố, vitamin và khoáng chất [19].
Ngoài ra, vi tảo thu ánh sáng mặt trời và thực hiện quang hợp bằng cách tạo
ra khoảng một nửa oxy trong khí quyển trên trái đất và hấp thụ một lượng lớn
carbon dioxide làm thức ăn chính. Do đó, vi tảo được ứng dụng sản xuất nhiên liệu

sinh học, thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và các thành phần giá trị gia tăng cao [37]
[38][39].
b) Xử lý nước thải
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng vượt trội của Chlorella vulgaris
trong việc cố định tới 74% carbon dioxide khi ni trong lị phản ứng quan sinh
học [40], hấp thụ 45%-97% nitơ, 28%-96% phốt pho và trong việc giảm COD
xuống 61%-86% từ các loại nước thải khác nhau như dệt, nước thải, đô thị, nông
nghiệp [41][42].
Vi tảo cung cấp một con đường để loại bỏ các chất dinh dưỡng quan trọng
(nitơ và phốt pho), carbon dioxide, kim loại nặng và mầm bệnh có trong chất thải
vì cần thiết cho sự tăng trưởng của chúng. Ngoài ra, tiết kiệm năng lượng, các yêu
cầu khắc phục hóa chất và giảm thiểu khả năng sử dụng nước ngọt để sản xuất sinh
khối là động lực chính để phát triển vi tảo như là một phần của quá trình xử lý
nước thải [43]. Do đó, tốc độ tăng trưởng nhanh hơn kèm theo việc loại bỏ mức độ
ơ nhiễm nước là một q trình đầy hứa hẹn và thuận lợi.
Hơn nữa, hiệu suất của Chlorella Vulgaris trong nước thải tổng hợp đã được
cải thiện khi được đồng hóa trong hạt alginate với vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng vi
tảo và loại bỏ 100% ammonium (NH4) trong bốn chu kỳ liên tiếp 48 giờ và 83%
phốt pho sau một chu kỳ 48 h [44]. Do đó, Chlorella Vulgaris được coi là một
12

Tieu luan


trong những vi tảo tốt nhất để xử lý nước thải sinh học có tiềm năng ấn tượng để
loại bỏ hồn tồn amoni và cịn có tiềm năng khiêm tốn để loại bỏ phốt pho có
trong mơi trường [45].
1.2 Khái quát chung về vi khuẩn Azospirillum brasilense
1.2.1 Sơ lược về vi khuẩn Azospirillum brasilense
a) Phân loại khoa học và lịch sử phát hiện

Azospirillum brasilense là loài vi khuẩn cố định đạm thuốc về phân loại
khoa học sau đây: giới: Bacteria, ngành: Proteobacteria, lớp: Proteobacteria, bộ:
Rhodospirillales, họ: Rhodospirillaceae, chi: Azospirillum, loài: brasilense.
Ban đầu được phân lập từ đất nghèo nitơ ở Hà Lan vào năm 1925, nó được
tìm thấy rộng rãi trong các thân rễ của cỏ trên khắp thế giới nơi nó thúc đẩy sự phát
triển của cây [46][47]. Vi khuẩn Azospirillum brasilense phân bố rộng trong tự
nhiên, hiện diện ở nhiều môi trường khác nhau: môi trường đất, trong rễ, gốc cây,
vùng đất quanh rễ, thân và lá của cây. Chúng sống tự do trong đất hay cộng sinh
với rễ của các loại ngũ cốc, các loại cây cỏ và cây có củ.
b) Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn Azospirillum sp. có dạng hình que thẳng hay hơi cong, kích thước
tế bào (0,6 - 1,7 x 2,1 - 3,8)µm thuộc Gram âm, có thể chuyển động trong mơi
trường lỏng nhờ có một tiên mao ở một đầu tế bào, trong mơi trường đặc nhiệt độ
30oC nhiều tiên mao bên có thể hình thành. Azospirillum sp. cho phản ứng dương
tính với catalase và oxidase. Khuẩn lạc có màu đỏ đậm hoặc đỏ tươi, hình trịn, bắt
màu đỏ trên mơi trường congo đỏ [48].

