(TIỂU LUẬN) trình bày pp sx 1 loại enz ứng dụng của enz đó trong CNTP

Trình bày pp sx 1 loại enz & ứng dụng của enz đó trong CNTP (khơng q 25
trang)
quy trình sản xuất
ứng dụng trong (sp nào)
(vd như trong quy trình A  B  C  D thì enz được ứng dụng trong cơng đoạn nào)

-

vai trị
cơ chế
hệ quả


I.ĐẶT VẤN ĐỀ
Ở Viêt Nam cây trồng nơng nghiệp chính là lúa (Oryza sativa) thuộc họ cây thân thảo
(Graminae) cũng là một loại cây lương thực quan trọng đối với hơn 1/2 dân số thế giới và
được trồng phổ biến nhiều ở vùng đồng bằng sơng Cửu Long vì tiềm lực ý nghĩa kinh tế lớn.

với gian sinh trưởng trung bình từ 75-250 ngày tùy theo chủng loại. Ở nước ta thì phân
ra thành hai loại đó là lúa nếp và lúa tẻ. Việt Nam là nước xuất khẩu lúa đứng hàng thứ
hai trên thế giới.
Ngày nay, cùng với sự phát triển vượt bật của khoa học công nghệ, các chế phẩm enzyme
được sản xuất ngày càng nhiều và được áp dụng hầu hết trong nhiều lĩnh vực như: công
nghiệp thực phẩm, chăn nuôi, y dược và phục vụ cho việc dưỡng nhan của đa số phái đẹp
trên thế giới. Một trong số đó phải kể đến enzyme amylase bởi lợi ích mà amylase mang
lại trong ngành thực phẩm.
………………………………………………………………………………………..
Vì vậy, đề tài “Tìm hiểu q trình trích ly enzyme amylase từ mầm lúa (Oryza sativa) ”
được thực hiện nhằm xác định một số hoạt tính và cũng như điều kiện trích ly mầm lúa
thu nhận enzyme amylase. Qua đó, giúp mở rộng hơn nhiều hướng đi mới, góp phần
làm gia tăng tiềm lực kinh tế cây lúa nói chung và nâng cao chất lượng nơng sản Việt

Nam nói riêng.
II.GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA
2.1 Giới thiệu về cây lúa (Oryza sativa L)
Cây lúa là loại lương thực vô cùng phổ biến và giữ vai trò quan trọng trong đời sống
con người Việt Nam. Nó gắn bó với người dân ta từ lâu đời, là thực phẩm quan trọng
không thể thiếu trong bữa ăn hằng ngày và cũng là cây lương thực xuất khẩu hàng
đầu của nước nhà..............................................

2.2 Cấu trúc hạt lúa
Vỏ trấu: bao gồm hợp chất cellulose và silic cấu tạo thành thường rất cứng với mục
đích bảo vệ hạt chống sự phá hoại của côn trùng sâu bọ hay các mầm bệnh khác và điều
kiện thời tiết bất lợi. Màu sắc vỏ trấu (vàng nhạt -> vàng nâu) sẽ có thay đổi theo mỗi
giống lúa.
Vỏ hạt: ở trong cùng là nội biểu bì đến tầng trung quả và lớp bên ngồi là lớp biểu bì,
vỏ hạt có màu đỏ và trắng đục và bọc xung quanh hạt.
Nội nhũ: trong hạt lúa đây là phần chiếm lớn nhất, chủ yếu là glucid 90%,
protein, vitamin...
Phơi: có chứa một tử diệp nằm ở góc hạt và được ép sát vào bên trong nội nhũ cũng là
cơ quan để biến đổi các chất được dự trữ trong nội nhũ thành các chất dinh dưỡng nhằm
cung cấp cho sự phát triển của cây mầm. Phơi hạt có protein, lipid, vitamin, đường hay
các enzyme khác.
Màng lúa: chiều cao khoảng 1/3 vỏ hạt. Tùy vào giống lúa cũng như là điều kiện canh tác
mà độ dài của màng lúa sẽ có sự khác nhau. Vỏ trấu hồng hơn so với màng lúa thì lại có
màu vàng nhạt.
2.3 Thành phần dinh dưỡng
Tùy theo điều kiện canh tác, giống lúa hay điều kiện đất đai mà thành phần dinh
dưỡng của hạt lúa sẽ khác nhau.


