Nghiên cứu tính đa hình gen MBL2, FCN2 và nồng độ protein MBL, Ficolin-2 ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue (FULL TEXT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

NGƠ TRƯỜNG GIANG

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH GEN MBL2, FCN2
VÀ NỒNG ĐỘ PROTEIN MBL, FICOLIN-2 Ở BỆNH
NHÂN SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI, 2022


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1. Dịch tễ học bệnh sốt xuất huyết Dengue

3

1.1.1. Tình hình sốt xuất huyết Dengue trên thế giới

3

1.1.2. Tình hình SXHD ở Việt Nam

4

1.2. Cơ chế bệnh sinh của sốt xuất huyết Dengue

5

1.3. Hệ thống bổ thể

9

1.3.1. Hệ thống bổ thể

9

1.3.2. Con đường lectin hoạt hóa bổ thể

13

1.4. Protein MBL và gen MBL2

14

1.4.1. Protein MBL

14

1.4.2. Gen MBL2 và tính đa hình gen MBL2

20

1.5. Protein Ficolin-2 và gen FCN2

24

1.5.1. Protein Ficolin-2

24

1.5.2. Gen FCN2 và tính đa hình gen FCN2

27

1.6. Vai trị của MBL, Ficolin-2 và tính đa hình gen MBL2,
FCN2 trong sốt xuất huyết Dengue

29

1.6.1. Vai trị của MBL và đa hình gen MBL2 trong sốt xuất

29

huyết Dengue
1.6.2. Vai trò của Ficolin-2 và đa hình gen FCN2 trong sốt xuất

30

huyết Dengue
1.7. Tình hình nghiên cứu về vai trò của protein MBL và Ficolin-

31

2 và tính đa hình của các gen MBL2 và FCN2 trong bệnh sốt
xuất huyết Dengue
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu

33
33

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

33

2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân

33

2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ

35

2.2. Phương pháp nghiên cứu

36

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

36

2.2.2. Cách chọn mẫu

37

2.2.3. Các phương tiện nghiên cứu

37

2.2.4. Các bước tiến hành

37

2.3. Nội dung nghiên cứu

39

2.3.1. Chỉ tiêu về dịch tễ

39

2.3.2. Chỉ tiêu về lâm sàng, cận lâm sàng

39

2.3.3. Xác định nồng độ Ficolins-2 và MBL trong huyết thanh

41

2.4. Phân tích kết quả

48

2.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

49

2.6. Đạo đức nghiên cứu

49

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Một số đặc điểm nhóm bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue
3.1.1. Đặc điểm tuổi và giới

50
50
50

3.1.2. Một số chỉ tiêu lâm sàng, cận lâm sàng

50

3.2. Tính đa hình gen MBL2, FCN2 và nồng độ protein MBL,

53

Ficolin-2 ở các nhóm đối tượng nghiên cứu
3.2.1. Tính đa hình gen MBL2 ở các nhóm đối tượng nghiên cứu

53

3.2.2. Tính đa hình gen FCN2 ởcác nhóm đối tượng nghiên cứu

56

3.2.3. Đặc điểm nồng độ protein MBL, Ficolin-2 ở các nhóm đối

60

tượng nghiên cứu
3.3. Mối liên quan giữa tính đa hình gen MBL2, FCN2 và nồng

61

độ MBL, Ficolin-2 với mức độ bệnh và một số biểu hiện lâm
sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt xuất huyết Dengue
3.3.1. Mối liên quan giữa tính đa hình gen MBL2 và mức độ

61

bệnh, một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt
xuất huyết Dengue
3.3.2. Mối liên quan giữa tính đa hình gen FCN2 với mức độ

72

bệnh và một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt
xuất huyết Dengue
3.3.3. Mối liên quan giữa nồng độ protein MBL với mức độ

80

bệnh và một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt
xuất huyết Dengue
3.3.4. Mối liên quan giữa nồng độ Ficolin-2 với mức độ bệnh và

84

một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt xuất
huyết Dengue
3.3.5. Mối liên quan giữa tính đa hình gen MBL2 và nồng độ

87

MBL huyết thanh ở bệnh sốt xuất huyết Dengue
3.3.6. Mối liên quan giữa tính đa hình gen FCN2 và nồng độ

90

protein Ficolin-2 ở bệnh sốt xuất huyết Dengue
Chương 4: BÀN LUẬN
4.1. Đặc điểm chung nhóm bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue

95
95

4.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới

96

4.1.2. Một số chỉ tiêu lâm sàng và cận lâm sàng

96

4.2. Về tính đa hình gen MBL2, FCN2 và nồng độ protein MBL,

100


Ficolin-2 ở các nhóm đối tượng nghiên cứu
4.2.1. Về tính đa hình gen MBL2 ở các nhóm đối tượng nghiên

100

cứu
4.2.2. Về tính đa hình gen FCN2 ở các nhóm đối tượng nghiên

102

cứu
4.2.3. Đặc điểm nồng độ protein MBL, Ficolin-2 ở các nhóm đối

104

tượng nghiên cứu
4.3. Về mối liên quan giữa tính đa hình gen MBL2, FCN2 và

105

nồng độ MBL, Ficolin-2 với mức độ bệnh và một số biểu hiện
lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt xuất huyết Dengue
4.3.1. Mối liên quan giữa tính đa hình gen MBL2 và mức độ

105

bệnh, một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt
xuất huyết Dengue
4.3.2. Mối liên quan giữa tính đa hình gen FCN2 với mức độ