13

Tieu luan


Hình 3: Vi khuẩn Azospirillum brasilense
c) Khả năng hoạt động
Vi khuẩn Azospirillum brasilense tăng sinh ở cả trong điều kiện hiếu khí và
kỵ khí với sự hiện diện hoặc khơng có hợp chất nitơ trong mơi trường, nhưng thích
hợp là hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp là 30 – 35°C. Một số dòng Azospirillum sp. là
những vi sinh vật tự dưỡng không bắt buộc. Vi khuẩn Azospirillum brasilense phát
triển tốt trên muối của những acid hữu cơ khác như malate, succinate, hay
pyruvate, fructore và những đường đơi khác cũng có thể được vi khuẩn sử dụng

như nguồn carbon [49].
1.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn Azospirillum brasilense trong xử lý môi
trường
Nuôi cấy vi khuẩn Azospirillum sp. kết hợp với các vi khuẩn khác dưới điều
kiện nuôi cấy tổng hợp nước thải bán liên tục làm tăng đáng kể việc loại bỏ ion
amoni và photpho hòa tan để cố định vi tảo. Đồng thời chúng làm tăng khả năng
sinh trưởng và phát triển của vi tảo. Sự phát triển của vi tảo-vi khuẩn tiên tiến có
thể phục vụ như một cơng cụ trong việc tạo ra các phương pháp xử lý nước thải
mới lạ [44].
Chính vì vậy khi muốn thiết lập các quần thể vi tảo lớn trong môi trường
nước người ta thường sử dụng vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPB) của
14

Tieu luan


chi Azospirillum như một phương tiện tăng sinh khối vi tảo trong môi trường hạn
chế và cải thiện khả năng làm sạch nước thải [50].
Sự phát triển của vi tảo-vi khuẩn tiên tiến có thể phục vụ như một cơng cụ
trong việc tạo ra các phương pháp xử lý nước thải mới. Vi khuẩn Azospirillum cho
thấy con đường tiề năng ứng dụng trong tương lai như một vi sinh vật thân thiện
với môi trường [51].
1.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về việc xử lý nước thải bằng
vi tảo
1.3.1 Một số nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam trong những năm gần đây các cơng trình nghiên cứu chủ yếu
tập trung khảo sát khả năng xử lý ô nhiễm môi trường nước của vi tảo Ch. vulgaris
và một vài cơng trình đánh giá hiệu quả sử dụng lồi vi tảo này làm nhiên liệu sinh
học.
Năm 2012 Võ Thị Kiều Thanh nghiên cứu về hiệu quả xử lý nước thải chăn

nuôi sau biogas của tảo Chlorella sp. cho thấy sau khi nuôi tảo 9 ngày, hàm lượng
COD trong nước thải chăn nuôi lợn giảm từ 65,8- 88,2%; BOD5 giảm từ 61,484%; TN giảm 87,4-90,18%, cịn TP có hiệu quả xử lý không cao chỉ đạt 47,756,15% [55].
Nguyễn Trần Thiện Khánh và cộng sự (2017) đã nghiên cứu khả năng xử lý
nitơ và phospho trong nước thải sinh hoạt bằng vi tảo Chlorella sp. Thí nghiệm
được tiến hành với nghiệm thức (NT) 1, nước thải sinh hoạt đã được xử lý sơ bộ và
NT2 100% nước thải sinh hoạt chưa được xử lý sơ bộ, mật số tảo là 100.103 ct.ml1. Sau 7 ngày, hiệu quả xử lý tổng Nitơ, tổng Phospho và COD lần lượt NT1 là
86.2, 60.8 và 58.7%, NT 2 là 63.6, 28.3 và 53,4%. Mật độ vi tảo phát triển nhiều
nhất vào ngày thứ ba lần lượt NT1 là 640.103 ct.ml-1 và NT2 là 566.103 ct.ml-1.
Dựa vào mơ hình thí nghiệm thực tế, nhóm nghiên cứu kết luận rằng vi tảo