Bảng Thành phần dinh dưỡng của hạt lúa

Thành phần dinh
dưỡng
Protein
Tinh bột
Lipid ( tổng số)
(Nguồn Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Nước: ở trong hạt thóc nước vừa ở dạng tự do vừa ở dạng liên kết. Chất lượng của hạt
lúa phụ thuộc vào lượng nước và lượng nước sẽ càng giảm đối với hạt lúa càng già.
Protein: chiếm 8-9%. Lượng protein bị biến tính và thối hóa dần trong lúc bảo quản.
Khi kết hợp với nước, protein sẽ trương nở và thành thể keo.
Lipid: chiếm 2% hàm lượng trong hạt.
Glucid: amylose và amylopectin là hai thành phần chính có trong tinh bột.Tùy thc vào
giống lúa mà amylose và anylopectin sẽ có sự thay đổi. Gạo tẻ khoảng 19,5% amylose
và 81,5% amylopectin; nếp khoảng 0,7% amylose và amylopectin là 99,3%. Cellulose và
hemicellulose chủ yếu ở trong vỏ trấu và vỏ hạt, là những polysaccharide khơng thể tiêu
hóa được.
Vitamin: carotenoid, B6, PP, B1, B2, H, C, E.
Amino acid: là những sản phẩm trung gian dùng để tổng hợp hoặc thủy phân protein.
Enzym: là các enzym amylase: enzym oxy hóa khử, a-amylase và β-amylase , protease và
một số khác.
Trong quá trình nảy mầm các enzym hoạt động mạnh và tăng cao thúc đẩy cho các phản
ứng sinh-lý-hóa với nhau và sinh tổng hợp các loại enzym. Các quá trình gần giống ở
đại mạch, chỉ khác mức độ tạo thành enzym cũng như tốc độ phản ứng.
III. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME AMYLASE
3.1 Định nghĩa
Amylase là một nhóm thuộc các enzyme tiêu hố thuỷ phân các liên kết glycosidic của tinh
bột thành glucose, maltos và dextrin hạn chế. Nhiều enzyme hoạt động trên tinh bột hoặc
trên các oligosaccharise có nguồn gốc từ chúng, dưới sự xúc tác và phân giải các liên kết
glucoside nội phân tử trong các polysaccharide có sự tham gia của nước. Ở trong nước bọt

của người có loại enzyme amylase và được gọi là ptyalin nhưng ở một số lồi động vật có
vú khác như chó, mèo, ngựa thì lại khơng có sự hiện diện của amylase . Ptyalin bắt đầu thuỷ
phân tinh bột từ vùng miệng và quá trình này sẽ được ruột non hồn tất nhờ amylase ở tuyến
tuỵ và cịn gọi là amylopsin. Amylase của malt sẽ thủy phân tinh


bột lúa mạch để tạo thành disaccharide làm cơ chất của quá trình lên men bởi các nấm
men.
Để cải thiện năng suất tiềm năng của enzyme amylase, bộ gen sinh vật phải đổi theo hai
cách khác nhau: một là cải thiện dịng cổ điển bằng cách đột biến và có sự chọn lọc, hai
là sử dụng enzyme amylase tái tổ hợp được tạo bởi các vi sinh vật sử dụng trong quá
trình lên men chìm và lên men ở trạng thái rắn.
Enzyme amylase có các ứng dụng tiềm năng và đa dạng chiếm khoảng 30% sản lượng
enzyme trên thế giới. Một cuộc khảo sát toàn diện các tài liệu về α-amylase, ß-amylase
và γ-amylase, cấu trúc của chúng, các đặc điểm chính, các nguồn gốc khác nhau như thực
vật, nấm, động vật và vi sinh vật cũng như các khía cạnh sản xuất khác nhau: lên men,
bánh mì, dệt, giấy và dược phẩm, các amylase từ nấm cịn có thể sử dụng rộng rãi cho
các ứng dụng thương mại hay trong các ngành công nghiệp chế biến thực phẩm và trong
việc làm rõ khói mù trong nước trái cây, đồ uống có cồn, sản xuất xi-rơ glucose và
maltose, các sản phẩm thực phẩm khác, bên cạnh đó ứng dụng khá quan trọng nhất của
amylase là trong công nghiệp tinh bột và sản xuất đường từ tinh bột.
3.2 Phân loại enzyme amylase
Amylase có sáu loại trong đó có ba loại phổ biến: α-amylase, γ-amylase và βamylase, dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase và oligodextrin6-glucanhydrolase (hay dextrinase).
Amylase này chia thành hai nhóm: endoamylase (enzyme nội bào) hoạt động trên phần
bên trong của phân tử cơ chất, và exoamylase (enzyme ngoại bào) thì ngược lại hoạt động
trên các đầu tận cùng và khơng có tính khử. Do đó, gốc glucose ở đầu tận cùng và các
liên kết α-1, 6 không thể bị phân cắt bởi α- amylase.
Endoamylase: α-amylase và các nhóm enzyme khử nhánh. Có hai loại thuộc nhóm
enzyme khử nhánh là nhánh khử trực tiếp (pullulanase hay α-dextrin 6gluccanohydrolase), nhánh khử gián tiếp (amylo-1,6-glucosidase và transglucosylase
(hay oligo-1,6-glucosidase)). Các loại enzyme trên thủy phân các liên kết ở bên trong

của chuỗi polysaccharide.
Exonuclease: β-amylase và γ-amylase. Đó là những loại enzyme thủy phân tinh bột
từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.
Vẽ sơ đồ AMYLASE
Ở nguồn khác nhau thì đặc tính thủy phân, thành phần, nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu và
tính chất ổn định với nhiệt cũng khác nhau. Amylase dễ tan trong nước và các dung dịch
hay rượu lỗng. Protein của α-amylase có tính chất của globulin và acid yếu. Có điểm
đẳng điện thường nằm trong vùng có độ pH 4,2 – 5,7.
3.3 Đặc tính và cơ chế hoạt động của enzyme amylase
3.3.1 α-amylase
α -amylase là một enzyme hydrolase xúc tác cho quá trình thuỷ phân các liên kết α -1, 4glycosidic của cơ chất trong tinh bột một cách ngẫu nhiên tạo ra glucose và maltose và là