110

bệnh và một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt
xuất huyết Dengue
4.3.3. Mối liên quan giữa nồng độ protein MBL với mức độ

114

bệnh và một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt
xuất huyết Dengue
4.3.4. Về mối liên quan giữa nồng độ Ficolin-2 với mức độ bệnh

115

và một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh sốt xuất
huyết Dengue
4.3.5. Về mối liên quan giữa tính đa hình gen MBL2 và nồng độ

119

MBL huyết thanh ở bệnh sốt xuất huyết Dengue
4.3.6. Về mối liên quan giữa tính đa hình gen FCN2 và nồng độ

122

protein Ficolin-2 ở bệnh sốt xuất huyết Dengue
KẾT LUẬN
KIẾN NGHỊ
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ
NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO


PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
TT

Phần
Phần viết đầy đủ (tiếng Anh)
viết tắt

Phần viết đầy đủ (tiếng Việt)

1

GPT

Glutamate Pyruvate
transaminase

Enzym chuyển amin của
Glutamat và Pyruvat

2

APTT

Activated -partial
thromboplastin time

Thời gian hoạt hoá
thromboplastin từng phần

3

GOT

Glutamate Oxaloacetate
Transaminase

Enzym chuyển amin của
Glutamat và Oxaloacetat

4

CR

Complement receptor

Thụ thể nhận diện bổ thể

5

CRD

Carbohydrate Recognition
Domain

Vùng nhận diện Carbohydrat

6

CRP

C-reactive protein

Protein phản ứng C

7

DENV-1 Dengue virus type 1

Virus Dengue týp 1

8

DHF

Dengue hemorrhagic fever

Sốt xuất huyết Dengue

9

DNA

Deoxyribonucleic Acid

Acid Deoxyribonucleic


10

DSS

Dengue shock syndrome

Hội chứng sốc Dengue

11

DWS

Dengue with warning signs

Sốt Dengue có dấu hiệu cảnh
báo

12

ELISA

Enzym linked immuno sorbent
assay

Xét nghiệm miễn dịch gắn
enzym

13

HCT

Hematocrite

Dung tích hồng cầu

14

HI

Haemagglutination - inhibition

Phản ứng ức chế ngưng kết
hồng cầu

15

IgA

Immunoglobuline A

Kháng thể lớp A

16

IgM

Immunoglobuline M

Kháng thể lớp M

17

IgG

Immunoglobuline G

Kháng thể lớp G

18

IL

TT

Phần
Phần viết đầy đủ (tiếng Anh)
viết tắt

Phần viết đầy đủ (tiếng Việt)

19

KN-KT

Kháng nguyên - kháng thể

20

LTA

Lipoteichoic Acid

Acid lipoteichoic

21

MACELISA

IgM antibody capture Enzym
Linked Immunosorbent Assays

Xét nghiệm miễn dịch enzym
tìm kháng thể IgM

22

MASP

MBL Assosiated Serine
Protease

Serin Protease liên kết MBL

23

MBL

Mannose Binding Lectin

Lectin liên kết mannose

24

NS

Non structural protein

Protein không cấu trúc

25

OR

Odd ratio

Tỷ xuất chênh

26

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng tổng hợp chuỗi

27

PLT

Platelet

Tiểu cầu

28

PT

Prothrombin time

Thời gian prothrombin

29

PRR

Pattern Recognition Receptor

Thụ thể nhận diện mầm bệnh

30

TLR

Toll-Like Receptor

Thụ thể Toll-Like

31

TNF

Tumor necrosis factor

Yếu tố hoại tử u

32

SD

Severe Dengue

Sốt Dengue nặng

Interleukin


33

SLE

Systemic lupus erythematous

Lupus ban đỏ hệ thống

34

SNP

Single-Nucleotide
Polymorphism

Đa hình đơn Nucleotid

35

SXHD

36

RBC

Red Blood Cell

Hồng cầu

37

WBC

White Blood Cell

Bạch cầu

38

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

Sốt xuất huyết Dengue

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

2.1
3.1

Trình tự các cặp mồi đặc hiệu
Đặc điểm tuổi, giới ở bệnh nhân nghiên cứu

46
50

3.2

Một số chỉ tiêu lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân nghiên

50

cứu
Đặc điểm kháng nguyên, kháng thể đặc hiệu virus Dengue

51

ở bệnh nhân nghiên cứu
Tần suất kiểu gen, alen các điểm đa hình vùng Promoter

53

gen MBL2 ở các nhóm nghiên cứu

Tần suất kiểu gen, alen các điểm đa hình vùng exon 1 gen

54

MBL2 ở các nhóm nghiên cứu
Tần suất kiểu gen đơn bội, lưỡng bội của đa hình (-

55

221)+exon 1 gen MBL2 ở các nhóm nghiên cứu
Tần suất các kiểu gen đơn bội gen MBL2 ở các nhóm nghiên

56

cứu
Tần suất kiểu gen và alen các điểm đa hình vùng promoter

57

gen FCN2 ở các nhóm nghiên cứu
Tần suất kiểu gen và alen các điểm đa hình vùng exon 7;

58

intron 7; exon 8 gen FCN2 ở các nhóm nghiên cứu
Tần suất kiểu gen đơn bội tạo bởi 3