15

Tieu luan


Chlorella sp. có khả năng cao trong việc xử lý nguồn dinh dưỡng có trong nước
thải sinh hoạt (Nguyễn Trần Thiện Khánh và cs., 2016).
Lê Hùng Anh và cộng sự (2016) nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát
triển của ba loài vi tảo biển Tetraselmis suiscica, Tetraselmis sp., Platymonas sp.
kết hợp với việc loại bỏ các hợp chất gây ô nhiễm có trong nước thải từ ao nuôi
tôm của huyện Cần Giờ, Việt Nam và so sánh đối chiếu với môi trường dinh
dưỡng Daigo’s IMK trong 14 ngày nuôi trồng. Kết quả cho thấy những vi tảo sinh
trưởng rất nhanh nhờ vào việc sử dụng các chất ô nhiễm trong nước thải, đặc biệt
hiệu suất xử l. COD, PO43-, NO3-, NH4+ và nitơ tổng của Platomonas sp. và
Tetraselmis suiscica rất cao thậm chí trong mơi trường nước thải đậm đặc. Do đó,
chúng tơi kết luận, vi tảo có tiềm năng rất lớn trong việc giảm nồng độ chất hữu
cơ, phốt pho và nitơ trong nước thải nuôi trồng thủy hải sản (Lê Hùng Anh và cs.,
2016).
Nguyễn Thị Thanh Xuân (2012) đã báo cáo kết quả thử nghiệm nuôi trồng
trong nước thải hầm biogas cho thấy Chlorella vulgaris có thể sinh trưởng tốt, đồng

thời có khả năng xử lý nước thải và cho lipid nhằm mục tiêu sản xuất biodiesel
(Nguyễn Thị Thanh Xn và cs., 2012).
Từ những cơng trình khoa học trên đây cho thấy, các nghiên cứu trong nước
về vi tảo Chlorella sp. chủ yếu quan tâm đến khả năng xử lý nước thải và sản xuất
biodiel mà chưa có cơng trình nào nghiên cứu những ảnh hưởng tích của vi khuẩn
Azospirilum sp. lên vi tảo Chlorella sp. khi đồng cố định trong các hạt nhận tạo
nhằm mục đích tăng hiệu quả xử lý ô nhiễm nguồn nước.
1.3.2 Một số nghiên cứu trên thế giới
Mouget và công sự 1995 đã cố định lần lượt hai chủng vi khuẩn là
Pseudomanas diminita và Pseudomonas sialaris với vi tảo Chlorella vulgaris trong
Alginate nhưng chúng khơng tiết ra bất cứ chất kích thích sinh trưởng nào.

16

Tieu luan


Nghiên cứu của Gonzalez Bashan năm 2000 và Lebsky năm 2001 đã chỉ ra
rằng Azospirillum brasilense tăng sinh khối và kéo dài tuổi thọ cuả vi tảo
Chlorella vulgaris.
Năm 2000 Bashan và Gonzalez đã đồng cố định vi tảo Chlorella vulgaris và
vi khuẩn Phyllobacterium myrsinacearum trong Alginate nhưng kết quả cho thấy
vi khuẩn Phyllobacterium myrsinacearum chỉ làm tăng việc sản xuất các sắc tố của
vi tảo nhưng không tăng sinh khối và làm giảm hiệu quả xử lý nước thải [52].
Không lâu sau đó kết quả nghiên cứu năm 2002 Bashan và cộng sự cho thấy
chủng vi tảo Chlorella vulgaris (UTEX 2714) khi cố định với vi khuẩn
Azospirillum brasilense không tăng kích thước nhưng tăng sinh khối [7].
Hướng nghiên cứu của Bashan và cộng sự năm 2004 là đánh giá khả năng
xử lý nước thải đô thị của vi tảo Chlorella vulgaris khi cố định với vi khuẩn
Azospirillum brasilense trong Alginate, kết quả cho thấy loại bỏ 100% amoni, 15%