endoenzym (enzym nội bào). Như là một canxi metalloenzyme, tức là phụ thuộc vào sự
hiện diện của một yếu tố đồng kim loại cho hoạt động của nó.
Bên cạnh α -amylase có khả năng phân hủy hồ tinh bột và cả khả năng phân hủy hạt
tinh bột nguyên vẹn.
α-amylase hiện tại là enzym có tầm quan trọng và thiết yếu do hoạt động thủy phân tinh
bột của nó và các hoạt động đó được thực hiện nhờ q trình thủy phân. Một trong
những hoạt động như vậy là sản xuất xi-rô glucose và fructose từ tinh bột (α-amylase xúc
tác là bước đầu tiên trong quá trình này)
Trước đây, tinh bột được thủy phân thành glucozơ bằng phương pháp thủy phân bằng
axit. Tuy nhiên có những hạn chế về điều kiện nhiệt độ cao và hoạt động có tính axit cao.
Những hạn chế này được khắc phục bằng cách thủy phân tinh bột bằng enzyme để thu
được xi-rô fructose cao. Enzyme an tồn với mơi trường và tăng cường khả năng tẩy rửa
để loại bỏ các vết bẩn khó giặt. Chúng có thể phân hủy sinh học và hoạt động ở điều
kiện nhẹ hơn so với chất xúc tác hóa học và do đó được ưa chuộng hơn chất xúc tác sau
này. α-amylase có nhiều ứng dụng vào ngành cơng nghiệp Việt nam và đó cũng chính là
động lực thúc đẩy cho việc nghiên cứu sản xuất enzyme này một cách tối ưu bởi tính an
tồn và tiện lợi.

Đặc tính:
Trọng lượng phân tử của α -amylase malt là 59.0OdkDa.
Điểm đảng điện trong vùng pH 4,2-5,7
-

Dễ tan trong nước, các dung dịch muối và rượu lỗng.

-

Protein của các amylase này có tính chất của globuline và có tính acid yếu.

- Mỗi phân tử α-amylase đều chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng khơng ít hơn 16 ngun tử gam/mol. Ca góp phần tạo nên sự ổn định và hình thành cấu trúc bậc 3 của
enzym. Khi bị tác động bởi các enzym phân giải protein và tác nhân gây biến tính khác,
Ca cịn có cơng dụng duy trì sự tồn tại cho enzyme. Trường hợp Ca bị loại ra khỏi phân
tử α-amylase thì nó sẽ hồn tồn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. Các amylase
khác chịu nhiệt kém hơn so với α-amylase. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng
Ca trong phân tử.
Kim loại nặng như Cu : Ag, Hg... đều có thể kìm hãm tất cả amylase.
- Tùy vào các nguồn khác nhau mà khả năng hoạt động và điều kiện hoạt động của aamylase là khác nhau.
Ví dụ: pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ đại mạch nảy mầm và thóc nảy mầm
là 5,3 (hoạt động tốt có thể trong khoảng pH 4,7-5,4). Cũng như độ bền của α -amylase
nấm mốc tốt hơn so với acid của α-amylase malt. Từ đó có thể thấy rằng pH tối thích
của α -amylase từ vi sinh vật khác so với của α -amylase từ malt.


- Tuy nhiên pH và nhiệt độ là hai yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của α -amylase
Ví dụ: Ở điều kiệu nhiệt độ là 0°C và pH=3,6, thì a-amylase của malt bị mất hoạt tính
hồn tồn. Tuy nhiên khi ở nhiệt độ 58-60°C thì a-amylase của mầm thóc và malt hoạt
động tốt nhất. Chính vì thế người ta thường đường hóa cơ chất bằng malt trong
khoảng nhiệt độ từ 60-65°C để sản xuất rượu.

Bảng độ bền với nhiệt của α-amylase từ malt
Nhiệt độ
(0C)
65
70
75

Cơ chế: hình cơ chế tác động của a-amylase lên tinh bột ( Nguyễn Đức Lượng t156)
α-amylase trong quá trình thủy phân tinh bột bao gồm nhiều giai đoạn:
- Trong tinh bột, enzym này sẽ phân cắt một số liên kết và tạo ra một lượng lớn dextrin
(phân tử thấp), các dextrin này tiếp tục bị thủy phân cho ra maltose và glucose.
-

Amylose bị phân cắt thành các polyglucose (6-7 gốc glucose) dưới tác dụng của aamylase, sau đó các polyglucose (6-7 gốc glucose) này tiếp tục được phân cắt thành
chuỗi ngắn dần và tạo thành maltose, maltotriose, maltotetrose. Nếu thời gian tác
dụng dài hơn,


thì amylose sẽ là 13% glucose và 87% maltose cũng là sản phẩm của quá trình thủy
phân này.
Tương tự khi cho a-amylase tác dụng lên trên amylopectin và sản phẩm được tạo là 19%
glucose, 72% maltose, bên cạnh cịn có dextrin (phân tử thấp) và 8% isomaltose lí do là
a-amylase không cắt được liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin.
Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của a-amylase:
+ Giai đoạn dextrin hóa:
Sơ đồ 156
α -amylase có khả năng dextrin hóa khá cao nên có thể gọi α-amylase là: amylase dịch
hóa hoặc amylase dextrin hóa.
3.3.2 β-amylase

β-amylase là một enzyme exohydrolase hoạt động từ đầu không nhân tạo bằng cách thủy
phân các liên kết α-1, 4-glucan trong tinh bột , polysaccharide và glucogen để tạo ra các
đơn vị maltose liên tiếp do sự xúc tác của b-amylase có cấu hình β. Vì nó khơng thể phân
cắt các liên kết nhánh trong polysaccharide phân nhánh như glycogen hoặc amylopectin,
nên sự thủy phân khơng hồn tồn và các đơn vị dextrin vẫn còn.
β-amylase hiện diện phổ biến ở thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hạt nảy mầm.
vd: hạt ngũ cốc nảy mầm.
- Ở ngũ cốc, b-amylase tham gia vào sự phân giải tinh bột trong quá trình nảy mầm
của hạt.