59

3.3

3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10

SNP


Bảng

Tên bảng

Trang

(+6031/+6220/+6424) gen FCN2 ở các nhóm nghiên cứu
3.11

Tần suất các kiểu gen đơn bội tạo bởi 8 SNP gen FCN2 ở

60

3.12

các nhóm nghiên cứu
Đặc điểm nồng độ MBL ở các nhóm nghiên cứu

60

3.13

Đặc điểm nồng độ Ficolin-2 ở các nhóm nghiên cứu

61

So sánh tần suất kiểu gen và kiểu alen các điểm đa hình

62

vùng Promoter gen MBL2 giữa các nhóm nghiên cứu.
So sánh kiểu gen và kiểu alen các điểm đa hình vùng exon 1

63

gen MBL2giữa các nhóm nghiên cứu.
So sánh tần suất kiểu gen đơn bội, lưỡng bội của đa hình (-

67

221)+exon 1 gen MBL2giữa các nhóm nghiên cứu
So sánh tần suất các kiểu gen đơn bội gen MBL2giữa các

70

nhóm nghiên cứu
So sánh tần suất kiểu gen và alen các điểm đa hình vùng

72

3.14
3.15
3.16
3.17

3.18

exon 7 ; intron 7; exon 8 gen FCN2 giữa các nhóm nghiên
cứu 73
So sánh tần suất kiểu gen đơn bội tạo bởi 3 SNP

3.19

3.20
3.21
3.22
3.23
3.24

77

(+6031/+6220/+6424) gen FCN2 giữa nhóm bệnh và nhóm
chứng
So sánh tần suất kiểu gen đơn bội tạo bởi 8 SNP gen FCN2

78

giữa nhóm bệnh và nhóm chứng
Tương quan giữa nồng độ MBL và các triệu chứng cận lâm

82

sàng
Giá trị phân biệt 2 nhóm bệnh DHF và DWS của protein

83

MBL 84
Tương quan giữa nồng độ Ficolin-2 và các triệu chứng cận

86

lâm sàng
Giá trị phân biệt 2 nhóm bệnh DHF và DWS của protein
Ficolin-2

87


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1
1.2

Phân bố tình hình SXHD trên thế giới giai đoạn 2010- 2016
Số ca sốt xuất huyết Dengue nhập viện và tử vong theo tuần

3
4

1.3
1.4
1.5
1.6
1.7

năm 2018 và 2019
Cơ chế bệnh sinh của sốt xuất huyết Dengue
Các con đường hoạt hóa bổ thể
Bước đầu khởi động con đường lectin
Cấu trúc phân tử protein MBL
Mơ hình kết quả phân tách hỗn hợp MBL bằng kỹ thuật

5
12
14
15
16

1.8
1.9
1.10
1.11
2.1

SDS-PAGE
Đa hình gen MBL2
Cây tiến hóa MBL2
Cấu trúc đa bậc của protein Ficolin và MBL
Máy Diagnostic Automation đo mật độ quang ở bước sóng

21
24
25
28
41

2.2

450 nm
Bộ kít định lượng Ficolin-2 trong huyết thanh bằng phương

42

2.3
2.4

pháp ELISA tiến hành trong nghiên cứu
Máy và phần mềm định lượng miễn dịch Luminex
Bộ kít định lượng MBL trong huyết thanh bằng máy

43
44

2.5
3.1

Luminex dùng trong nghiên cứu
Máy nhân gen Eppendorf
Hoạt độ enzym GOT và GPT ở hai nhóm bệnh nhân dương

47
52

Đa hình đơn Nucleotit trên gen FCN2

tính và âm tính với kháng thể IgG và IgM đặc hiệu virus
3.2

Dengue
Mối liên quan giữa đa hình -550C/G gen MBL2 và một số

64

3.3

biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD
Mối liên quan giữa đa hình -221C/G gen MBL2 và một số

65

3.4

biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD

Mối liên quan giữa đa hình +4G/A gen MBL2 và một số

65


Hình

Tên hình

Trang

3.5

biểu hiện lâm sàng ở bệnh nhân SXHD
Mối liên quan giữa các đa hình trên exon 1 gen MBL2 và

66

3.6

một số biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD
Mối liên quan giữa kiểu gen đơn bội tạo bởi điểm -221C/G

68

+ exon 1 gen MBL2 và một số biểu hiện cận lâm sàng ở
3.7

bệnh nhân SXHD
Mối liên quan giữa kiểu gen lưỡng bội tạo bởi điểm

69

-221C/G + exon 1 gen MBL2 và một số biểu hiện cận lâm
3.8

sàng ở bệnh nhân SXHD
Mối liên quan giữa kiểu gen đơn bội tạo bởi 6 điểm đa hình

71

gen MBL2 và một số biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân
3.9

SXHD
Mối liên quan giữa đa hình +6031A/G gen FCN2 và một số

74

3.10

biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD
Mối liên quan giữa đa hình +6220T/G gen FCN2 và một số

75

3.11

biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD
Mối liên quan giữa đa hình +6424G/T gen FCN2 và một số

76

3.12

biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD
Mối liên quan giữa kiểu gen đơn bội tạo bởi 3 SNP

77

(+6031/+6220/+6424) gen FCN2 và một số biểu hiện cận
3.13

lâm sàng ở bệnh nhân SXHD
Mối liên quan giữa kiểu gen đơn bội tạo bởi 8 SNP gen

79

3.14
3.15

FCN2 và một số biểu hiện cận lâm sàng ở bệnh nhân SXHD
So sánh nồng độ protein MBL ở các nhóm nghiên cứu
So sánh nồng độ protein MBL giữa các nhóm âm tính và