nitrat và 36% photpho trong 16 ngày. Trong khi cố định vi tảo một mình thì chỉ xử
lý được 75% amoni, 6% nitrat và 19% photpho [53].
Một số thí nghiệm đã được tiến hành để kiểm tra sự chuyển hóa TN và TP ra
khỏi môi trường nước thải bằng tảo Chlorella vulgaris như của Luz Estela Gozalez
(1997) là người đã phát hiện ra rằng tảo Chlorella vulgaris hấp thu 95% NH4+ và
50% TP trong nước thải. Thí nghiệm này cho thấy có thể dùng vi tảo để xử lý nước
thải trên các dịng sơng ở Colombia [44].
Kết quả thực tế tại thải nhà máy Mill Creek ở Cincinnari, OH, U.S.A cho
thấy vi tảo có khả năng cao trong việc loại bỏ BOD5, COD khi hiệu quả xử lý
BOD5, COD đạt 97,3 và 88% trên nước thải tại nhà máy [9].
Colak và Kaya (1988) đã báo cáo về hiệu quả loại bỏ nitơ (50,2%) và
photpho (85,7%) trong nước thải công nghiệp của tảo. Hiệu quả xử lý của
Chlorella vulgaris với nước thải dệt nhuộm cũng được nghiên cứu trong đó loại bỏ

17

Tieu luan


màu dao động từ 41,8% đến 50,0%, giảm NH4 –N (44,4-45,1%), PO4 –P (33,1
-33,3%) và COD (38,3 -62,3%) [54]
Việc hấp thụ kim loại nặng bởi vi tảo tạo ra bước khả thi trong xử lý nước
thải ô nhiễm kim loại nặng báo cáo rằng, quang hợp trực tiếp của vi tảo có vai trị
trong việc loại bỏ kim loại nặng trong nước thải dầu mỏ. Bên cạnh đó vi tảo cịn
được báo cáo có khả năng trong việc tích lũy Cu 2+, Pb2+ và Cr3+ cũng như Ni2+,
Cd2+, Co2+, Fe2+ và Mn2+. Vi tảo cũng được chứng minh làm giảm các hydrocarbon
chứa trong dầu thải [4].
Năm 2013 Farooq Ahmad tiến hành sử dụng Chlorella vulagris trong xử lý
nước thải đô thị và sản xuất dầu diesel sinh học, kết quả phân tích các thơng số
được thực hiện trong các bước thí nghiệm cho thấy một tỷ lệ phần trăm loại bỏ tối

đa COD (99,9%), BOD (100%), NO3-(99,98%), PO42-(99,96%) và tổng colifrom
(100%) trong nước thải [55].

18

Tieu luan


CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Azospirillum brasilense từ Phòng vi sinh, Khoa Sinh-Môi
trường, ĐH Sư Phạm Đà Nẵng.
Chủng vi tảo Chlorella vulgaris từ Phịng cơng nghệ tảo, Khoa Sinh-Mơi
trường, ĐH Sư Phạm Đà Nẵng.
Hạt alginate đồng cố định vi khuẩn và vi tảo.
2.1.2 Phạm vi nghiên cứu
Địa điểm thu thập nước thải ngồi thực địa
Phịng TN vi sinh, Phịng xử lý mơi trường và Phịng cơng nghệ tảo thuộc
khoa Sinh - Mơi trường trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng.
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh IAA của vi khuẩn
Azospirillum brasilense.
- Khảo sát khả năng sinh trưởng của vi tảo Chlorella vulgaris khi đồng cố
định với vi khuẩn Azospirillum brasilense trong hạt alginate.
- Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ của nitơ, phôtpho trong nước thải chăn
nuôi bằng sự kết hợp giữa vi khuẩn và vi tảo.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm nghiên cứu được bố trí theo sơ đồ sau đây:

19

Tieu luan


CHỦNG VI
KHUẨN
AZOSPIRILLUM
BRASILENSE

CHỦNG VI TẢO
CHLORELLA
VULGARIS

KS MÔI TRƯỜNG,
pH, NỒNG ĐỘ
TRYPTOPHAN,
NHIỆT ĐỘ

KHẢO SÁT KHẢ
NĂNG SINH
TRƯỞNG

CỐ ĐỊNH
TRONG
ALGINATE

pH, NHIỆT

ĐỘ, CƯỜNG
ĐỘ ÁNH
SÁNG

XỬ LÝ MÔI
TRƯỜNG
TRONG PTN

%N, %P

QUY TRÌNH TỐI ƯU XỬ
LÝ NƯỚC THẢI NƠNG
NGHIỆP

20

Tieu luan


2.3.2 Hóa chất và mơi trường
a) Mơi trường ni cấy sinh khối vi khuẩn
Môi trường Dobereiner và cộng sự (1976) (g/l)
Acid malic

5,0

K2HPO4

0,4

MgSO4.7H20

0,2

CaCl2.7H2O

0,02

NaCl

0,1

FeCl3.6H2O

0,01

NaMoO4

0,002

Bromothymol blue (0.5%)

2ml

KOH

4,0

Agar

1,75

pH

6,8

b) Môi trường nuôi cấy sinh khối vi tảo
Mơi trường C30 (g/l):

Vi chất dinh dưỡng (µg/l)

KNO3 

25

H3BO3 

2,86

MgSO4 .7H2O

10

MnCl2.4H2O

1,81

KH2PO4 

4

ZnSO4 .7H2O,

0,11

K2HPO4 

1

CuSO4 .5H2O,

0,09

FeSO4 .7H2O

1

NaMoO4 ,

0,021

2.3.3 Phương pháp khảo sát nồng độ tối ưu của vi khuẩn, vi tảo, alginate
và CaCl2
a) Nuôi cấy sinh khối vi sinh vật
Chlorella vulgaris ni trong mơi trường khống vơ trùng (BBM) trong 5
ngày.
21

Tieu luan

Azospirillum brasilense được nuôi trong môi trường lỏng LB tại 30±20℃
trong giờ trong 17 giờ, máy lắc tốc độ 150 vòng/phút.
b) Cố định vi khuẩn, vi tảo vào Alginate
Ly tâm 100ml dịch nuôi cấy vi tảo Chlorella vulgaris (6.106 tế bào/ml) và
50ml dịch nuôi Azospirillum brasilense (109 CFU/ml) ở 4000 vòng trong 20 phút.
Sau khi ly tâm, rửa 2 lần bằng nước muối NaCl 0,85%. Sau đó, giữ lại trong 20ml
dung dịch nước muối trong 2 bình tam giác [56].
Vi sinh vật được cố định bằng phương pháp được mô tả bởi Bashan [56]:
Trộn lẫn 10ml dịch nước muối chứa vi tảo Chlorella vulgaris và 10ml dịch
nước muối chứa vi khuẩn Azospirillum brasilense với 80ml dung dịch alginate 2%
đã vô trùng (dung dịch alginate đã sau khi hấp khủ trùng chỉ làm giảm độ nhớt đi
một chút) và khuấy chậm trong 15 phút. Nhỏ giọt hỗn hợp vào dung dịch CaCl2
2% đã vô trùng rồi khuấy chậm. Ủ trong 1h ở nhiệt độ phịng để bảo dưỡng và sau
đó rửa sạch trong dung dịch nước muối NaCl 0,85% vô trùng.
Vi khuẩn và vi tảo sau khi cố định alginate được ni trong mơi trường
BBM tại nhiệt độ phịng thí nghiệm trong 10 ngày. Bởi vì cố định thường làm giảm
số lượng vi sinh vật trong các hạt nên cần bước ủ thứ hai: ủ qua đêm trong mơi
trường khống ni dưỡng của vi khuẩn và vi tảo. Sau đó, rửa hạt 3 lần bằng dung
dịch muối NaCl 0,85% vô trùng. Nếu cần thiết có thể lưu trữ hạt ở 40C trong 7
ngày.
Hòa tan hạt bằng cách ngâm 6 hạt trong 1ml dung dịch NaHCO3 4% trong
30 phút rồi đếm vi tảo và vi khuẩn.
c) Đếm Azospirillum brasilense và Chlorella vulgaris
Đếm Azospirillum brasilense bằng cách cấy chang một loạt dịch các pha
loãng trong nước muối NaCl 0,85% ở các nồng độ trên các đĩa thạch dinh dưỡng sẽ
tạo khuẩn lạc có màu hồng đến đỏ đặc trưng.
Chlorella vulgaris được đếm bằng cách sử dụng buồng đếm hồng cầu.
22