- Ở lúa, b-amylase được tổng hợp trong hạt suốt quá trình nảy mầm của hạt tuy nhiên
ở hạt khơ thì khơng được tổng hợp.
- Ở lúa mạch, trong hạt khơ enzym được tích lũy trong suốt quá trình phát triển của hạt,
chủ yếu là liên kết với tinh bột của hạt. Khi ở dạng liên kết, enzym này là một phân tử
có trọng lượng phân tử là 64kDa và khi bị phân cắt bởi một protease sẽ được phóng
thích dưới dạng tự do và có trọng lượng phân tử là 59kDa.
Maltose là nguyên nhân chính tạo ra vị ngọt của trái cây trong q trình chính vì được
β-Amylase phân giải tinh bột (pH tối ưu khoảng 4,0 đến 5,5).
β- Amylase được sử dụng cho các ứng dụng khác nhau trong nghiên cứu cũng như cơng
nghiệp. Nó có thể được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc của các phân tử tinh bột và glycogen
được sản xuất bằng nhiều phương pháp khác nhau. Trong cơng nghiệp, nó được


sử dụng để lên men, sản xuất bia và chưng cất. Ngồi ra cịn được sử dụng để sản xuất
xi-rơ có hàm lượng maltose cao.
Đặc tính:
-

Mầm lúa mạch có a-amylase và B-amylase.

-

B-amylase bền với acid nhưng chịu nhiệt kém hơn a-amylase.

B-amylase ở nhiệt độ 70°C bị bất hoạt (nhiệt độ hoạt động tối thích 55°C, pH 5,15,5).
- B-amylase khơng bền khi có Ca2+, b-amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, Hg2+,
urea, iodoacetamide, iodin, ozon...
- B-amylase là một albumin, tâm xúc tác có chứa nhóm –SH, nhóm -COOH và vịng
imidazol của các gốc histidine và là enzym ngoại bào (exoenzym).
Cơ chế:
b-amylase là một exoamylase (enzyme ngoại bào). Các nhánh ngoài cùng của cơ chất tiến
trình phân giải bắt đầu từ đầu khơng khử. B-amylase phân cắt các liên kết a-1,4 glucoside
nhưng khi gặp liên kết a-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết (a-1,6 glucoside thì nó sẽ
ngừng tác dụng. Phần polysaccharide cịn lại được gọi là B-dextrin là dextrin phân tử lớn
có chứa rất nhiều liên kết a-1,6 glucoside.
hình cơ chế tác động của B-amylase lên tinh bột ( Nguyễn Đức Lượng t159)
Tác dụng của B-amylase lên tinh bột như sau:
Tinh bột -> maltose (54-58%) + B-dextrin (42-46%)
(glucogen)
Tinh bột sẽ bị thủy phân đến 95% trong trường hợp cả a và b-amylase đều được
thuỷ phân đồng thời.
B-amylase trong quá trình thuỷ phân tinh bột:
-

B-amylase phân giải 100% amylose thành maltose.

-

B-amylase phân giải 54-58% amylopectin thành maltose.

- B-amylase phân huỷ rất mạnh hồ tinh bột và ngược lại không thủy phân các hạt tinh
bột nguyên vẹn.


3.3.3 γ-amylase (glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase)
γ-amylase phân cắt các liên kết glycosidic α (1-6), ngồi ra cịn phân cắt các liên kết
glycosidic tận cùng α (1-4) ở các đầu không nhân tạo của amylose và amylopectin,
không giống như các dạng amylase khác, nó tạo ra glucose.
γ-amylase hoạt động mạnh nhất trong mơi trường axit và có độ pH tối ưu là 3.
Tên gọi khác: a-1,4:1,6-glucan-4:6-glucohydrolase; glucoamylase; amyloglucosidase;
taka-amylase B; γ -amylase; maltulase,... glucoamylase là enzym ngoại bào.
Glucoamylase có khả năng thủy phân liên kết a-1,4 lẫn a-1,6 glucoside, ngồi ra cũng
có thể thủy phân các liên kết a-1,2 và a-1,3 glucoside.
Khi thủy phân liên kết a-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, sẽ lần lượt tách từng
phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose. Ở nhiệt độ 50°C
và pH 3,5-5,5 glucoamylase có hoạt lực cao nhất, kém bền trong rượu acetone và
không được bảo vệ bởi Ca2+ nhưng lại bền với acid hơn a-amylase.
Tinh bột, panose, glucogen, dextrin, isomaltose, maltose và amylopectin hoàn toàn bị
thuỷ phân bởi glucoamylase thành glucose mà khơng cần có sự góp mặt của khác enzyme
khác. Glucoamylase thủy giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so với các
chất có phân tử nhỏ. Các polysaccharide có nhánh như amylopectin, glucogen, B-dextrin
bị gluoamylase thủy phân khá nhanh.
d. Oligo-1,6-glucosidase hay dextrinage tới hạn
Trong isomaltose, panose và các dextrin tới hạn, Oligo-1,6-glucosidase sẽ thuỷ phân liên
kết a-1,6-glucoside thành đường có thể lên men được.
Hoạt động dextrinase mạnh nhất ở điều kiện tốt thích là 40°C và độ pH tối ưu là 5,1
Hệ dextrinase trong hạt ngũ cốc nảy mầm hoặc đại mạch, thóc nảy mầm có amylopectin 1,6-glucosidase hay R-enzym và dextrin-1,6-glucosidase hay amylo-1,6glucosidase hay
dextrin- 6-glucanhydrolase. Trong q trình thuỷ phân thì dịch thuỷ phân có nhiều
maltose vì các enzym này thủy phân dextrin triệt để hơn so với a và b-amylase.
3.4 Cơ chất của enzyme amylase