80
81

dương tính với kháng ngun NS1 và kháng thể IgG, IgM
3.16

đặc hiệu với virus Dengue
So sánh nồng độ protein MBL ở nhóm có và khơng có đấu

81

3.17
3.18

hiệu xuất huyết
So sánh nồng độ protein MBL ở nhóm bệnh nhân nam và nữ
Biểu đồ đường cong ROC của protein MBL trong phân biệt

82
83


Hình

Tên hình

Trang

3.19

2 nhóm bệnh DHF và DWS
So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa các nhóm nghiên

84

3.20

cứu
So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa các nhóm âm tính và

85

dương tính với kháng nguyên NS1 và kháng thể IgG, IgM
3.21

đặc hiệu với virus Dengue
So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa có và khơng có dấu

85

3.22

hiệu suất huyết
So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa hai nhóm bệnh nhân

86

3.23

nam và nữ
Biểu đồ đường cong ROC của protein Ficolin-2 trong phân

87

3.24

biệt 2 nhóm bệnh DHF và DWS
Nồng độ protein MBL ở các kiểu gen khác nhau ở nhóm

88

3.25

DHF
Nồng độ protein MBL trên các kiểu gen khác nhau ở nhóm

88

3.26

DWS
Nồng độ protein MBL trên các kiểu gen khác nhau ở nhóm

89

3.27

chứng
Nồng độ protein MBL trên các kiểu gen đơn bội khác nhau

90

3.28

ở nhóm chứng và nhóm bệnh

So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa các kiểu gen của các

91

3.29

điểm đa hình gen FCN2 ở nhóm bệnh
So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa các kiểu gen của các

92

3.30

điểm đa hình gen FCN2 ở nhóm chứng
So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa các kiểu gen đơn bội

93

của 3 SNP (+6031/+6220/+6424) gen FCN2 ở nhóm chứng
3.31

và nhóm bệnh
So sánh nồng độ protein Ficolin-2 giữa các kiểu gen đơn bội
của 8 SNP gen FCN2 ở nhóm chứng và nhóm bệnh

93



ĐẶT VẤN ĐỀ

Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus
Dengue gây ra, bệnh lây truyền qua muỗi Aedes. Trong khoảng 50 năm trở lại
đây, tỉ lệ mắc SXHD tăng cao, đặc biệt ở các vùng địa lý mới. Theo thống kê
của Tổ chức Y tế Thế giới, xấp xỉ 3,9 tỷ người đang sống trong vùng dịch sốt
xuất huyết và có khoảng 390 triệu ca nhiễm virus Dengue với khoảng 96 triệu
ca có biểu hiện lâm sàng hàng năm .
Trong 10 năm trở lại đây, các nước khu vực Đơng Nam Á và Tây Thái
Bình Dương tiếp tục ghi nhận số bệnh nhân mắc SXHD tăng. Tại Việt Nam,
tình hình dịch SXHD đã và đang diễn ra hết sức phức tạp trên cả nước đặc
biệt ở các đô thị lớn như Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh. Năm 2018, cả
nước có 126.682 số ca mắc với 17 ca tử vong. Năm 2019, số ca mắc tăng 2,5
lần và số ca tử vong tăng 3 lần với 320.702 trường hợp mắc SXHD và 54
trường hợp tử vong . Trên thực tế, số ca mắc và tử vong có thể cịn cao hơn
nhiều. Trong thực hành lâm sàng, việc tiên lượng đúng các ca bệnh nặng sẽ
giúp các bác sĩ lựa chọn được phác đồ hiệu quả để điều trị bệnh nhân. Tuy
nhiên, việc tiên lượng này cịn gặp rất nhiều khó khăn và hạn chế do thiếu các
chỉ tiêu tiên lượng. Do đó, nghiên cứu sâu về cơ chế bệnh sinh của SXHD từ
đó có thể đưa ra các yếu tố dùng làm chỉ tiêu tiên lượng các ca bệnh nặng là
rất cần thiết và hữu ích cho cơng tác điều trị bệnh.
Trong q trình virus Dengue xâm nhập vào cơ thể, hệ thống miễn dịch
bẩm sinh phản ứng sớm nhất chống lại sự xâm nhập và nhân lên của virus. Hệ
thống bổ thể gồm một nhóm các protein trong huyết thanh là một thành phần
quan trọng của hệ thống miễn dịch bẩm sinh. Thơng qua các cơ chế: làm tan
tế bào, opsonin hóa, tăng cường đáp ứng viêm, hệ thống bổ thể bảo vệ cơ thể
chống lại rất nhiều tác nhân gây bệnh . Để thực hiện được chức năng, các
protein bổ thể cần được hoạt hóa. Một trong những con đường hoạt hóa bổ thể


quan trọng, tham gia vào cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh lý là con đường
lectin với vai trò then chốt của 2 protein Mannose Binding Lectin (MBL) và