Tieu luan


2.3.4 Phương pháp khảo sát khả năng hấp thụ nitơ và phôtpho trong
nước thải của vi tảo Chlorella vugaris kết hợp vi khuẩn Azospirillum brasilense
trong Alginate
a) Chuẩn bị nước thải nhân tạo
Chuẩn bị nước thải nhân tạo, vô trùng [56] (mg / L):
NaCl

7

CaCl2

4

MgSO4.7H2O

2

K2HPO4

21.7

KH2PO4

8.5

Na2HPO4

33.4

NH4Cl

19.1

b) Phân tích hàm lượng nitơ và phơtpho
Phân tích hàm lượng nitơ và phơtpho bằng cách sử dụng máy đo quang phổ.
NH4- được phân tích bởi phương pháp Nessler, PO43- được phân tích bởi phương
pháp sử dụng thuốc thử Sunfo-molypdic.
2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Số liệu phân tích từ các thí nghiệm được
tính tốn thống kê bằng chương trình excel và ANOVA.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ DỰ KIẾN
Xác định được khả năng hấp thụ nitơ và phôtpho trong nước thải của vi tảo
Chlorella vugaris đồng cố định vi khuẩn Azospirillum brasilense trong Alginate.

23

Tieu luan


CHƯƠNG IV: KẾ HOẠCH THỰC HIỆN
STT

Thời gian

Nội dung

Kết

quả

dự

kiến
1

06/2019

Xây dựng đề cương nghiên cứu

Đề

cương

nghiên

cứu

hoàn chỉnh
2

07/2019

Nhân

sinh

khối

vi

khuẩn Sinh

khối

vi

Azospirillum brasilense và vi tảo khuẩn, vi tảo
Chlorella vulgaris

phục

vụ

cho

việc

đồng

cố

định
3

8/2019

Cố định vi khuẩn Azospirillum Vi khuẩn, vi tảo

brasilense và vi tảo Chlorella phát triển trong
vulgaris vào hạt Alginate

4

Alginate

9/2019-

Khảo sát nồng độ tối ưu của vi Tìm ra nồng độ

11/2019

khuẩn, vi tảo, alginate và CaCl2

tối ưu khi thực
hiện đồng cố
định phục vụ
cho việc xử lý
nước thải

1/2020-3/2020
5

Khảo sát khả năng loại bỏ nito và Xác định được
photpho khỏi nước thải của vi khả năng loại
24

Tieu luan

khuẩn

Azospirilium

brasilense bỏ

nito

khi kết hợp với vi tảo Chlorella photpho

6

4/2020- 5/2020

và
trong

vulgaris trong Alginate

nước thải

Viết báo cáo tổng kết

Báo cáo tổng
kết hoàn thành

25

Tieu luan