3.4.1 Tinh bột
Tinh bột trong thực vật được xem như chất dự trữ năng lượng quan trọng và có chủ yếu ở
các loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì,... trong các loại ngũ cốc, các loại hạt.
Tinh bột là một polysaccharide bao gồm hai loại: amylose và amylopectin. Amylose
chiếm 20-25% phân tử tinh bột là một chuỗi tuyến tính gồm các đơn vị glucose kết nối
với nhau bằng liên kết α-1, 4-glycosidic tạo thành một mạch xoăn dài không phân nhánh.
Amylopectin chiếm 75-80% tinh bột, đặc trưng bởi các chuỗi phân nhánh từ các đơn vị
glucose được liên kết bằng liên kết α- 1, 4-glycosidic và α-1, 6 glycosidic tạo thành mạch
có nhiều nhánh. Tùy vào nhiệt độ, nguồn gốc, điều kiện thuỷ phân mà thành phần dịch


thuỷ phân thu được sau khi thuỷ phân tinh bột sẽ có thay đổi và pH tối ưu cho hoạt động
được tìm thấy là 7,0.
Hiện tượng hồ tinh bột là khi tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn dịch
tinh bột được đun 60-85°C.
Sự phân cắt các liên kết glucoside làm xuất hiện hiện tượng tinh bột bị thủy phân bởi
tác động của enzyme amylase và xảy ra theo hai mức độ: dịch hóa và đường hóa. Sản
phẩm trung gian của sự dịch hóa này là dextrin và khi tiếp tục đường hóa thì sản phẩm
sẽ là maltose và glucose.
3.4.2 Đường (glycogen)
Là một loại carbohydrate được dự trữ ở trong cơ thể động vật chuyển hóa thành
năng lượng để phục vụ cho nhu cầu của cơ thể. Ở tế bào vi sinh vật và động vật,
amylase không thể thiếu vì giúp chuyển hóa glucid.
Ở người và động vật, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan và dễ tan trong nước, nếu
carbohydrate được nạp quá nhiều và cơ thể chúng ta thì sẽ chuyển hóa chúng thành
chất béo để dự trữ.
3.4 Phương pháp thu nhận enzyme amylase
Alpha-amylase, dạng amylase với các vị trí liên kết carbohydrate thứ cấp, là một loại
enzyme quan trọng trong suốt thời kỳ sinh trưởng và vịng đời của hạt kín. Trong lúa,
isozyme alpha-amylase rất quan trọng đối với sự hình thành của hạt tinh bột dự trữ trong

quá trình trưởng thành và thúc đẩy tinh bột dự trữ để nuôi dưỡng cây con đang phát triển
trong quá trình nảy mầm, điều này sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển và năng suất
của cây. Alpha-amylase vẫn chưa được nghiên cứu nhiều để hiểu về phân loại, cấu trúc,
đặc điểm biểu hiện và quy định biểu hiện của nó ở lúa và các cây trồng khác. Trong số 10
alpha-amylase của lúa, hầu hết được biểu hiện độc quyền trong phôi hạt đang phát triển
và gây ra trong quá trình nảy mầm của hạt. Trong quá trình nảy mầm của hạt lúa, sự biểu
hiện của các gen alpha-amylase được biết là được điều chỉnh tiêu cực bởi đường trong
phơi, tuy nhiên lại tích cực bởi gibberellin (GA) trong nội nhũ thông qua liên kết cạnh
tranh với vùng promoter cụ thể; bên cạnh đó, nó cịn được kiểm sốt bởi một loạt các yếu
tố phi sinh học hoặc sinh học khác, chẳng hạn như độ mặn.
Trong bài đánh giá này, chúng tôi đã giới thiệu tổng quan về tiến độ nghiên cứu của
alpha-amylase, tập trung vào sự nảy mầm của hạt và phản ánh về cách thức hoạt động
chuyên sâu có thể làm sáng tỏ quy định của nó và tạo điều kiện cho việc nhân giống
cây trồng như một dấu ấn sinh học hiệu quả.