Ficolin-2 . Thông qua vùng nhận diện tác nhân trong cấu trúc phân tử, MBL
và Ficolin-2 có khả năng gắn đặc hiệu với các phân tử trên bề mặt các tác
nhân gây bệnh, từ đó hoạt hóa hệ thống bổ thể theo con đường lectin bảo vệ
cơ thể chống lại các tác nhân đó .
Nồng độ MBL và tính đa hình gen MBL2 đã được chỉ ra có liên quan
đến nhiễm nhiều loại virus khác nhau như HIV, HBV, HCV và đặc biệt là một
số virus trong họ Flaviviridae như WNV , , , . Trong nghiên cứu này, MBL
được chỉ ra là có khả năng gắn vào đầu có chứa N-Linked glycan trên vỏ virus
từ đó trung hịa và thanh thải hiệu quả virus . Giống như MBL, Ficolin-2 cũng
đã được chỉ ra đóng một vai trị quan trọng trong nhiễm một số loại virus ở
người như HBV, HCV , . Là một loại trong họ Flaviviridae, vỏ của virus
Dengue có chứa N-Linked glycan là phối tử cho MBL và Ficolin-2 gắn vào,
từ đó trung hịa và thanh thải virus . Do đó, nồng độ và chất lượng MBL và
Ficolin-2 có thể đóng vai trị quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của SXHD.
Tuy nhiên, các nghiên cứu về vai trò của hai protein MBL, Ficolin-2 và các
gen MBL2 và FCN2 mã hóa cho hai protein này ở bệnh nhân mắc SXHD cịn
khá hạn chế và hồn tồn mới trên quần thể người Việt. Từ những cơ sở lý
luận và thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tính đa hình gen
MBL2, FCN2 và nồng độ protein MBL, Ficolin-2 ở bệnh nhân sốt xuất huyết
Dengue” với hai mục tiêu:
1. Xác định tính đa hình các gen MBL2, FCN2 và định lượng nồng độ
protein MBL, Ficolin-2 ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue.
2. Phân tích mối liên quan giữa tính đa hình các gen MBL2, FCN2,
nồng độ protein MBL, Ficolin-2 với mức độ bệnh và một số biểu hiện lâm
sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue.


TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Dịch tễ học bệnh sốt xuất huyết Dengue
1.1.1. Tình hình sốt xuất huyết Dengue trên thế giới

Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là bệnh do virus lây lan mạnh trên toàn
cầu do muỗi Aedes truyền bệnh. Dịch SXHD lần đầu tiên được khẳng định và
ghi lại ở Philippines vào năm 1953 - 1954 và ở Thái Lan năm 1958 . Từ đó,
SXHD ảnh hưởng đến hầu hết các nước ở khu vực Châu Á, Châu Mỹ La Tinh và
trở thành nguyên nhân hàng đầu dẫn đến nhập viện, tử vong ở các khu vực này.
Trong 50 năm qua, tỷ lệ bị bệnh tăng gấp 30 lần, cùng với sự mở rộng về mặt địa
lý đến các nước mới, từ thành thị tới nơng thơn .

Hình 1.1: Phân bố tình hình SXHD trên thế giới giai đoạn 2010- 2016
* Nguồn: theo Cucunawangsih và cs (2017)

Hiện nay, Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, xấp xỉ 3,9 tỷ người
đang sống trong vùng dịch sốt xuất huyết và có khoảng 390 triệu ca nhiễm
virus Dengue với khoảng 96 triệu ca có biểu hiện lâm sàng hàng năm. Có
khoảng 2,6 tỷ người (trên 70%) có nguy cơ nhiễm SXHD sống ở khu vực Đông
Nam Á và tây Thái Bình Dương, riêng khu vực này chiếm gần 70% gánh nặng
toàn cầu do SXHD gây ra .


1.1.2. Tình hình SXHD ở Việt Nam
Mùa hè 1958, lần đầu tiên xuất hiện một dịch nhỏ SXHD tại Hà Nội
trên một số bệnh nhân tại Bệnh viện Bạch Mai. Vào năm 1960, một vụ dịch
Dengue cổ điển rất lớn bùng ra ở miền Bắc, bắt đầu từ Hà Nội và lan ra 29
tỉnh thành miền Bắc. Những năm sau đó dịch phát tán ra nhiều vùng khác
nhau trong cả nước, xu hướng tăng dần từ năm 1977, 1979, 1980, 1983, 1987
với tổng số bệnh nhân lớn dần lần lượt là 40.544, 63.976, 95.146, 149.519 và
130.000, cùng với đó tỷ lệ mắc trên 10 vạn dân cũng tăng dần. Năm 1983 là
năm có số ca mắc cao nhất với 260 bệnh nhân trên 10 vạn dân. Từ 1988 1998, SXHD tiếp tục gây ra những vụ dịch lớn với số ca mắc/tử vong vào các
năm 1988 (72.600/710), năm 1991 (92.122/347), năm 1995 (80.447/222),
năm 1997 (107.188/226) và tăng đột biến vào năm 1998 (146,155/277) .

Năm 2018, cả nước có 126.682 số ca mắc với 17 ca tử vong. Năm
2019, số ca mắc tăng 2,5 lần và số ca tử vong tăng 3 lần với 320.702 trường
hợp mắc SXHD và 54 trường hợp tử vong. Trên thực tế, số ca mắc và tử vong
có thể cịn cao hơn nhiều .

Hình 1.2: Số ca sốt xuất huyết Dengue nhập viện và tử vong theo tuần năm 2018
và 2019
* Nguồn: theo WHO (2020)


Ở Việt Nam, SXHD phân bố không đều. Theo báo cáo của cục y tế dự
phòng, số ca mắc SXHD tích lũy tới tuần 37 năm 2020 tập trung chủ yếu ở
khu vực phía Nam với 57%, thấp hơn ở miền Trung với 33% và khá ít ở khu
vực Tây nguyên và miền Bắc chiếm lần lượt 6% và 5% .
1.2. Cơ chế bệnh sinh của sốt xuất huyết Dengue
Cho đến nay, cơ chế bệnh sinh của sốt xuất huyết Dengue còn nhiều
điểm chưa rõ ràng. Dựa vào hai học thuyết được được công nhận nhiều nhất
là thuyết độc lực virus và thuyết miễn dịch tăng cường và các nghiên cứu gần
đây, cơ chế bệnh sinh của sốt xuất huyết Dengue có thể được tóm tắt thơng
qua vai trị của các yếu tố tham gia như sau:

Hình 1.3: Cơ chế bệnh sinh của sốt xuất huyết Dengue
*Nguồn: theo Pang X. và cs (2017)

Vai trò của NS1 và kháng thể kháng NS1
NS1 là protein không cấu trúc của virus Dengue, được biểu hiện ở
nhiều dạng oligomer khác nhau gắn ở nhiều vị trí của tế bào: trong màng tế


bào, bề mặt tế bào và hòa tan trong dịch ngoại bào . Trong quá trình nhiễm

virus Dengue, protein NS1 được tiết mạnh vào huyết thanh của bệnh nhân,
nồng độ NS1 tương quan với mức độ nghiêm trọng của bệnh và góp phần vào
cơ chế bệnh sinh của SXHD ở vật chủ , . Thật vậy, DENV-NS1 có thể liên kết
trực tiếp với bề mặt của tế bào chủ để gây tổn thương mô . Một nghiên cứu
gần đây đã chứng minh DENV-NS1 kích thích sản xuất cytokine gây viêm
bằng cách kích hoạt các đại thực bào và tế bào đơn nhân trong máu ngoại vi
của con người (PBMCs) thông qua thụ thể Toll-like 4 (TLR4), do đó dẫn đến
sự phá vỡ tính tồn vẹn đơn lớp tế bào nội mơ mạch máu . Hơn nữa, DENVNS1 cũng kích hoạt hoạt hóa bổ thể, gây thốt huyết tương. Trong q trình
này, DENV-NS1 hịa tan được giải phóng từ các tế bào bị nhiễm và trực tiếp
hoạt hóa bổ thể trong máu. Một mối tương quan chặt chẽ đã được tìm thấy
giữa nồng độ DENV-NS1 và sự hình thành phức hợp C5b-C9. Phức hợp C5bC9 có thể kích thích sự biểu hiện mạnh mẽ của các cytokine gây viêm dẫn đến
tiến triển bệnh sốt xuất huyết Dengue . Gần đây, DENV-NS1 được chứng
minh có thể tạo ra chế độ tự chuyển hóa trong dịng tế bào nội mơ người
(HMEC-1) cũng như trên chuột từ đó làm rối loạn chức năng tế bào nội mơ .
Ngồi protein NS1, các kháng thể kháng NS1 cũng góp phần quan
trọng vào cơ chế bệnh sinh của SXHD. Sự kết hợp giữa kháng thể kháng NS1
với protein GPI-NS1 trên màng tế bào có thể kích hoạt tín hiệu tế bào dẫn đến
phosphoryl hóa tyrosine làm tăng cường sao chép DENV trong tế bào bị
nhiễm . Quá trình phosphoryl hóa protein và kích hoạt NF-κB đã được quan
sát thấy sau khi kích thích các tế bào HMEC-1 bằng các kháng thể kháng
DENV-NS1. Hơn nữa,biểu hiện một số cytokine và chemokine, như IL-6, IL8, và MCP-1 tăng lên sau khi tế bào nội mơ được kích thích bởi kháng thể
kháng DENV-NS1 . Rối loạn giải phóng cytokine được coi là yếu tố chính
trong cơ chế bệnh sinh của SXHD. Do đó, kích hoạt đáp ứng miễn dịch qua


trung gian kháng thể kháng NS1 có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự
tiến triển của giảm tiểu cầu và tăng tính thấm thành mạch. Sự khởi phát của
các rối loạn tự miễn dịch do kháng thể kháng NS1 cũng đã được mơ tả là một
yếu tố góp phần vào cơ chế bệnh sinh SXHD. DENV-NS1có sự tương đồng
về trình tự với một số tự kháng nguyên, như plasminogen, các protein trên các

tế bào nội mô và tiểu cầu, các tự kháng thể do NS1 kích thích tạo ra có thể
phản ứng chéo với các tự kháng nguyên này , . Những phản ứng này kích
thích tổng hợp oxit nitric (NO) và quá trình chết theo chu trình của các tế bào
nội mô mạch máu. Tổn thương tế bào nội mơ và tiểu cầu có thể góp phần gây
giảm tiểu cầu, rối loạn đơng máu và tăng tính thấm thành mạch trong SXHD .
Vai trò của bộ gen virus
Sự khác biệt về mặt di truyền giữa các chủng virus Dengue có liên quan
đến độc lực virus từ đó dẫn tới sự khác biệt về mức độ nghiêm trọng của
bệnh. Một số chủng virus Dengue có độc lực và khả năng gây dịch lớn hơn
những chủng khác. Bên cạnh sự khác biệt trong bộ gen giữa các chủng, các
đoạn ARN của virus (subgenomic flavivirus RNA-sfRNA) có thể đóng một
vai trị nhất định trong qua trình nhân lên của virus trong tế bào chủ, do đó
góp phần gây bệnh SXHD. Trong quá trình sao chép DENV, đoạn ARN 11 kb
của virus có thể bị thối hóa khơng hồn tồn từ vùng 3’UTR bởi
exoribonuclease của vật chủ để tạo ra các ARN nhỏ 0,3 đến 0,5 kb được gọi là
sfRNA , . sfRNA có thể tích tụ trong các tế bào bị nhiễm để ngăn chặn các
phản ứng miễn dịch kháng virus của vật chủ, như tín hiệu interferon , . sfRNA
cũng có thể tạo điều kiện thuận lợi cho việc sao chép virus thơng qua việc
thay đổi tính ổn định của mARN tế bào bị nhiễm, do đó sfRNA đóng vai trò
nhất định trong trốn tránh miễn dịch của virus Dengue và cơ chế bệnh sinh
SXHD , .
Vai trò của kháng thể


Bằng chứng dịch tễ học đã chỉ ra rằng nguy cơ mắc SXHD tăng lên có
liên quan đến nhiễm trùng thứ phát một chủng virus khác với chủng gây
nhiễm nguyên phát . Nguy cơ phát triển SXHD trong lần nhiễm trùng thứ phát
cao hơn ít nhất 10 lần so với nguy cơ phát triển tình trạng này trong lần nhiễm
trùng nguyên phát . Tỷ lệ này là do các kháng thể gây ra từ lần nhiễm trùng
nguyên phát được gọi là hiện tượng tăng cường phụ thuộc kháng thể

(Antibody-dependent enhancement –ADE). Các kháng thể kháng virus
Dengue khơng những khơng có hoạt tính trung hịa virus để loại trừ virus mà
cịn tạo thành phức hợp virion-kháng thể. Mặt khác, các kháng thể có bản chất
là IgG có phần Fc gắn được vào thụ thể Fc gamma (FcγR) trên các tế bào
đích. FcγR là một phức hợp đa tiểu đơn vị được phân bố trên bề mặt của
nhiều loại tế bào miễn dịch, như tế bào đuôi gai, đại thực bào và tế bào
mGOT, và nhận biết vùng Fc của các globulin miễn dịch. Sự hấp thu phức
hợp virion-kháng thể qua trung gian của thụ thể Fcγ (FcγR) vào các tế bào
này có thể gây ra tăng lan tràn virus . Do đó, trong q trình nhiễm virus
Dengue, các phức hợp này có thể nhanh chóng xâm nhập vào các tế bào mang
FcγR thông qua tương tác với FcγR, dẫn đến số lượng tế bào bị nhiễm cao
hơn khi có mặt so với khi khơng có kháng thể từ lần nhiễm ngun phát . Hơn
nữa, các nghiên cứu trước đây cũng đã chỉ ra rằng: nhiễm DENV qua trung
gian FcγR có thể tăng cường sự tái sinh của virus thông qua việc ức chế các
đáp ứng miễn dịch nội bào kháng virus, bao gồm các đáp ứng kháng virus qua
trung gian interferon và tăng cường sản xuất IL-10 trong các tế bào bị nhiễm
virus Dengue. Việc ngăn chặn các phản ứng miễn dịch của cơ thể có thể thúc
đẩy việc sản sinh ra số lượng lớn các virion lây nhiễm.
Ngoài việc tăng cường sự lan tràn virus Dengue, hiện tượng tăng cường
phụ thuộc kháng thể qua trung gian FcγR trực tiếp kích thích tiết các cytokine


từ các tế bào mast và các tế bào miễn dịch khác từ đó làm rối loạn chức năng
tế bào nội mơ mạch máu và tăng tính thấm thành mạch.
Vai trò của lympho T
Sự gia tăng sản xuất cytokine và hoạt hóa tế bào TCD8+ đã được quan
sát thấy ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue nặng đã chỉ ra vai trò của các tế
bào T phản ứng chéo trong cơ chế bệnh sinh của SXHD . Tế bào T có trí nhớ
miễn dịch từ lần lây nhiễm ngun phát đã được kích hoạt bởi một chủng
virus Dengue khác trong lần lây nhiễm thứ hai. Tuy nhiên, đặc tính phản ứng

chéo cao và ái lực thấp dẫn đến việc tiêu diệt tế bào bị nhiễm bệnh và loại bỏ
kiểu huyết thanh vi rút mới nhiễm bệnh của các tế bào này không hiệu quả.
Ngược lại, tế bào T phản ứng chéo cịn góp phần tăng nguy cơ gây ra SXHD.
Các tế bào này sau khi bị kích hoạt bởi chủng Dengue nhiễm thứ phát sẽ tăng
cường sản xuất các cytokin và chemokine như IFN-γ, IL-2 và TNF-α từ đó
làm tăng mức độ trầm trọng SXHD , . Hơn nữa, quá trình tự chết của tế bào T
ở bệnh nhân SXHD gópphần vào tăng mức độ nghiêm trọng của SXHD , .
Nồng độ IL-10 tăng cao trong huyết thanh của bệnh nhân sốt xuất huyết nặng
làm tăng cường chết theo chu trình của các tế bào lympho T từ đó làm giảm
sự thanh thải virus và làm giảm đáp ứng kháng virus, dẫn đến các biểu hiện
nghiêm trọng trên lâm sàng.
1.3. Hệ thống bổ thể
1.3.1. Hệ thống bổ thể
Miễn dịch tự nhiên hay miễn dịch bẩm sinh (natural immunity hay
innate immunity), cịn gọi là miễn dịch khơng đặc hiệu (non specific
immunity), là khả năng tự bảo vệ sẵn có và mang tính di truyền trong các cơ
thể cùng lồi . Miễn dịch tự nhiên khơng để lại trí nhớ, khá ổn định, ít bị sai
sót. Điểm đặc biệt là hệ miễn dịch bẩm sinh có tính chất di truyền, khác nhau