1. Sự trưởng thành của hạt lúa và bảo quản tinh bột
Gạo là lương thực chính của hơn một nửa dân số thế giới (www.fao.org). Hạt gạo được
làm giàu với tinh bột, protein và lipid. Trong quá trình trưởng thành của hạt lúa, thụ tinh
kép tạo ra phôi lưỡng bội và nội nhũ tam bội nhiều tinh bột, phôi gồm trục phôi được bao
quanh bởi một lá mầm gọi là lá mầm. Mơ phân sinh đỉnh chồi phơi phân hóa ba ngày sau
khi thụ tinh (DAF) và nguyên sinh lá xuất hiện ở 5–8 DAF; trong khi đó, thành tế bào của
nội nhũ hình thành ở 3–4 DAF, quá trình phân hóa tế bào nội nhũ và q trình sinh sản
hoàn thành ở khoảng 6–10 DAF; các cơ quan của hạt to ra và trưởng thành ở 11–20 DAF
và nội nhũ tích lũy các chất dự trữ và sau đó hạt kích hoạt q trình hút ẩm ở khoảng 30
DAF (Hình 1A). Kết quả là chỉ có phơi và aleurone còn sống trong hạt đã trưởng thành
Hạt gạo hấp thụ khoảng 30% cacbohydrat của nó từ cacbohydrat khơng cấu trúc trong các
bẹ lá và thân trước khi nhóm được thay thế bằng cacbon đồng hóa quang sau nhóm [2,3].
Một mối quan hệ rõ ràng đã được tìm thấy giữa hoạt động của enzym alpha-amylase (EC
3.2.1.1) và hàm lượng tinh bột trong bẹ lá sau khi xử lý với hoạt tính phù hợp với mức độ

phân giải tinh bột [2]. Hoạt tính và biểu hiện alpha-amylase cao được phát hiện ở hạt
phấn có kích thích ở nhiệt độ cao [4].


Tinh bột tích tụ trong nội nhũ dưới dạng hai đồng phân d-glucose bao gồm amylose chỉ
có α-1,4-glucan mạch thẳng và amylopectin với các nhánh liên kết α-1,6 glucan [5,6].
Một số enzym tham gia vào quá trình tổng hợp tinh bột hạt gạo, bao gồm sucrose ADPglucose pyrophosphorylase, phosphoglumutase, tinh bột tổng hợp, enzym phân nhánh
tinh bột và enzym phân nhánh tinh bột. Tinh bột xuất hiện dưới dạng tinh bột hòa tan,
sucrose hoặc các dẫn xuất của sucrose như fructosyl-oligosaccharides (fructan), hoặc tinh
bột khơng hịa tan. Trong giai đoạn đầu của sự phát triển của hạt, tinh bột cacbohydrat
hòa tan trong nước có thể được lưu trữ [7]. Trong khi ở các lồi ngũ cốc nhiệt đới thiếu
enzym tích tụ fructan [8], sự tích tụ tinh bột xảy ra ở dạng hạt tinh bột khơng hịa tan. Hạt
tinh bột có bản chất trong suốt và có thể được phân loại là hạt tinh bột đơn giản hoặc
phức hợp. Hạt tinh bột được hình thành trong amyloplast, một bào quan có màng kép
liên kết với nhau tham gia vào quá trình tổng hợp và lưu trữ tinh bột [9]. Các hạt tinh bột
phức hợp được tập hợp bởi các hạt tinh bột nhỏ hơn thành các hạt 10–20 µm [10,11].


Tinh bột tích lũy trong hạt đang chín sẽ trang bị cho chúng những chất nền đủ để hạt
nảy mầm.
2. Sự nảy mầm của hạt
Sự nảy mầm của hạt là một quá trình quan trọng đảm bảo sự liên tục của sự sống ở thực
vật phụ thuộc vào nó như một phương thức nhân giống độc quyền [12]. Sự nảy mầm của
hạt giống hiệu quả sẽ dẫn đến sự phát triển của cây con mạnh mẽ và khỏe mạnh, với
những cây con có khả năng chống chọi với các áp lực sinh học hoặc phi sinh học và phát
triển thành cây trồng năng suất cao [13]. Sự nảy mầm của hạt (Hình 1B) địi hỏi các điều
kiện mơi trường thuận lợi, bao gồm nước, oxy và nhiệt độ [14], và sự kết hợp của nhiều
quá trình tế bào, chẳng hạn như tổng hợp, vận chuyển, tín hiệu, cảm nhận và thủy phân.
Sự nảy mầm bắt đầu bằng sự xâm nhập của nước và kết thúc bằng sự nhô ra của lớp xơ
mềm và lá mầm [12]. Sự xâm nhập hạt giống lúa là một quá trình ba pha với giai đoạn (I)

được đặc trưng bởi sự hấp thụ nước nhanh chóng và sửa chữa DNA (khoảng 0–24 giờ
sau khi xâm nhập, HAI) [15,16], tiếp theo là giai đoạn cố định (II) được đặc trưng bằng
cách tổng hợp ty thể [17] và dịch mã mRNA dự trữ (24–48 HAI) [18], và sự gia tăng hấp
thu nước cuối cùng, xảy ra sau khi trục phơi đã thốt ra khỏi các cấu trúc xung quanh nó
(48–72 HAI, giai đoạn III ) [12,19] (Hình 1 A). Hạt khơ n tĩnh nhanh chóng tiếp tục
hoạt động trao đổi chất khi bị xâm nhập, dẫn đến sự suy thoái của các đại phân tử được
lưu trữ trong nội nhũ, do đó, cung cấp năng lượng và chất dinh dưỡng cần thiết cho phơi
để hình thành cây con.
Trong quá trình nảy mầm của hạt lúa, sucrose nhanh chóng được tiêu thụ bởi trục phơi
đang phát triển. Phơi khô dự trữ carbohydrate dưới dạng đường sucrose và các mơ
chồi tiêu thụ lượng đường sucrose có trong phơi lớn nhất [22]. Phơi khơ chứa ít hạt
tinh bột và đường được phôi hấp thụ được chuyển đổi tạm thời thành tinh bột. Khoảng
24–36 giờ sau khi xâm nhập, nhiều hạt lớn hơn tích tụ xung quanh các mơ mạch, lớp
vỏ và biểu mơ [22], làm cho giai đoạn II có lẽ là giai đoạn quan trọng nhất của quá
trình nảy mầm của hạt lúa. Cơ chế mà đường hòa tan được vận chuyển đến phôi từ
các nguồn dự trữ đã bị phân hủy trong nội nhũ vẫn chưa được biết rõ, tuy nhiên cần
phải có sự liên lạc, vận chuyển và tín hiệu thường xun giữa phơi và nội nhũ, tất cả
đều nhằm mục đích thiết lập sự nảy mầm thành công. Ở đại mạch, các chất vận
chuyển peptit được đề xuất là thuộc tính của các tương tác hai chiều này [23,24].
Nguồn năng lượng chính cho sự nảy mầm của hạt và hình thành cây con là sự phân
hủy của tinh bột dự trữ trong nội nhũ. Quá trình thủy phân hoàn toàn tinh bột đạt
được nhờ hoạt động kết hợp của α-amylase, β-amylase, enzyme khử nhánh và αglucosidase. Alpha-amylase (1,4-α-d-glucan maltohydrolase) là một canxi
metalloenzyme và nó hoạt động tại các vị trí ngẫu nhiên dọc theo chuỗi tinh bột tạo ra
α-maltose và α-glucose [25], trong khi β- amylase (1, 4-α-d-glucan maltohydrolase)
hoạt động từ đầu không khử của tinh bột thủy phân liên kết α-1,4 glycosidic thứ hai
và phân cắt từng đơn vị maltose [26]. Alpha-amylase được tổng hợp de novo trong
quá trình nảy mầm của hạt với sự hiện diện của GA nội sinh (gibberellic acid) từ phôi
[27]. Ngược lại, β-amylase hiện diện trước khi nảy mầm ở dạng không hoạt động mà

khơng có sự kiểm sốt của GA [26], được kích hoạt bởi hoạt động của protease phân
cắt đầu tận cùng cacboxyl của nó [6,27,28]. Tổng hợp β-amylase chỉ xảy ra ở lớp
aleurone, trong khi alpha- amylase xảy ra cả ở lớp aleurone và lớp biểu mô. Trong
nghiên cứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi đã phát hiện một trong những alphaamylase (amylase1A) trong phôi hạt lúa và chứng minh rằng mức độ protein và
mRNA của nó đều tăng đáng kể và đạt đỉnh ở 48 HAI trong quá trình nảy mầm [29],
ngồi ra đáp ứng với phytohormone, có thể xác định sự biến đổi hạt tinh bột trong
hạt lúa nảy mầm.


3.4.1 Phương pháp thu nhận malt
malt đại mạch
malt thóc
3.4.2 Phương pháp tinh sạch
a. Tinh sạch enzyme amylase bắng phương pháp sắc ký
Hạt lúa được cho hút ẩm và ủ trong tối ở 30°C trong 8 ngày. Hạt nảy mầm được đồng hóa
trong một máy trộn và một polytron với 800ml dung dịch đệm TRIS/HCI 50mM (pH 8,5)
(dung dịch đệm A).
Sản phẩm đồng hóa được ép qua hai lớp lưới nylon và dịch lọc thô được đưa vào ly tâm
với tốc độ 15.000 vòng trong 20 phút. Phần ở trên được xem nhu dịch enzym thô. Dịch
enzym thô được cho kết tủa với (NH.)SO. (25- 60%). Phần kết tủa thu được đem hòa
tan trong 10ml dung dịch đệm A và ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong 20 phút.
Sau khi sử dụng phương pháp thẩm tích thì phần nổi ở trên trong dung dịch đệm A thi sẽ
được cho qua cột DEAE cellulose, DE 52 (Whatman) và được cân bằng bởi dung dịch
đệm A; enzyme được tách ra bằng NaCI nồng độ 0-0,5M. Dung dịch được thẩm tích và
được lơi cuốn qua cột CHA (ancyclodextrin), cột này được đặc biệt sử dụng để lôi cuốn
amylase. Các phân đoạn qua cột thu được sẽ được chuyển qua 12 sắc ký cột superose.
b.Thu nhận enyme amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide
Hạt lúa được ngâm nước và ủ cho nảy mầm. Sau 14 ngày, cây mầm được xay nhuyễn với
đệm Tris -HCl 0,005M (pH 8,0). Tỷ lệ mô đệm là 1:2 (trọng lượng/ thể tích). Hỗn hợp
sau khi đồng hóa được ly tâm với tốc độ 10.000ppm trong 15 phút ở nhiệt độ 4 độ C.

Phần nổi ở trên được chuyển sang một ống ly tâm khác và được xem là dịch enzyme.
Gel được chuẩn bị sẵn sàng và được đưa vào điện di với cường độ dòng điện 70V. Sau
khi hoàn tất việc chạy điện di, gel được đưa ra nhuộm với dung dịch nhuộm màu để
xác định sự hiện diện của amylase.
3.4.3 Lên men ở trạng thái rắn
3.4.4 Lên men chìm
3.5 Các yếu tố ảnh hưởng
3.5.1 pH mơi trường
3.5.2 Nhiệt độ và các ion kim loại
3.5.3 Độ ẩm
3.6 Ứng dụng của enzyme amylase