giữa các loài và các cá thể trong cùng một lồi. Các yếu tố thuộc miễn dịch
khơng đặc hiệu là phương tiện chung dùng để chống lại sự xâm nhập các các
vi sinh gây bệnh khơng phân biệt đó là vi khuẩn hay ký sinh trùng hoặc virus.
Có nhiều chất, phân tử trong các mô, các dịch của cơ thể tham gia vào quá
trình đáp ứng miễn dịch tự nhiên, trong đó, hệ thống bổ thể đóng vai trị quan
trọng hơn cả.
Bổ thể được phát hiện bởi Jules Bordet và Paul Ehrlich vào cuối thế kỷ
XIX. Trong những năm sau đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện
ra rằng sự hoạt động của bổ thể là kết quả của sự tương tác giữa một nhóm
phức hệ các glycoprotein. Hầu hết các thành phần của bổ thể được tổng hợp ở

gan bởi các tế bào gan, mặc dù một số cũng được sản xuất bởi các loại tế bào
khác như: bạch cầu đơn nhân, đại thực bào mô, fibroblasts và các tế bào biểu
mơ của đường tiêu hóa và đường sinh dục , .
Bổ thể hoạt động không có tính chất đặc hiệu lồi, bổ thể của bất cứ
lồi động vật nào cũng có khả năng làm tan vi khuẩn sau khi ngưng kết với
kháng thể của loài khác. Bất cứ tế bào nào sau khi bị kháng thể làm ngưng kết
cũng có thể bị tan do bổ thể, do đó bổ thể được xếp vào miễn dịch khơng đặc
hiệu. Tuy nhiên hoạt tính của bổ thể là khác nhau giữa các loài như cao nhất ở
chuột lang, trung bình ở người và chó, thấp nhất ở chuột nhắt và thỏ .
*Hệ thống bổ thể bao gồm các nhóm sau:
- Những protein thành phần của bổ thể được đánh số từ C1 đến C9 theo
trình tự mà chúng tham gia phản ứng (trừ C4 là ký hiệu theo trình tự phát hiện
bổ thể). Trong suốt quá trình hoạt hóa, một vài thành phần cấu trúc bổ thể
được phân tách làm 2 phần. Phần lớn hơn của phân tử được gọi là b (binding)
thường gắn kết với mầm bệnh, trong khi phần nhỏ hơn gọi là a (activated) có
thể phân tán đi (trừ C2: phần lớn là C2a và phần nhỏ là C2b, vì vậy ngày nay


để tránh nhầm lẫn, một số tài liệu ký hiệu phần lớn là C2b và phần nhỏ là
C2a).
- Các yếu tố: B, H, I, P (properdin), MBL, MASP-1, MASP-2 (MBL
Assosiated Serine Protease)
- Yếu tố điều hòa: C1 Inhibitor (C1-INH=Serpin), C4-Binding protein
(C4-PB), yếu tố tăng cường thoái biến (Decay Accellerating factor), thụ thể 1
(CR1); Protein-S (vitronectin) .
*Các con đường hoạt hóa bổ thể
Sự hoạt hóa bổ thể theo phản ứng dây truyền và theo một trật tự nhất
định. Một bổ thể sau khi hoạt hóa lại có khả năng kích thích sự hoạt hóa của
bổ thể tiếp theo. Có 3 con đường hoạt hóa bổ thể là: con đường cổ điển
(classical pathway), con đường lectin (lectin pathway), cuối cùng là con

đường nhánh (Alternative pathway) .
Con đường cổ điển có thể được bắt đầu bằng sự liên kết của C1q
(protein đầu tiên trong hệ thống bổ thể) trực tiếp lên bề mặt mầm bệnh. Nó
cũng có thể được kích hoạt trong phản ứng miễn dịch đáp ứng bằng cách gắn
C1q với kháng thể. Con đường lectin được bắt đầu bằng cách liên kết của với
carbohydrates chứa mannose trên bền mặt của vi khuẩn hoặc virus. Cuối cùng
là cịn đường nhánh có thể được khởi động khi một thành phần bổ thể được
kích hoạt tự phát liên kết với bề mặt của mầm bệnh. Mỗi con đường theo một
chuỗi các phản ứng khác nhau nhưng cuối cùng để tạo ra một protease gọi là
C3 convertase (có khả năng phân tách phân tử C3 thành hai mảnh là C3a và
C3b). Protease hoạt động được giữ lại ở bề mặt mầm bệnh và điều này đảm
bảo rằng zymogen bổ sung tiếp theo trong con đường cũng được phân cắt và
kích hoạt. Ngược lại, đoạn peptide nhỏ được giải phóng khỏi vị trí phản ứng
có thể đóng vai trị trung gian hịa tan , .


Hình 1.4: Các con đường hoạt hóa bổ thể.
*Nguồn: theo Company W. và cs (2013)

*Vai trò của hệ thống bổ thể:
-Hoạt tính làm tan tế bào: phức hợp tấn cơng màng MAC (membrane
attack complex) chọc thủng màng tế bào, tạo các lỗ trên màng làm tan tế bào,
gây chết tế bào.
-Tham gia cơ chế opsonin hóa: làm cho việc thực bào dễ dàng hơn.
-Tăng cường đáp ứng viêm: các độc tố phản vệ có tác dụng co bóp cơ
trơn, tăng tính thấm thành mạch giúp cho sự thốt mạch, kích thích tế bào
Mast giải phóng các chất trung gian gây viêm như histamin.
-Tính hóa hướng động: có khả năng thu hút các tế bào thực bào .