Là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm
enzyme thủy phân, xác tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide
với sự tham gia của nước, thường được sử dụng để thủy phân tinh bột.
- Enzyme amylase được phát hiện đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành cơng
nghiệp chế biến thực phẩm. Chế phẩm amylase đã được dùng phổ biến trong một số
lãnh vực của công nghiệp thực phẩm như sản xuất bánh mì, glucose, rượu, bia,…
- Trong sản xuất bánh mì, chế phẩm amylase đã làm thay đổi hồn tồn chất lượng của
bánh mì về hương vị, màu sắc, độ xốp,… chế phẩm amylase sạch cho chất lượng
bánh mì tốt hơn ở dạng phức hợp với protease.
- Trong sản xuất bánh kẹo, maltose là sản phẩm thủy phân tinh bột bằng amylase và
glucose bằng glucoamylase. Chính glucoamylase là yếu tố làm tăng hiệu suất alpha
amylase.
- Trong sản xuất rượu, bia việc sử dụng amylase có trong các hạt nẩy mầm thay
thế malt đã góp phần đáng kể trong việc giảm giá thành.
- Enzyme amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như amylase từ thực vật
động vật, mầm thóc, mầm đại mạch (malt), hạt bắm nảy mầm hay từ nấm mốc,…
nguyên liệu cho sản xuất là gạo, bắp, khoai mì… đây là những nguyên liệu dễ tìm, rẻ

có thể dễ dàng tìm thấy ở Việt Nam. Do đó, đây là một lợi thế và là hướng phát triển
mạnh làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển.
3.6.1 Q trình thuỷ phân tinh bột
+Trong ngành cơng nghiệp tinh bột:
Amylase chuyển hóa tinh bột thành glucose và các loại siro khác nhau.
Amylase là một enzyme quan trọng để tiêu hóa và hấp thụ tinh bột.

Thêm amylase vào thức ăn có thể cải thiện q trình tiêu hóa và hấp thụ tinh
bột của động vật, cải thiện hiệu suất sản xuất và tăng khả năng sử dụng thức ăn.
3.6.2 Enzyme amylase trong sản xuất bia và cồn
Trong ngành công nghiệp sản xuất rượu bia (tham gia vào giai đoạn đường
hóa tinh bột):
Amylase được sử dụng trong q trình đường hóa tinh bột thành maltose,
glucose, dùng làm cơ chất cần thiết cho tiến trình lên men bia;
Trong sản xuất bia, việc sử dụng amylase có trong các hạt nảy mầm thay


thế malt đã góp phần đáng kể trong việc giảm giá thành.
3. 6.3 Enzyme amylase trong sản xuất bánh
mì + Trong sản suất bánh kẹo, bánh mỳ,…
Quá trình sản xuất bánh kẹo cũng sử dụng rất nhiều nguyên liệu có
chứa enzyme amylase.
Trong nướng bánh, chúng xúc tác sự phân hủy tinh bột trong bột thành đường
đặc biệt trong sản xuất bột bánh quy nhờ enzyme amylase mà bánh quy có
mùi, vị, màu hấp dẫn
Nguyên liệu amylase thường được bổ sung trong q trình làm bánh mì để giúp bánh
có kết cấu tốt hơn, màu sắc và hương vị hấp dẫn hơn. Các nghiên cứu thực tế đã cho
thấy sản phẩm cải thiện rõ rệt về cấu trúc, thể tích và độ cứng khi bổ sung thêm các
nguyên liệu phụ gia có chứa amylase.
3.6.4 Enzyme amylase trong chế biến bột

3.6.5 Một số ứng dụng khác
Trong ngành công nghiệp sản xuất rượu bia: Amylase được sử dụng trong q
trình đường hóa tinh bột thành maltose, glucose, dùng làm cơ chất cần thiết
cho tiến trình lên men bia
Trong sản xuất tương, mạch nha, mật, đường glucose
Amylase thủy phân tinh bột có thể ứng dụng trong sản xuất ra cơm rượu,
làm thức ăn cho gia súc để bổ sung chất dinh dưỡng
Ứng dụng trong sản xuất bánh mì, làm cho bánh nở xốp, thơm ngon hơn
Trong ngành dệt may, enzyme amylase được dùng để rũ hồ vải, tẩy lớp hồ bột
trên bề mặt vã, giúp vải mềm mịn, dễ tẩy trắng, dễ bắt màu trong q trình
nhuộm
Ứng dụng trong cơng nghiệp sản xuất dược phẩm
Ứng dụng trong ngành chế biến bột ngọt.
Đóng vai trị là chất xúc tác, giúp cho q trình tiêu hóa và hấp thu tinh bột ở
ruột non diễn ra dễ dàng hơn


Tài liệu tham khảo
Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng,
Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương và Phan Thị Huyền. Công nghệ enzyme,
(2004). NXB Đại học Quốc gia Thành phố Cần Thơ. Hồ Chí Minh
Ứng dụng của enzyme amylase trong cơng nghiệp. Đại học Cơng nghiệp Thực phẩm
Thành phố Hồ Chí Minh.
H. Taniguchi, Y. Honnda, in Encyclopedia of Microbiology (Third Edition), (2009)
P. Williams, in Encyclopedia of Analytical Science (Second Edition), 200
Ajita Sundarram, and Thirupathihalli Pandurangappa Krishna Murthy, “α-Amylase
Production and Applications: A Review.” Journal of Applied & Environmental
Microbiology, vol. 2, no. 4 (2014): 166-175
Ritu Saini, Harnek Singh Saini and Anjali Dahiya, “Amylase: Characteristics and
industrial applications” Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2017;6(4): 18651871